Protocol
Protokollen skal udføres i nøje overensstemmelse med nationale og internationale love og lokale bestemmelser. Blod fra raske donorer, der gav deres samtykke til at donere blod til forskningsformål er indhentet fra blodtransfusion Centers, som institutionerne har indgået aftale. Særlige beskyttelser skal udvises forsigtighed ved brug af humant blod. Eksperimenter med HIV-1 skal udføres i et biosikkerhed niveau 3 eller 2 (BSL-3 eller 2) laboratorium i overensstemmelse med lokal lovgivning.
1. Fremstilling af human monocyt-afledte makrofager (hMDMs) ved densitetsgradientcentrifugering og Valg efter Adhæsion
- Start med frisk blod fra raske donorer (9 ml). Fortynd hele volumen af frisk blod med steril 1X phosphatpufret saltopløsning (PBS) uden Ca2 + og Mg2 + til opnåelse af et slutvolumen på 70 ml, og der tilsættes forsigtigt det fortyndede blod i to 50 ml koniske rør (35 ml pr rør) oven i 15 ml af eneutral, stærkt forgrenede, høj masse, hydrofilt polysaccharid i opløsning allerede i hvert rør.
- Centrifuger begge rør af blod ved 537 x g i 20 min ved 20 ° C uden bremse. Samles de mononukleære blodceller (PBMC'er) perifere indeholdt i overskyet celle ring ved grænsefladen og overføre dem til en ny 50 ml rør indeholdende 15 ml 1x PBS uden Ca2 + og Mg2 +.
- Centrifuger cellerne ved 218 x g i 5 min ved 20 ° C, og pellet resuspenderes i 45 ml 1x PBS uden Ca2 + og Mg2 +.
- Centrifuger cellerne ved 218 x g i 5 minutter ved 20 ° C, pellet resuspenderes i 10 ml 1x PBS uden Ca2 + og Mg2 +, og tæl cellerne ved fortynding til en endelig fortynding på 1/200 i trypanblåt.
- Centrifugeres cellerne ved 218 x g i 5 minutter ved 20 ° C, og pellet resuspenderes i RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640-medium suppleret med 2 mM L-glutamin og 100 ug / ml Penicillin-streptomycin at have 7 x 10 6 PBMC'er per brønd i 2 ml medium i hver brønd af en 6 brønd-plade.
- Pladerne inkuberes ved 37 ° C med 5% CO2 i 2 timer. Efter 2 timer monocytterne vil have klæbet til plast.
- At tillade frisk isolerede monocytter til at differentiere til hMDMs, aspireres mediet og erstatte det med 2 ml hMDM medium (RPMI 1640, 10% decomplemented føtalt kalveserum (FCS), 2 mM L-glutamin og 1% penicillin-streptomycin) suppleret med rekombinant humant makrofagkolonistimulerende faktor (RHM-CSF) i en endelig koncentration på 10 ng / ml.
- Inkuber cellerne ved 37 ° C med 5% CO2 i 11 dage (figur 1).
- På dag 11 fjerne mediet og vask 2 gange med 2 ml kold hMDM medium per brønd. Næste vask hver brønd 2 gange med 1 ml kold 1x PBS.
- Aftagning fuldt differentierede hMDMs, vask hver brønd 1 gang med 1 ml kold 1x PBS med 2 mM ethylenediaminetetraacetatic syre (EDTA) og inkuber cellerne i 2 ml kold 1x PBS med 2 mM EDTA per brønd i 15-60 minutter ved 4 ° C.
BEMÆRK: Alternative metoder til at løsrive eksisterer cellerne (fx trypsin eller trypsin-lignende aktiviteter), der kan give gode resultater 11. - Efter løsrivelse (afsluttet ved pipettering forsigtigt op og ned i brønden), indsamle cellerne og læg dem i et 50 ml rør på is indeholdende 10 ml kold hMDM medium.
- Centrifuger cellerne ved 218 x g i 5 minutter ved 20 ° C, pellet resuspenderes i 10 ml kold hMDM medium, og tæl cellerne ved fortynding 1/20 i trypanblåt.
