Abstract
Afferente neuronen niet alleen informatie over te brengen over de normale fysiologie, maar ook het signaal verstoorde homeostase en pathofysiologische processen van de verschillende orgaansystemen van de periferie naar het centrale zenuwstelsel. Als zodanig is de toegenomen activiteit of "sensibilisatie" van mesenteriale afferente zenuwen toegewezen een belangrijke rol in de pathofysiologie van viscerale overgevoeligheid en buikpijn syndromen.
Mesenterische afferente zenuwactiviteit kan worden gemeten in vitro een geïsoleerde intestinale segment dat in een speciaal gebouwde orgaanbad gemonteerd en waarvan de splanchnische zenuw wordt geïsoleerd, waardoor onderzoekers zenuwactiviteit naast het maag-segment direct beoordelen. Activiteit kan worden opgenomen in de uitgangssituatie in gestandaardiseerde omstandigheden, tijdens uitzetting van het segment of na de toevoeging van farmacologische verbindingen intraluminaal of serosally opgeleverd. Deze techniek maaktde onderzoeker om het effect van geneesmiddelen gericht het perifere zenuwstelsel controlemonsters gemakkelijk bestuderen; bovendien biedt belangrijke informatie over neuronale activiteit wordt veranderd bij ziekte. Er moet echter worden opgemerkt dat het meten van afferente neuronale activiteit alleen vormt een relaisstation in de complexe neuronale signalering cascade, en onderzoekers moeten in gedachten houden niet neuronale activiteit kijken uit op andere niveaus (bijvoorbeeld, de ganglia, ruggenmerg of het centrale zenuwstelsel ) om de complexe neuronale fysiologie bij gezondheid en ziekte volledig te helderen.
Gebruikte toepassingen omvatten het onderzoek van neuronale activiteit in reactie op de toediening van lipopolysaccharide en de studie van afferente zenuwactiviteit in diermodellen van het prikkelbare darmsyndroom. In een translationele benadering kan het geïsoleerde muis intestinale segment worden blootgesteld aan colon supernatanten van IBS-patiënten. Bovendien is een wijzigingvan deze techniek is onlangs aangetoond in menselijke colon specimens toepassing.
Introduction
Zintuiglijke signalering en pijnperceptie is een complex proces dat voortvloeit uit een ingewikkeld samenspel van afferente zenuwen, ruggenmerg neuronen, stijgende en dalende faciliterende en remmende paden en verschillende hersengebieden. Als zodanig kunnen veranderingen in één of meer van deze niveaus resulteren in gewijzigde zintuiglijke signalering en ingewandspijn bij ziektetoestanden. Om al deze verschillende aspecten van zintuiglijke signalering meerdere technieken te bestuderen zijn ontwikkeld variërend van eencellige experimenten (bijvoorbeeld calcium beeldvorming op neuronen) op hele diermodellen (bijvoorbeeld gedragsreacties zoals visceromotor respons). De in dit document beschreven techniek stelt onderzoekers in staat om specifiek te beoordelen afferente zenuwactiviteit in vitro van een geïsoleerd segment van de dunne darm of dikke darm bij knaagdieren. Kortom, een geïsoleerd maag-segment (meestal jejunum of colon) gemonteerd in een speciaal gebouwde opname kamer geperfuseerd met een fysiologische KRebs oplossing. De Nervi Splanchnici is gratis ontleed en verbonden met een elektrode waardoor registratie van afferente neuronale activiteit in splanchnisch of bekken afferente zenuwen. Zenuwactiviteit kan basaal of in antwoord op toenemende intraluminale druk en / of farmacologische samenstelling die direct in de opname kamer (serosally) kan worden aangebracht, of via de intraluminale perfusaat (mucosaal) om hun effect op afferente ontlading 1-6 evalueren geregistreerd . We merken splanchnische zenuwen bevatten ook efferente vezels en viscerofugal afferenten naast de sensorische afferenten. Een van de grote voordelen van ex vivo splanchnicus zenuw opname is dat onderzoekers zenuwactiviteit kan kwantificeren zonder modulatie of een signaal van het centrale zenuwstelsel, zodat men de rechtstreekse werking van lokaal toegediende verbindingen op zenuwactiviteit bestuderen. Bovendien controleren van vitale parameters, zoals noodzakelijk is met de in vivo benadering (zie hieronder), no langer relevant. In vitro splanchnisch opname is uiteindelijk veel minder tijd in beslag dan de in vivo tegenhanger.
