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Immunology and Infection

फेगोसोम प्रवासन और वेग लाइव प्राथमिक मानव मैक्रोफेज एचआईवी -1 से संक्रमित में मापा

Published: September 5, 2016 doi: 10.3791/54568
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Inserm U1016, Institut Cochin, CNRS UMR 8104, Université Paris Descartes, Sorbonne Paris Cité

Protocol

प्रोटोकॉल राष्ट्रीय और अंतरराष्ट्रीय कानूनों और स्थानीय नियमों के साथ सख्त अनुसार किया जाना है। स्वस्थ दाताओं कि अनुसंधान प्रयोजनों के लिए रक्त दान करने के लिए अपनी सहमति दे दी है से रक्त रक्त आधान केन्द्रों के साथ जो संस्थाएं समझौते पर हस्ताक्षर किए हैं से प्राप्त किया गया है। जब मानव रक्त का उपयोग विशेष सुरक्षा लिया जाना चाहिए। एचआईवी -1 के साथ प्रयोग 3 या 2 (बीएसएल 3 या 2) प्रयोगशाला स्थानीय कानून के अनुसार एक जैव सुरक्षा के स्तर में प्रदर्शन किया जाना चाहिए।

1. मानव monocyte व्युत्पन्न मैक्रोफेज (hMDMs) घनत्व ढाल centrifugation और चयन से आसंजन द्वारा की तैयारी

  1. स्वस्थ दाताओं (9 मिलीलीटर) से ताजा रक्त के साथ शुरू करो। 70 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए सीए 2 और 2 मिलीग्राम + बिना बाँझ 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ ताजा रक्त की पूरी मात्रा पतला और धीरे दो 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में पतला खून जोड़ने (ट्यूब प्रति 35 मिलीलीटर) , एक की 15 मिलीलीटर की चोटी परeutral, अत्यधिक समाधान में पहले से ही branched, उच्च द्रव्यमान, हाइड्रोफिलिक polysaccharide प्रत्येक ट्यूब में।
  2. अपकेंद्रित्र दोनों ब्रेक के बिना 20 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 537 XG पर खून की नलियों। फिर परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMCs) इंटरफेस में बादल छाए रहेंगे सेल की अंगूठी में निहित इकट्ठा करने और उन्हें एक नया 50 मिलीलीटर सीए 2 और 2 मिलीग्राम + बिना 1x पीबीएस के 15 मिलीलीटर युक्त ट्यूब में हस्तांतरण।
  3. अपकेंद्रित्र 20 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 218 XG पर कोशिकाओं और सीए 2 और मिलीग्राम के बिना 1x पीबीएस के 45 मिलीलीटर में गोली resuspend 2+।
  4. अपकेंद्रित्र 20 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 218 XG पर कोशिकाओं, सीए 2 और 2 मिलीग्राम + बिना 1x पीबीएस के 10 मिलीलीटर में गोली resuspend, और Trypan ब्लू में 1/200 के अंतिम कमजोर पड़ने के लिए गिराए द्वारा कोशिकाओं की गिनती।
  5. 20 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 218 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र और RPMI (रोसवेल पार्क मेमोरियल संस्थान) में गोली 1640 मध्यम 2 मिमी एल glutamine और 100 माइक्रोग्राम / एमएल Penic के साथ पूरक resuspendIllin स्ट्रेप्टोमाइसिन एक 6 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में मध्यम 2 मिलीलीटर में अच्छी तरह से प्रति 7 एक्स 10 6 PBMCs है।
  6. 2 घंटे के लिए 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें सेते हैं। 2 घंटे के बाद monocytes प्लास्टिक का पालन किया है जाएगा।
  7. हौसले से पृथक monocytes, hMDMs में अंतर मध्यम aspirate और 2 मिलीलीटर hMDM मध्यम (RPMI 1640, 10% decomplemented भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस), 2 मिमी एल glutamine और 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन) के साथ पूरक के साथ इसे बदलने के लिए अनुमति देने के लिए पुनः संयोजक मानव बृहतभक्षककोशिका कॉलोनी उत्तेजक फैक्टर 10 एनजी / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता में (RHM-सीएसएफ)।
  8. 11 दिन (चित्रा 1) के लिए 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते हैं।
  9. 11 दिन में मध्यम हटाने और अच्छी तरह से प्रति ठंड hMDM मध्यम 2 मिलीलीटर के साथ 2 बार धो लें। अगले ठंड 1x पीबीएस के 1 मिलीलीटर के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से 2 बार धो लें।
  10. पूरी तरह से विभेदित hMDMs को अलग करने के लिए, (2 मिमी ethylenediaminetetraacetatic एसिड के साथ ठंड 1x पीबीएस के 1 मिलीलीटर के साथ प्रत्येक अच्छी तरह 1 बार धोनेEDTA) और 4 डिग्री सेल्सियस पर 15-60 मिनट के लिए अच्छी तरह से प्रति 2 मिमी EDTA के साथ ठंड 1x पीबीएस के 2 मिलीलीटर में कोशिकाओं को सेते हैं।
    नोट: अलग करने के लिए कोशिकाओं मौजूद वैकल्पिक तरीकों (जैसे, trypsin या trypsin-तरह की गतिविधियों) कि अच्छे परिणाम 11 दे सकता है।
  11. सेना की टुकड़ी (धीरे ​​ऊपर और नीचे कुएं में pipetting द्वारा पूरा) के बाद, कोशिकाओं को इकट्ठा करने और एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में ठंड hMDM माध्यम के 10 मिलीलीटर युक्त बर्फ पर डाल दिया।
  12. अपकेंद्रित्र 20 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 218 XG पर कोशिकाओं, ठंड hMDM माध्यम के 10 मिलीलीटर में गोली resuspend, और Trypan ब्लू में 1/20 गिराए द्वारा कोशिकाओं की गिनती।
  13. 35 मिमी माइक्रोस्कोपी ग्रेड गिलास नीचे पकवान प्रति 1 एक्स 10 6 hMDMs पर कोशिकाओं बीज और 1 दिन के लिए 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें सेते हैं।

