Summary
本研究描述了小鼠加速动脉硬化诱导的侵入性程序。与其他使用电或低温诱发损伤的方法相比，机械诱导损伤模仿再血管化治疗后人类的再病状况，是研究有关分子机制的理想之选。
Abstract
动脉硬化是一种在动脉壁上发育的增殖性纤维炎疾病，导致血流不足或血流不足。此外，通过有缺陷的血管壁破裂，动脉硬化会诱发闭塞性血栓形成，这是心肌梗死或中风的主要原因，也是最常见的死亡原因。尽管在心血管领域取得了进步，但许多问题仍未得到解答，而额外的基础研究对于增进我们对动脉硬化及其效应的分子机制的理解至关重要。由于有限的临床研究，需要有代表性的动物模型重新创建动脉硬化条件，如支架植入后的新肌形成，气球血管成形术，或内皮切除术。由于小鼠具有许多优点，是研究分子过程最常用的模型，本研究提出了一种侵入性内皮变性过程，又称线损伤模型，它代表了再血管化后动脉新丁岛形成的人的状况。
Introduction
动脉硬化是心血管事件（如心肌梗塞或中风）的主要病理。引发急性心血管综合征的主要机制是斑块破裂、表面侵蚀和血栓形成。有多种临床情况与斑块的发展有关：原生动脉硬化斑块，内侧切除术后，和气球血管成形术后，带/没有支架植入1。动脉损伤后，抑制炎症过程2，3 和内皮室的恢复是防止进一步并发症的关键1。由于伦理因素、费用和缺乏基本机制知识，临床研究仅限于组织和血液样本。由于这些原因，有必要研究动物模型4-6中的分子机制，从而重现临床条件。我们在动脉硬化背景下加速新丁体形成的模型是多年在小动物7-11中实施这些模型的经验的结果。小鼠模型是最有吸引力的研究模型，由于其易于处理，能够有大型动物群，由于与动物购买和护理相关的低成本，以及各种转基因和淘汰菌株的可用性。
小鼠模型的主要缺点是，主动脉小尺寸，受到动脉硬化疾病（胡萝卜动脉、主动脉和股骨动脉），这需要合格的手术专业知识和技能来操纵血管和侵入性诱导动脉硬化斑块。因此，本文提出了在内皮切除术或支架植入后，在内皮切除术或支架植入后，加速新牙形成模型，提出了分步指导和建议，以方便相关人员的介绍。另一个缺点是，在正常动脉壁上进行变性，因此，与临床情况相比，新内皮形成将较为温和。以高脂肪饮食喂养的抗脂蛋白E敲除（Apoe-/-）小鼠的血浆胆固醇达到高水平，为新性蛋白的形成创造了适当的亲炎环境。
手术在立体显微镜下进行。腹颈动脉由中切切口暴露。胡萝卜动脉顶部和周围的解剖结构被最少操纵，以减少手术后炎症。胡萝卜动脉分叉暴露。为了诱导加速的新丁组织形成，内部和外部胡萝卜动脉准备停止血流和随后的常见肉皮动脉变性。总之，这种方法可以由在动物手术中经验最少的人员学习。
Protocol
本文提出的实验是按照德国法律和欧洲动物护理指南进行的。这些动物是在德国亚森大学医院实验室动物科学研究所的动物设施中繁殖的，由托尔巴博士和Teubner博士（动物福利官员）监督。
1. 动物护理
- 将小鼠留在专门的护理室，确保适当获得食物，并进行专门的兽医控制和治疗。如果动物是移动或从第三方购买的，请确保在进行手术前有一周的住宿期。
2. 高脂血症诱导
- 喂养6 - 8周大，18 - 20克，雌性（可选）ApoE-/--小鼠 与异生饮食（21%脂肪，0.15%胆固醇，19.5%卡丁，wt/wt）在手术前一周，并继续节食，直到进行动脉硬化斑块分析。
3. 手术准备
- 使用内向注射100毫克/千克氯胺酮按体重和10毫克/千克基胺按体重麻醉小鼠。由于缺乏反射和胡须运动，在手术前确认正确的麻醉。在眼睛中放置少量无菌眼药膏，以尽量减少干燥。
- 确保保持无菌条件，避免在手术过程中使用无菌材料和仪器感染。
- 剃掉腹颈区域的小鼠。切口前用β丁消毒皮肤。在颈部区域的中位区域，在气管顶部进行 1 厘米的皮肤切口。
- 分离两个脂肪体，以确保对气管区域的正确视图。使用缩回器保持肌肉层并暴露肌动脉。如果存在，则对覆盖胡萝卜状动脉的薄肌肉层进行钝解剖。
- 使用锋利的弯曲钳子将胡萝卜动脉与迷走神经和血管分开。因此，与内部和外部胡萝卜动脉的分叉区域应可见。使用0.9%NaCl，以避免手术过程中组织干燥。
4. 电线伤害
- 将7厘米长的0/5丝线在胡萝卜动脉下，与主动脉拱门近在一起。使一个开放循环，随时可以关闭。
- 在外胡萝卜动脉周围放置两根 0/7 丝线（每根 1.5 厘米长）：一个环靠近分叉点，一个环尽可能不长。将它们准备为开放循环，随时可以关闭。
- 将一个0/7丝缝合线（1.5厘米长）放在内皮蒂德动脉下。准备它作为一个开放循环，随时可以关闭。
- 将鼠标头的鼠标表朝向操作员，以确保在拆卸期间正确定位导丝插入（图 1A）。
- 在微观视野下，通过用血钳抓住和拉扯0/5丝线状的末端，阻止血液流经普通心肌动脉。
- 在常见的胡萝卜状动脉连结后，立即关闭放置在内胡萝卜状动脉上的缝合环和外胡萝卜动脉上的外部动脉的外部缝合线（图1B）。