Afferente neuronale activiteit in respons op andere stimuli, zoals mucosale strelen, indringende behulp von Frey haren of strekken van het segment, kan worden onderzocht in een gemodificeerde experimentele opstelling waarin het darmweefsel wordt vastgepind en longitudinaal geopend (dit in tegenstelling tot onze opstelling met behulp van een intact segment), zoals werd beschreven in een vorige uitgave 7,8. Bovendien, pas onlangs, een techniek werd beschreven aan de dikke afferente zenuwen activering studeren in de dikke wand zelf via calcium imaging, opnieuw met een vastgepind, longitudinaal geopend segment 9.
Een alternatieve versie van deze in vivo techniek bestaat uit het meten neuronale buurt vermelding afferente's in het ruggenmerg. Kortom, het verdoofd dier geplaatst in buikligging, exposing het lumbosacrale ruggenmerg waaraan de afferente zenuw van belang projecten door middel van laminectomie, de bouw van een paraffine gevuld en met behulp van de huid van de incisie en draperen de dorsale worteltje over een platina-bipolaire elektrode 10,11. Deze techniek maakt voorts onderzoekers vezels op basis van hun geleidingssnelheid karakteriseren en te onderscheiden gemyeliniseerde C-vezels uit dun gemyeliniseerde Aδ-vezels. Bovendien dorsale wortels bevatten uitsluitend sensorische afferente vezels, in tegenstelling tot de gemengde afferente en efferente zenuwen ingewands eerder vermeld.
Opname afferente zenuwactiviteit in vitro van geïsoleerde darm segmenten kan ook worden gedaan met behulp van menselijke specimens, als twee onderzoeksgroepen onafhankelijk gepubliceerd first-in-man manuscripten opnemen colon afferente zenuw activiteit in het menselijk resectie exemplaren 12,13. De toepassing van deze techniek kan leiden tot een beter vertalinop van muizen gegevens aan de menselijke staat, en kan leiden tot onderzoekers gemakkelijk drugs richten op de gesensibiliseerd gevoelszenuw identificeren. De klinische betekenis karakteriseren de afferente zenuwactiviteit, en de ontdekking van nieuwe therapeutische reagentia die gericht buitensporige afferente zenuwactiviteit is uitvoerig besproken door vele deskundigen op het gebied 14-19.
De voornoemde in vitro techniek vormt een aanvulling op de meer algemeen in vivo meten van afferente zenuwactiviteit bekend. Tijdens de in vivo neuronale activiteit meting kan zenuwactiviteit direct worden gemeten in de verdoofde dier waarin het segment van belang geïdentificeerd en vervolgens geïntubeerd en een vloeibare paraffine gevulde goed geconstrueerd met de buikwand en de huid van het knaagdier 20. De afferente zenuw van belang wordt vervolgens geïdentificeerd, doorgesneden en op een bipolaire platina-elektrode, waardoor neuronale activiteit measurement. Deze techniek maakt het mogelijk de onderzoeker afferente zenuwactiviteit moduleren in levende zij gesedeerd dieren; als zodanig kan men neuronale activiteit reageert op storingen zoals luminale uitzetting of intraveneuze toediening van een verbinding bestuderen.
