Abstract
Afferenta nerver inte bara förmedla information om normal fysiologi, men också signalera störd homeostas och patofysiologiska processer i olika organsystem från periferin mot det centrala nervsystemet. Som sådan har den ökade aktiviteten eller "sensibilisering" av mesenteriska afferenta nerver tilldelats en viktig roll i patofysiologin för visceral överkänslighet och abdominala smärtsyndrom.
Mesenteriska afferent nervaktivitet kan mätas in vitro i ett isolerat intestinala segment som är monterad i en specialbyggd organbad och från vilken den splanchnicus nerven isoleras, vilket gör att forskare för att direkt bedöma nervaktivitet i anslutning till det gastrointestinala segmentet. Aktivitet kan registreras vid baseline i standardiserade förhållanden under buk av segmentet eller efter tillsatsen av farmakologiska föreningar levereras intraluminalt eller serosally. Denna teknik medgerforskaren att enkelt studera effekten av läkemedel som riktar sig till perifera nervsystemet i kontrollprover; Dessutom ger det avgörande information om hur nervaktivitet förändras under sjukdom. Det bör dock noteras att mäta afferent neuronaktivitet endast utgör en relästation i det komplexa neuronala signalkaskad, och forskare bör ha i åtanke att inte förbise neuronal aktivitet på andra nivåer (t.ex. dorsalrotsganglier, ryggmärgen eller centrala nervsystemet ) för att fullt ut klarlägga komplexa neuronala fysiologi vid hälsa och sjukdom.
Vanligen använda applikationer inkluderar studier av neuronal aktivitet som svar på administrering av lipopolysackarid, och studiet av afferent nervaktivitet i djurmodeller av colon irritabile. I en mer translationell tillvägagångssätt, kan det isolerade mus tarmsegmentet exponeras för colonic supernatanter från IBS-patienter. Vidare, en modifieringav denna teknik har nyligen visat sig vara tillämplig i humana kolonprover.
Introduction
Sensorisk signalering och smärtupplevelse är en komplex process som resulterar från ett intrikat samspel mellan afferenta nerver, spinal nervceller, stigande och fallande facilitatory och hämmande vägar och flera olika områden i hjärnan. Som sådana kan förändringar vid en eller flera av dessa nivåer resulterar i förändrad sensorisk signalering och visceral smärta vid sjukdomstillstånd. För att studera alla dessa olika aspekter av sensorisk signalering flera tekniker har utvecklats som sträcker sig från enstaka cellförsök (t.ex. kalcium avbildning på neuroner) till hela djurmodeller (t.ex. beteendemässiga reaktioner såsom visceromotor svar). Den teknik som beskrivs i detta dokument tillåter forskare att särskilt bedöma afferent nervaktivitet in vitro från en isolerad del av tunntarmen eller kolon hos gnagare. Kort sagt, en isolerad gastrointestinal segment (vanligen jejunum eller kolon) monterad i en specialbyggd inspelning kammare perfusion med en fysiologisk KRebs lösning. Den splanchnicus nerv dissekeras och kopplas till en elektrod möjliggör registrering av afferent neuronal aktivitet i splanchnicus eller bäcken afferenta nerver. Nervaktiviteten kan registreras basalt eller som svar på ökande intraluminala tryck och / eller farmakologiska föreningar som kan användas antingen direkt till inspelningen kammaren (serosally), eller via det intraluminala perfusat (mukosalt) för att bedöma deras effekt på afferenta urladdning 1-6 . Att notera, splanchnicus nerver innehåller också efferenta fibrer och viscerofugal afferenter utöver de sensoriska afferenter. En av de stora fördelarna med ex vivo splanchnicus nerv inspelning är det faktum att forskarna kan kvantifiera nervaktivitet utan modulering eller input från det centrala nervsystemet, tillåter en att studera den direkta effekten av lokalt tillämpade föreningar på nervaktivitet. Dessutom övervakning av vitala parametrar, som är nödvändigt med hjälp av in vivo tillvägagångssätt (se nedan), är no längre relevant. In vitro splanchnicus inspelning slutligen mycket mindre tidskrävande än dess in vivo motsvarighet.
Afferent neuronal aktivitet som svar på andra stimuli, såsom mukosal strök, sondering med användning av von Frey-hår eller stretching av segmentet, kan studeras i en modifierad experimentuppställning i vilken tarmvävnaden är nålas ner och öppnas i längdriktningen (som är i motsats till vår inställning med en intakt segment), som beskrevs i en tidigare utgåva 7,8. Dessutom, helt nyligen, var en teknik som beskrivs för att studera kolon afferenta nerv aktivering i kolon väggen själv via kalcium avbildning, återigen med hjälp av en nålas ner, längs öppnade segment 9.
En alternativ version av detta in vivo teknik består av att mäta neuronal aktivering nära afferenta inträde i ryggmärgen. Kort sagt är den sedated djuret placerades i framstupa läge, exposing lumbosacral ryggmärgen som afferenta nervränte projekt genom laminektomi, konstruera en paraffin fylld brunn med huden på snittet och draperingar rygg RÖTTER över en platina bipolär elektrod 10,11. Denna teknik medger dessutom forskare att karakterisera fibrer baserat på deras ledningshastighet, och särskilja omyeliniserade C-fibrer från tunt myeliniserade Aδ-fibrer. Vidare dorsala rottrådar uteslutande innehåller sensoriska afferenta fibrer, i motsats till de blandade afferenta och efferenta splanchnicus nerver som nämnts tidigare.