- Frø cellerne ved 1 x 10 6 hMDMs pr mikroskopi kvalitet glas 35 mm bund skål og inkuberes pladerne ved 37 ° C med 5% CO2 i 1 dag.
2. Produktion og Kvantificering af HIV-1 Virale Stocks
BEMÆRK: NLR4.3 HIV-1 Gag-iGFP (grønt fluorescerende protein), der bærer en R5-tropisk kuvert, gave fra M. SchindlER 10 anvendes til at inficere makrofager og se inficerede celler i realtid.
- Producere virale stamopløsninger ved transfektion af humane embryonale nyre 293T-celler (2 x 10 6 i 100 mm skål) med 6 ug af det tilsvarende provirale DNA ved anvendelse af et kommercielt transfektionsreagens.
- Kvantificer infektivitet af virusstammer hjælp indikatorcellerne HeLa TZM-bl (der bærer ß-galactosidase-gen under kontrol af HIV-1 LTR) ved anvendelse seriefortyndinger af de virale lagre efterfulgt af en ß-galactosidase farvning af cellerne og tælling af blå celler 12.
3. Infektion af hMDMs med HIV-1
- Tilsæt virus ved en infektionsmultiplicitet (MOI) 0,02-0,03 i 1 ml hMDM medium til hMDMs (celler udpladet i 1,13). Til kontrolbrønde kun tilføje 1 ml hMDM medium og inkuberes retterne ved 37 ° C med 5% CO2 i 2 dage (figur 1).
- På dag 2 vaske cellerne med hMDM withium 3 gange, og der tilsættes 1 ml frisk hMDM medium per fad. Inkuber cellerne ved 37 ° C med 5% CO2 i 6 dage (figur 1).
4. opsonisering af røde blodceller fra får
- Til fremstilling af 7 x 10 6 SRBC'er pr skål, vaske SRBC'er to gange i 100 pi opløsning indeholdende 0,1% bovint serumalbumin (BSA) i 1 x PBS med centrifugering ved 600 xg i 4 min.
- Resuspender vaskede SRBC'er i 500 pi 1x PBS / BSA 0,1% med kanin IgG anti-SRBC'er ved en sub-agglutinerende koncentration per 5 pi SRBC'er og inkuberes med rotation ved stuetemperatur i 30 minutter.
BEMÆRK: For at bestemme sub-agglutinerende koncentration af anti-SRBC'er IgG, forberede serielle fortyndinger af IgG (stamkoncentration på 13,1 mg / ml) fra 1/50 til 1 / 25.600 i 20 pi i en 96-brønds plade. Tilsæt 2 x 10 6 SRBC'er i 20 ul i hver brønd og sætte pladen i et mørkt rum under flere time. Koncentrationen af sub-agglutinerende erfortynding af brønden lige før godt med agglutination (IgG + SRBC'er danner et netværk). - Efter rotation, centrifugere IgG-opsoniseret-SRBC'er ved 600 xg i 4 min og vask med 100 pi 1x PBS / BSA 0,1% med centrifugering ved 600 xg i 4 min.
- Resuspendere IgG-opsoniseret-SRBC'er i forvarmet Phenolrødt-frit RPMI-medium suppleret med 2 mM L-glutamin og 1% penicillin-streptomycin (1 ml / skål).
5. Levende Cell Video Microscopy Fagocytose Assay
- Brug et konfokalt afbildningssystem såsom en roterende skive, der er udstyret med et varmekammer ved 37 ° C med CO 2 passerer gennem en flaske med vand til befugtning.
- Tænd varmekammeret før forsøget for at have objektbordet ved 37 ° C før starten af fagocytose assay. Tænd mikroskop og computer, og indlæse imaging software.
- Optimer indstillinger billedbehandling såsom scanning hastighed, Magnification, opløsning osv at have mindst én celle pr område og til ét billede hvert minut mellem 60 til 120 min.