Translationeel onderzoek richt zich tegenwoordig vooral op de toepassing van humaan afgeleide supernatanten (bijv., Uit colon biopten, gekweekte perifere mononucleaire cellen, enzovoort) op jejunale en / of colon muis afferenten 21,22. Onderzoekers kunnen direct supernatants zijn hetzij in het orgel bad of in de intraluminale oplossing die de darm segment perfundeert, zodat de differentiële effecten van serosal versus mucosale applicatie kan worden bestudeerd op afferente zenuwactiviteit. Zo werd aangetoond dat colonic mucosale biopsie supernatans van patiënten met prikkelbare darmsyndroom kan overgevoeligheid bij muizen colon afferenten, cavia submukeuze neuronen en muis dorsale wortel veroorzakenganglion neuronen 21,23,24.
Tenslotte opname neuronale activiteit is niet beperkt tot de mesenteriale en / of bekken neuronen innerveren het maagdarmkanaal. Anderen hebben aangetoond dat zenuw opnames in afferentia kan worden uitgevoerd leveren van het kniegewricht 25, terwijl anderen blaas afferente zenuwactiviteit hebben gekenmerkt en 26-28, en toonde aan dat het bekken afferentia uit de blaas en het maagdarmkanaal convergeren, mogelijk resulterend in neuronale 29 overspraak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven hieronder beschreven, werden goedgekeurd door het Comité voor Medische Ethiek en het gebruik van proefdieren aan de Universiteit Antwerpen (dossiernummer 2012-42).
1. Tissue Voorbereiding van de jejunale en Colonic afferente neuronen
- Voorbereiding van de jejunale afferente zenuw
- Voer knaagdier euthanasie van de adolescent of volwassene knaagdieren die voorafgaand aan het experiment door de lokale Ethische Commissie heeft goedgekeurd (bijv., Terminale sedatie gevolgd door cardiale lekke band, cervicale dislocatie, etc.).
OPMERKING: Wij gebruikten cervicale dislocatie de dieren hetgeen resulteert in experimenten offeren zonder verdere verdoving of postoperatieve zorg weefsels verder worden verwerkt in vitro.
OPMERKING: Leeftijd is aangetoond verzwakken mesenteriale afferente functies mechanosensorische 30, dus we raden onderzoekers houden aan een specifieke leeftijdsgroep voor de duur vaneen enkel experiment. - Plaats het geofferde proefdier in rugligging en het uitvoeren van een abdominale middellijn incisie door de huid en buikspier laag met behulp van een scalpel, dat zich uitstrekt van de xyphoid proces tot het schaambeen.
- Baden de buikholte met koude Krebs oplossing om te voorkomen dat de intra-abdominale weefsel uitdroogt (Krebs samenstelling: 120,03 mM NaCl, 6,22 mM KCl, 1,57 mM NaH 2PO 4, 15,43 mM NaHCO 3, 1,21 mM MgSO 4, 11,52 mM D-glucose en 1,52 mM CaCl 2).
- Snel accijnzen het hele nuchtere darm met behulp van een scherpe schaar door het uitsnijden van ongeveer 20 cm van de dunne darm te beginnen onmiddellijk distaal van de duodenojejunal buiging, zorg ervoor dat u de omliggende structuren beschadigen en het bijhouden van de darmen's mesenterium, die jejunale bloedvaten en afferente zenuwen bevat, intact.
LET OP: Voor de loutere jejunale dissectie in de buikholte, men hoeft niet te gebruikeneen stereomicroscoop, omdat dit kan gemakkelijk met het blote oog. - Plaats de uitgesneden jejunum in ijskoude Krebs oplossing en houdt op ijs, onder voortdurend zuurstof de Krebs oplossing met carbogeen (95% O2, 5% CO2).
- Snijd de jejunum met scherpe schaar in ongeveer 3 cm lang loops. Let op de mesenteriale bundel met de schepen en Nervi Splanchnici ergens in de buurt van het centrum van de respectievelijke lus.
- Spoel elk segment met Krebs oplossing met een stomp katheter luminale inhoud te verwijderen en maagbrij aangezien deze spijsverteringsenzymen dat de verslechtering van het weefselmonster in vitro versnellen bevatten.