Inspelning afferenta nerv ansvarsfrihet vitro från isolerade tarmsegment kan också göras med hjälp av prover från människa, som två forskargrupper oberoende publicerade första-in-man manuskript inspelning kolonafferent nervaktivitet i human resektion exemplar 12,13. Genomförandet av denna teknik kan resultera i en mera lätt translatipå av murina data till humana tillstånd, och kan göra det möjligt för forskare att enkelt identifiera droger som riktar sig till sensibiliserade sensoriska nerver. Den kliniska betydelsen av karakterisera afferenta nervaktivitet, liksom upptäckten av nya terapeutiska reagens som riktar orimliga afferent nervaktivitet, har omsorgsfullt diskuterats av många experter på området 14-19.
Den tidigare nämnda in vitro teknik kompletterar mer känd in vivo mätning av afferent nervaktivitet. Under in vivo-nervaktivitet mätning kan nervaktiviteten mätas direkt i sedated djuret under vilken segmentet av intresse identifieras och därefter intuberades, och en flytande paraffin fylld väl konstrueras med användning av den abdominala väggen och huden på gnagare 20. Afferenta nerv av intresse identifieras sedan, snittades och placerades på en bipolär platinaelektrod, vilket gör att nervaktivitet measurement. Denna teknik gör det möjligt för forskare att modulera afferent nervaktivitet i levande än sederade djur; som sådan, kan man studera nervaktivitet svara på störningar såsom luminala buk eller intravenös administrering av en förening.
Translationell forskning fokuserar numera huvudsakligen på tillämpningen av supernatanter humant ursprung (eg., Från kolonbiopsier, odlade perifera mononukleära blodceller, etc.) på jejunala och / eller kolon mus afferenter 21,22. Forskare kan direkt tillämpa supernatanterna antingen till organbadet eller i intraluminal lösning som perfuses tarmen segmentet, så att differentiella effekter av serosala mot mucosal ansökan kan studeras på afferenta nerv urladdning. Som sådan, visade det sig att kolon slemhinnor biopsi supernatans från patienter med IBS kan orsaka överkänslighet i mus kolon afferenter, marsvin submukös nervceller och mus dorsalaganglieneuroner 21,23,24.
Slutligen spelar in neuronal aktivitet inte är begränsad till den mesenteriala och / eller bäcken neuroner som innerverar det gastrointestinala området. Andra har visat att nerv inspelningar kan utföras i afferenter levererar knäleden 25, medan andra har präglat blåsafferent nervaktivitet samt 26-28, och visade att bäcken afferenter från blåsan samt mag-tarmkanalen konvergerar, vilket kan leda till neuronal överhörning 29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök som beskrivs nedan godkändes av kommittén för medicinsk etik och användningen av försöksdjur vid universitetet i Antwerpen (filnummer 2012-42).
1. Vävnadsberedning för jejunal och Colonic afferenta nerver
- Beredning av jejunala afferenta nerv
- Utför gnagare dödshjälp av unga eller vuxna gnagare som har godkänts före experimentet av den lokala etiska kommittén (eg., Terminal sedering följt av hjärtpunktion, halsdislokation, etc.).
OBS: Vi använde halsdislokation att offra djuren sålunda resulterar i experiment utan behov av ytterligare bedövning eller postoperativ vård som vävnader bearbetas ytterligare in vitro.
OBS: Ålder har visat sig dämpa mesenteriska afferenta mechanosensory funktioner 30, därför rekommenderar vi forskare att hålla sig till en viss åldersgrupp under helaett enda experiment. - Placera offrade försöksdjurs i ryggläge och utför en abdominal mittlinjeincision genom huden och buken muskellagret med användning av en skalpell, som sträcker sig från xyphoid processen tills blygdbenet.
- Bada bukhålan med kall Krebs lösning för att förhindra de intraabdominella vävnader från att torka ut (Krebs sammansättning: 120,03 mM NaCl, 6,22 mM KCl, 1,57 mM NaH 2 PO 4, 15,43 mM NaHCOa 3, 1,21 mM MgSO 4, 11,52 mM D-glukos och 1,52 mM CaCl2).
- Snabbt skära hela jejunum med hjälp av vass sax genom att skära ca 20 cm i tunntarmen börjar omedelbart distalt om duodenojejunal böjning, noga med att inte skada omgivande strukturer och hålla tarmen är tarmkäxet, som innehåller jejunala blodkärl och afferenta nerver, intakt.
OBS: För enbart jejunal dissektion i bukhålan, en inte behöver användaett stereomikroskop, eftersom detta kan enkelt visualiseras med blotta ögat. - Placera utskurna jejunum i iskall Krebs lösning och hålla på is, medan syresätta Krebs lösning kontinuerligt med karbogen (95% O2, 5% CO2).
- Skär jejunum med vass sax i cirka 3 cm långa slingor. Observera mesenteriala bunten innehåller fartyg och splanchnicus nerv någonstans nära centrum av respektive slinga.
- Spola varje segment med Krebs lösning med användning av en trubbig kateter för att avlägsna luminala innehållet och CHYMUS som dessa innehåller matsmältningsenzymer som kommer att påskynda försämringen av vävnadsprov in vitro.