BEMÆRK: Her prøven afbildes en ramme hvert minut under 60 min med 63x objektiv. - Placer imaging fadet på mikroskopet scenen. Juster fokus, og det sted for at finde bare en hel HIV-1 inficerede makrofager i marken. Brug relevante indstillinger excitation / emission baseret på det anvendte imaging system og sonde. Omfatte et lyst felt (BF) kanal til at observere fagosomer (fig 1ii). Optimere udseendet af de forskellige kanal billeder ved at justere procentdelen af transmitteret lys og eksponeringstid.
BEMÆRK: Her NLR4.3 HIV-1 Gag-iGFP var begejstret ved hjælp af en 491 nm laser med 50 ms af tid eksponering med 20% af laser (Figur 1i). - Fjern imaging fad og tilsæt 1 ml SRBC suspension på 7 x 10 6 SRBC'er / ml til fadet (figur 1).
- Centrifuger ved 500 x g i2 minutter ved stuetemperatur til at synkronisere fagocytose, registrere den tid i slutningen af denne centrifugering og returnere skålen til scenen.
- Optimere fokus og opsamling GFP og BF billeder i Z-stakke (hele tykkelsen af cellen med en step-afstand på 0,3 um - som regel 20 fly) hvert minut i mindst 1 time. Spar tid-lapse video i native fil-format af det anvendte billeddannende system.
BEMÆRK: Her blev time-lapse film gemt i oprindelige format, * .stk filer.
6. Analyse af Time-lapse film
- For videoredigering, skal du klikke på drop down menuen "Apps" og på fanebladet "anmeldelse Multi Dimensional data" i video redigeringssoftware den.
- For at åbne filen, skal du klikke på "Vælg base File" og derefter på "Vælg Directory". I boksen "Datasæt", vælg købet til at analysere (i .nd format) og klik på "Vis". Dataene er vist i en tabel med tiden i kolonnen end Z-plan i linjen.
- At repræsentere infektion i en Z-projektion (Figur 2, venstre paneler), vælg 491 nm bølgelængde i feltet "bølgelængder" og klik på "Z projektion" fanen med "alle planer".
- At analysere en tid sekvens, skal du vælge BF bølgelængde i feltet "bølgelængder", og vælge den optimale flyet på Z-aksen til at skelne eksterne SRBC'er (Figur 2, rød pilespids), interne SRBC'er (Figur 2, rød cirkel) og kernen ( Figur 2, blå cirkel).
- For at gemme video montager, klik på "Selection [X s]" fanen og derefter på "Load Image (s)". Endelig gemme de indlæste billeder i .tif format og åbne dem næste på ImageJ software.
- Brug plugin "Manuel Tracking" på ImageJ software til at måle positionen af kernen og de forskellige fagosomer observeret i BF kanal (figur 3).
- Download "Manuel Sporing" plugin på ImageJ hjemmeside. På ImageJ Åbn plugin og billedet sekvens, der skal analyseres (Figur 3, trin 1 og 2).
- Indtast indstillinger som "Time Interval", som repræsenterer mængden af tid mellem tilstødende frames, og "x / y kalibrering", som repræsenterer afstanden per pixel (Figur 3, trin 3).
BEMÆRK: Her gemme billedet sekvens med et tidsinterval på 1 min mellem hver ramme og x / y kalibrering af 0,205 um fordi der anvendes den 63X zoom og et kamera med pixelstørrelse på 6,45 x 6,45 um 2. - For at starte sporingen, skal du klikke på "Tilføj track" (Figur 3, trin 4) og klik på en SRBC center på første gang, når det er internaliseret. Den næste ramme vises automatisk.
- Fortsæt med at klikke på SRBC center i alle rammer til at have forskellige positioner i den tid (Figur 3, trin 6 i rød boks).
- Begynd at spore kernen at dens holdning i alle rammer ved at klikke på dens centrum. Næste spore fagosomer (ved at klikke på dens centrum) én efter én på det tidspunkt (ramme) af deres internalisering, forskellige i funktion af SRBC'er. For nemheds skyld at se SRBC på BF-kanal, skal du bruge "Brightness & kontrast" vinduet under sporing (Figur 3, trin 5).
- Mellem hver SRBC sporing, skal du klikke på "Tilføj track" (Figur 3, trin 4) at have et nyt spor. Antallet af sporingen vil blive ændret i den anden kolonne, "Track n °" af resultater tabel (Figur 3, trin 6).