OPMERKING: Zorg het lumen van de lus niet wordt beschadigd tijdens het spoelen, de vernietiging van de villi zal resulteren in de afgifte van mediatoren die de afferente zenuwactiviteit kan veranderen. - Identificeer het segment van de afferente zenuw activiteit te meten (bijvoorbeeld de eerste jejunale segment distaal van het ligament van Treitz of duodenojejunal buiging), en plaats deze in een speciaal gebouwde opname kamer bedekt met een silicone elastomeer laag.
Opmerking: Het begin van het jejunum wordt anatomisch gedefinieerd als het deel van de dunne darm, waar het ligament van Treitz kruist de dunne darm, ook wel de duodenojejunal buiging.
OPMERKING: Bedek de bodem van de opname kamer met een dunne silicone elastomeerlaag ruim van tevoren voor het begin van het experiment. De bereiding van deze elastomeerlaag worden uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant 1. - Perfuseren de kamer voortdurend met warme, carbogenated Krebs oplossing bij een snelheid van 10 ml / min en houdt de Krebs 'temperatuur van de opname kamer constant op 34 ° C.
- Monteer het jejunum segment in het orgaanbad zodat de orale uiteinde is verbonden met de spuitpomp verschaffen luminale stroom en aboral einde aansluit op de uitstroomopening. lichtjes stkokhalzen het segment maar zorg overmatige spanning niet uit te oefenen. Bevestig beide uiteinden stevig vast met 4/0 zijde ligaturen aan de in- en uitstroom poorten.
- Bevestig de spuitpomp de mondelinge einde en perfuseren de jejunale segment intraluminaal met Krebs-oplossing (niet geoxideerde, omgevingstemperatuur) met een snelheid van 10 ml / uur.
- Speld het mesenterium van de gemonteerde intestinale segment plat tegen de siliconenelastomeer onderste laag, met behulp van insect pinnen. Strek het mesenterium uitgevoerd om visualisatie van de mesenteriale bundel te optimaliseren; hoeft niet druk uit te oefenen op de bundel of het jejunum.
- Voer een test helling uitzetting (zie hieronder) door het sluiten van de uitgang van de haven totdat de intraluminale druk van de intestinale segment bereikt 60 mmHg, om te controleren dat geen intraluminale Krebs oplossing lekt uit de gemonteerde segment. Let op een vlotte stijging van de intraluminale druk zonder onderbrekingen.
- Observeer kleine samentrekkingen van het segment (peristaltische waves) tijdens de eerste fase uitzetting. Desgewenst blokkeren peristaltische activiteit door toevoeging van 1 uM van het L-type calcium channel blocker nifedipine de Krebs oplossing.
Opmerking: Het toevoegen van 1 uM atropine de Krebs oplossing naast nifedipine, zal volledig verlammen darmsegment. We hebben echter geen persoonlijke ervaring met het gebruik en het effect van atropine op de afferente zenuwen opname. - Onder een stereomicroscoop, zacht beginnen te pellen het vetweefsel van het mesenterium door zachtjes te trekken met twee kleine pincet, het verzorgen van de schepen en afferente zenuw die begraven liggen in het vetweefsel niet te beschadigen.
- Vanaf een afstand van het jejunum en bloot zowel bloedvaten in het mesenteriale bundel.
- Let op de afferente jejunale zenuw in tussen beide schepen als een dunne, witte draad ingekapseld in vetweefsel. Alleen ontleden meer proximaal naar de jejunum door voorzichtig pellen het vetweefsel weg met een pincet, wanneer deinitiële identificatie van zowel mesenteriale vaten en / of de afferente zenuw moeilijk.
- Ontleden de jejunale mesenteriale zenuw van het vrije segment over een afstand van enkele millimeters, door het verwijderen van het vetweefsel aanhanger van de zenuw.
- Doorsnijden van de zenuw met behulp van scherpe weefsel schaar. Desgewenst trek het resterende vet en bindweefsel, evenals de epineuronal omhulsel door zachtjes trekken met de kleine pincet.