OBS: Se till att inte skada lumen av slingan under spolning, eftersom förstörelsen av villi kommer att resultera i frisättning av mediatorer som kan förändra afferent nervaktivitet. - Identifiera segmentet för att mäta afferenta nervaktivitet (t.ex. den första jejunal segment distalt av ligamentet Treitz eller duodenojejunal böjning), och placera denna i en specialbyggd inspelning kammare belagd med ett silikonelastomerskikt.
OBS: I början av jejunum är anatomiskt definieras som den del av tunntarmen där ligamentet av Treitz korsar tunntarmen, även kallad duodenojejunal böjning.
OBS: Täck botten av inspelningen kammaren med ett tunt silikonelastomerskikt i god tid före början av experimentet. Framställningen av denna elastomerskikt ska utföras enligt tillverkarens anvisningar 1. - BEGJUTA kammaren constantly med varmt, carbogenated Krebs-lösning med en hastighet av 10 ml / minut och hålla Krebs temperaturen i inspelningen kammaren konstant vid 34 ° C.
- Montera jejunal segmentet i organbadet så att den orala änden är ansluten till sprutan föraren tillhandahåller luminala flödet och aboral änden ansluter till utflödet. något stkväljningar segmentet men se till att inte utöva överdriven spänning. Fäst båda ändarna ordentligt med 4/0 siden ligaturer till in- och utflödesportar.
- Fäst sprutan föraren att den muntliga slut, och BEGJUTA jejunala segmentet intraluminalt med Krebs lösning (icke-syre, omgivningstemperatur) med en hastighet av 10 ml / h.
- Pin tarmkäx från den monterade tarmsegmentet plant mot silikonelastomeren bottenskiktet, med hjälp av insekter stift. Sträck tarmkäxet ut i syfte att optimera visualisering av mesenteriala knippet; inte utöva belastning på bunten eller jejunum.
- Utföra ett test ramp buk (se nedan) genom att stänga utgången tills det intraluminala trycket av tarmsegmentet når 60 mmHg, i syfte att kontrollera att ingen intraluminal Krebs lösning läcker från den monterade segmentet. Observera en jämn ökning av intraluminal tryck utan avbrott.
- Observera små sammandragningar av segmentet (peristaltisk WAVes) under den inledande buk fasen. Om så erfordras, block peristaltisk aktivitet genom att tillsätta 1 | iM av L-typ kalciumantagonisten nifedipin till Krebs lösning.
OBS: Lägga ett iM atropin till Krebs lösning utöver nifedipin, kommer att helt lamslå tarmsegmentet. Vi har dock ingen personlig erfarenhet av användning och verkan av atropin på afferenta nerv inspelning. - Under en stereomikroskop, försiktigt börja dra av fettvävnad från tarmkäxet genom att försiktigt rycka den med två små pincett och var noga med att inte skada fartygen och afferenta nerver som ligger begravda i fettvävnaden.
- Börja på en avlägsen avstånd från jejunum, och exponera både blodkärl i mesenteriala bunten.
- Observera afferenta jejunal nerv i mellan båda fartygen som en tunn, vit tråd inkapslad i fettvävnad. Endast dissekera mer proximalt mot jejunum genom att försiktigt skala fettvävnad bort med pincett närinledande identifieringen av både mesenteriska fartyg och / eller afferenta nerv är svårt.
- Dissekera jejunal mesenterica nerven av segmentet fritt över ett avstånd på flera millimeter, genom att ta bort fettvävnad vidhäftande till nerven.
- Transekt nerven med hjälp av vassa vävnads sax. Om så erfordras, dra av den återstående fett och bindväv, liksom den epineuronal manteln genom att försiktigt rycka den med de små pincett.
- Med hjälp av en mikromanipulator, lägre spetsen på sug elektroden, ansluten till en spruta med kolv, till organbadet; sedan, genom manipulering av kolven, försiktigt aspirera vissa Krebs lösning från organbadet så att spetsen av elektroden är nedsänkt i Krebs lösning (Figur 1). Se till att Krebs lösning omfattar trådelektroden inuti sug elektroden.
OBS: Förbered borsilikatglas sug kapillär som innehåller trådelektroden före starten av experimentet ossing en pipett avdragare. - Placera spetsen på sug elektroden omedelbart intill transected afferenta nervsträngen och dra transected nervsträngen i kapillären över hela sin längd.
- Manövrera spetsen på elektroden mot vissa fettvävnad och aspirera detta i glaset kapillär medan stadigt aspire med kolven, därigenom mekaniskt "tätning" nerven i kapillären från innehållet i organbadet.
- Kontrollera registrering av afferenta nervaktivitet med hjälp av datainsamlingssystem, till exempel genom att utföra en ramp buk-inducerad ökning av afferenta bränning (se nedan). Efter isolering av nerven i sug elektroden, stabilisera beredningen under 15 min i syfte att erhålla ett stabilt tillstånd spontan afferent nervaktivitet innan du utför de faktiska experimenten.
- För att utföra ramp buk, tänja tarmsegmentet genom att stänga utgången, vilket leder till gradUAL tryckökning i tarmsegmentet (upp till 60 mm Hg). Endast utföra den önskade försöksprotokoll när tre på varandra följande ramp distensions (med 15 minuters intervall) ger en reproducerbar urladdning flera enheter (Figur 2).
- Utför gnagare dödshjälp av unga eller vuxna gnagare som har godkänts före experimentet av den lokala etiska kommittén (eg., Terminal sedering följt av hjärtpunktion, halsdislokation, etc.).