- 使用小剪刀在两个回路之间，在两个回路之间，对外部胡萝卜动脉进行小切口（动脉切除术，血管直径的一半）（图1C）。如果切口太大，请按照故障排除说明操作（请参阅讨论）。
- 使用商业抛光导轨线或使用内部专门人员抛光导轨。用酒精消毒 14 英寸抛光柔性导丝，并在 0.9% NaCl 液滴中润湿，以确保正确滑入容器。
- 通过外部胡萝卜动脉的横向动脉切除术将导丝插入普通胡萝卜动脉（图1D）。在旋转时沿导丝穿过导丝，获得内皮变性。重复此过程三次。在每只鼠标中保持相同的旋转运动幅度，以提高可重复性。
- 紧闭外胡萝卜动脉上的近向回路。通过切断普通动脉周围的缝合线和内胡萝卜动脉周围的缝合线，恢复心肌动脉的血液流动。
5. 缝合和恢复
- 取出缩回器，将肌肉层和两个脂肪体返回到生理位置。
- 如果需要超声心动测量，请用三个分离的缝合线0/6关闭皮肤。如果不需要成像，请使用金属夹子关闭皮肤。
- 将鼠标放在其左侧的红外光下，直到它醒来。在完全康复之前，不要让动物无人看管，也不要与其他动物在一起。
- 对于将来的标识，请使用本地系统标记鼠标。向当地机构的动物福利官员询问。
6. 动脉硬化斑块分析
- 在结束时间点麻醉小鼠使用内向注射100毫克/千克氯胺酮的体重和10毫克/千克木酸按体重。缺乏反射和胡须运动，确认正确的麻醉。
- 通过复古轨道或心脏穿刺进行排泄，并收集血液作进一步分析2。
- 用贝塔丁消毒皮肤。打开胸腔，取出心脏的右牙。磷酸盐缓冲溶液通过左心室去除血管中剩余的血液，然后用4%的PFA来修复组织。
- 如果不需要固定，洗涤2，4，11后立即清洗胡萝卜动脉。执行标准协议，分析感兴趣的：石蜡嵌入，低温，mRNA或蛋白质分析等。
- 对于形态测量，小心地将胡萝卜动脉（包括分叉）外化，只需最少的操作，即使用弯曲钳子和小剪刀近到主动脉拱。
- 使用标准嵌入协议将胡萝卜状动脉嵌入石蜡块中。要执行横向剖面，请将胡萝卜动脉直立在分叉上。切5 μm 厚的串行部分，从分叉开始，将它们全部收集在涂层组织学幻灯片上（图 2A）。
- 每10节染色 使用移动染色，以突出拉米纳斯2，4，11。收集所有容器的微观图片（使用 10 倍目标）后，使用特殊设计的软件2，4，11 测量流明，以及每个部分的内部和外部层压，如图 2B 所示。计算容器的刺激生长和介质。
- 使用通常的免疫病理学染色2（ 图2C）分析平滑肌细胞和巨噬细胞含量，或连续部分的内皮恢复。
Representative Results
动脉硬化斑块诱导程序需要15-20分钟，显示最低死亡率，主要是由于手术过程中发生的出血。手术后，小鼠在20-25分钟内从麻醉中恢复过来。手术后未观察到身体损伤，如瘫痪或喂养障碍。
线伤诱发去内皮化，模仿气球切除或支架植入后血管病变。受伤后，被遮盖的血管壁将覆盖一层血栓细胞，这调解和有利于单核细胞的粘附12。从介质中激活的平滑肌肉细胞会扩散并迁移到刺激空间，形成新肌。平滑肌细胞的其他祖体将从血液中迁移（估计为40%）并有助于新主义的发展。斑块形成将在完全重新内皮化后结束，通常在线伤后4周。
可以使用移动染色评估新丁岛的形成。使用软件计算每张幻灯片的斑块大小，如图 2B 所示。总斑块大小（左胡萝卜动脉）在 70，000 - 100，000 μm2 之间可能变化，而控制容器大小（右胡萝卜动脉）在 7，000 - 8，000 μm2 之间可能变化。这些价值观在很大程度上取决于外科医生。因此，我们强烈建议在相同的研究实验中使用相同的外科医生。
发育的斑块 类似于支架松 弛，它主要由增殖和迁移的平滑肌肉细胞从介质组成。由免疫染色程序确定的细胞组成表明，平滑的肌肉细胞含量约为30-40%，而巨噬细胞在15-25%的受伤血管的新肌。重新内皮化可以在染色后测量内皮标记，并计算为整个流明圆周的圆周百分比。通常，3周后再内皮化达到80-90%，4周后应几乎完成（图2C）。为了跟踪斑块在开发过程中的生长，根据兴趣和研究的主题，可以在线伤后的每个时间点重复相同的分析（参见 表 1）。
图1。操作程序的示意图。（A） 在线伤手术期间操作台对操作人员的定位（B） 普通胡萝卜动脉及其分支的放大视图，在显微镜下以 10 倍放大率显示（C）显微镜下外部胡萝卜动脉的切口大小为 10 倍放大（D）使用 14 英寸导丝对导线伤害程序的示意图表示。请单击此处查看此图的较大版本。
图2.雷氏病斑分析。（A）普通胡萝卜动脉斑块分析的示意图，电线损伤诱导后4周（B）新丁岛形成4周后，线损伤和示意图表示用于分析的主要参数。因蒂玛（绿色区域）是流明（红色）和拉米纳内联（绿线）之间的差值。介质（黄色区域）是拉米纳 externa（黄线）和 Interna（绿线）之间的差值。比例杆 100 μm（C）代表图像的染色的主要细胞类型涉及新丁岛形成。平滑肌细胞（平滑肌肉作用素 -红色，比例杆 100 μm），巨噬细胞（Mac 2-绿色，比例杆100μm）和内皮细胞（CD31-红色，箭头，比例杆50μm）。请单击此处查看此图的较大版本。
