चूहों में त्वरित एथेरोस्क्लेरोसिस का समावेश: "वायर-इंजरी" मॉडल

Summary

यह अध्ययन चूहों में त्वरित एथेरोस्क्लेरोसिस के प्रेरण के लिए एक आक्रामक प्रक्रिया का वर्णन करता है। इलेक्ट्रिक-या क्रायो-प्रेरित चोट का उपयोग करके अन्य तरीकों की तुलना में, यांत्रिक-प्रेरित चोट पुनर्संवहन उपचारों के बाद रेस्टेनोसिस की मानव स्थिति की नकल करती है और इसमें शामिल आणविक तंत्र के अध्ययन के लिए आदर्श है।

Abstract

एथेरोस्क्लेरोसिस धमनी की दीवार में विकसित होने वाली एक प्रोलिफेरेटिव फाइब्रो-भड़काऊ बीमारी है, जो रक्त प्रवाह की कमी या रक्त प्रवाह की कमी को प्रेरित करता है। इसके अलावा, दोषपूर्ण संवहनी दीवार के टूटने से, एथेरोस्क्लेरोसिस ऑक्सीक्लोसिव थ्रोम्बस गठन को प्रेरित करता है, जो मायोकार्डियल इंफेक्शन या स्ट्रोक के मुख्य कारण और मृत्यु का सबसे लगातार कारण का प्रतिनिधित्व करता है। हृदय क्षेत्र में प्रगति के बावजूद, कई प्रश्न अनुत्तरित रहते हैं, और एथेरोस्क्लेरोसिस और इसके प्रभावों के दौरान आणविक तंत्र की हमारी समझ में सुधार करने के लिए अतिरिक्त बुनियादी अनुसंधान आवश्यक है। सीमित नैदानिक अध्ययनों के कारण, स्टेंट प्रत्यारोपण, गुब्बारा एंजियोप्लास्टी, या एंडार्टेक्टॉमी के बाद नियोइंटिमा गठन जैसी एथेरोस्क्लेरोटिक स्थितियों को पुन: बनाने वाले प्रतिनिधि पशु मॉडलों की आवश्यकता होती है। चूंकि माउस कई फायदे प्रस्तुत करता है और आणविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए सबसे अधिक बार उपयोग किया जाने वाला मॉडल है, वर्तमान अध्ययन में एंडोथेलियल डेन्यूडेशन की एक आक्रामक प्रक्रिया का प्रस्ताव है, जिसे तार-चोट मॉडल के रूप में भी जाना जाता है, जो पुनर्संवहन प्रक्रियाओं के बाद धमनियों में नियोंटिमा गठन की मानव स्थिति का प्रतिनिधि है।

Introduction

एथेरोस्क्लेरोसिस मुख्य विकृति अंतर्निहित हृदय की घटनाओं जैसे मायोकार्डियल इंफार्क्शन या स्ट्रोक है। तीव्र हृदय सिंड्रोम को ट्रिगर करने वाले मुख्य तंत्र पट्टिका टूटना, सतही कटाव और थ्रोम्बस गठन हैं। पट्टिका विकास से जुड़े कई नैदानिक स्थितियां हैं: देशी एथेरोस्क्लेरोटिक पट्टिका, एंडार्टेक्टॉमी के बाद रेस्टेनोसिस, और¹गुब्बारे एंजियोप्लास्टी के बाद रेटेनोसिस/ धमनी की चोट के बाद, भड़काऊ प्रक्रियाओं का दमन^2,3 और एंडोथेलियल डिब्बे की वसूली आगे की जटिलताओं को रोकने के लिए आवश्यक है^1। नैदानिक अनुसंधान ऊतक और रक्त नैतिक विचार, लागत, और बुनियादी तंत्र में ज्ञान की कमी के कारण नमूनों तक ही सीमित है । इन कारणों से, पशु मॉडल^4-6में आणविक तंत्र का अध्ययन करने की आवश्यकता है, जो नैदानिक स्थितियों को फिर से बना सकता है। एथेरोस्क्लेरोसिस के संदर्भ में त्वरित नियोंटिमा गठन का हमारा मॉडल छोटे जानवरों में इन मॉडलों के कार्यान्वयन में कई वर्षों के अनुभव का परिणाम है^7-11। माउस मॉडल अनुसंधान के लिए सबसे आकर्षक मॉडल है, इसकी हैंडलिंग में आसानी के कारण, पशु खरीद और देखभाल से संबंधित कम लागत के कारण बड़े पशु समूहों की क्षमता, और विभिन्न ट्रांसजेनिक और नॉकआउट उपभेदों की उपलब्धता।