- Framställning av ryggradens splanchnicus afferenta (kolon afferent nerv)
OBS! Dissektion av kolon afferenta nerver kräver en mer detaljerad dissektion. Avvikelser från den tidigare "jejunala" protokoll listas nedan:- Avliva djuret med hjälp av en human metod, placera den i ryggläge, utför en mittlinjen laparotomi och överdrivet häll iskallt Krebs lösning i bukhålan. OBS: Krebs sammansättning: 118 mM NaCl, 4,75 mM KCl, 1 mM NaH 2 PO 4, 22 NaHCOa 3, 1,2 mM MgSO 4, 11 mM D-glukos och 2,5 mM CaCl2, 3 ^ M indometacin.
OBS! Notera den förändrade sammansättningen av Krebs lösning; indometacin tillsätts till den sålution för att förhindra förändringar av afferent nervaktivitet av prostaglandiner. - Kassera fettvävnad, urinblåsa och interna genitalier, och försiktigt förskjuta tunntarmen till en sida i bukhålan. Utföra en utökad prelevation av den distala delen av tjocktarmen med intakta mesenteriska nerver från buken.
OBS: Viktiga landmärken som kan ingå i denna dissektion för att underlätta ytterligare beredning av vävnaden inkluderar bukaorta och vena cava, vänster njure och bäckenbotten muskulatur.
OBS: Under dissektion, se till att inte utöva dragkraft på den anslutande vävnaden mellan kolon och bukaortan, eftersom denna region innehåller ländryggen splanchnicus nerver. - Överför mjukpapper i silikonelastomeren fodrad inspelningen kammaren. Använda den vänstra njurartären, som härstammar från den abdominala aortan, som en startpunkt. Följ bukaorta i aboral riktning, stöter de överlägsna mesenteric artär tillsammans med celiaki och överlägsen mesenteriska ganglion. Slutligen anländer till den förbindande vävnaden mellan den distala delen av tjocktarmen och aorta, varvid nerven av intresse är beläget.
- Identifiera den underlägsna mesenterica som härrör från den abdominala aortan. Ländryggen splanchnicus afferenta nerv kan identifieras på basen av sämre mesenterica; den löper parallellt med artären (figur 3).
- Efter tran av nerven, försiktigt dra av omgivande bindvävshinnan och retas nerven i flera fina trådar. Se till att hålla ett säkert avstånd från tjocktarmen.
- Rita en av dessa enkla trådar in i sug elektroden, säl kapillär med omgivande fettvävnad som tidigare beskrivits och utföra den önskade försöksprotokoll.
- Kasta bort överflödig vävnad som finns i organbadet (t.ex. njurar, bukkärl, muskelvävnad), enär dessa kan störa afferenta signalen.
OBS: nifedipin (1 ^ M) kan sättas till Krebs lösning för det fall afferenta nervsignalen störs av spontan tarmrörelse på grund av glatta muskelceller sammandragningar.
OBS: Läkemedel kan administreras på tre olika platser: 1) serosally genom upplösning av den önskade föreningen i Krebs som perfuses inspelningen kammaren, 2) direkt till organbadet medan tillfälligt stoppa perfusion eller 3) intraluminalt genom att lösa föreningen av intresse i Krebs lösning i sprutan enheten. Desensibilisering av afferenta nerv kan uppstå när kumulativa doser av en förening administreras för snabbt i följd.
- Avliva djuret med hjälp av en human metod, placera den i ryggläge, utför en mittlinjen laparotomi och överdrivet häll iskallt Krebs lösning i bukhålan. OBS: Krebs sammansättning: 118 mM NaCl, 4,75 mM KCl, 1 mM NaH 2 PO 4, 22 NaHCOa 3, 1,2 mM MgSO 4, 11 mM D-glukos och 2,5 mM CaCl2, 3 ^ M indometacin.
Figur 1: Schematisk översikt av specialbyggda inspelningen kammaren och Sug elektrod detaljerad översikt över den tek. cal installation med sug elektroden och inspelningen kammaren på plats. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Representant spårning av in vitro inspelning av jejunal Afferent nervaktivitet Typisk inspelning av jejunala flera enheter afferenta nervaktivitet (imp.sec -1) (övre panelen) vid baslinjen och som svar på 2 ramp distensions fram 60 mmHg. (lägre panel), och efterföljande identifiering (wavemark analys) av olika enkelheter i nervsignalen (tredje panel). klicka här för att se en större version av denna siffra.
"Figur 3" src = "/ filer / ftp_upload / 54576 / 54576fig3.jpg" />
Figur 3:. Neuroanatomi av Colon A) Sensorisk information från kolon leds via de lumbala colonic nerver (LCN) mot det centrala nervsystemet, med LCN körs i nära anslutning till den inferior mesenterica (IMA). En del av fibrerna från denna ryggradens kolon nerv kommer kurs längs intermesenteric nerv (IMN) för att bilda ländryggen splanchnicus nerver (LSN). Den sämre mesenterica ganglion (IMG) ligger till grund för IMA från bukaorta. Inspelning distalt av IMG är obligatorisk bör forskare vill studera viscerofugal afferent nervaktivitet. B) En schematisk översikt över försöksuppställningen. Afferenta inspelning av LCN utförs i ett organ både med hjälp av en sug elektrod ansluten till datainsamlingssystemet. Ramp utvidgning kan genomföras vid stängning av utloppsöppningen samtidigt som man fortsätter inflödet avKrebs lösning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
2. Data Acquisition
- Anteckna nervaktiviteten via en sug elektrod är ansluten till en huvudsteg. Amplify (vinna 10k) och filtrera signalen (bandpass 500 - 5000 Hz) 20.