- Gemme dataene i et regneark for at fortsætte til næste trin i analysen.
- Brug regneark til at beregne den tilbagelagte afstand af fagosomer indeholdende SRBC'er mod kernen og hastigheden af fagosomer under de første 5 min efter internalisering af SRBC'er (Figur 4).
- Åbn regnearket bordet og et nyt regneark fil. Overførsel til denne nye fil følgende parametre kun, tid, x- og y- koordinat for kernen og alle SRBC'er (figur 4A).
- For at beregne afstanden mellem SRBC'er og kernen med kun deres koordinater, overveje kernen og en SRBC i en XY-koordinatsystem plan (figur 4B).
BEMÆRK: Afstanden mellem to punkter er længden af stien forbinder dem. I planet, er afstanden mellem SRBC og kernen afgivet Pythagoras.- Hvis c (afstanden mellem kernen og SRBC) angiver længden af hypotenusen og a og b angiver længden af de to andre sider, udtrykke Pythagoras 'læresætning som Pythagoras ligning:
BEMÆRK: Samtidig, på ortonormale, den vandrette afstanda er (x kerne -x SRBC) og den vertikale afstand b er (y kerne -y SRBC). - Således at beregne afstanden mellem kernen og SRBC (figur 4A, lilla boks) ved:
BEMÆRK: Multiplicer den opnåede afstandsværdi (i pixel) ved x / y kalibrering for at have afstanden i um. Her ix / y kalibrering er 0,205 um. - På hvert tidspunkt, trække afstanden mellem kernen og den SRBC til den oprindelige afstand (figur 4C).
- Plot målingen mod tiden for de første 5 min. Anvende en lineær trend-linie (figur 5A) til plottet og bestemme hældningen af den lineære trend-linie, der repræsenterer fagosomet hastighed mod kernen i den første 5 min efter SRBC internalisering.
- Sætvis data til at beregne den gennemsnitlige og statistiske fejl afde velocity værdier og plot dem i en passende form ved hjælp af passende software (figur 5B).
- Hvis c (afstanden mellem kernen og SRBC) angiver længden af hypotenusen og a og b angiver længden af de to andre sider, udtrykke Pythagoras 'læresætning som Pythagoras ligning:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
FcR-medieret fagocytose med HIV-1-inficerede og ikke-inficerede hMDMs beskrives her ved hjælp af IgG-opsoniseret SRBC'er som model mål (figur 1). De kritiske trin i denne protokol er udarbejdelse af hMDMs og infektion med HIV-1. Faktisk udbyttet og kvaliteten af differentierede makrofager varierer blandt donorerne, samt infektion sats med effektivitetsgevinster i størrelsesordenen 10-40%. Hertil kommer, at udarbejdelsen af IgG-opsoniseret-SRBC'er er også vigtigt at undgå at beskadige erythrocytterne, fordi dette kunne fremkalde deres anerkendelse og optagelse som vragrester i stedet for ved FcR-medieret fagocytose. Optimal opsonisering vil sikre en effektiv fagocytose.
Fagosom bevægelse i levende HIV-inficerede makrofager analyseres i realtid med BF kanal på en roterende skive konfokalt mikroskop i BSL-3 laboratorium. Indstillingerne for BF-kanalen er kritiske to se kernen (figur 2, blå cirkel) og til at skelne eksterne (figur 2, røde pilespidser) fra internaliserede SRBC'er (Figur 2, røde cirkler). BF mikroskopi betragtes som den enkleste optisk mikroskopi belysning teknik er tilstrækkelig til at se fagosomer, som er mindre refringent end de ydre SRBC'er.
Det første skridt efter erhvervelse af billedsekvenser er manuel sporing på ImageJ software (figur 3). Dette punkt kan være særlig lang og kedelig, fordi det foretrækkes at spore hver fagosomet, én efter én for alle billedsekvenser og det anses, at forsøg skal gentages med mindst 3 donorer pr betingelse for at nå en tilstrækkelig stor stikprøve af statistisk analyse (mindst 30 fagosomer med 3 forskellige donorer).
