Protocol
1. Beredning av reagenser och buffertar
- 0,5 M etylendiamintetraättiksyra (EDTA)
- I en 2 liter bägare, tillsätt 186,1 g EDTA till 800 ml avjoniserat-destillerat vatten (DDH 2 O). Justera pH i lösningen till 8,0 med användning av NaOH-pellets. Lägg DDH 2 O till en slutlig volym av 1,0 L och överför lösningen till en autoklaverbar glasflaska för autoklavering och förvara vid 4 ° C.
- 10 × Tris-borat EDTA (10x TBE)
- I en 4 L plastbägare, tillsätt 432 g Tris-bas, 200 g borsyra, 80 ml av 0,5 M EDTA (pH 8,0) och DDH 2 O till en slutlig volym av 4 L. Mix med användning av en omröringsstav tills alla komponenterna löses. Överför lösningen till en L glasflaskor för autoklavering och förvara vid 4 ° C.
- 10% denaturer Polyakrylamid Stock
- I en 4 L plastbägare, tillsätt 1681,7 g urea, 400 ml 10x TBE, en liter 40% akrylamid / bisakrylamid (29: 1) lösning och DDH 2 O tills fInal volym är fyra L. Blanda med hjälp av en omrörare tills urea upplöst. Överför lösningen till en L bruna glasflaskor och förvara vid 4 ° C.
- 2x gelladdningsbuffert (2x GLB)
- I en 200 ml glasbägare, tillsätt 44 g karbamid, 8 g sackaros, 10 mg bromfenolblått, 10 mg xylencyanol FF, 400 | il 10% natriumdodecylsulfat, och 4 ml av 10 x TBE. Lägg DDH 2 O till en slutlig volym av 40 ml och lös komponenterna med mild upphettning vid 50 ° C under omblandning med en magnetisk omrörarstav. Överföring 1 ml alikvot till 1,5 ml mikrofugrör och förvara vid 4 ° C.
OBS: Före användning kräver kort uppvärmning vid 90 ° C för återupplösning några fasta ämnen.
- I en 200 ml glasbägare, tillsätt 44 g karbamid, 8 g sackaros, 10 mg bromfenolblått, 10 mg xylencyanol FF, 400 | il 10% natriumdodecylsulfat, och 4 ml av 10 x TBE. Lägg DDH 2 O till en slutlig volym av 40 ml och lös komponenterna med mild upphettning vid 50 ° C under omblandning med en magnetisk omrörarstav. Överföring 1 ml alikvot till 1,5 ml mikrofugrör och förvara vid 4 ° C.
- 1 M Tris-hydroklorid (Tris-HCl) (pH 7,5)
- I en glasflaska, tillsätt 12,1 g Tris-bas och 70 ml DDH 2 O och blanda tills fastämnet är upplöst. Justera pH till 7,5 med användning av 1 M saltsyra (HCl). Lägg DDH 2 O till en slutlig volym av 100 ml, autoklav och store vid 4 ° C
- 5 M natriumklorid (NaCl)
- I en glasflaska, lös upp 58,4 g NaCl i 150 ml DDH 2 O. Justera volymen till 200 ml med DDH 2 O. Lagra vid 4 ° C.
- DNA elueringsbuffert
- I en glasflaska, blanda 2,0 ml 1 M Tris-HCl (pH 7,5), 8,0 ml 5 M NaCl och 0,4 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0). Justera volymen till 200 ml med DDH 2 O, autoklav och lagra vid 4 ° C.
- 1 M 4- (2-hydroxietyl) -1-piperazinetansulfonsyra (HEPES) (pH 7,4)
- I en glasflaska, upplösa 2,38 g HEPES i 80 ml DDH 2 O. Justera pH till 7,4 med användning av 5 N NaOH och tillsätt DDH 2 O till en slutlig volym av 100 ml.
- 1 M magnesiumklorid (MgCl2)
- I en glasflaska, tillsätt 2,03 g MgCl2 6H 2 O och bringa volymen till 100 ml med DDH 2 O.
- Reaction Buffer (RB)
- I ett 50 ml koniskt rör, tillsätt 500 | il av 1 M Tris-HCl (pH 7,5), 8,8 g NaCl, 50 pl 1 M MgCl2 och 5 | il Tween 20. Lägg DDH 2 O till en slutlig volym av 50 ml. Blanda lösningen och filtrera till en annan koniska rör med hjälp av en spruta driven filter (0,22 ^ m) och förvara vid 4 ° C fram till användning.
- I ett 50 ml koniskt rör, tillsätt 5,8 g NaCl, 3 ml 1 M MgCl2, 1,5 g urea, och 40 ml av DDH 2 O. Justera pH i lösningen till 5,0 med användning av 10 mM HCl. Eftersom lösningen inte är buffrad, justera pH med användning av HClförsiktigt genom tillsats av små HCl alikvoter. Lägg DDH 2 O till en slutlig volym av 50 ml.