OBS: En 50/60 Hz Buller Eliminator bör ingå i experimentuppställning för att avlägsna 50/60 Hz elektriska störningar brussignaler. Signalen är automatiskt digitaliseras och samplad vid 20 kHz för analys.
3. Analys 5,20
- Rapport afferenta nerv ansvarsfrihet som det totala antalet impulser / sekund för hela nerv eller använda specialiserad programvara för att utföra ytterligare analys, som flera enheter inspelningar av totalt nervaktivitet innehåller aktionspotentialer av olika form, amplitud och bredd, motsvarande olika nerv enheteri varje afferenta fiber (Figur 2).
- Matcha enskilda wavemarks till fördefinierade mallar, så att diskriminering mellan singel-enheter. Innan tilldelning av en spik till en viss våg-märke, ett förhållande signal-till-brus av> 2: 1 ska verkställas.
OBS: Under wavemark analys, vi bygga en ny mall när minst 10 liknande spikar identifieras av analysprogram. Ingen mall är konstruerad för former ovanligare än en i 50 spikar. En spik är anpassad till en mall med hjälp Principalkomponentanalys när åtminstone 80% av dess punkter är identiska till mallen spik. Mall matchning är operatörsberoende, och bör alltid utföras av samma forskare i en blindad sätt. - Beräkna aktionspotentialen svar genom att subtrahera spontan aktivitet vid baslinjen (intraluminal tryck på 0 mmHg) från svaret under buk vid fasta tidpunkter (5 mmHg av ökningen från 0 till 20 mmHg intraluminal tryck, steg om 10mmHg från 20 mmHg och framåt). Mät baslinjen afferenta utsläpp med hjälp av en lagerstorlek av 10 sek.
- Använd analysen enda enhet för att klassificera fibrer baserade på deras utsläpp profil under ramp buk (Figur 4). Dessutom kan enkelenhetsanalys användas för att studera kemosensitivt profilen för olika typer av enheter, som inte alla typer av enheter kommer att visa samma förändrad avfyrnings aktivitet som svar på ett läkemedel eller förening.
- Klassificera fibrer som låg tröskel fibrer ( "LT", typiskt utöva ökad urladdning vid lägre distension tryck), hög tröskel fibrer ( "HT", utöva ökad urladdning vid de högsta distension tryck), stort dynamiskt omfång fibrer (WDR ", visar ökad bränning under hela ramp buk) eller mekaniskt okänslig afferenta (MIA ", nervfibrer som vanligtvis inte svarar på ramp distensions) 5; 20.
- Uttryck nerv bränning svar på 20 mmHg som percentage av den maximala avfyrnings svar under buk (LT%) eftersom den återspeglar omfattningen av bränning vid låg buk tryck.
OBS: Därför är LT fibrer kännetecknas av en LT%> 55%, medan HT definieras av ett värde på <15%. Värden för WDR enheter varierar mellan 15 och 55% (20). En MIA visar spontan afferenta bränning som är opåverkad av distensions.
Figur 4:. Schematisk representation av Olika Afferent fiberenheterna baserat på deras Mechanosensitive Profil Units klassificeras baserat på den procentuella (LT%) av deras eldhastighet på 20 mmHg buk tryck jämfört med den maximala avfyrnings svar under distension. Låg tröskel fibrer (övre vänstra panelen) övervägande visa en ökad nervaktivitet vid låga distension tryck, vilket resulterar i en LT% av över 55%. Hög tröskel enheter (uppe till högerpanel) tvärtom bara visa en ökning av eldhastighet på skadliga tryck (% LT <15). Stort dynamiskt omfång fibrer (nedre vänstra panelen) visar en gradvis ökning av nervaktivitet under hela buk (% LT sträcker sig mellan 15 och 55), medan mekaniskt okänsliga fibrer (nedre högra panelen) inte svarar på ökande distension tryck. LT%: (inåtledande bränning vid 20 mmHg / maximal afferenta bränning) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Jejunal afferent nervaktivitet mättes vid baslinjen och som svar på ramp buk i nio åtta veckor gammal hane AV-1 möss. Djuren inhystes i grupper i standardiserade förhållanden (6 djur per bur, 20-22 ° C, luftfuktighet 40-50%, 12 timmar ljus-mörker-cykel) med obegränsad tillgång till kranvatten och vanlig chow. Jejunal segment av möss visade oregelbundna spontan afferenta nerv urladdning vid baslinjen vid en intraluminal tryck på 0 mmHg (medelvärde spontan aktivitet 11,47 ± 3,31 imp / sek).
Den jejunal afferent nervaktivitet ökas vid utför ramp distensions fram 60 mm Hg. Typiskt är ökningen av afferenta nervaktivitet efter höjningen av intraluminala tryck som kännetecknas av en bifasisk respons (Figur 5), som består av en initial snabb ökning vid bränning aktivitet fram till intraluminala trycket når 20 mmHg, which kan huvudsakligen tillskrivas den ökade eldhastighet av låg tröskel fibrer. Detta följs sedan av en platå fas, varefter en andra ökning av avfyrningsaktiviteten kan observeras från 40 mmHg uppåt, vilket utgör aktiveringen av övervägande höga tröskelfibrer.