माउस मॉडल का प्रमुख नुकसान एथेरोस्क्लेरोटिक रोग (कैरोटिड धमनी, महाधमनी, और फीमोरल धमनी) के अधीन मुख्य धमनियों का छोटा आकार है, जिसके लिए जहाजों में हेरफेर करने और आक्रामक रूप से एथेरोस्क्लेरोटिक पट्टिका को प्रेरित करने के लिए योग्य शल्य चिकित्सा विशेषज्ञता और कौशल की आवश्यकता होती है। इसलिए, एंडार्टेक्टॉमी या स्टेंट प्रत्यारोपण के बाद रेटेनोसिस के संदर्भ में त्वरित नियोंटिमा गठन का मॉडल, इस पेपर में प्रस्तावित इच्छुक कर्मियों के लिए परिचय को कम करने के लिए कदम-दर-कदम दिशानिर्देश और सुझावों के साथ प्रस्तुत किया जाता है। एक और नुकसान यह है कि सामान्य धमनी दीवार पर डेनडेशन किया जाता है, और इसलिए, नैदानिक स्थिति की तुलना में नव-इंतिमा गठन मध्यम होगा। प्लाज्मा कोलेस्ट्रॉल के उच्च स्तर एपोलीपोप्रोटीन ई नॉकआउट में पहुंच(Apoe-/-)^-/-चूहों एक उच्च वसा आहार के साथ खिलाया एक उचित समर्थक भड़काऊ नव इंतिमा गठन के लिए आवश्यक वातावरण बनाता है ।

सर्जरी एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत किया जाता है। कैरोटिड धमनी वेंट्रल सर्वाइकल क्षेत्र में एक औसत चीरा द्वारा उजागर किया जाता है। सर्जिकल के बाद की सूजन को कम करने के लिए कैरोटिड धमनी के शीर्ष और आसपास की शारीरिक संरचनाओं को न्यूनतम रूप से हेरफेर किया जाता है। कैरोटिड धमनी विभाजन उजागर होता है। त्वरित नियोंटिमा गठन को प्रेरित करने के लिए, आंतरिक और बाहरी कैरोटिड धमनियों को रक्त प्रवाह समाप्ति और बाद में आम कैरोटिड धमनी डेनडेशन के लिए तैयार किया जाता है। अंत में, विधि पशु सर्जरी में न्यूनतम अनुभव के साथ कर्मियों द्वारा सीखा जा सकता है।

Protocol

इस पेपर में प्रस्तुत प्रयोग जर्मन कानून और यूरोपीय पशु देखभाल दिशानिर्देशों के अनुसार किए जाते हैं। जर्मनी के यूनिवर्सिटी हॉस्पिटल आकिन, प्रो डॉ आर तोल्बा और डॉ ए तेउनर (एनिमल वेलफेयर ऑफिसर) की देखरेख में जर्मनी के इंस्टीट्यूट फॉर लेबोरेटरी एनिमल साइंस की एनिमल फैसिलिटी में जानवरों को पैदा किया जाता है ।

1. पशु देखभाल

1. चूहों को एक विशेष देखभाल इकाई में रखें, भोजन और विशेष पशु चिकित्सा नियंत्रण और उपचार तक उचित पहुंच सुनिश्चित करें। यदि जानवरों को तीसरे पक्ष से स्थानांतरित या खरीदा जाता है, तो कृपया प्रक्रिया से गुजरने से पहले एक सप्ताह की आवास अवधि सुनिश्चित करें।

2. हाइपरलिपिडेमिया प्रलोभन

1. फ़ीड 6 -8 सप्ताह पुराने, 18 - 20 ग्राम, महिला (वैकल्पिक रूप से) ApoE^-/- चूहों के साथ एथेरोजेनिक आहार (21% वसा, 0.15% कोलेस्ट्रॉल, 19.5% केसिन, wt/wt) सर्जिकल प्रक्रिया से एक सप्ताह पहले और आहार जारी रखें जब तक कि एथेरोस्क्लेरोटिक पट्टिका विश्लेषण नहीं किया जाना है।

3. सर्जिकल तैयारी

1. शरीर के वजन द्वारा 100 मिलीग्राम/किलो केटामाइन और बॉडीवेट द्वारा 10 मिलीग्राम/किलो जाइलाज़ीन के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन का उपयोग करके चूहों को एनेस्थेटाइज करें। सजगता और मूंछ आंदोलन की कमी से सर्जरी से पहले उचित एनेस्थेटाइजेशन की पुष्टि करें। सुखाने को कम करने के लिए आंखों में थोड़ी मात्रा में बाँझ आंखों का मरहम रखें।
2. बाँझ सामग्री और उपकरणों का उपयोग करके सर्जरी के दौरान संक्रमण से बचने के लिए बाँझ स्थितियों के रखरखाव को सुनिश्चित करें।
3. वेंट्रल गर्दन क्षेत्र में चूहों को शेव करें। चीरा लगाने से पहले बीटाडीन के साथ त्वचा को कीटाणुरहित करें। श्वासनली के शीर्ष पर गर्दन क्षेत्र के औसत क्षेत्र में 1 सेमी त्वचा चीरा बनाएं।
4. श्वासनली क्षेत्र पर उचित दृष्टिकोण सुनिश्चित करने के लिए दो वसा निकायों को अलग करें। मांसपेशियों की परत को पकड़ने और कैरोटिड धमनी को बेनकाब करने के लिए रिट्रैक्टर्स का उपयोग करें। यदि मौजूद है, तो कैरोटिड धमनी को कवर करने वाली पतली मांसपेशी परत का कुंद-विच्छेदन करें।
5. कैरोटिड धमनी को वेगस तंत्रिका और जुगुलर नस से अलग करने के लिए तेज घुमावदार संदंश का उपयोग करें। इस प्रकार, आंतरिक और बाहरी कैरोटिड धमनी के साथ विभाजन क्षेत्र दिखाई देना चाहिए। सर्जिकल प्रक्रिया के दौरान ऊतक सूखापन से बचने के लिए 0.9% एनएसीएल का उपयोग करें।