| 时间 | 特龙布斯 | 斑块 （μm2） |
巨 噬 细胞 （% 从普拉克） |
平滑肌肉细胞 （% 从普拉克） |
重新内皮化 （% 流明周长） |
| 1 天 | 目前 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 1 周 | - | < 30 000 | > 10 | < 50 | < 50 |
| 2 周 | - | < 50 000 | > 10 | < 50 | > 50 |
| 3 周 | - | < 70 000 | 15-25 | 30-40 | 80-90 |
| 4 周 | - | 70 000 – 100 000 | 15-25 | 30-40 | 完成 |
表1.时间取决于普拉克的发展。
| 模型 | 动物 | 优势 | 失范 |
| 饮食引起的原生动脉硬化 | 小 |
|
|
| 大 |
|
|
|
| 气球膨胀 | 小 |
|
|
| 大 |
|
|
|
| 电线受伤 | 小 |
|
|
| 支架植入 | 小 |
|
|
| 大 |
|
|
表2.动脉损伤模型的优点和缺点。
Discussion
在这篇论文中，我们提供了有用的提示，以执行电线损伤程序，即使是在动物手术经验最少的人员。执行此过程有两个关键步骤：外部胡萝卜动脉的切口和导线的插入。外部胡萝卜动脉的切口需要尽可能从分叉中进行，以确保足够的剩余材料（图1C）。切口不应太大，因为切割整个容器的风险。第二个关键步骤是动脉切除术期间出血的高风险，如果血流不能有效停止，插入导丝的风险很高。此外，如果导丝未在流明容器中正确引入，则可能无法进行内皮变性或动脉破裂。为了避免这种情况，操作前必须仔细抛光导丝的表面。
为了优化协议，手术台与鼠标头的位置对外科医生确保更好的视图，可访问性和控制，以适当的引导线操作。此外，为了增加可重复性，在所有研究中使用相同的导丝。由于导线大小不会改变，因此，对研究中包括的所有小鼠使用相同的性别、年龄和体重，考虑并消除小鼠之间所有可能的差异非常重要。此后，埃文斯-蓝染色将帮助外科医生确定变性的效率。适当的设备的存在是程序成功的先决条件。10X 立体显微镜对于执行此过程至关重要。正确准备导丝（例如抛光导丝）至关重要。因此，我们强烈建议专业技术人员在有帮助时进行导丝制备。
此协议中有许多故障排除步骤。如果将外皮动脉靠近分叉，小心地将外皮，靠近分叉，因此不出血。在切割过程中，看不到外部胡萝卜动脉。因此，考虑在丝绸缝合水平的分叉。丝质缝合消失时收集部分。如果外侧胡萝卜动脉的切口太大且血管破裂，请确保血液有效流入胡萝卜部和内胡萝卜动脉，并尝试用钳子找到血管的开口。引入导丝并执行脱毛后，将容器绑定到分叉附近。在切割过程中，当缝合的丝绸开始消失时，开始收集。如果使用导丝在去擦时发生动脉破裂，请在显微镜下检查导丝是否抛光。
尽管线伤模型与临床情况相似，但许多群体都专注于小鼠的原生动脉硬化，或者他们选择侵入性动脉硬化诱导，如大鼠或兔子的气球血管成形术，因为缺乏能够进行小型动物手术的训练有素的人员。尽管使用兔子/老鼠的好处 ，例如不需要 小型化设备，但无论是大鼠模型还是兔子模型，在研究涉及新丁体生长和支架血栓形成分子机制方面，都没有提供各种不同的敲出菌株。
现有的小鼠支架内休息研究模型是困难的，需要很高的手术技能，并且有很高的并发症风险，如出血或瘫痪。例如，通过股动脉将机械损伤或支架植入胸大动脉伴随着高死亡率（35%）由于后腿瘫痪或出血13-15。我们还描述了在小鼠16的胡萝卜动脉中植入支架。程序相似;然而，用于分析的组织处理是复杂的，并不是所有的实验室16。胡萝卜动脉是直接访问的，不仅用于手术程序，而且用于现有的成像方法，如超声波成像。小鼠的冠状动脉中的其他损伤诱导可以使用电气设备17完成。此方法易于执行，并确保高可重复性。然而，它在所有容器层中诱发损伤，与机械损伤不同。气球应用具有 益处，例如 根据临床实践对容器直径进行调整，对病理结果有强烈影响。即使鼠标气球是可用的，他们是非常昂贵的，因此，没有广泛使用。相反，线伤是既定的方法，模仿支架狭窄。
在正常动脉壁上进行遮挡，尽管具有动脉硬化背景。因此，与临床情况相比，新丁岛的形成将较为温和。大量临床前模型表明，没有一个模型满足发现导致人类病理生理学的全部细胞和分子机制所需的所有标准（见表2）。
执行线损伤程序后，可以进行其他生物和分子分析，以识别细胞、蛋白质、mRNA、微RNA、基因或其他生物标志物，这些细胞可用作治疗靶点，以开发动脉硬化的新治疗策略，特别是血管损伤后新丁体形成。如果可用，可以使用高频超声波或其他高分辨率成像技术监测斑块的生长。此外，掌握这项技术将使操作者有机会使协议适应其他侵入性动脉硬化诱导模型，如衣领放置、部分结扎甚至支架植入。