Baserat på deras vågformer, kan singel-enheter diskrimineras i varje flerenhets inspelning och klassificeras i en av de tidigare nämnda fyra kategorier. I 9 möss, diskriminerade vi 40 olika enheter (4,44 ± 1,01 enheter / jejunal afferenta nerv), med LT enheterna är de vanligaste sådana, följt av WDR och HT fibrer (Figur 6). Avfyrnings aktiviteten för de olika enheterna som svar på rampdistension kan iakttas i figur 7.
Figur 5:
Figur 6:. Single Unit Fördelning av 40 enheter identifierade i jejunal afferenta nerver från 9 vildtyp möss HT: hög tröskel fiber, LT: låg tröskel fiber, MIA: mekaniskt okänslig fiber, WDR: stort dynamiskt omfång fiber._blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7:. Tryckresponskurvor för olika typer av subenheter i vildtyp möss Den enda enhet afferenta nerv urladdning (imp.sec -1) från de fyra olika enheter som kan identifieras, i vildtyp möss under ramp distensions. Låg tröskel fiber (LT, övre vänstra figuren) kännetecknas av en initial snabb ökning av skjutaktivitet under distensions, medan den höga tröskeln fibrer (HT, nedre vänstra bilden) display ökade bränning under skadliga intraluminala tryck. Stort dynamiskt omfång fibrer (WDR, övre högra figur) visar en stadig ökning av eldning aktivitet under hela buk, och mekano okänsliga afferenta fibrer (MIA, nedre högra figuren) inte svarar på ökande intraluminala tryck. värden repharmas över medelvärdet afferenta urladdning ± sem imp.sec -1. impulser per sekund klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet i detta dokument beskriver en reproducerbar laboratorieteknik för att studera mesenteriska afferent nervaktivitet hos gnagare som används av vår grupp och andra 3,4,7,8,12,20,21,31. Kritiska steg i protokollet omfattar snabb isolering av vävnaden, aspiration av nervsträngen i sug elektroden och adekvat "tätning" av glas kapillär från organbadet genom att aspirera omgivande fettvävnad i kapillären. Öppningen i glaskapillär bör bestämmas exakt: en öppning som är för litet kommer att komplicera aspiration av nervsträngen i elektroden, medan en alltför stor bländare kommer att hindra den "försegling" av kapillären med fettvävnad, vilket resulterar i överflödig bakgrundsljud som kommer att hämma analysen (låga signal-till-brus-inspelningar). För att möjliggöra tillförlitlig enda enhet klassificering, bör splanchnicus afferenter delas in i olika delar för att minskaantalet enheter i inspelningen. Normalt skulle vi föreslår syftar till att ha maximalt 4 - 5 enheter i varje inspelning. Forskare borde därför att justera bländaren baserat på fiber av intresse och labbet djur som används.
En annan kritisk punkt omfattar tillräcklig jordning av experimentuppställning. Sug elektroden och inspelningen kammaren bör vara tillräckligt jordad och täckt av en Faradays bur för att minimera störande elektriska fält som hindrar analys av nervaktivitet, medan all annan utrustning, inklusive inspelningsapparater, bör sprutpump et cetera installeras utanför buren .
Genom att registrera afferent nervaktivitet i närheten av jejunum eller kolon, kan man isolera den första delen av den afferenta signalöverföring kedja och enkelt studera bidrag och förändringar som uppstår vid den enda afferenta nivå utan inblandning från den centrala nervligt systemet. En av begränsningarna med denna teknik är det faktum att in vitro observationer kan inte alltid vara lätt extrapoleras till inställningen in vivo, eftersom installationen in vitro innehåller endast en relästation i det komplexa nervsignalkaskad. Som sådan måste en bredare bild göras omfattar alla andra stationer, såsom dorsalrotsganglier, centrala nervsystemet (t.ex. funktionell hjärnavbildning) och fallande (hämmande) efferenta vägar.
En annan fördel med denna metod utgör det ganska enkelt tekniskt förfarande, som en inte längre har att övervaka välbefinnandet hos labbet djur som ger de gastrointestinala provet. Å andra sidan är mätning in vitro av nervaktivitet inte lämpar sig för att belysa effekten av en systemiskt administrerade läkemedel på afferenta nervurladdning, men forskarna kan teoretiskt övervinna detta hinder genom att systemiskt administrera läkemedlet of intresse till djuret, följt av ex vivo in vitro inspelning av afferent nervaktivitet. Man bör dock vara uppmärksam på det faktum att någon drog närvarande i inspelningen kammaren kommer att spädas på grund av badet perfusion under dissektion och efterföljande inspelningar. Slutligen kan utföra in vitro splanchnicus nerv inspelningar med genmanipulerade djur tillåta forskare att fullt ut klarlägga betydelsen av olika kanaler och receptorer som uttrycks på afferenta fibrer.
Forskare försöker genomföra denna teknik måste också tänka på att identifieringen och isoleringen av den mesenteriala afferenta och bäcken afferenter kräver naturligtvis kunskap om grundläggande anatomi och teknisk utbildning, och forskare borde vara bekant med de grundläggande principerna för neuronal elektrofysiologi.
In vitro inställningen kan dessutom forskare att enkelt identifiera möjliga farmakologiska tjärablir, och ger insikt om den fysiologiska rollen av neuronal aktivitet såväl som förändrad sensorisk signalering i flera sjukdomsprocesser.