2. उत्पादन और एचआईवी -1 वायरल शेयरों की मात्रा

नोट: NLR4.3 एचआईवी -1 चुप iGFP (ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन) एक R5-रेखा लिफाफा, एम Schindl से उपहार ले जानेएर 10 मैक्रोफेज संक्रमित करने के लिए और वास्तविक समय में संक्रमित कोशिकाओं देखने के लिए प्रयोग किया जाता है।

  1. इसी proviral डीएनए एक वाणिज्यिक अभिकर्मक अभिकर्मक का उपयोग कर के 6 ग्राम के साथ मानव भ्रूण गुर्दे 293T कोशिकाओं (2 x 100 10 में 6 मिमी पकवान) के अभिकर्मक द्वारा वायरल शेयरों का उत्पादन।
  2. सूचक कोशिकाओं हेला TZM बीएल (एचआईवी -1 लीटर के नियंत्रण में एसएस galactosidase जीन असर) कोशिकाओं और उनकी गिनती के एक ß-galactosidase रंगाई के द्वारा पीछा वायरल शेयरों के धारावाहिक dilutions का उपयोग कर का उपयोग कर वायरस शेयरों की संक्रामकता यों नीले रंग की कोशिकाओं को 12।

3. एचआईवी -1 के साथ hMDMs का संक्रमण

  1. hMDMs (1.13 में चढ़ाया कोशिकाओं) को hMDM माध्यम की 0.02-0.03 1 मिलीलीटर में संक्रमण (MOI) की बहुलता पर वायरस जोड़ें। कुओं hMDM मध्यम का केवल 1 मिलीलीटर जोड़ने को नियंत्रित करने और 2 दिन (चित्रा 1) के लिए 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर बर्तन सेते हैं।
  2. दिन में 2 hMDM मेड के साथ कोशिकाओं को धोने3 गुना IUM और पकवान प्रति ताजा hMDM माध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ें। 6 दिन (चित्रा 1) के लिए 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते हैं।

4. भेड़ लाल रक्त कोशिकाओं के opsonization

  1. पकवान प्रति 7 एक्स 10 6 SRBCs की तैयारी के लिए, SRBCs दो बार centrifugation के साथ 1x पीबीएस में युक्त 0.1% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) समाधान के 100 μl में 600 XG पर 4 मिनट के लिए धो लें।
  2. SRBCs के 5 μl प्रति एक उप agglutinating एकाग्रता में खरगोश आईजीजी विरोधी SRBCs के साथ 1x पीबीएस / बीएसए 0.1% 500 μl में धोया SRBCs Resuspend और 30 मिनट के लिए आरटी पर रोटेशन के साथ सेते हैं।
    नोट: विरोधी SRBCs आईजीजी के उप-agglutinating एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए, आईजीजी के धारावाहिक dilutions एक 96 अच्छी तरह से थाली में 20 μl में 1 / 25,600 को 1/50 से (शेयर एकाग्रता 13.1 मिलीग्राम / एमएल) तैयार करें। प्रत्येक कुएं में 20 μl में 2 एक्स 10 6 SRBCs जोड़ें और कई घंटे के दौरान एक अंधेरे कमरे में प्लेट डाल दिया। उप agglutinating एकाग्रता हैअच्छी तरह के कमजोर पड़ने बस से पहले अच्छी तरह से समूहन (आईजीजी + SRBCs एक नेटवर्क बनाने) के साथ।
  3. रोटेशन के बाद, 4 मिनट के लिए 600 XG पर आईजीजी opsonized-SRBCs अपकेंद्रित्र और 4 मिनट के लिए 600 XG पर centrifugation के साथ 1x पीबीएस / बीएसए 0.1% की 100 μl से धो लें।
  4. पूर्व गर्म फिनोल लाल मुक्त RPMI माध्यम 2 मिमी एल glutamine और 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन (1 मिलीग्राम / पकवान) के साथ पूरक में आईजीजी opsonized-SRBCs Resuspend।