- Blanda lösningen och filtrera till en annan koniska rör med hjälp av en spruta driven filter (0,22 ^ m) och förvara vid 4 ° C fram till användning.
- I en bägare upplöses 20,0 g LB pulver i en liter DDH 2 O. Överföra vid 4 ° C till en glasflaska, autoklav, och lagra.
- I en 250 ml kolv, till 1,5 g agar och 100 ml av LB-buljong. Autoklav och förvara vid 4 ° C.
- Lös LB agar i en mikrovågsugn och kyl lösningen till -50 ° C. Häll lösningen i petriskålar, vilket gör ~ 5 plattor och tillåta dem att stelna.
2. Syntes och rening av E. coli- responsiv DNAzyme EC1
- Syntes av EC1 by Mall medierad enzymatisk ligering
- rena commercially syntetiserade oligonukleotider BS1, DE1, och T1 (sekvenser som tillhandahålls i tabell 1) med 10% denaturerande polyakrylamidgelelektrofores (dPAGE) enligt standardprotokoll.
- Förbered en 100 | iM lager av BS1, DE1, och T1. Förvara vid -20 ° C fram till användning.
- I en 1,5 ml mikrofugrör, tillsätt 38,5 | il av DDH 2 O, 5 pl av DE1, och 5 ^ il 10 x T4-polynukleotidkinas reaktionsbuffert som tillhandahålls av enzymleverantören (500 mM Tris-HCl (pH 7,6), 100 mM MgCl2, 50 mM ditiotreitol (DTT), 1,0 mM spermidin).
- Tillsätt 1 pl av adenosintrifosfat (ATP) (100 mM). Tillsätt 5 enheter T4-polynukleotidkinas (10 U / pl). Blanda genom att försiktigt pipettera av reaktionsblandningen.
- Inkubera reaktionen vid 37 ° C under 30 min.
- Släck reaktionen genom upphettning till 90 ° C under 5 min.
- Lägg 118 pl DDH 2 O, 5 pl BS1, och 5 pl T1. Värm reaktionsblandningen till 90 ° C under 2 min och kyl sedan till rumstemperatur under 10 min.
- Tillsätt 20 | il av 10 x T4 DNA-ligas-reaktionsbuffert som tillhandahålls av enzymleverantören (400 mM Tris-HCl (pH 7,8), 100 mM MgCl2, 100 mM DTT, 5 mM ATP). Tillsätt 10 enheter T4 DNA-ligas (5 U / ^ il) och försiktigt blanda genom pipettering.
- Inkubera vid rumstemperatur under 2 h.
- Tillsätt 20 | il 3 M natriumacetat (NaOAc) (pH 5,2), 500 pl kall 100% etanol. Blanda lösningen genom att vortexa och placera röret i en -20 ° C frys under 30 min.
- Centrifugera mikrofug vid 20.000 xg under 20 min vid 4 ° C. Försiktigt bort supernatanten genom pipettering.
- Tvätta pelleten med kall 70% etanol och centrifugera igen vid 20.000 xg under 10 min vid 4 ° C. Återigen avlägsna supernatanten och torka pelleten under vakuum under 10 min.
- Resuspendera DNA med 15 | il DDH 2 O och sedan lägga till 15 pl 2x GLB.
- Skaka kraftigt och värm till 90 ° C under2 min. Rena den DNA med fullständig längd med 10% dPAGE såsom beskrivs nedan.
- Ställa in 10% dPAGE
- Ren två glasplattor (en full tallrik och en spårförsedda), två 0,75 mm tjocka avståndshållare och en 12-brunn kam. Lägga en glasplatta på en plan yta med två distansorgan på varje sida och den skårade plattan ovanpå. Klipp de båda plåtarna ihop med de fyra clipsen som tillhandahålls av leverantören.
- I en 150 ml plastbägare, häll 40 ml 10% dPAGE, 40 pl tetrametyletylendiamin (TEMED) och 400 | il av 10% ammoniumpersulfat (APS). Blanda komponenterna och häll lösningen mellan plattorna långsamt.
- Sätt kammen och låt gelen polymerisera under 10 minuter. När gelen polymeriseras, sakta ut kammen och spola brunnarna med DDH 2 O.
- Montera plattorna på gelén elektroforesapparaten. Använd en metallplatta för att avleda värme som genereras för att förhindra överhettning.
- Pour 1x TBE på de övre och undre kamrarnaoch se till att brunnarna är väl nedsänkt i bufferten. Spola brunnarna med 1x TBE med hjälp av en pipett eller spruta.
- Ställ apparaten för att köras på 35 mA och pre-run i 15 minuter innan proverna.