Det andet trin er analyseni regneark til at beregne fagosomet hastighed under de første 5 min efter internalisering for hver internaliserede SRBC'er (figur 4). For dette, vi plotter for hver fagosomet den afstand i den første 5 min mod tiden. Et repræsentativt eksempel er vist i ikke-inficerede hMDMs på figur 5A. Næste vi opnå hastigheden af fagosomet, hvilket er hældningen af den lineære regression kurve. En hastighed på 0,5384 um / min blev fundet for denne fagosomet.
Af note, er det muligt at analysere fagosomet hastighed i de første få minutter efter internalisering, som beskrevet her eller i Dumas et al. 8, eller senere ved at analysere hastigheden over længere tidshorisonter. I vores undersøgelse observerede vi, at fagosomet hastigheden under de første 5 min efter internalisering i HIV-inficerede hMDMs er lavere sammenlignet med ikke-inficerede hMDMs (figur 5B).
Figur 1. Fremstilling af kontrol og HIV-inficerede hMDMs for fagocytose billeddannelse. Monocytter oprenset ved adhæsion (1) og differentieret til makrofager i 11 dage med M-CSF (2). Dernæst hMDMs smittet med NLR4.3 HIV-1Gag-iGFP i) ved en MOI mellem 0,02 og 0,03 i 8 dage med vask på dag 2 (3). (4) IgG-opsoniseret SRBC'er er tilføjet på hMDMs for fagocytose i løbet af 1 time. De fagosomer indeholder SRBC'er kan påvises på BF billeder (rød cirkel, ii). Billederne er fra Servier billeder databasen. Bar = 10 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur erhvervelse 2. Real-tid underfagocytose med repræsentative kontrol og HIV-inficerede hMDMs. hMDMs fremstilles og inficeret som beskrevet i figur 1. detekteres De NLR4.3 HIV-1Gag-iGFP inficerede celler med 491 nm laser. Z-stakke af spinning disk konfokal billeder erhverves og analyseret ved hjælp af både køb mikroskop software og ImageJ (venstre paneler). Gallerier af BF billeder repræsenterer en ikke-inficeret (top paneler svarende til Movie 1) og et NLR4.3 HIV-1Gag-iGFP inficerede (nederste paneler svarende til Movie 2) celle under en 45 min erhvervelse (46 billeder med tid, der er angivet som hh : mm). Cellemembranen (stiplede sorte linie), kernen (blå cirkel), de eksterne SRBC'er (nogle af dem er angivet med røde pile) og de interne SRBC'er (nogle af dem er angivet med røde cirkler) er påviselige på BF billeder. Bar = 10 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Instruktion trin for billedanalyse med Manuel Tracking plugin på ImageJ. Efter åbning af "Manuel Sporing" plugin (1) og ilægning af time-lapse video i BF-kanal (2), indtast parametrene for (3) erhvervelse. Klik på "Tilføj track" (4) og start målingen af sporing ved at klikke på én fagosom (5) for at opnå et nyt vindue med X og Y positioner af valgte fagosom (6, rød boks). At følge fagosomet af den tid sekvens for bekvemmelighed, varierer lysstyrke og kontrast (5 '). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Instruktion trin for dataanalyse af fagosom migration hastighed i regneark. (A) Saml X og Y-position af kernen og hver fagosomet (rød boks) i et regneark tabel. I en anden søjle (violette felt), at beregne afstanden mellem fagosomet og kernen med Pythagoras 'læresætning hvor c betegner længden mellem kernen og SRBC og a og b længderne af de to andre sider af en retvinklet trekant ( B). (C) Endelig beregne den afstand, som de fagosomer på hver gang (grøn boks) ved at fratrække afstanden mellem SRBC og kernen på et givet tidspunkt fra den indledende afstand på tidspunkt 0. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
p_upload / 54568 / 54568fig5.jpg "/>
Figur 5. Kvantificering af fagosom migration hastighed i kontrol og HIV-inficerede hMDMs. (A) For hver SRBC og lige efter SRBC internalisering, er den tilbagelagte afstand mod kernen målt og plottet mod tiden. Dets hastighed under den første 5 min beregnes ved lineær regression i regnearkssoftware. Et repræsentativt eksperiment er vist (det indre SRBC i figur 3-4). (B) Alle hastigheder i den første 5 min måles til 66 fagosomer i ikke-inficerede (5 donorer) og 60 fagosomer i HIV-inficerede celler (4 donorer). Dataene repræsenterer middelværdien ± SEM (Uparret Student t-test med Welch korrektion, ** P <0,01). Klik her for at se en større version af dette tal.