5. लाइव सेल वीडियो माइक्रोस्कोपी Phagocytosis परख

  1. इस तरह के एक कताई डिस्क सीओ 2 आर्द्रीकरण के लिए पानी के साथ एक बोतल से गुजर के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक हीटिंग चैम्बर के साथ सुसज्जित प्रणाली के रूप में एक confocal इमेजिंग प्रणाली का प्रयोग करें।
  2. प्रयोग करने से पहले हीटिंग कक्ष चालू करें phagocytosis परख की शुरुआत से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर खुर्दबीन मंच है। माइक्रोस्कोप और कंप्यूटर पर बारी, और इमेजिंग सॉफ्टवेयर लोड।
  3. ऐसी स्कैनिंग गति, Magnificat के रूप में इमेजिंग सेटिंग्स का अनुकूलनआयन, संकल्प, आदि क्षेत्र के प्रति और 60 से 120 मिनट के बीच हर मिनट छवि एक फ्रेम करने के लिए कम से कम एक सेल है।
    नोट: यहाँ, नमूना 63X लेंस के साथ 60 मिनट के दौरान एक फ्रेम हर मिनट imaged है।
  4. खुर्दबीन मंच पर इमेजिंग पकवान रखें। फोकस समायोजित करें और स्थान के लिए सिर्फ एक पूरे क्षेत्र में एचआईवी -1 से संक्रमित मैक्रोफेज खोजने के लिए। उचित / उत्तेजना उत्सर्जन इस्तेमाल किया इमेजिंग सिस्टम और जांच के आधार पर सेटिंग्स का उपयोग करें। Phagosomes निरीक्षण करने के लिए एक उज्ज्वल क्षेत्र (बीएफ) चैनल शामिल (चित्रा 1ii)। प्रेषित प्रकाश और जोखिम समय के प्रतिशत का समायोजन करके अलग चैनल छवियों की उपस्थिति का अनुकूलन।
    नोट: यहाँ, NLR4.3 एचआईवी -1 चुप iGFP (चित्रा 1 मैं) लेजर के 20% के साथ समय जोखिम के 50 मिसे के साथ एक 491 एनएम लेजर का उपयोग कर उत्साहित थी।
  5. इमेजिंग पकवान निकालें और 7 एक्स 10 6 SRBCs / डिश के लिए मिलीलीटर (चित्रा 1) में SRBC निलंबन के 1 मिलीलीटर जोड़ें।
  6. के लिए 500 XG पर अपकेंद्रित्रआरटी पर 2 मिनट phagocytosis सिंक्रनाइज़, इस centrifugation के अंत में समय रिकॉर्ड और चरण के लिए पकवान लौटने के लिए।
  7. कम से कम 1 घंटे के लिए हर मिनट - (आमतौर पर 20 विमानों 0.3 माइक्रोन से एक कदम दूरी के साथ सेल की मोटाई के दौरान) जेड के ढेर में ध्यान केंद्रित करने और कब्जा GFP और बीएफ छवियों का अनुकूलन। इस्तेमाल किया इमेजिंग प्रणाली के मूल फ़ाइल प्रारूप में समय चूक वीडियो सहेजें।
    नोट: ये लो, समय चूक फिल्मों मूल स्वरूप में बच गए, * .stk फ़ाइलें।