- Eluering av Ligerat EC1 från 10% dPAGE
- Efter steg 2.2.6, kör gelén vid 35 mA tills den nedre färgämne (bromfenolblått) når botten av glasskivan. Detta bör ta cirka 1,5 timmar. Stäng av strömmen och ta bort plattorna från anordningen.
- Lägg plattorna på några ark hushållspapper och försiktigt bort distanserna från glasplattorna. Försiktigt bort den övre glasplatta och linda gelen med plastfolie.
- Vänd gelen över för att ta bort den andra glasplattan och täck med plastfolie igen. Var noga med att undvika rynkor i plastfolie.
- Visualisera den ligerade produkten med hjälp av UV-skuggning (260 nm), som kommer att producera 4 olika DNA-band (Fully ligerade EC1, DE1, BS1, och T1).
- Centrifugera gellösningen vid 20.000 x g under 5 min och noggrant överföra 400 fil av supernatanten till ett annat 1,5 ml mikrofugrör. Undvik att dra gel bitar under pipettering.
- Till mikrofugrör med den överförda supernatanten tillsätt 40 ul av 3 M NaOAc (pH 5,2), och 1,0 ml kall 100% etanol. Blanda lösningen genom att vortexa och placera röret i en -20 ° C frys under 30 min.
- Centrifugera mikrofug vid 20.000 xg under 20 min vid 4 ° C. Försiktigt bort supernatanten genom pipettering.
- Tvätta pelleten med kall 70% etanol och centrifugera igen vid 20.000 xg under 10 min vid 4 ° C. Återigen, ta bortsupernatanten och torka pelleten under vakuum under 10 min.
- Bestämma koncentrationen av EC1 genom att mäta UV-absorbans vid 260 nm. Gör en 10 pM stock och lagra provet vid -20 ° C fram till användning.
3. Konjugering av ureas för att DNA
- Framställning av succinimidyl-4- (N-maleimidometyl) cyklohexan-1-karboxylat (SMCC) Lager
- Lös 1 mg SMCC i 676 pl DMSO. Vortex och plats på is fram till användning.
- Framställning av Ureas Stock
- Upplös 1 mg ureas i 1 ml 1 x PBS (utan Mg 2 + eller Ca2 +). Placera på is fram till användning.
OBS: Kristalliserad ureas är långsam att lösa och det behövs varsam blandning för att undvika denaturering.
- Upplös 1 mg ureas i 1 ml 1 x PBS (utan Mg 2 + eller Ca2 +). Placera på is fram till användning.
- Syntes av Ureas-DNA (UrDNA)
- Tillsätt 10 pl av 100 pM LD1 till en 2,5 ml mikrofugrör. Lägg 140 pl DDH 2 O, 40 pl 10x PBS och virvel.
- Lägg 80,5 pl SMCC stock, 159,5 il DMSO, virvel, och kort centrifug med hjälp av en bordscentrifug.
- Inkubera vid 37 ° C under 60 min. Undvika kondens under mikrofug cap.
- Tillsätt 200 | il 1 x PBS, 60 ul av 3 M NaOAc (pH 5,2), och 1,5 ml kall 100% etanol. Blanda lösningen genom att vortexa och inkubera vid -20 ° C under 30 min.
- Centrifugera lösningen vid 20.000 xg under 20 min vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten och torka pelleten under vakuum. Undvika övertorkning.
- Till den torkade pelleten till 400 pl av ureas lager och inkubera vid rumstemperatur under 5 h.
- Överföra 200 fil av rå konjugat till en förtvättad 100k MWCO centrifugal filterkolonn. Centrifugera kolonnen vid 14.000 xg under 5 min.
- Överföra de återstående 200 | il av rå konjugat till kolonnen och centrifugera vid 14.000 xg under 5 min. Ta bort kolumnen och placera den upp och ned i en ny 2,0 ml mikrofugrör ( "provröret").
- centrifugeuge uppsamlingsröret (med den inverterade kolumnen) vid 1000 xg under 2 minuter. Avlägsna provröret och tillsätt 30 pl 1x PBS till centrifugal kolumnen att tvätta membranet för ytterligare återhämtning av konjugat.
- Än en gång invertera kolonnen och placera tillbaka in i provröret. Centrifugera uppsamlingsröret (med den inverterade kolumnen) vid 1000 xg under 2 minuter. Ta bort och kassera kolonnen.
- Förvara UrDNA vid 4 ° C fram till användning.
4. Montering av EC1 och UrDNA på magnetiska pärlor
- Blanda magnetisk pärla (MB) lager väl och överför 100 pl av MB suspension till ett 1,5 ml mikrofugrör. Placera mikrofugrör på en magnetställning hållare för isolering av MB.
- Avlägsna supernatanten genom pipettering och tillsätt 150 | il bindningsbuffert (BB) till röret. Ta bort röret från hållaren och försiktigt knacka på röret för att resuspendera MB till en homogen lösning. Undvik stänk suspensionen till top av röret eller locket. Om detta händer, använd en bordscentrifug att kortfattat snurra återstoden tillbaka till suspensionen.