Movie 1: fagosom bevægelse i et repræsentativt ikke-inficerede makrofager. . (Højreklik for at downloade) Bevægelsen af opsoniseret røde blodlegemer blev påvist i BF kanal under 45 min af fagocytose med et billede pr minut (46 billeder med tid, der er angivet som tt: mm). Bar = 10 um.
Movie 2: fagosom bevægelse i et repræsentativt HIV-smittede makrofag. (Højreklik for at downloade). HIV-1 (NLR4.3 HIV-1 Gag iGFP) inficerede makrofager blev identificeret efter belysning med 491 laser. Bevægelsen af opsoniseret røde blodlegemer blev påvist i BF kanal under 45min af fagocytose med et billede pr minut (46 billeder med tid, der er angivet som tt: mm). Bar = 10 um.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne teknik har adskillige kritiske trin. For det første er fremstillingen af hMDMs og deres infektion med HIV-1 er kritisk, fordi procentdelen af infektion er donor afhængig. Af note, har vi besluttet at bruge makrofager, der ikke er polariseret in vitro før infektion, fordi status af makrofager potentielt stødt af viruset in vivo er ikke blevet godt karakteriseret hidtil. Vi kontrollerede ekspressionen af flere overflademarkører, hvilket indikerer, at makrofagerne er hverken M1 eller M2, og efterprøvede ekspressionen af CD4 og CCR5. De smittede er variable og spænder fra 10 til 40%, og nogle gange lavere. Denne variabel infektion sats er derfor, det kan være vanskeligt at finde en HIV-1 inficerede fluorescerende hMDM under mikroskopet. Desuden kan den nødvendige tid til at finde en HIV-1 inficerede celle umiddelbart efter centrifugeringstrin også føre til en forsinkelse i at starte købet. Fagocytose kunne indledes uden synchronization af binding og optagelse genereres ved centrifugering. Men denne indstilling ikke er valgt for SRBC'er der svæver, før de når cellerne. Det kunne være en god mulighed med perler. For at minimere den nødvendige tid til at finde inficerede celler, kunne gridded glasbund retter anvendes til at identificere HIV-1-inficerede hMDMs før man går videre til at starte fagocytose assay. De valgte HIV-inficerede celler, der har en "rimelig" antal SRBC'er omkring dem vil derefter blive hurtigt valgt at starte opkøb. "Rimelig SRBC mængde" betyder nok til at have mindst 10 SRBC'er per celle og ikke alt for mange til at forhindre de eksterne SRBC'er fra maskering af fagosomer.
Desuden er det vigtigt at optimere opsonisering betingelser for at sikre at der vil være effektiv genkendelse og optagelse af cellerne. FCR-medieret fagocytose er konstitutiv og hMDMs rutinemæssigt meget effektive i FcR-medieret optagelse. Desuden for korrekt fagocytose, betingelserne nødt til be optimal med opvarmningskammeret ved 37 ° C og 5% CO2. Det er nødvendigt at kontrollere gassen og temperatur før start af fagocytose assay.