4. वायर-इंजरी

1. कैरोटिड धमनी के नीचे 7 सेमी लंबा 0/5 रेशम सीवन रखें, महाधमनी आर्क को समीपस्थ रखें। एक खुला लूप बनाएं, किसी भी समय बंद होने के लिए तैयार करें।
2. बाहरी कैरोटिड धमनी के चारों ओर दो 0/7 रेशम टांके (प्रत्येक 1.5 सेमी लंबा) रखें: विभाजन बिंदु के करीब एक लूप, और यथासंभव डिस्टल के रूप में एक लूप। उन्हें एक खुले लूप के रूप में तैयार करें, किसी भी समय बंद होने के लिए तैयार करें।
3. आंतरिक कैरोटिड धमनी के नीचे एक 0/7 रेशम सीवन (1.5 सेमी लंबा) रखें। इसे एक खुले लूप के रूप में तैयार करें, जो किसी भी समय बंद होने के लिए तैयार है।
4. डेनडेशन(चित्रा 1 ए)के दौरान गाइड-वायर प्रविष्टि के लिए उचित स्थिति सुनिश्चित करने के लिए ऑपरेटर की ओर माउस सिर के साथ माउस टेबल की स्थिति रखें।
5. सूक्ष्म दृश्य के तहत, आम कैरोटिड धमनी के माध्यम से रक्त प्रवाह को पकड़ कर बंद करें और हीमोस्टेट संदंश के साथ 0/5 रेशम सीवन के सिरों को खींच कर।
6. आम कैरोटिड धमनी लिगेचर के तुरंत बाद, आंतरिक कैरोटिड धमनी पर रखे सीवन लूप और बाहरी कैरोटिड धमनी पर डिस्टल सीवन को कसकर(चित्रा 1B)बंद करें।
7. छोटी कैंची(चित्रा 1C)का उपयोग करके, दो छोरों के बीच बाहरी कैरोटिड धमनी के लिए एक छोटा चीरा (आर्टेरियोटॉमी, पोत व्यास का आधा) डिस्टल करें। यदि चीरा बहुत बड़ा है, तो कृपया समस्या निवारण निर्देशों का पालन करें (चर्चा देखें)।
8. गाइड तारों को पॉलिश करने के लिए व्यावसायिक रूप से पॉलिश गाइड तारों का उपयोग करें या घर में विशेष कर्मियों का उपयोग करें। शराब के साथ 14 इंच पॉलिश लचीला गाइड तार कीटाणुरहित और यह 0.9% NaCl की एक बूंद में गीला करने के लिए पोत में उचित फिसलने सुनिश्चित करने के लिए।
9. बाहरी कैरोटिड धमनी(चित्रा 1D)के ट्रांसवर्स आर्टेरियोटॉमी के माध्यम से गाइड-वायर को आम कैरोटिड धमनी में डालें। घूर्णन करते समय पोत के साथ गाइड तार पारित करके एंडोथेलियल डेनडेशन प्राप्त करें। इस प्रक्रिया को तीन बार दोहराएं। प्रजनन क्षमता बढ़ाने के लिए प्रत्येक माउस में घूर्णन आंदोलन के समान आयाम बनाए रखें।
10. बाहरी कैरोटिड धमनी पर समीपस्थ लूप को कसकर बंद करें। आम धमनी और आंतरिक कैरोटिड धमनी के आसपास सीवन काटने के द्वारा कैरोटिड धमनी में रक्त प्रवाह को बहाल करें।

5. सीवन और वसूली

1. रिट्रैक्टर्स को हटा दें और मांसपेशियों की परत और दो वसा वाले शरीर को शारीरिक स्थिति में वापस करें।
2. तीन अलग टांके 0/6 के साथ त्वचा को बंद करें, अगर इकोकार्डियोग्राफिक माप की आवश्यकता है। यदि कोई इमेजिंग की आवश्यकता नहीं है, तो त्वचा को बंद करने के लिए धातु क्लिप का उपयोग करें।
3. माउस को अवरक्त प्रकाश के नीचे अपनी बाईं ओर नीचे रखें जब तक कि यह जाग न जाए। पूरी तरह से बरामद होने तक किसी जानवर को उपेक्षित न छोड़ें और न ही अन्य जानवरों की कंपनी में।
4. भविष्य की पहचान के लिए, स्थानीय प्रणाली का उपयोग कर माउस को चिह्नित करें। स्थानीय संस्था से पशु कल्याण अधिकारी से पूछें।