6. समय चूक फिल्मों का विश्लेषण

  1. वीडियो संपादन के लिए, नीचे मेनू "एप्लिकेशन" और टैब "की समीक्षा बहु आयामी डेटा" वीडियो संपादन सॉफ्टवेयर में पर ड्रॉप पर क्लिक करें।
    1. फ़ाइल खोलने के लिए, पर "आधार फाइल चुनें" फिर "निर्देशिका का चयन करें" पर क्लिक करें। "डेटा सेट" बॉक्स में, (.nd प्रारूप में) का विश्लेषण और "देखें" पर क्लिक करने के लिए अधिग्रहण का चयन करें। डेटा स्तंभ एक में समय के साथ एक तालिका में प्रतिनिधित्व कर रहे हैंलाइन में डी जेड योजना है।
    2. एक जेड-प्रक्षेपण (चित्रा 2, बाएं पैनल) में संक्रमण का प्रतिनिधित्व करने के लिए, "तरंग दैर्ध्य" बॉक्स में 491 एनएम तरंगदैर्ध्य चयन और के साथ "सभी विमानों" "Z प्रक्षेपण" टैब पर क्लिक करें।
    3. एक समय अनुक्रम का विश्लेषण, "तरंग दैर्ध्य" बॉक्स में बीएफ तरंगदैर्ध्य चयन और बाहरी SRBCs (चित्रा 2, लाल नोक), आंतरिक SRBCs (चित्रा 2, लाल वृत्त) और नाभिक भेद करने के लिए जेड अक्ष पर इष्टतम विमान का चयन करने के लिए ( चित्रा 2, नीले वृत्त)।
    4. वीडियो montages बचाने के लिए, "चयन [एक्स]" टैब पर और फिर "लोड छवि (ओं)" पर क्लिक करें। अंत में, .tif प्रारूप में भरी हुई छवियों को बचाने और उन्हें ImageJ सॉफ्टवेयर पर अगले खुला।
  2. नाभिक की स्थिति और विभिन्न phagosomes बीएफ चैनल में मनाया (चित्रा 3) को मापने के लिए ImageJ सॉफ्टवेयर पर प्लगइन "मैनुअल ट्रैकिंग" का प्रयोग करें।
    1. डॉवImageJ वेबसाइट पर "मैनुअल ट्रैकिंग" प्लगइन nload। ImageJ पर, (चित्रा 3, चरण 1 और 2) खोलने प्लगइन और छवि अनुक्रम का विश्लेषण किया जाए।
    2. इस तरह के "समय अंतराल" जो आसन्न फ्रेम के बीच समय की राशि का प्रतिनिधित्व करता है, और "एक्स / y अंशांकन" जो पिक्सेल प्रति दूरी का प्रतिनिधित्व करता है (चित्रा 3, चरण 3) के रूप में सेटिंग्स दर्ज करें।
      नोट: यहाँ, प्रत्येक फ्रेम और 0.205 मीटर की एक्स / y अंशांकन के बीच 1 मिनट का समय अंतराल के साथ छवि अनुक्रम बचाने के लिए क्योंकि 63X ज़ूम और 6.45 x 6.45 माइक्रोन 2 के पिक्सेल आकार के साथ एक कैमरे का इस्तेमाल किया जाता है।
    3. ट्रैकिंग शुरू करने के लिए, "ट्रैक जोड़ें" पर (चित्रा 3, चरण 4) क्लिक करें और पहली बार में एक SRBC केंद्र पर क्लिक करें जब यह भली भाँति है। अगले फ्रेम स्वचालित रूप से प्रकट होता है।
    4. सभी फ्रेम में SRBC केंद्र पर क्लिक करने के लिए समय के दौरान विभिन्न पदों (चित्रा 3, लाल बॉक्स में कदम 6) के लिए जारी।
      1. इसके केंद्र पर क्लिक करके सभी फ्रेम में अपनी स्थिति के लिए है नाभिक ट्रैक करने के लिए शुरू करो। अगली बार उनकी internalization की (फ्रेम), SRBCs के समारोह में अलग से एक के बाद एक (अपने केंद्र पर क्लिक करके) phagosomes ट्रैक। सुविधा बीएफ चैनल पर SRBC देखने के लिए, ट्रैकिंग (चित्रा 3, चरण 5) के दौरान "चमक और विपरीत" खिड़की का उपयोग करें।
    5. प्रत्येक SRBC ट्रैकिंग के बीच, एक नया ट्रैक करने के लिए "ट्रैक जोड़ें" पर (चित्रा 3, 4 चरण) पर क्लिक करें। ट्रैकिंग की संख्या दूसरे स्तंभ में बदल जाएगा, परिणाम तालिका के "ट्रैक n °" (चित्रा 3, चरण 6)।
    6. एक स्प्रेडशीट में डेटा को बचाने के विश्लेषण के अगले चरण के लिए जारी रखने के लिए।
  3. स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर का उपयोग करें (नाभिक और SRBCs के internalization के बाद पहले 5 मिनट के दौरान phagosomes के वेग की ओर SRBCs युक्त phagosomes के लिए कूच दूरी की गणना करने के लिए फाईआंकड़ा 4)।
    1. स्प्रेडशीट मेज और एक नई स्प्रेडशीट फ़ाइल को खोलें। केवल निम्नलिखित मानकों के इस नए फ़ाइल, समय, एक्स में स्थानांतरण और नाभिक और सभी SRBCs (चित्रा 4 ए) का समन्वय y-।
    2. केवल अपने निर्देशांक के साथ SRBCs और नाभिक के बीच दूरी की गणना करने के लिए, एक XY समन्वय विमान (चित्रा 4 बी) में नाभिक और एक SRBC पर विचार करें।
      नोट: दो बिंदुओं के बीच दूरी पथ उन्हें जोड़ने की लंबाई है। विमान में, SRBC और नाभिक के बीच की दूरी पाइथागोरस प्रमेय द्वारा दिया जाता है।
      1. सी (नाभिक और SRBC के बीच की दूरी) कर्ण और एक की लंबाई को दर्शाता है और ख अन्य दो पक्षों की लंबाई को निरूपित करते हैं, तो अभिव्यक्त पाइथागोरस समीकरण के रूप में पाइथागोरस प्रमेय:
        1 समीकरण
        नोट: एक ही समय में, orthonormal पर, क्षैतिज दूरीएक (एक्स नाभिक -x SRBC) है और ऊर्ध्वाधर दूरी बी (SRBC -y Y नाभिक) है।
      2. इस प्रकार, नाभिक और SRBC (चित्रा -4 ए, बैंगनी बॉक्स) द्वारा बीच दूरी की गणना:
        2 समीकरण
        नोट: एक्स / y अंशांकन द्वारा प्राप्त दूरी मूल्य (पिक्सेल में) गुणा माइक्रोन में दूरी है। इधर, एक्स / y अंशांकन 0.205 माइक्रोन है।
      3. प्रत्येक समय, नाभिक और प्रारंभिक दूरी (चित्रा 4C) को SRBC के बीच की दूरी घटाना।
      4. पहले 5 मिनट के लिए समय के खिलाफ माप प्लॉट। भूखंड के लिए एक रेखीय ट्रेंड लाइन (चित्रा 5 ए) लागू करें और रैखिक ट्रेंड लाइन है कि SRBC internalization के बाद पहले 5 मिनट के दौरान नाभिक की ओर फेगोसोम वेग का प्रतिनिधित्व करता है के ढलान का निर्धारण।
      5. डेटा मुक़ाबला की औसत और सांख्यिकीय त्रुटि की गणना करने के लिएवेग मूल्यों और उन्हें एक उचित रूप में साजिश उपयुक्त सॉफ्टवेयर (चित्रा 5 ब) का उपयोग।