Endelig diskrimination af eksterne SRBC'er fra interne fagosomer og identifikation af kernen i BF-kanalen er vigtige for analyse af ImageJ software. Dette er grunden til indstillingerne for denne kanal er vigtige. I betragtning af, at fokus kan gå tabt under erhvervelse, anbefaler vi at erhverve stakke af billeder i Z-aksen for at være sikker på at have den optimale plan til at analysere fagosom hastighed. Det foretrækkes at have en enkelt celle i et felt til at analysere alle internaliserede SRBC'er for hver celle. Derfor er linsen valg er vigtigt, og her er brugt 2 linser som funktion af cellestørrelsen. Det var lettere for os at spore fagosomer med et 100X objektiv, men nogle gange cellerne var for stor, så vi var nødt til at skifte til en 63X objektiv. Valget af linsen er også kritisk når tænker imalder analyse ved hjælp ImageJ og et regneark tabel, fordi begge linser implicerer forskellige x / y kalibreringer.
Den første begrænsning ved denne teknik er antallet af prøver, der skal erhverves at have statistisk signifikante resultater. Vi kan registrere flere film pr donor, men som regel ikke mere end to celler pr tilstand, per fad. Løsningerne på denne begrænsning for at forøge antallet af prøver er at gentage forsøgene med flere donorer eller at gøre multi-point XY imaging afhængigt mikroskopet. Den ulempe for den sidste metode er det potentielle tab af fokus under motoriseret XYZ scanning. En anden begrænsning er, at den manuelle kvantificering af hastigheden er lang og kedelig sammenlignet med et automatiseret analyse. For fuld automatiseret analyse, er det nødvendigt at anvende fluorescens-mærkede partikler, som rapporteret i banebrydende studier 4 med latexperler koblet til fiskeskind gelatine, der blev fulgt med en tracking algoritme på MatLab software. Fluorescensmærket opsoniserende antistoffer eller perler kunne være et alternativ, men de er underlagt blegning, hvilket er et problem, når der optages fagocytose i 1 time. Andre undersøgelser rapporterer brugen af latex perler 13,14. Vi bemærkede dog, at internalisering af latexperler er mindre let afsløres end optagelsen af SRBC'er. Faktisk udgangspunktet for kinetikken af intracellulær migration er vigtigt at vide at opdage tidlige defekter i phagosomal bevægelse.
Den største fordel ved den her beskrevne metode er dens enkelhed og anvendelsen af en fri software. For at udføre manuel sporing ved hjælp af ImageJ software, vi nødt til at bruge position fagosomet og kernen, og dermed er vi nødt til at bruge Pythagoras 'sætning til at beregne afstanden mellem fagosomet og kernen, og for at få hastigheden efter en lineær regression i regneark. Dette 3 trin analyse kan reduceres til et trin, tracking, om ICY software med & #34;. Manuel Tracking "plugin Outputdataene er derefter direkte hastigheden af partiklen til følge, og nærmere bestemt den relative hastighed mellem 2 grupper (såsom fagosomer og kerne) Endelig beregningen giver os mulighed for at måle den relative hastighed af. en partikel i forhold til en anden partikel, der også kan bevæge sig.
Den potentielle fremtidige anvendelse af denne levende time-lapse-analyse kan være for synlige partikler i lyse felt, som bakterier, svampe eller celle debris. Forskellige behandlinger eller infektion, der er tilstrækkelige til at ændre phagosomal modning og aktivering egenskaber makrofager ville nyde godt af en raffineret analyse af phagosomal bevægelse mod cellens centrum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | For viral production |
| Glass Bottom Dishes 35 mm uncoated 1.5 | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C Case | For acquisition |
| Falcon Tissue Culture Plates 6-well | Thermo Fischer Scientific | Corning. Inc. 353934 | For human monocyte-derived macrophages |