Disclosures
提交人没有披露。
Acknowledgments
这项工作得到了跨学科临床研究中心（初级研究小组到E.A.L.）在RWTH亚琴大学医学院的支持。我们还感谢罗亚·索尔坦夫人在免疫石化学染色方面的帮助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope | Olympus | SZ/X9 | - |
| Forceps | FST, Germany | 91197-00 | standard tip curved 0,17 mm |
| Hemostat forceps | FST, Germany | 13007-12 | curved |
| Scissors | FST, Germany | 91460-11 | Straight |
| Vannas scissor | Aesculap, Germany | OC 498 R | - |
| Retractors | FST, Germany | 18200-10 | 2.5 mm wide |
| Retractors | FST, Germany | 18200-11 | 5 mm wide |
| Ketamine 10% | CEVA, Germany | - | - |
| Xylazine 2% | Medistar, Germany | - | - |
| Bepanthene eye and nose cream | Bayer, Germany | - | - |
| Silicon tube | IFK Isofluor, Germany | custom-made product | diameter 500 µm, |
| section thickness 100 µm, | |||
| polytetrafluorethylene catheter | |||
| PROLENE Suture 6/0 | ETHICON | 8707H | polypropylene monofilament suture, unresorbable, needle CC-1, 13 mm, 3/8 Circle |
| 7/0 Silk | Seraflex | IC 1005171Z | - |
| Michel Suture Clips | FST, Germany | 12040-01 | - |
| Clip Applying Forcep | FST, Germany | 12018-12 | - |
| 14”Wire for Catheter | Abbot | 1000462H | Use 10 cm from stiff part and equalize the ends |
| Mice | Charles River | Apolipoprotein E -/- mice with C57/Bl6 background | - |
References
- Simsekyilmaz, S., Liehn, E. A., Militaru, C., Vogt, F. Progress in interventional cardiology: challenges for the future. Thromb Haemost. 113 (3), 464-472 (2015).
- Kubo, N., McCurdy, S., Boisvert, W. A. Defective Fas Expression on Bone Marrow Derived Cells Alters Atherosclerotic Plaque Morphology in Hyperlipidemic Mice. Discoveries. 3 (1), e37 (2015).
- Saffarzadeh, M., et al. Characterization of rapid neutrophil extracellular trap formation and its cooperation with phagocytosis in human neutrophils. Discoveries. 2 (2), e19 (2014).
- Lindner, V., Fingerle, J., Reidy, M. A.
- Schwartz, R. S., et al. Preclinical evaluation of drug-eluting stents for peripheral applications: recommendations from an expert consensus group. Circulation. 110 (16), 2498-2505 (2004).