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Representative Results

एचआईवी -1 से संक्रमित और गैर संक्रमित hMDMs द्वारा एफसीआर की मध्यस्थता phagocytosis यहाँ वर्णित है मॉडल लक्ष्य के रूप में आईजीजी opsonized SRBCs (चित्रा 1) का उपयोग। इस प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण कदम hMDMs की तैयारी और एचआईवी -1 संक्रमण के साथ कर रहे हैं। दरअसल, उपज और विभेदित मैक्रोफेज की गुणवत्ता दाताओं के बीच बदलता है, साथ ही 10-40% की सीमा में क्षमता के साथ संक्रमण की दर। इसके अलावा, आईजीजी opsonized-SRBCs की तैयारी भी एरिथ्रोसाइट्स को नुकसान पहुँचाए से बचने के लिए, क्योंकि यह उनकी मान्यता प्रेरित और मलबे के रूप में के बजाय एफसीआर की मध्यस्थता phagocytosis द्वारा तेज कर सकता है महत्वपूर्ण है। इष्टतम opsonization कुशल phagocytosis को सुनिश्चित करेगा।

रहने वाले एचआईवी संक्रमित मैक्रोफेज में फेगोसोम आंदोलन बीएसएल 3 प्रयोगशाला में एक कताई डिस्क confocal खुर्दबीन पर बीएफ चैनल के साथ वास्तविक समय में विश्लेषण किया है। बीएफ चैनल की सेटिंग में महत्वपूर्ण टी रहे हैंओ नाभिक (चित्रा 2, नीले वृत्त) और बाहरी भाँति SRBCs (चित्रा 2, लाल हलकों) से (चित्रा 2, लाल तीर) भेदभाव के लिए देखते हैं। बीएफ माइक्रोस्कोपी सरलतम ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी रोशनी तकनीक phagosomes, जो बाहरी SRBCs से कम refringent हैं देखने के लिए पर्याप्त माना जाता है।

छवि दृश्यों के अधिग्रहण के बाद पहला कदम ImageJ सॉफ्टवेयर पर मैनुअल ट्रैकिंग (चित्रा 3) है। इस बिंदु पर, विशेष रूप से लंबे और थकाऊ हो सकता है क्योंकि यह सब छवि दृश्यों के लिए एक एक करके प्रत्येक फेगोसोम, एक ट्रैक करने के लिए बेहतर है और यह माना जाता है कि प्रयोगों के लिए एक बड़ा पर्याप्त नमूना आकार तक पहुँचने के लिए शर्त के अनुसार कम से कम 3 दाताओं के साथ दोहराया जाना चाहिए सांख्यिकीय विश्लेषण (3 अलग दाताओं के साथ कम से कम 30 phagosomes)।

दूसरे चरण के विश्लेषण हैस्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर में प्रत्येक भाँति SRBCs (चित्रा 4) के लिए internalization के बाद पहले 5 मिनट के दौरान फेगोसोम वेग की गणना करने के लिए। इस के लिए, हम प्रत्येक फेगोसोम दूरी समय के खिलाफ पहले 5 मिनट के दौरान कूच के लिए साजिश है। एक प्रतिनिधि उदाहरण चित्रा 5 ए पर गैर संक्रमित hMDMs में दिखाया गया है। अगले हम फेगोसोम, जो रेखीय प्रतिगमन वक्र के ढलान है के वेग प्राप्त करते हैं। 0.5384 माइक्रोन / मिनट की एक वेग इस फेगोसोम के लिए मिला था।

ध्यान से, यह फेगोसोम वेग, या बाद अब timescales पर वेग का विश्लेषण करके यहाँ के रूप में या Dumas एट अल। 8 में वर्णित है, internalization के बाद पहले कुछ मिनट के दौरान विश्लेषण करने के लिए संभव है। हमारे अध्ययन में, हम चाहते हैं कि पहले 5 एचआईवी संक्रमित hMDMs में internalization के बाद मिनट के दौरान फेगोसोम वेग गैर संक्रमित hMDMs (चित्रा 5 ब) की तुलना में है कम मनाया।