- Upprepa steg 4,2 ytterligare två gånger.
- Till denna suspension tillsätt 10 pl 10 nM EC1. Blanda försiktigt genom att knacka på röret.
- Inkubera lösningen med mild skakning under 30 min. Knacka på röret varje 2-3 min för att undvika utfällning av MB.
- Placera mikrofugrör tillbaka på den magnetiska rack för att isolera MB och avlägsna supernatanten genom pipettering. Tvätta MB tre gånger med 150 | il av BB (som beskrivs i steg 4.2).
- När tvätten är klar, avbryta MB i totalt 150 pl BB. Till denna lösning, tillsätt 15 | il av UrDNA och värm lösningen till 45 ° C under 2 min. Kyl lösningen till rumstemperatur och inkubera i 2 h.
- Placera mikrofugrör tillbaka på den magnetiska rack för att isolera MB och avlägsna supernatanten genom pipettering.
- Tillsätt 100 | il av reaktionsbuffert (RB). ta bort than mikrofugrör från den magnetiska rack och försiktigt suspendera MB.
- Tvätta MB tre gånger genom att upprepa steg 4,9.
OBS: Den tvättade supernatanten kan snabbt testas för att bestämma om ohybridiserade UrDNA är fortfarande närvarande, vilket kan resultera i ett falskt positiv signal. Testet kan göras genom att tillsätta 10 ul av 50 mM urea och 10 | il av 0,04% fenolrött till tvättlösningen. Fortsätta att tvätta MB tills tvättlösningen inte orsakar en färgförändring. Den 100 | j, l suspensionen lagras vid 4 ° C fram till användning.
5. Beredning av bakterieceller 20
- Odling E. coli från Stocks
- Plattan E. coli K12 (MG1655) på LB-agarplattor från en glycerol lager enligt en eld eller i ett biologiskt säkerhetsskåp.
- Med hjälp av en steril pipettspets trycker försiktigt glycerol lager och lätt strimma ytan av en agarplatta för att undvika att punktera LB-agar.
- Vänd strimmigaplattan och inkubera vid 37 ° C under 14 h.
- Förslut plattan med Parafilm och förvara vid 4 ° C under högst 3 veckor.
- Odling E. coli för cellräkning
- I en steril 14 ml odlingsrör, fördela 2 ml LB-buljong.
- Med hjälp av en steril pipettspets, plocka en enda koloni från strimmiga agarplattan framställts i steg 5,1 och överföra den till odlingsröret.
- Inkubera kulturen vid 37 ° C och skaka vid 230 rpm under 14 h.
- Seriellt späda bakteriekulturen i 10-faldiga intervall.
- För varje utspätt prov, jämnt plattan fem hundra il portioner på separata LB-agarplattor. Vänds plattorna och inkubera vid 37 ° C under 14 h.
- Räkna cellerna i varje prov för att få den genomsnittliga cellkoncentration av varje spädning.
OBS: 10 7-celler används ofta för att ställa in en referens litmustest för E. coli som denna nivå av E. coli kan utlösa en snabb färg chanGE. Däremot kan en väl utförd lackmustest upptäcka så lite som 500 celler, som diskuteras i avsnittet Resultat.
- Framställning E. coli-celler för testning
- För en önskad cellsuspensionen, överföring 1 ml odlade lager till en 1,5 ml mikrofugrör.
- Centrifugera cellerna vid 6000 xg under 10 min vid 4 ° C. Försiktigt bort supernatanten utan att störa cellpelleten.
- Tillsätt 10 | il av reaktionsbuffert till cellpelleten och återsuspendera cellerna. Sonikera cellsuspensionen i 5 min. Överför cellsuspensionen till en is box för 5 min.
- Sonikera cellsuspensionen för en annan 5 min.
- Centrifugera cellsuspensionen vid 13.000 xg under 10 min vid 4 ° C. Använda supernatanten för testning (10 ^ il).
6. avgörande provet
- I en 1,5 ml mikrofugrör, förtvättas röret genom att tillsätta och vortexa 100 pl reaktionsbuffert (RB) i mikrofugrör ochkasserar bufferten.
- Transfer 15 pl monterade EC1 (protokoll 4) till den tvättade mikrofugrör.
- Tvätta de magnetiska pärlorna genom att placera mikrofugrör på en magnetställning. Avlägsna supernatanten genom pipettering. Avlägsna mikrofugrör från ställningen, tillsätt 100 | il av RB, och försiktigt återsuspendera de magnetiska pärlorna.
- Tvätta MB ytterligare två gånger genom att upprepa steg 6,3.
- Placera mikrofugrör tillbaka på den magnetiska rack, avlägsna supernatanten och tillsätt 10 pl E. coli prov framställt från steg 5,3.