- Schwartz, R. S., et al. Restenosis and the proportional neointimal response to coronary artery injury: results in a porcine model. J Am Coll Cardiol. 19 (2), 267-274 (1992).
- Curaj, A., et al. Noninvasive molecular ultrasound monitoring of vessel healing after intravascular surgical procedures in a preclinical setup. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35 (6), 1366-1373 (2015).
- Liehn, E. A., Schober, A., Weber, C. Blockade of keratinocyte-derived chemokine inhibits endothelial recovery and enhances plaque formation after arterial injury in ApoE-deficient mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24 (10), 1891-1896 (2004).
- Liehn, E. A., Zernecke, A., Postea, O., Weber, C.
- Simsekyilmaz, S., et al. Role of extracellular RNA in atherosclerotic plaque formation in mice. Circulation. 129 (5), 598-606 (2014).
- Wu, Z., et al. Rhodamine-loaded intercellular adhesion molecule-1-targeted microbubbles for dual-modality imaging under controlled shear stresses. Circ Cardiovasc Imaging. 6 (6), 974-981 (2013).
- Schober, A., et al. Crucial role of the CCL2/CCR2 axis in neointimal hyperplasia after arterial injury in hyperlipidemic mice involves early monocyte recruitment and CCL2 presentation on platelets. Circ Res. 95 (11), 1125-1133 (2004).
- Ali, Z. A., et al. Increased in-stent stenosis in ApoE knockout mice: insights from a novel mouse model of balloon angioplasty and stenting. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27 (4), 833-840 (2007).
- Chamberlain, J., et al. A novel mouse model of in situ stenting. Cardiovasc Res. 85, 38-44 (2010).
- Rodriguez-Menocal, L., et al. A novel mouse model of in-stent restenosis. Atherosclerosis. 209 (2), 359-366 (2010).
- Simsekyilmaz, S., et al. A murine model of stent implantation in the carotid artery for the study of restenosis. J Vis Exp. , e50233 (2013).
- Schroder, K., et al. NADPH oxidase Nox2 is required for hypoxia-induced mobilization of endothelial progenitor cells. Circ Res. 105 (6), 537-544 (2009).