चित्रा 1. नियंत्रण और phagocytosis इमेजिंग के लिए एचआईवी संक्रमित hMDMs की तैयारी। Monocytes आसंजन द्वारा शुद्ध कर रहे हैं (1) और एम सीएसएफ के साथ 11 दिनों के लिए मैक्रोफेज में भेदभाव (2)। अगले, hMDMs NLR4.3 एचआईवी 1Gag-iGFP मैं) के साथ एक MOI में 0.02 और 0.03 के बीच 8 दिनों के लिए 2 दिन धोने से संक्रमित होते हैं (3)। (4) आईजीजी opsonized SRBCs 1 घंटे के दौरान phagocytosis के लिए hMDMs पर जोड़ा जाता है। SRBCs युक्त phagosomes बीएफ चित्र पर पता लगता है (लाल वृत्त, द्वितीय)। छवियाँ सरवियर छवियों डेटाबेस से कर रहे हैं। बार = 10 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा के दौरान 2. वास्तविक समय अधिग्रहणप्रतिनिधि नियंत्रण और एचआईवी संक्रमित hMDMs द्वारा phagocytosis। hMDMs तैयार कर रहे हैं और संक्रमित चित्रा 1 में वर्णित है। NLR4.3 एचआईवी 1Gag-iGFP संक्रमित कोशिकाओं 491 एनएम लेजर के साथ पाया जाता है। कताई डिस्क confocal छवियों के Z ढेर हासिल कर लिया और दोनों माइक्रोस्कोप अधिग्रहण सॉफ्टवेयर और ImageJ (बाएं पैनल) का उपयोग विश्लेषण कर रहे हैं। बीएफ छवियों की गैलरी एक गैर संक्रमित (शीर्ष पैनल 1 मूवी के लिए इसी) और एक NLR4.3 एचआईवी 1Gag-iGFP संक्रमित (नीचे के पैनल फिल्म 2 के लिए इसी) सेल एक 45 मिनट के अधिग्रहण के दौरान (समय के साथ 46 छवियों HH संकेत के रूप में प्रतिनिधित्व : मिमी)। कोशिका झिल्ली (बिंदीदार काला लाइन), नाभिक (नीला वृत्त), बाहरी SRBCs (उनमें से कुछ लाल तीर के साथ संकेत दिया) और आंतरिक SRBCs (उनमें से कुछ लाल हलकों के साथ संकेत) बीएफ चित्र पर पता लगता है। बार = 10 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. ImageJ पर मैनुअल ट्रैकिंग प्लगइन के साथ छवि विश्लेषण के लिए निर्देश कदम। बीएफ चैनल (2) में "मैनुअल ट्रैकिंग" प्लगइन (1) खोलने और समय चूक वीडियो लोड करने के बाद, (3) अधिग्रहण के मापदंडों दर्ज करें। "ट्रैक जोड़ें" (4) और चुने फेगोसोम (6, लाल बॉक्स) की एक्स और वाई पदों के साथ एक नई विंडो प्राप्त करने के लिए एक फेगोसोम (5) पर क्लिक करके ट्रैकिंग की माप प्रारंभ पर क्लिक करें। सुविधा के लिए समय अनुक्रम पर फेगोसोम का पालन करने के लिए, चमक और विपरीत (5 ') बदलती हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
आकृति 4. स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर में फेगोसोम पलायन वेग के डेटा विश्लेषण के लिए निर्देश कदम। (ए) इकट्ठा एक स्प्रेडशीट तालिका में एक्स और वाई नाभिक की स्थिति और प्रत्येक फेगोसोम (लाल बॉक्स)। एक और स्तंभ (बैंगनी बॉक्स) में, फेगोसोम और पाइथागोरस प्रमेय के साथ नाभिक जहां सी और नाभिक और SRBC और एक के बीच एक समकोण त्रिकोण के अन्य दो पक्षों की लंबाई ख लंबाई (प्रतिनिधित्व के बीच दूरी की गणना बी)। (सी) अंत में, समय 0 पर प्रारंभिक दूरी से एक निश्चित समय पर SRBC और नाभिक के बीच की दूरी को घटाकर दूरी हर बार (हरे बॉक्स) पर phagosomes से कूच की गणना का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें यह आंकड़ा।

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चित्रा 5. नियंत्रण और एचआईवी संक्रमित hMDMs में फेगोसोम पलायन वेग की मात्रा। (ए) प्रत्येक SRBC और सिर्फ SRBC internalization के बाद के लिए, नाभिक की ओर कूच किया दूरी मापी और समय के खिलाफ साजिश रची है। पहले 5 मिनट के दौरान उसके वेग स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर में रेखीय प्रतिगमन उपयोग कर की गणना की जाती है। एक प्रतिनिधि प्रयोग (चित्रा 3-4 की आंतरिक SRBC) दिखाया गया है। (बी) के पहले 5 मिनट के दौरान सभी वेग एचआईवी संक्रमित कोशिकाओं में गैर संक्रमित (5 दाताओं) में 66 phagosomes और 60 phagosomes (4 दाताओं) के लिए मापा जाता है। डेटा ± SEM के मतलब का प्रतिनिधित्व करते हैं (वेल्च के सुधार के साथ unpaired छात्र टी परीक्षण; **, पी <0,01)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


फिल्म 1: एक प्रतिनिधि गैर संक्रमित मैक्रोफेज में फेगोसोम आंदोलन। । (राइट डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें) opsonized लाल रक्त कोशिकाओं के आंदोलन प्रति मिनट एक छवि (: मिमी के रूप में HH संकेत समय के साथ 46 छवियों) के साथ phagocytosis के 45 मिनट के दौरान बीएफ चैनल में खोजा गया था। बार = 10 माइक्रोन।

फिल्म 2
फिल्म 2: एक प्रतिनिधि एचआईवी संक्रमित मैक्रोफेज में फेगोसोम आंदोलन। (राइट डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें)। एचआईवी -1 (NLR4.3 एचआईवी -1 चुप iGFP) -infected मैक्रोफेज 491 लेजर के साथ रोशनी के बाद पहचान की गई। opsonized लाल रक्त कोशिकाओं के आंदोलन के दौरान 45 बीएफ चैनल में पाया गया थाप्रति मिनट एक छवि (: मिमी के रूप में HH संकेत समय के साथ 46 छवियों) के साथ phagocytosis की मि। बार = 10 माइक्रोन।