| Ficoll-Plaque PLUS | Dominique Dutscher | 17-1440-03 | a neutral, highly branched, high-mass, hydrophilic polysaccharide in solution for density centrifugation |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fischer Scientific | 14190-094 | RT |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1x, liquid (High Glucose) | GIBCO, Molecular probes | 31966-021 | Conserved at 4 °C ; for HEK cells culture |
| RPMI 1640 medium GLUTAMAX Supplement | Life technologies | 61870-010 | Conserved at 4 °C; for hMDMs culture |
| Fœtal Calf Serum (FCS) | Eurobio | CVFSVF0001 | Conserved at -20 °C ; decomplemented |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Thermo Fischer Scientific | 15140-122 | Conserved at -20 °C ; for hMDMs culture |
| RPMI 1640 medium, no phenol red (10x 500 ml) | Life technologies | 11835-105 | Warm in 37 °C water bath before use ; for phagocytosis assay |
| FuGENE6 Transfection Reagent | Promega | E2692 | Conserved at 4 °C ; for viral production |
| Sheep red blood cells (SRBCs) | Eurobio | DSGMTN00-0Q | Conserved in Alsever buffer at 4 °C before use |
| Anti-sheep red blood cells IgG | MP Biomedicals | 55806 | Conserved at 4 °C |
| Bovine Serum Albumin heat shock fraction, pH 7, ≥98% | Sigma | A7906 | Conserved at -20 °C |
| Inverted microscope DMI600 | Leica | ||
| Confocal Spinning Disk Unit CSU-X1M1 | Yokogawa | ||
| 491 nm 50 mW laser | COBOLT CALYPSO | ||
| HCX PL APO CS Objectif | Leica | Objective lens ; Magnification 100X ; Numerical aperture 1.40 ; Immersion oil | |
| CoolSnap HQ2 (FireWire) Camera | Photometrics | Pixel size 6.45 µm x 6.45 µm ; Definition 1,392 x 1,040 ; Encoding the image in 14 Bit | |
| Metamorph 7.7.5 software | Molecular Devices | For the control of the microscope | |
| GraphPad Prism software | For the statistics analysis |
References
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annu. Rev. Pathol. 7, 61-98 (2012).
- Niedergang, F. Encyclopedia of Cell Biology. 2, Academic Press. Waltham, MA. 751-757 (2016).
- Blocker, A., Griffiths, G., Olivo, J. C., Hyman, A. A., Severin, F. F. A role for microtubule dynamics in phagosome movement. J Cell Sci. 111 (Pt 3), 303-312 (1998).
- Blocker, A., et al. Molecular requirements for bi-directional movement of phagosomes along microtubules. J Cell Biol. 137, 113-129 (1997).
- Flannagan, R. S., Cosio, G., Grinstein, S. Antimicrobial mechanisms of phagocytes and bacterial evasion strategies. Nat Rev Microbiol. 7, 355-366 (2009).
- Feasey, N. A., Dougan, G., Kingsley, R. A., Heyderman, R. S., Gordon, M. A. Invasive non-typhoidal salmonella disease: an emerging and neglected tropical disease in Africa. Lancet. 379, 2489-2499 (2012).
- Mazzolini, J., et al. Inhibition of phagocytosis in HIV-1-infected macrophages relies on Nef-dependent alteration of focal delivery of recycling compartments. Blood. 115, 4226-4236 (2010).
- Dumas, A., et al. The HIV-1 protein Vpr impairs phagosome maturation by controlling microtubule-dependent trafficking. J Cell Biol. 211, 359-372 (2015).
- Greenberg, S., el Khoury, J., Kaplan, E., Silverstein, S. C. A fluorescence technique to distinguish attached from ingested erythrocytes and zymosan particles in phagocytosing macrophages. J. Immunol. Methods. 139, 115-122 (1991).
- Koppensteiner, H., Banning, C., Schneider, C., Hohenberg, H., Schindler, M. Macrophage internal HIV-1 is protected from neutralizing antibodies. J Virol. 86, 2826-2836 (2012).
- Gartner, S. The macrophage and HIV: basic concepts and methodologies. Methods Mol Biol. 1087, 207-220 (2014).
- Wei, X., et al. Emergence of resistant human immunodeficiency virus type 1 in patients receiving fusion inhibitor (T-20) monotherapy. Antimicrob Agents Chemother. 46, 1896-1905 (2002).
- Harrison, R. E., Bucci, C., Vieira, O. V., Schroer, T. A., Grinstein, S. Phagosomes fuse with late endosomes and/or lysosomes by extension of membrane protrusions along microtubules: role of Rab7 and RILP. Mol Cell Biol. 23, 6494-6506 (2003).
- Toyohara, A., Inaba, K. Transport of phagosomes in mouse peritoneal macrophages. J Cell Sci. 94 (Pt 1), 143-153 (1989).