- Blanda provet och magnetiska pärlor noggrant genom att försiktigt knacka på mikrofugrör.
- Inkubera reaktionen vid rumstemperatur under 1 timme.
- Till reaktions, tillsätt 90 | il av DDH 2 O och placera mikrofugrör på en magnetställning.
- Efter ca 3 min av magnetisk separation, noggrant överföra 85 | il av supernatanten till ett 0,5 ml mikrofugrör. Återkalla supernatanten långsamt tillundvika att samla några magnetiska pärlor.
- Till ovanstående mikrofugrör till 15 pl 0,04% fenolrött, och 100 pl substratlösning.
- Ta ett fotografi vid specifika tidsintervall för att spela in färgförändring.
OBS: Förändringen i pH kan också övervakas med hjälp av en pH-mätare med en mikroelektrod. Utgångs pH skall vara cirka 5,2 till 5,5 (lösningen är gul). Om inte, kan lösningen justeras genom tillsats av 1 mM acetatbuffert pH 5,0).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Principen för den bakteriella lackmustest förklaras i figur 1 Testet använder tre viktiga material:. En RNA-klyvning DNAzyme som aktiveras av en specifik bakterie, ureas och magnetiska pärlor. Den DNAzyme används som den molekylära igenkänningselement för att uppnå höggradigt specifik detektion av en bakterie av intresse. Ureas och magnetiska pärlor används för att uppnå signalöverföring av RNA-klyvningsaktivitet av DNAzyme. Detta innebär att man skapar magnetiska kulor som innehåller ureas-DNAzyme konjugat. I närvaro av målet bakterien, den DNAzyme klyver sin RNA koppling. Denna åtgärd ger upphov till en dissociation av ureas från magnetiska pärlor. Den frigjorda ureas kan lätt separeras från magnetiska kulor och användes för att alstra en färgförändring i en reporter-lösning, vilken innehåller urea och ett pH-känsligt färgämne. Ureas hydrolyserar urea till ammoniak, tillsammans med en ökning av pH-värdet som utlöser color förändring av färgämnet.
Figur 2 visar en bakteriell lackmustest där EC1, en E. coli -responsive RNA-klyvning DNAzyme, användes som DNAzyme, och fenolrött användes som pH-rapporterings färgämne. EC1 har tidigare isolerades genom vår grupp från en slumpmässig-sekvens-DNA pool med användning av tekniken av in vitro-selektion. 5 Våra tidigare studier har visat att EC1 är mycket specifik för E. coli och uppvisar minimal aktivitet mot andra bakterier. 5,19 Det har visat sig att EC1 aktiveras av en proteinmolekyl från E. coli. Även om identiteten av detta protein biomarker inte har dechiffreras, antyder den höga igenkänningsspecificitet att detta protein är unik för E. coli. Reportern lösningen är inställd för att ha ett ursprungligt pH av 5,5. Vid detta pH, uppvisar fenolrött en gul färg. Såsom ureas hydrolyserar urea till ammoniak, basiciteten av reporter solution ökar. Detta återspeglas i den gradvisa förändringen av färg från gult till rosa. Djupet av färgförändringen är beroende av följande två parametrar, såsom illustreras av figur 2: antalet E. coli-celler som används i DNAzyme aktiveringssteget och tidsfristen för urea hydrolyssteget. Mer E. coli-celler resulterade i starkare färgförändringar, reflekteras av observationen av en progressiv gul till rosa färg övergång när E. coli-celler i serie ökade 5-5 x 10 7 (10-faldig ökning varje gång). Under tiden en längre tid för urea hydrolys tillåts för detektion av ett mindre antal E. coli-celler (5000 celler i en timme reaktionen och 500 celler i 2 timmars reaktion).
PH-förändringen av bakterie lackmustest kan också övervakas med hjälp av en handhållen pH-mätare och representativa resultat visas i figur 3. Det was funnit att närvaron av 10 7 E. coli-celler resulterade i en gradvis ökning av pH genom 3 enheter inom 10 min. Däremot saknas E. coli-celler orsakade inte detekterbara pH-förändringar under samma inställning.