6. एथेरोस्क्लेरोटिक पट्टिका का विश्लेषण

1. बॉडीवेट द्वारा 100 मिलीग्राम/किलो केटामाइन और बॉडीवेट द्वारा 10 मिलीग्राम/किलो जाइलाज़ीन के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन का उपयोग करके अंत समय बिंदु पर चूहों को एनेस्थेटाइज करें। सजगता और मूंछ आंदोलन की कमी से उचित एनेस्थेटाइजेशन की पुष्टि करें।
2. रेट्रो-ऑर्बिटल या कार्डियक पंचर द्वारा एक्सेगिनिंग करें और आगे के विश्लेषण के लिए रक्त एकत्र^{करें 2।}
3. बीटाडीन के साथ त्वचा को कीटाणुरहित करें। वक्ष गुहा खोलें और दिल के दाहिने ऑरिकुलम को हटा दें। पोत से शेष रक्त को हटाने के लिए बाएं वेंट्रिकल के माध्यम से फॉस्फेट बफर समाधान और फिर ऊतक को ठीक करने के लिए 4% पीएफए को छिद्रित करें।
4. यदि कोई निर्धारण की आवश्यकता नहीं है, तो^2,4,11धोने के तुरंत बाद कैरोटिड धमनी को हटा दें। रुचि के विश्लेषण के साथ मानक प्रोटोकॉल करें: पैराफिन एम्बेडिंग, क्रायोसेक्शन, एमआरएनए या प्रोटीन विश्लेषण आदि।
5. मॉर्फोमेट्रिकल मापन के लिए, घुमावदार संदंश और छोटी कैंची का उपयोग करके महाधमनी आर्क को समीपस्थ के रूप में, न्यूनतम हेरफेर के साथ, विभाजन सहित कैरोटिड धमनी को सावधानीपूर्वक निकालें।
6. मानक एम्बेडिंग प्रोटोकॉल का उपयोग करके पैराफिन ब्लॉक में कैरोटिड धमनी को एम्बेड करें। ट्रांसवर्सल सेक्शनिंग करने के लिए, कैरोटिड धमनी को विभाजन पर सीधा रखें। विभाजन के साथ शुरू 5 μm मोटी धारावाहिक वर्गों में कटौती और उन सभी को लेपित हिस्टोलॉजिकल स्लाइड्स(चित्रा 2A)पर इकट्ठा ।
7. हर 10^खंड पर दाग मोवत धुंधला का उपयोग करने के लिए laminas^2,4,11को उजागर । सभी जहाजों (10X उद्देश्य का उपयोग करके) की सूक्ष्म चित्रों को इकट्ठा करने के बाद, विशेष डिज़ाइन किए गए सॉफ्टवेयर 2,4,11 का उपयोग करके, विशेष डिज़ाइन किए गए सॉफ्टवेयर^2,4,11का उपयोग करके, प्रत्येक खंड के लिए ल्यूमेन, साथ ही आंतरिक और बाहरी लैमिना को मापें, जैसा कि चित्र 2बीमें दिखाया गया है। जहाजों के सूचनागत विकास और मीडिया की गणना करें।
8. सामान्य इम्यूनोहिस्टोलॉजिकल स्टेनिंग² (चित्रा 2 सी)का उपयोग करके, धारावाहिक वर्गों में चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं और मैक्रोफेज सामग्री, या एंडोथेलियल रिकवरी का विश्लेषण करें।

Representative Results

एथेरोस्लेरोटिक पट्टिका प्रेरण प्रक्रिया में 15-20 मिनट लगते हैं और न्यूनतम मृत्यु दर दिखाता है, ज्यादातर प्रक्रिया के दौरान होने वाले रक्तस्राव के कारण। सर्जरी के बाद, चूहे 20 - 25 मिनट के भीतर संज्ञाहरण से ठीक हो जाते हैं। सर्जरी के बाद पक्षाघात, या खिलाने में गड़बड़ी जैसी कोई शारीरिक हानि नहीं देखी गई।

तार-चोट एक डी-एंडोथेलियलाइजेशन को प्रेरित करती है, गुब्बारे की निंदा या स्टेंट-प्रत्यारोपण के बाद संवहनी घावों की नकल करती है। चोट के तुरंत बाद, डेन्ड वैस्कुलर दीवार को थ्रोम्बोसाइट्स की एक परत से ढका जाएगा, जो मोनोसाइट्स¹²के आसंजन को मध्यस्थता और एहसान करता है। मीडिया से सक्रिय चिकनी मांसपेशी कोशिकाएं जन्म लेगी और नियोनिटिमा बनाने वाले इंटिमल रिक्त स्थान में स्थानांतरित हो जाएगी। चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के लिए अन्य जनक रक्त से माइग्रेट करेंगे (40% होने का अनुमान है) और नेओइंतिमा विकास में योगदान देते हैं। पट्टिका गठन पूर्ण पुनः एंडोथेलियलाइजेशन के बाद समाप्त हो जाएगा, आमतौर पर तार चोट के 4 सप्ताह बाद।