Vid jejunala afferenta mätningar kan studeras flera vävnads segment av ett enskilt djur samtidigt, en funktion som är ganska svårt att använda en in vivo setup. Forskare bör dock försiktigt tolka resultaten från olika segment, som regionala skillnader kan sned resultat. Vi rekommenderar därför att konsekvent mäta afferent nervaktivitet från samma plats (t.ex. första segment distalt från ligament Treitz eller duodenojejunal fotled).
Typiska nuvarande och framtida tillämpningar av denna teknik innefattar screening av farmakologiska föreningar som kan förändra sensibilisering av mesenteriala afferenter under patologier som kännetecknas av visceral överkänslighet och smärta. Såsom redan nämnts tidigare, målet förSE föreningar kan påträffas någonstans längs den intrikata nervsystemet som sträcker sig från det enter inre nervsystemet i hjärnan; som sådan, karakterisera och modulera afferent nervaktivitet bidrar till den bredare bild som också omfattar kalcium avbildning av inneboende enter nerver och dorsalrotsganglier mätning av visceromotor svaret som en indikator på visceral överkänslighet in vivo, och funktionell hjärnavbildning, bland andra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sodium chloride (NaCl) | VWR Chemicals | 27,810,295 | compound Krebs solution |
| potassium chloride (KCl) | Acros organics | 196770010 | compound Krebs solution |
| sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4) | VWR Chemicals | 1,063,461,000 | compound Krebs solution |
| sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | 1,063,291,000 | compound Krebs solution |
| magnesium sulfate (MgSO4) | Merck | 1,058,861,000 | compound Krebs solution |
| calcium chloride (CaCl2) | Merck | 23,811,000 | compound Krebs solution |
| D-glucose | VWR Chemicals | 1011175P | compound Krebs solution |
| Distilled water | compound Krebs solution | ||
| PVC tubing | Scientific Laboratory Supplies | The intestinal segment should be mounted over PVC tubing | |
| Silicone tubing | Scientific Laboratory Supplies | The rest of the tubing, ideally silicone-based - more easily dislodging of debris in the tubing | |
| Silk thread | Pearsall Limited | 10B15S220 | Attachment of the segment over the PVC tubing |
| Syringe driver | Harvard Apparatus | 55-2222 | Intraluminal infusion of Krebs |
| Binocular - including 10X magnification in oculair | Zeiss STEMI 2000 | Optimal visualization for the dissection of the afferent nerve | |
| Homeothermic Blanket Control Unit | Harvard Apparatus | 507214 | Heating of the organ chamber |
| Custom made organ bath with Sylgard covered bottom | |||
| Spike2 software | Recording and analysis of the data | ||
| Insect pins, 500 pieces, stainless steel, diameter 0.2 mm | Austerlitz insect pins minutiens | Dissection of the afferent nerve | |
| Tweezer Dumont #5 inox 11 cm | World Precision Instrument | 500341 | Dissection of the afferent nerve |
| Scissors, spring, 14 cm | World Precision Instrument | 15905 | Dissection of the afferent nerve |
| DB digitimer | NL 108T2/10 | pressure transducer | |
| Micromanipulator | Narishige | M-3333 | 3D manipulation of the suction electrode |
| Micromanipulator | X-4 rotating block | 3D manipulation of the suction electrode | |
| Micromanipulator | GJ-8 magnetic stand | 3D manipulation of the suction electrode | |
| LightSource | Euromex Microscopes Holland EK-1 | Optimal visualization for the dissection of the afferent nerve | |
| CED 1401 Recording Apparatus | Recording of afferent nerve activity | ||
| Humbug 50/60 Hz Noise Eliminator | Quest Scientific Instruments | Elimination of background noise | |
| Infusion Pump | Gibson Minipuls 2 | Infusion of the organ chamber in which the segment is mounted | |
| Microelectrode Holder Half Cells 1.5 mm | World Precision Instrument | MEH2SW | Suction electrode for isolation of the afferent fiber |
| Borosilicate Glass Capillaries, 300 pc; 1.5/0.84 OD/ID | World Precision Instrument | 1B150-4 | Capillary for the isolation of the afferent nerve |
References
- Donovan, J., Grundy, D. Endocannabinoid modulation of jejunal afferent responses to LPS. Neurogastroenterol Motil. 24 (10), 956-e465 (2012).
- Gregersen, H., Jiang, W., Liao, D., Grundy, D. Evidence for stress-dependent mechanoreceptors linking intestinal biomechanics and sensory signal transduction. Exp Physiol. 98 (1), 123-133 (2013).
- Keating, C., et al. Afferent hypersensitivity in a mouse model of post-inflammatory gut dysfunction: role of altered serotonin metabolism. J Physiol. 586 (18), 4517-4530 (2008).
- Liu, C. Y., Jiang, W., Muller, M. H., Grundy, D., Kreis, M. E. Sensitization of mesenteric afferents to chemical and mechanical stimuli following systemic bacterial lipopolysaccharide. Neurogastroenterol Motil. 17 (1), 89-101 (2005).
- Deiteren, A., et al. Mechanisms contributing to visceral hypersensitivity: focus on splanchnic afferent nerve signaling. Neurogastroenterol Motil. 27 (12), 1709-1720 (2015).
- Nullens, S., et al. The effect of prolonged CLP-induced sepsis on mesenteric afferent nerve activity in mice. Neurogastroenterol Motil. 27 (Suppl 2), 22 (2015).