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Discussion

इस तकनीक को कई महत्वपूर्ण कदम है। सबसे पहले, एचआईवी -1 से hMDMs की तैयारी और उनके संक्रमण के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि संक्रमण का प्रतिशत दाता निर्भर है। ध्यान से, हम, क्योंकि मैक्रोफेज संभावित विवो में वायरस द्वारा सामना की स्थिति अच्छी तरह से अब तक नहीं बताया गया है कि मैक्रोफेज के संक्रमण से पहले इन विट्रो में ध्रुवीकरण नहीं कर रहे हैं का उपयोग करने का फैसला किया है। हम कई सतह मार्करों की अभिव्यक्ति की जाँच की, यह दर्शाता है कि मैक्रोफेज न एम 1 और न ही M2 हैं, और सीडी 4 और CCR5 की अभिव्यक्ति सत्यापित। संक्रमण दर चर रहे हैं और 10 से 40%, और कभी कभी कम करने के लिए सीमा। यह चर संक्रमण की दर कारण है कि यह माइक्रोस्कोप के तहत एक एचआईवी -1 से संक्रमित फ्लोरोसेंट hMDM खोजने के लिए मुश्किल हो सकता है। इसके अलावा, समय तुरंत centrifugation कदम के बाद एक एचआईवी -1 संक्रमित कोशिका खोजने की जरूरत भी अधिग्रहण शुरू करने में देरी करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। Phagocytosis synchronizatio के बिना शुरू किया जा सकता हैबंधन और centrifugation द्वारा उत्पन्न तेज की एन। हालांकि, इस विकल्प SRBCs कि कोशिकाओं तक पहुँचने से पहले नाव के लिए नहीं चुना गया था। यह मोतियों के साथ एक अच्छा विकल्प हो सकता है। समय संक्रमित कोशिकाओं को खोजने की जरूरत को कम करने के लिए, gridded गिलास नीचे व्यंजन phagocytosis परख शुरू करने के लिए आगे बढ़ने से पहले एचआईवी -1 से संक्रमित hMDMs की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। चुने हुए एचआईवी संक्रमित कोशिकाओं है कि उनके आसपास SRBCs के एक "उचित" संख्या तो जल्दी से अधिग्रहण शुरू करने के लिए चुना जाएगा। "वाजिब SRBC राशि" सेल के अनुसार कम से कम 10 SRBCs और भी phagosomes मास्किंग से बाहरी SRBCs को रोकने के लिए कई नहीं करने के लिए पर्याप्त का मतलब है।

इसके अलावा, यह opsonization शर्तों का अनुकूलन करने के लिए सुनिश्चित करने के लिए कुशल मान्यता और तेज कोशिकाओं से देखते हो जाएगा महत्वपूर्ण है। एफसीआर की मध्यस्थता phagocytosis विधान है और नियमित रूप से hMDMs एफसीआर की मध्यस्थता तेज में बहुत कुशल हैं। इसके अलावा, सही phagocytosis के लिए, शर्तों ख के लिए हैई हीटिंग चैम्बर के साथ इष्टतम 37 डिग्री सेल्सियस पर और 5% सीओ 2। यह phagocytosis परख शुरू करने से पहले गैस और तापमान की जांच करने के लिए आवश्यक है।

अंत में आंतरिक phagosomes से बाहरी SRBCs के भेदभाव और बीएफ चैनल में नाभिक की पहचान ImageJ सॉफ्टवेयर पर विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण हैं। यही कारण है कि इस चैनल की सेटिंग में महत्वपूर्ण हैं। यह देखते हुए कि फोकस अधिग्रहण के दौरान खो दिया जा सकता है, हम फेगोसोम वेग का विश्लेषण करने के लिए इष्टतम विमान है सुनिश्चित करने के लिए जेड अक्ष में छवियों के ढेर प्राप्त करने के लिए सलाह देते हैं। यह प्रत्येक कक्ष के लिए सभी भली भाँति SRBCs विश्लेषण करने के लिए एक क्षेत्र में एक एकल कोशिका है करने के लिए बेहतर है। क्यों लेंस चुनाव महत्वपूर्ण है और यहाँ हम सेल के आकार के एक समारोह के रूप में 2 लेंस का इस्तेमाल किया है यही कारण है। हमें एक 100X लेंस के साथ phagosomes ट्रैक करने के लिए, लेकिन कभी कभी कोशिकाओं बहुत बड़ी है तो हम एक 63X लेंस करने के लिए स्विच करने के लिए किया था के लिए यह आसान था। लेंस का चुनाव भी महत्वपूर्ण है जब IM के बारे में सोचउम्र विश्लेषण ImageJ और एक स्प्रेडशीट का उपयोग कर तालिका क्योंकि दोनों लेंस अलग एक्स / y calibrations फंसाना।

इस तकनीक के पहले सीमा नमूने सांख्यिकीय महत्वपूर्ण परिणाम है का अधिग्रहण करने की आवश्यकता है की संख्या है। हम दाता प्रति कई फिल्में लेकिन हालत प्रति कोशिकाओं आमतौर पर 2 से अधिक नहीं, पकवान प्रति रजिस्टर कर सकते हैं। इस सीमा के समाधान संख्या में वृद्धि करने के नमूने अधिक दाताओं के साथ प्रयोग को दोहराने के लिए या माइक्रोस्कोप के आधार पर बहु ​​बिंदु XY इमेजिंग कर रहे हैं। पिछले विधि की असुविधा मोटर चालित XYZ स्कैनिंग के दौरान ध्यान केंद्रित करने की क्षमता का नुकसान हुआ है। एक और सीमा वेग के मैनुअल मात्रा का ठहराव लंबे और थकाऊ है एक स्वचालित विश्लेषण की तुलना में है। पूर्ण स्वचालित विश्लेषण के लिए, यह fluorescently लेबल कणों का उपयोग करने के लिए आवश्यक है, के रूप में अग्रणी अध्ययन मछली त्वचा जिलेटिन करने के लिए मिलकर लेटेक्स मोती कि Matlab सॉफ्टवेयर पर एक ट्रैकिंग एल्गोरिथ्म के साथ पीछा किया गया था के साथ 4 में रिपोर्ट। Fluorescently एंटीबॉडी या मोती opsonizing एक विकल्प हो सकता लेबल, लेकिन वे विरंजन, जो एक समस्या है, जब 1 घंटे के लिए phagocytosis रिकॉर्डिंग के अधीन हैं। अन्य अध्ययनों लेटेक्स मोती 13,14 के उपयोग की रिपोर्ट। हम फिर भी गौर किया है कि लेटेक्स मोतियों की internalization कम आसानी से SRBCs के तेज से पता चला है। दरअसल intracellular प्रवास के कैनेटीक्स के शुरुआती बिंदु phagosomal आंदोलन के शुरू में दोष का पता लगाने के लिए पता करने के लिए महत्वपूर्ण है।