Figur 1: Principen utformningen av bakteriell lackmustest (A) Aktivering av en RNA-klyvning DNAzyme av en specifik biomarkör från en bakterie av intresse.. I närvaro av biomarkör, RNA-klyvning DNAzyme immobiliserade på magnetiska pärlor klyver RNA koppling, vilket resulterar i frisättning av den märkta ureas från magnetiska pärlor till lösning. (B) Trestegsanalysförfarandet. Steg 1: DNAzyme aktivering, såsom beskrivits i panel A. steg 2: Magnetisk separation - den frigjorda ureas separeras från magnetiska pärlor. Steg 3: Urea hydrolys R12; den frigjorda ureas tillsätts i en ureainnehållande reporter lösning. Ureas hydrolyserar urea till ammoniak, vilket resulterar i en förändring i pH som kan rapporteras av ett pH-känsligt färgämne. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: lackmustest med E. coli med hjälp av E. coli -responsive DNAzyme EC1. Representativa färgskiftande resultat med varierande antal E. coli-celler som tillhandahålls ovanför varje provrör. Fenolrött användes som pH-känsligt färgämne. Ett test utan E. coli användes som en negativ kontroll. Mer E. coli-celler förväntas orsaka utsläpp av fler ureas molekyler, tillsammans by starkare färgförändringar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Övervakning pH-ökning med hjälp av en pH-mätare Förändringen av pH som orsakas av 10 7 E.. coli-celler övervakades med användning av en bärbar pH-mätare. Ett test utan E. coli användes som en negativ kontroll. Närvaron av 10 7 E. coli-celler i testlösningen kan öka basiciteten vid ~ 3 pH-enheter i 10 min. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| namn | SEkvens (5'-3 ') | Notera |
| BS1 | BTTTT TTTTT TTTAC TCTTC CTAGC FRQGG TTCGA TCAAG A | B: 5'-Biotin; R: adenin ribonukleotid; F: fluorescein-dT; Q: DABCYL-dT |
| DE1 | GATGT GCGTT GTCGA GACCT GCGAC CGGAA CACTA CACTG TGTGG GGATG GATTT CTTTA CAGTT GTGTG TTGAA CGCTG TGTCA AAAAA AAAA | |
| T1 | GACAA CGCAC ATCTC TTGAT CGAAC C | |
| LD1 | XTTTT TTTTT TTTTT TTGAC ACAGC GTTCA A | X: 5'-NH2 |
Tabell 1: Sekvenser av syntetiska oligonukleotider.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Översättningen av verkan av RNA-klyvningsaktivitet av en bakterie-responsiv DNAzyme till ett avgörande prov möjliggörs genom användning av ureas och magnetisk separation, vilket framgår av figur 1. Även om den demonstration av den modifierade litmustest för bakteriell detektion är gjort med en E. coli -beroende RNA-klyvning DNAzyme, 5,19,20 konstruktionen kan i allmänhet förlängas något RNA-klyvning DNAzyme. Med tanke på den stora tillgången på RNA-klyvning DNAzymes för olika analyter och olika metoder för att isolera nya RNA-klyvning DNAzymes från random-sekvens pooler för nya mål, förväntar vi oss att den modifierade lackmustest plattformen kan utvidgas till detektion av olika mål av intresse .
Lackmustestet för E. coli detektion kan upptäcka 5000 och 500 celler när rapportreaktionstiden sätts till att vara en och två timmar, respektive. Den populära polymeraskedjereaktion (PCR) ochsandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) metoder kan uppnå gränserna för ca 10 4 -10 5 E. detektions coli-celler i liknande test gånger. 25,26 Således erbjuder den bakteriella lackmustest jämförbar detektionskänslighet.
Även bakterie lackmustest är lätt att genomföra och kan producera livfulla färgförändringar, kan flera faktorer signifikant påverka testresultaten. För det första är det mycket viktigt att kvaliteten av ureas. Vi har använt ureas från olika källor och fann testresultaten kan variera avsevärt. Vi rekommenderar användning av ureas från källan anges i avsnittet Material.
Monteringen av DNAzyme / ureas / magnetiska pärlor behöver särskild uppmärksamhet. Noggrann tvättning av magnetiska pärlor för att avlägsna ohybridiserad UrDNA är nödvändig för att förhindra falskt positiva resultat. Care måste också vidtas för att undvika ansamling av rest magnetiska pärlor på den inre ytan av den lid av mikrofugrör, vilket kan vara svårt att se. Väl där, är de magnetiska pärlorna inte längre utsätts för magnetisk separation och därmed kunde utföra vissa icke hybridiserad UrDNA som kan leda till falskt positiva signaler i reportern reaktionen. Det är också viktigt att undvika att lämna mikrofugrör på den magnetiska rack för längre tid än 10 minuter, under den magnetiska separationssteget. Pärlorna kan aggregera eller hålla sig till mikrofugrör, vilket kan minska tvätteffekten och införa sats till sats inkonsekvens. Införande av 0,01% Tween-20 i tvättlösningen kan förbättra sats till sats konsistens och bör genomföras.
De magnetiska pärlorna är belagda med streptavidin, som användes som ankare för att montera DNAzyme-ureas-konjugat på de magnetiska pärlorna. Både streptavidin och ureas är proteinmolekyler som kan denatureras under lagring. Vi lagrar vanligtvis monterade DNAzyme-ureas-magnetiska kulor vid 4 ° C i upp till 4 veckoroch göra nya partier regelbundet för att uppnå jämnare resultat.