मोवत स्टेनिंग का उपयोग करके नियोनिटिमा गठन का आकलन किया जा सकता है। प्लेक आकार की गणना प्रत्येक स्लाइड के लिए सॉफ्टवेयर का उपयोग करके की जाती है जैसा कि चित्र 2बीमें दिखाया गया है। कुल पट्टिका आकार (बाएं कैरोटिड धमनी) 70,000 - 100,000 μm² के बीच भिन्न हो सकते हैं, जबकि नियंत्रण पोत का आकार (दाएं कैरोटिड धमनी) 7,000 - 8,000 μm² के बीच भिन्न हो सकते हैं। ये मूल्य काफी हद तक सर्जन पर निर्भर करते हैं। इसलिए, हम दृढ़ता से एक ही अध्ययन के लिए प्रयोगों के दौरान एक ही सर्जन का उपयोग करने की सलाह देते हैं।

विकसित पट्टिका स्टेंट रेस्टेनोसिस में जैसा दिखता है, जिसमें मुख्य रूप से मीडिया से बढ़ी हुई और माइग्रेट चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाएं होती हैं। इम्यूनोलॉजिकल स्टेनिंग प्रक्रियाओं द्वारा निर्धारित सेलुलर संरचना से पता चलता है कि चिकनी मांसपेशी कोशिका सामग्री लगभग 30 - 40% है, जबकि मैक्रोफेज घायल पोत के नियोनितिमा के 15 - 25% में पाए जाते हैं। एक एंडोथेलियल मार्कर के लिए धुंधला होने के बाद पुनः एंडोथेलियलाइजेशन को मापा जा सकता है, और लुमेन की पूरी परिधि पर दाग परिधि के प्रतिशत के रूप में गणना की जा सकती है। आमतौर पर री-एंडोथेलियलाइजेशन 3 सप्ताह के बाद 80 - 90% तक पहुंच जाता है, और लगभग 4 सप्ताह(चित्रा 2C)के बाद पूरा होना चाहिए। इसके विकास के दौरान पट्टिका विकास को ट्रैक करने के लिए, एक ही विश्लेषण को तार-चोट के बाद हर बार-बिंदु के लिए दोहराया जा सकता है, ब्याज और विषय के आधार पर अध्ययन किया (तालिका 1देखें)।

चित्रा 1. ऑपरेटिव प्रक्रिया का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (क) तार-चोट प्रक्रिया(बी) सामान्य कैरोटिड धमनी और इसकी शाखाओं के बढ़े हुए दृश्य के दौरान ऑपरेटर की ओर ऑपरेशन टेबल की स्थिति, जैसा कि यह 10X आवर्धन(सी) में माइक्रोस्कोप के नीचे दिखाई देता है 14 इंच गाइड वायर का उपयोग करके तार-चोट प्रक्रिया के 10X आवर्धन(डी) योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व पर माइक्रोस्कोप के तहत बाहरी कैरोटिड धमनी में चीरा का आकार। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा 2। रेटेनोसिस पट्टिका का विश्लेषण। (क) सामान्य कैरोटिड धमनी में पट्टिका विश्लेषण का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व, तार-चोट प्रेरण(बी) नियोंटिमा गठन के 4 सप्ताह बाद तार की चोट और विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले मुख्य मापदंडों के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व के 4 सप्ताह बाद । इंटिमा (ग्रीन एरिया) ल्यूमेन (लाल) और लैमिना इंटरना (ग्रीन लाइन) के बीच का अंतर है। मीडिया (पीला क्षेत्र) लैमिना एक्सटर्ना (येलो लाइन) और इंटरना (ग्रीन लाइन) के बीच का अंतर है। स्केल बार 100 माइक्रोन(सी) नियोइंटिमा गठन में शामिल मुख्य सेल प्रकारों के धुंधला की प्रतिनिधि छवियां। चिकनी मांसपेशी कोशिकाएं (चिकनी मांसपेशी ऐक्टिन -लाल, स्केल बार 100 माइक्रोन), मैक्रोफेज (मैक 2- ग्रीन, स्केल बार 100 माइक्रोन) और एंडोथेलियल कोशिकाएं (सीडी 31- लाल, तीर, स्केल बार 50 माइक्रोन)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