यहाँ वर्णित विधि का मुख्य लाभ यह अपनी सादगी और एक मुक्त सॉफ्टवेयर का इस्तेमाल होता है। ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग मैनुअल ट्रैकिंग प्रदर्शन करने के लिए, हम, फेगोसोम और नाभिक की स्थिति का प्रयोग किया है इस प्रकार, हम पाइथागोरस प्रमेय का उपयोग फेगोसोम और नाभिक के बीच की दूरी की गणना करने के लिए, और एक के बाद वेग है करने के लिए की जरूरत स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर में रेखीय प्रतिगमन। यह 3 चरणों विश्लेषण & # के साथ एक कदम है, पर नज़र रखने के लिए कम किया जा सकता, बर्फीले सॉफ्टवेयर पर34;। मैनुअल ट्रैकिंग "प्लगइन उत्पादन के आंकड़ों हैं तो सीधे कण के वेग का पालन करने के लिए, और अधिक विशेष रूप से (जैसे phagosomes और नाभिक के रूप में) 2 समूहों के बीच सापेक्ष वेग अंत में, हम में से गणना सापेक्ष वेग को मापने के लिए अनुमति देता है। एक कण कण एक और भी है कि चलती हो सकता है की तुलना में।

इस रहने की समय व्यतीत हो जाने के विश्लेषण के संभावित भविष्य के आवेदन उज्ज्वल क्षेत्र में दिखाई कणों, बैक्टीरिया, कवक, या सेल मलबे की तरह हो सकता है। अलग उपचार या संक्रमण की स्थिति phagosomal परिपक्वता और मैक्रोफेज की सक्रियता के गुणों को संशोधित करने के लिए सेल केंद्र की ओर phagosomal आंदोलन के इस तरह के एक परिष्कृत विश्लेषण करने से लाभ होगा पर्याप्त है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish Corning 353003 For viral production
Glass Bottom Dishes 35 mm uncoated 1.5 MatTek corporation P35G-1.5-14-C Case For acquisition
Falcon Tissue Culture Plates 6-well Thermo Fischer Scientific Corning. Inc. 353934 For human monocyte-derived macrophages
Ficoll-Plaque PLUS Dominique Dutscher 17-1440-03 a neutral, highly branched, high-mass, hydrophilic polysaccharide in solution for density centrifugation
DPBS, no calcium, no magnesium Thermo Fischer Scientific 14190-094 RT
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1x, liquid (High Glucose) GIBCO, Molecular probes 31966-021 Conserved at 4 °C ; for HEK cells culture
RPMI 1640 medium GLUTAMAX  Supplement Life technologies 61870-010 Conserved at 4 °C; for hMDMs culture
Fœtal Calf Serum (FCS)  Eurobio CVFSVF0001 Conserved at -20 °C ; decomplemented
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Thermo Fischer Scientific 15140-122 Conserved at -20 °C ; for hMDMs culture
RPMI 1640 medium, no phenol red (10x 500 ml) Life technologies 11835-105 Warm in 37 °C water bath before use ; for phagocytosis assay
FuGENE6 Transfection Reagent Promega E2692 Conserved at 4 °C ; for viral production
Sheep red blood cells (SRBCs) Eurobio DSGMTN00-0Q Conserved in Alsever buffer at 4 °C before use
Anti-sheep red blood cells IgG MP Biomedicals 55806 Conserved at 4 °C
Bovine Serum Albumin heat shock fraction, pH 7, ≥98%  Sigma A7906 Conserved at -20 °C
Inverted microscope DMI600 Leica
Confocal Spinning Disk Unit  CSU-X1M1 Yokogawa
491 nm 50 mW laser COBOLT CALYPSO
HCX PL APO CS Objectif Leica Objective lens ; Magnification 100X ; Numerical aperture 1.40 ; Immersion oil
CoolSnap HQ2 (FireWire) Camera Photometrics Pixel size 6.45 µm x 6.45 µm ; Definition 1,392 x 1,040 ; Encoding the image in 14 Bit
Metamorph 7.7.5 software Molecular Devices For the control of the microscope
GraphPad Prism software For the statistics analysis

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक 115 मानव monocyte व्युत्पन्न मैक्रोफेज phagocytosis गड़बडिय़ों आंदोलन वेग फेगोसोम लाइव सेल इमेजिंग मैनुअल ट्रैकिंग ह्यूमन इम्यूनो वायरस टाइप 1
फेगोसोम प्रवासन और वेग लाइव प्राथमिक मानव मैक्रोफेज एचआईवी -1 से संक्रमित में मापा
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Lê-Bury, G., Deschamps, C., Dumas, A., Niedergang, F. Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1. J. Vis. Exp. (115), e54568, doi:10.3791/54568 (2016).

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