- Brierley, S. M., Jones, R. C. III, Gebhart, G. F., Blackshaw, L. A. Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice. Gastroenterology. 127 (1), 166-178 (2004).
- Feng, B., Gebhart, G. F. In vitro functional characterization of mouse colorectal afferent endings. J Vis Exp. (95), e52310 (2015).
- Travis, L., Spencer, N. J. Imaging stretch-activated firing of spinal afferent nerve endings in mouse colon. Front Neurosci. 7, 179 (2013).
- De Schepper, H. U., et al. TRPV1 receptor signaling mediates afferent nerve sensitization during colitis-induced motility disorders in rats. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294 (1), G245-G253 (2008).
- Sengupta, J. N., Gebhart, G. F. Characterization of mechanosensitive pelvic nerve afferent fibers innervating the colon of the rat. J Neurophysiol. 71 (6), 2046-2060 (1994).
- Jiang, W., et al. First-in-man': characterising the mechanosensitivity of human colonic afferents. Gut. 60 (2), 281-282 (2011).
- Peiris, M., et al. Human visceral afferent recordings: preliminary report. Gut. 60 (2), 204-208 (2011).
- Brookes, S. J., Spencer, N. J., Costa, M., Zagorodnyuk, V. P. Extrinsic primary afferent signalling in the gut. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (5), 286-296 (2013).
- Bulmer, D. C., Grundy, D. Achieving translation in models of visceral pain. Curr Opin Pharmacol. 11 (6), 575-581 (2011).
- De Winter, B. Y., De Man, J. G. Interplay between inflammation, immune system and neuronal pathways: effect on gastrointestinal motility. World J Gastroenterol. 16 (44), 5523-5535 (2010).
- Akbar, A., Yiangou, Y., Facer, P., Walters, J. R., Anand, P., Ghosh, S. Increased capsaicin receptor TRPV1-expressing sensory fibres in irritable bowel syndrome and their correlation with abdominal pain. Gut. 57 (7), 923-929 (2008).
- De Schepper, H. U., et al. TRPV1 receptors on unmyelinated C-fibres mediate colitis-induced sensitization of pelvic afferent nerve fibres in rats. J Physiol. 586 (21), 5247-5258 (2008).
- Vermeulen, W., et al. Role of TRPV1 and TRPA1 in visceral hypersensitivity to colorectal distension during experimental colitis in rats. Eur J Pharmacol. 698 (1-3), 404-412 (2013).
- Booth, C. E., Shaw, J., Hicks, G. A., Kirkup, A. J., Winchester, W., Grundy, D. Influence of the pattern of jejunal distension on mesenteric afferent sensitivity in the anaesthetized rat. Neurogastroenterol Motil. 20 (2), 149-158 (2008).
- Hughes, P. A., et al. Sensory neuro-immune interactions differ between irritable bowel syndrome subtypes. Gut. 62 (10), 1456-1465 (2013).
- Hughes, P. A., et al. Immune derived opioidergic inhibition of viscerosensory afferents is decreased in Irritable Bowel Syndrome patients. Brain Behav Immun. 42, 191-203 (2014).
- Buhner, S., et al. Neuronal activation by mucosal biopsy supernatants from irritable bowel syndrome patients is linked to visceral sensitivity. Exp Physiol. 99 (10), 1299-1311 (2014).
- Wouters, M. M., et al. Histamine Receptor H1-mediated Sensitization of TRPV1 Mediates Visceral Hypersensitivity and Symptoms in Patients With Irritable Bowel Syndrome. Gastroenterology. , (2016).
- Brenn, D., Richter, F., Schaible, H. G. Sensitization of unmyelinated sensory fibers of the joint nerve to mechanical stimuli by interleukin-6 in the rat: an inflammatory mechanism of joint pain. Arthritis Rheum. 56 (1), 351-359 (2007).
- Christianson, J. A., Liang, R., Ustinova, E. E., Davis, B. M., Fraser, M. O., Pezzone, M. A. Convergence of bladder and colon sensory innervation occurs at the primary afferent level. Pain. 128 (3), 235-243 (2007).
- Daly, D. M., Chess-Williams, R., Chapple, C., Grundy, D. The inhibitory role of acetylcholine and muscarinic receptors in bladder afferent activity. Eur Urol. 58 (1), 22-28 (2010).
- Minagawa, T., Wyndaele, M., Aizawa, N., Igawa, Y., Wyndaele, J. J. Mechanisms of pelvic organ cross-talk: 2. Impact of colorectal distention on afferent nerve activity of the rat bladder. J Urol. 190 (3), 1123-1130 (2013).
- Wyndaele, M., et al. Mechanisms of pelvic organ crosstalk: 1. Peripheral modulation of bladder inhibition by colorectal distention in rats. J Urol. 190 (2), 765-771 (2013).
- Keating, C., Nocchi, L., Yu, Y., Donovan, J., Grundy, D. Ageing and gastrointestinal sensory function: Altered colonic mechanosensory and chemosensory function in the aged mouse. J Physiol. , (2015).
- Valdez-Morales, E. E., et al. Sensitization of Peripheral Sensory Nerves by Mediators From Colonic Biopsies of Diarrhea-Predominant Irritable Bowel Syndrome Patients: A Role for PAR2. Am J Gastroenterol. 108 (10), 1634-1643 (2013).