समय	ट्रॉमस	पट्टिका (μm²)	Macrophages (पट्टिका से%)	चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाएं (पट्टिका से%)	री-एंडोथेलियलाइजेशन (% ल्यूमेन परिधि)
1 दिन	वर्तमान	0	0	0	0
1 सप्ताह	-	30 हजार	10	लेफ्टिनेंट; 50	लेफ्टिनेंट; 50
2 सप्ताह	-	50 हजार	10	लेफ्टिनेंट; 50	50
3 सप्ताह	-	70 हजार	15-25	30-40	80-90
4 सप्ताह	-	70 000 – 100 000	15-25	30-40	पूरा

तालिका 1. समय पर निर्भर पट्टिका का विकास।

मॉडल	जानवरों	लाभ	डिसवांटाइंस
आहार-प्रेरित देशी एथेरोस्क्लेरोसिस	छोटे	एथेरोस्क्लेरोसिस पैथोलॉजी की नकल करता है हैंडलिंग में आसानी कोई सर्जरी नहीं जानवरों के लिए कोई तनाव नहीं पशु खरीद और देखभाल से संबंधित कम लागत विभिन्न ट्रांसजेनिक और नॉकआउट उपभेदों की उपलब्धता	कम प्रजनन क्षमता अत्यधिक विचरण पशुओं की संख्या में वृद्धि आवश्यक प्रतीक्षा काल में वृद्धि
	बड़ा	एथेरोस्क्लेरोसिस पैथोलॉजी की नकल करता है हैंडलिंग में आसानी कोई सर्जरी नहीं जानवरों के लिए कोई तनाव नहीं	कम प्रजनन क्षमता अत्यधिक विचरण पशुओं की संख्या में वृद्धि आवश्यक
गुब्बारा फैलाव	छोटे	गुब्बारा एंजियोप्लास्टी के बाद रिटेनोसिस की नकल करता है पशु खरीद और देखभाल से संबंधित कम लागत विभिन्न ट्रांसजेनिक और नॉकआउट उपभेदों की उपलब्धता	मुख्य धमनियों का छोटा आकार योग्य शल्य चिकित्सा विशेषज्ञता की आवश्यकता है गुब्बारे बहुत महंगे सामान्य धमनी दीवार पर डेनडेशन किया जाता है उपयुक्त उपकरणों का अस्तित्व रक्तस्राव या पक्षाघात के रूप में जटिलताओं के जोखिम
	बड़ा	गुब्बारा एंजियोप्लास्टी के बाद रिटेनोसिस की नकल करता है हैंडलिंग में आसानी मनुष्यों के लिए उपकरणों का उपयोग	सामान्य धमनी दीवार पर डेनडेशन किया जाता है
तार की चोट	छोटे	गुब्बारा एंजियोप्लास्टी के बाद रिटेनोसिस की नकल करता है हैंडलिंग में आसानी न्यूनतम मृत्यु दर पशु खरीद और देखभाल से संबंधित कम लागत विभिन्न ट्रांसजेनिक और नॉकआउट उपभेदों की उपलब्धता कोई शारीरिक दुर्बलता नहीं	मुख्य धमनियों का छोटा आकार कम योग्य शल्य चिकित्सा विशेषज्ञता की आवश्यकता है सामान्य धमनी दीवार पर डेनडेशन किया जाता है उपयुक्त उपकरणों का अस्तित्व
स्टेंट इम्प्लांटेशन	छोटे	स्टेंट प्रत्यारोपण के बाद रेस्टेनोसिस और थ्रोम्बोसिस की नकल करता है पशु खरीद और देखभाल से संबंधित कम लागत विभिन्न ट्रांसजेनिक और नॉकआउट उपभेदों की उपलब्धता	मुख्य धमनियों का छोटा आकार योग्य शल्य चिकित्सा विशेषज्ञता की आवश्यकता है छोटे स्टेंट उपलब्ध नहीं सामान्य धमनी दीवार पर डेनडेशन किया जाता है बढ़ी हुई मृत्यु दर उपयुक्त उपकरणों का अस्तित्व रक्तस्राव या पक्षाघात के रूप में जटिलताओं के जोखिम
	बड़ा	रेटेनोसिस की नकल करता है और स्टेंट प्रत्यारोपण के बाद थ्रोम्बोसिस हैंडलिंग में आसानी मनुष्यों के लिए उपकरणों का उपयोग	सामान्य धमनी दीवार पर डेनडेशन किया जाता है

तालिका 2. धमनी की चोट के मौजूदा मॉडल के फायदे और नुकसान।

Discussion

इस पेपर में, हम पशु सर्जरी में न्यूनतम अनुभव वाले कर्मियों द्वारा भी तार-चोट प्रक्रिया करने के लिए उपयोगी सुझाव प्रदान करते हैं। इस प्रक्रिया को करने में दो महत्वपूर्ण कदम हैं: बाहरी कैरोटिड धमनी का चीरा और तार का सम्मिलन। बाहरी कैरोटिड धमनी में चीरा विभाजन से जहां तक संभव हो, पर्याप्त शेष सामग्री(चित्रा 1C)सुनिश्चित करने के लिए किया जाना चाहिए । चीरा बहुत बड़ा नहीं होना चाहिए, पूरे पोत को काटने का खतरा होने के कारण। दूसरा महत्वपूर्ण कदम धमनी के दौरान रक्तस्राव का उच्च जोखिम है और यदि रक्त प्रवाह कुशलता से बंद नहीं होता है तो गाइड तार का सम्मिलन होता है। इसके अलावा, यदि गाइड तार को लुमेन पोत में ठीक से पेश नहीं किया जाता है तो एंडोथेलियल डेन्यूडेशन नहीं हो सकता है या धमनी टूटना संभव है। इससे बचने के लिए, ऑपरेशन से पहले गाइड तार की सतह को सावधानीपूर्वक पॉलिश किया जाना चाहिए।