Omsorg måste också vidtas för att undvika misstag tar magnetiska pärlor i den magnetiska separationssteget (steg 6,9) efter DNAzyme aktivering. Från vår erfarenhet, kan cellrester och andra partiklar i lösning minskar den magnetiska separationseffektiviteten, och därför kan en del magnetiska pärlor oavsiktligt tas ut under pipettering. Detta kommer att resultera i falskt positiva resultat. Vi rekommenderar följande åtgärder för att lindra problemet: en längre separation tid (t.ex. 5-10 min), en långsammare frisättning av trycket på pipetten för att möjliggöra mild tillbakadragande av supernatanten, och utsätta supernatanten till en ytterligare runda av magnetisk separation .
Slutligen är det viktigt att undvika olycks kontamination av reporterstamlösningen genom ureas under loppet av ett experiment där flera prov testas. Med tanke på den höga reaktiviteten hos urease, förorening av detta slag kan leda till falskt positiva resultat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | VWR AMRESCO | 0105 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) pellets | BIO BASIC CANADA INC. | SB6789 | |
| Tris-base | VWR AMRESCO | 0497 | |
| Boric acid | AMRESCO | 0588 | |
| Urea | VWR AMRESCO | M123 | |
| 40% acrylamide/bisacrylamide (29:1) solution | BIO BASIC CANADA INC. | A0007 | |
| Sucrose | Bioshop Canada inc. | SUC507 | |
| Bromophenol blue | Bioshop Canada inc. | BRO777 | |
| Xylenecyanol FF | SIGMA-ALDRICH | X-4126 | |
| 10% sodium dodecyl sulfate | Bioshop Canada inc. | SDS001 | |
| Hydrochloric Acid (HCl) | CALEDON LABORATORIES LTD | 6026 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Bioshop Canada inc. | SOD001 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Bioshop Canada inc. | HEP001 | |
| Magnesium Chloride (II) hexahydrate | VWR AMRESCO | 0288 | |
| Tween 20 | Bioshop Canada inc. | TW508 | |
| Adenosine Triphospahte (ATP) | AMRESCO | 0220 | |
| Sodium Acetate trihydrate (NaOAc) | SIGMA-ALDRICH | S8625 | |
| Ethanol | Commercial Alcohols | P016EAAN | |
| Tetramethyleneethylenediamine (TEMED) | AMRESCO | 0761 | |
| 10% Ammonium persulfate (APS) | BIO BASIC CANADA INC. | AB0072 | |
| Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC) | ThermoFisher SCIENTIFIC | 22360 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | CALEDON LABORATORIES | 803540 | |
| Urease | SIGMA-ALDRICH | U0251 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher SCIENTIFIC | 70011-069 | |
| 0.04% Phenol red | SIGMA-ALDRICH | P3532 | |
| 10x T4 polynucleotide kinase reaction buffer | Lucigen | 30061-1 | |
| 10x T4 DNA ligase reaction buffer | Bio Basics Canada | B1122-B | |
| T4 DNA ligase (5 U/μl) | Thermo Fischer Scientific | B1122 | |
| Luria Bertani (LB) Broth | AMRESCO | J106 | |
| Agar | AMRESCO | J637 | |
| T4 polynucleotide kinase (10 U/μl) | Lucigen | 30061-1 | |
| E. coli K12 (MG1655) | ATCC | ATCC700926 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter, Inc. | 392187 | |
| Glass plates | CBS scientific | ngp-250nr | |
| 0.75 mm thick spacers | CBS scientific | VGS-0725r | |
| 12-well comb | CBS scientific | VGC-7512 | |
| UV Lamp | UVP | 95-0017-09 | |
| Spectrophotometer (NanoVue) | GE Healthcare | N/A | |
| Metal plate | CBS scientific | CPA165-250 | |
| Vortex | VWR International | 58816-123 | |
| Gel electrophoresis apparatus | CBS scientific | ASG-250 | |
| Petri dishes | VWR International | 25384-342 | |
| 100 kDa MWCO centrifugal filters | EMD Millipore | UFC510024 | |
| Magnetic Bead (BioMag) | Bangs Laboratories Inc | BM568 | |
| Magnetic Seperation Rack | New England BioLabs | S1506S | |
| Microfuge tubes | Sarstedt | 72.69 | |
| Syringe filter (0.22 μm) | VWR International | 28145-501 | |
| 14 ml culture tube | VWR International | 60818-725 | |
| Cell culture incubator | Eppendorf Scientific | M13520000 | |
| Branson Ultrasonic cleaner | Branson | N/A | |
| Camera (Canon Powershot G11) | Canon | N/A | |
| 50 ml conical tube | VWR International | 89004-364 |
References
- Daar, A. S., et al. Top ten biotechnologies for improving health in developing countries. Nat. Genet. 32, 229-232 (2002).
- Newman, J. D., Turner, A. P. Home blood glucose biosensors: a commercial perspective. Biosens. Bioelectron. 20, 2435-2453 (2005).