प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने के लिए, सर्जन की ओर माउस-हेड के साथ ऑपरेटिंग-टेबल की स्थिति उचित गाइड वायर हेरफेर के लिए बेहतर दृश्य, पहुंच और नियंत्रण सुनिश्चित करती है। इसके अलावा, प्रजनन क्षमता बढ़ाने के लिए, सभी अध्ययनों में एक ही गाइड वायर का उपयोग करें। चूंकि तार का आकार नहीं बदलता है, इसलिए एक अध्ययन में शामिल सभी चूहों के लिए एक ही लिंग, उम्र और वजन का उपयोग करके चूहों के बीच सभी संभावित मतभेदों पर विचार करना और उन्हें खत्म करना महत्वपूर्ण है। इसके बाद इवांस-ब्लू स्टेनिंग से सर्जन को डेनडेशन की दक्षता तय करने में मदद मिलेगी । उचित उपकरणों का अस्तित्व प्रक्रिया की सफलता के लिए एक शर्त है । इस प्रक्रिया को करने के लिए 10X स्टीरियोमाइक्रोस्कोप आवश्यक है। गाइड-वायर की उचित तैयारी (उदाहरण के लिए इसे चमकाने) महत्वपूर्ण है। इसलिए, हम दृढ़ता से अनुशंसा करते हैं कि गाइड वायर तैयार करने का कार्य विशेष तकनीकी कर्मियों द्वारा किया जाए जहां उपलब्ध हो।

इस प्रोटोकॉल में कई समस्या निवारण कदम हैं। यदि विभाजन के पास बाहरी कैरोटिड धमनी को चीरना, ध्यान से विभाजन के पास, एक्सटर्ना बांधें, तो कोई रक्तस्राव नहीं होता है। कटिंग के दौरान बाहरी कैरोटिड धमनी को नहीं देखा जा सकता। इसलिए, रेशम सीवन के स्तर पर विभाजन पर विचार करें। जब रेशम सीवन गायब हो जाता है तो अनुभागों को इकट्ठा करें। यदि बाहरी कैरोटिड धमनी में चीरा बहुत बड़ा है और पोत उठी हुई है, तो सुनिश्चित करें कि कैरोटिड साम्यवाद और आंतरिक कैरोटिड धमनी में रक्त प्रवाह प्रभावी रूप से बाधित हो और संदंश का उपयोग करके पोत के उद्घाटन को खोजने की कोशिश करे। गाइड वायर का परिचय देने और डेफ्यूजेशन करने के बाद, विभाजन के पास पोत को बांधें। काटने के दौरान, जब सीवन से रेशम गायब होने लगता है तो इकट्ठा करना शुरू कर दें। यदि गाइड तार के साथ निंदा के दौरान धमनी टूटना होता है, तो माइक्रोस्कोप के नीचे जांच करें यदि गाइड तार ठीक से पॉलिश किया गया है।

नैदानिक स्थितियों के लिए तार-चोट मॉडल की समानता के बावजूद, कई समूह चूहों में देशी एथेरोस्क्लेरोसिस पर केंद्रित होते हैं, या वे चूहों या खरगोशों में गुब्बारे एंजियोप्लास्टी जैसे आक्रामक एथेरोस्क्लेरोसिस प्रेरण का चयन करते हैं, क्योंकि प्रशिक्षित कर्मियों की कमी होती है जो छोटे पशु सर्जरी कर सकते हैं। खरगोशों/चूहों का उपयोग करने के लाभों के बावजूद, उदाहरण के लिए लघुकृत उपकरणों की कोई आवश्यकता नहीं है, न तो चूहा मॉडल और न ही खरगोश मॉडल नियोइन्टिमा विकास और इन-स्टेंट थ्रोम्बोसिस में शामिल आणविक तंत्रों का अध्ययन करने के मामले में विभिन्न नॉक आउट उपभेदों की एक किस्म प्रदान करते हैं ।

चूहों में इन-स्टेंट रेस्टेनोसिस का अध्ययन करने के लिए मौजूदा मॉडल मुश्किल हैं, उच्च शल्य चिकित्सा कौशल की आवश्यकता होती है, और रक्तस्राव या पक्षाघात जैसी जटिलताओं के उच्च जोखिम होते हैं। उदाहरण के लिए, ऊर्ध्वाधर धमनी के माध्यम से वक्ष महाधमनी में यांत्रिक चोट या स्टेंट-प्रत्यारोपण एक उच्च मृत्यु दर (35%) हिंद लेग पक्षाघात या रक्तस्राव^13-15के कारण . हम माउस¹⁶की कैरोटिड धमनी में स्टेंट प्रत्यारोपण का भी वर्णन करते हैं । प्रक्रिया समान है; हालांकि, विश्लेषण के लिए ऊतक प्रसंस्करण जटिल है और सभी प्रयोगशालाओं के लिए उपलब्ध नहीं है¹⁶. कैरोटिड धमनी न केवल ऑपरेशन प्रक्रियाओं के लिए, बल्कि अल्ट्रासाउंड इमेजिंग जैसे मौजूदा इमेजिंग विधियों के लिए भी सीधे सुलभ है। चूहों में कैरोटिड धमनियों में अन्य चोट प्रेरण विद्युत उपकरणों का उपयोग करके किए जा सकते हैं¹⁷. इस विधि को प्रदर्शन करने के लिए आसान है और उच्च प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करता है। हालांकि, यह सभी पोत परतों में चोट को प्रेरित करता है, जो यांत्रिक चोट के समान नहीं है। गुब्बारा अनुप्रयोगों के लाभ हैं, उदाहरण के लिए नैदानिक अभ्यास के अनुरूप पोत व्यास के लिए समायोजन और रोग परिणाम पर मजबूत प्रभाव पड़ता है। हालांकि माउस गुब्बारे उपलब्ध हैं, वे बहुत महंगे हैं और इसलिए, व्यापक रूप से उपयोग नहीं किए जाते हैं। इसके बजाय, तार-चोट स्थापित विधि है, जो स्टेंट स्टेनोसिस की नकल कर रही है।

डेनडेशन सामान्य धमनी दीवार पर किया जाता है, हालांकि एक एथेरोस्क्लेरोटिक पृष्ठभूमि के साथ। इसलिए, नैदानिक स्थिति की तुलना में नियोनिटिमा गठन मध्यम होगा। प्रीक्लिनिकल मॉडल की उच्च संख्या दर्शाती है कि कोई भी मॉडल मानव में रोगविज्ञान के लिए अग्रणी सेलुलर और आणविक तंत्र की संपूर्णता को उजागर करने के लिए आवश्यक मानदंडों को पूरा नहीं करता है (तालिका 2देखें)।

तार-चोट प्रक्रिया करने के बाद, कोशिकाओं, प्रोटीन, एमएचएनए, माइक्रोआरएनए, जीन या अन्य बायोमार्कर की पहचान करने के लिए अन्य जैविक और आणविक विश्लेषण किया जा सकता है, जिसका उपयोग एथेरोस्क्लेरोसिस के लिए नई उपचार रणनीतियों को विकसित करने के लिए चिकित्सीय लक्ष्यों के रूप में किया जा सकता है, और विशेष रूप से संवहनी चोट के बाद नियोइंटिमा गठन के लिए। यदि उपलब्ध है, तो पट्टिका विकास की निगरानी उच्च आवृत्ति अल्ट्रासाउंड या अन्य उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग तकनीकों का उपयोग करके की जा सकती है। इसके अलावा, इस तकनीक में महारत हासिल करने से ऑपरेटर को प्रोटोकॉल को कॉलर प्लेसमेंट, आंशिक लिगशन या यहां तक कि स्टेंट प्रत्यारोपण जैसे अन्य आक्रामक एथेरोस्क्लेरोसिस प्रलोभन मॉडल के अनुकूल बनाने का अवसर मिलेगा।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereomicroscope	Olympus	SZ/X9	-
Forceps	FST, Germany	91197-00	standard tip curved 0,17 mm
Hemostat forceps	FST, Germany	13007-12	curved
Scissors	FST, Germany	91460-11	Straight
Vannas scissor	Aesculap, Germany	OC 498 R	-
Retractors	FST, Germany	18200-10	2.5 mm wide
Retractors	FST, Germany	18200-11	5 mm wide
Ketamine 10%	CEVA, Germany	-	-
Xylazine 2%	Medistar, Germany	-	-
Bepanthene eye and nose cream	Bayer, Germany	-	-
Silicon tube	IFK Isofluor, Germany	custom-made  product	diameter 500 µm,
section thickness 100 µm,
polytetrafluorethylene catheter
PROLENE Suture 6/0	ETHICON	8707H	polypropylene monofilament suture, unresorbable, needle CC-1, 13 mm, 3/8 Circle
7/0 Silk	Seraflex	IC 1005171Z	-
Michel Suture Clips	FST, Germany	12040-01	-
Clip Applying Forcep	FST, Germany	12018-12	-
14”Wire for Catheter	Abbot	1000462H	Use 10 cm from stiff part and equalize the ends
Mice	Charles River	Apolipoprotein E -/- mice with C57/Bl6 background	-