- Turner, A. P. Biosensors: sense and sensibility. Chem. Soc. Rev. 42, 3184-3196 (2013).
- Tram, K., Kanda, P., Salena, B. J., Huan, S. Y., Li, Y. F. Translating Bacterial Detection by DNAzymes into a Litmus Test. Angew. Chem. Int. Ed. 53, 12799-12802 (2014).
- Ali, M. M., Aguirre, S. D., Lazim, H., Li, Y. Fluorogenic DNAzyme probes as bacterial indicators. Angew. Chem. Int. Ed. 50, 3751-3754 (2011).
- Schlosser, K., Li, Y. Biologically inspired synthetic enzymes made from DNA. Chem. Biol. 16, 311-322 (2009).
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligand by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249, 505-510 (1990).
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346, 818-822 (1990).
- Breaker, R. R. Making catalytic DNAs. Science. 290, 2095-2096 (2000).
- Liu, J., Cao, Z., Lu, Y. Functional nucleic acid sensors. Chem. Rev. 109, 1948-1998 (2009).
- Navani, N. K., Li, Y. Nucleic acid aptamers and enzymes as sensors. Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 272-281 (2006).
- Li, J., Lu, Y. A highly sensitive and selective catalytic DNA biosensor for lead ions. J. Am. Chem. Soc. 122, 10466-10467 (2000).
- Liu, J., Lu, Y. A colorimetric lead biosensor using DNAzyme-directed assembly of gold nanoparticles. J. Am. Chem. Soc. 125, 6642-6643 (2003).
- Liu, Z., Mei, S. H. J., Brennan, J. D., Li, Y. Assemblage of signaling DNA enzymes with intriguing metal specificity and pH dependence. J. Am. Chem. Soc. 125, 7539-7545 (2003).
- Liu, J., et al. A catalytic beacon sensor for uranium with parts-per-trillion sensitivity and millionfold selectivity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 2056-2061 (2007).
- Huang, P. J., Vazin, M., Liu, J. In vitro selection of a new lanthanide-dependent DNAzyme for ratiometric sensing lanthanides. Anal. Chem. 86, 9993-9999 (2014).
- Chiuman, W., Li, Y. Simple fluorescent sensors engineered with catalytic DNA 'MgZ' based on a non-classic allosteric design. PLoS One. 2, e1224 (2007).
- Xiang, Y., Lu, Y. Using personal glucose meters and functional DNA sensors to quantify a variety of analytical targets. Nat. Chem. 3, 697-703 (2011).
- Aguirre, S. D., Ali, M. M., Salena, B. J., Li, Y. A sensitive DNA enzyme-based fluorescent assay for bacterial detection. Biomolecules. 3, 563-577 (2013).
- Aguirre, S. D., Ali, M. M., Kanda, P., Li, Y. F. Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes. J. Vis. Exp. (63), e3961 (2012).
- Shen, Z., et al. A catalytic DNA activated by a specific strain of bacterial pathogen. Angew. Chem. Int. Ed. 54, (2015).
- He, S., et al. Highly specific recognition of breast tumors by an RNA-cleaving fluorogenic DNAzyme probe. Anal. Chem. 87, 569-577 (2015).
- Sumner, J. B., Hand, D. B. Isoelectric point of crystalline urease. J. Am. Chem. Soc. 51, 1255-1260 (1929).
- Karplus, P. A., Pearson, M., Hausinger, R. P. 70 Years of crystalline urease: What have we learned. Acc. Chem. Res. 30, 330-337 (1997).
- Omiccioli, E., Amagliani, G., Brandi, G., Magnani, M. A new platform for Real-Time PCR detection of Salmonella spp., Listeria monocytogenes and Escherichia coli O157 in milk. Food Microbiol. 26, 615-622 (2009).
- Cui, S., Schroeder, C. M., Zhang, D. Y., Meng, J. Rapid sample preparation method for PCR-based detection of Escherichia coli O157:H7 in ground beef. J. Appl. Microbiol. 95, 129-134 (2003).
- Ibekwe, A. M., Watt, P. M., Grieve, C. M., Sharma, V. K., Lyons, S. R. Multiplex fluorogenic real-time PCR for detection and quantification of Escherichia coli O157:H7 in dairy wastewater wetlands. Appl. Environ. Microbiol. 68, 4853-4862 (2002).
- Strachan, N. J., Ogden, I. D. A sensitive microsphere coagulation ELISA for Escherichia coli O157:H7 using Russell's viper venom. FEMS Microbiol Lett. 186, 79-84 (2000).
- de Boer, E., Beumer, R. R. Methodology for detection and typing of foodborne microorganisms. Int. J. Food Microbiol. 50, 119-130 (1999).
- Gracias, K. S., McKillip, J. L. A review of conventional detection and enumeration methods for pathogenic bacteria in food. Can. J. Microbiol. 50, 883-890 (2004).