- Met behulp van een micromanipulator, verlagen de punt van de afzuigelektrode, verbonden met een injectiespuit met zuiger, in het orgaanbad; Vervolgens, door het manipuleren van de plunjer zachtjes zuigen sommige Krebs oplossing van het orgaanbad zodat het uiteinde van de elektrode wordt ondergedompeld in de Krebs-oplossing (figuur 1). Zorg ervoor dat de Krebs-oplossing omvat de draad elektrode in de zuig-elektrode.
NB: Bereid de borosilicaatglas capillaire zuiging dat de draadelektrode voor het begin van het experiment ons bevating een pipet trekker. - Plaats de punt van de zuig-elektrode direct naast de doorsneden afferente zenuw streng en trek de doorgesneden zenuw streng in de capillaire over de gehele lengte.
- Manoeuvreren punt van de elektrode aan sommige vetweefsel en zuig dit in het glas capillair door stevig opzuigen met de zuiger, waardoor mechanisch 'afdichting' de zenuw in de capillair van de inhoud van het orgaanbad.
- Controleer of de opname van afferente zenuwactiviteit met behulp van de data-acquisitie-systeem, bijvoorbeeld door het uitvoeren van een ramp-uitzetting veroorzaakte toename van afferente vuren (zie hieronder). Na de isolatie van de zenuw in de afzuigelektrode stabiliseren de voorbereiding van 15 minuten om een stabiele toestand spontane afferente zenuwactiviteit verkrijgen voordat de eigenlijke experimenten.
- Om ramp uitzetting uit te voeren, opzwellen de intestinale segment door het sluiten van de uitgang, wat leidt tot gradgriteit drukverhoging in de intestinale segment (maximaal 60 mmHg). Voer alleen de gewenste experimentele protocol wanneer drie opeenvolgende uitzettingen helling (met een 15 minuten interval) op een reproduceerbare meerdere eenheden ontlading (figuur 2).
- Voer knaagdier euthanasie van de adolescent of volwassene knaagdieren die voorafgaand aan het experiment door de lokale Ethische Commissie heeft goedgekeurd (bijv., Terminale sedatie gevolgd door cardiale lekke band, cervicale dislocatie, etc.).
- Voorbereiding van de lumbale splanchnisch afferente (colon afferente zenuw)
NB: De ontleding van het colon afferente zenuwen vereist een meer gedetailleerde dissectie. Afwijkingen van de voormalige 'jejunale' protocol zijn hieronder opgesomd:- Euthanaseren van de dieren door middel van een humane methode, plaats hem in de rugligging, het uitvoeren van een middellijn laparotomie en overdreven giet ijskoude Krebs oplossing in de buikholte. OPMERKING: Krebs samenstelling: 118 mM NaCl, 4,75 mM KCl, 1 mM NaH 2PO 4, 22 NaHCO3, 1,2 mM MgSO4, 11 mM D-glucose en 2,5 mM CaCl 2, 3 uM indomethacine.
LET OP: Let op de veranderde samenstelling van de Krebs oplossing; indomethacine toegevoegd aan de zolutie met het oog op wijzigingen van afferente zenuwactiviteit te voorkomen door prostaglandines. - Gooi het vetweefsel, blaas en inwendige genitaliën, en voorzichtig verschuiving van de dunne darm bij zich in de buikholte. Voer een uitgebreide prelevation van het distale deel van de colon met intacte mesenteriale zenuwen uit de buik.
OPMERKING: Belangrijke bezienswaardigheden die in deze dissectie worden opgenomen om verdere bereiding van het weefsel helpen omvatten de abdominale aorta en vena cava, de linker nier en de bekkenbodemspieren.
LET OP: Tijdens de dissectie, zorg niet om de tractie uit te oefenen op het bindweefsel tussen de dikke darm en de abdominale aorta, omdat dit gebied bevat de lumbale Nervi Splanchnici. - Breng de weefsel segment in de silicone-elastomeer bekleed opname kamer. Gebruik de linker nierslagader, dat afkomstig is van de abdominale aorta, als uitgangspunt. Volg de abdominale aorta in de aboral richting, kennis met de superieure mesenteric slagader samen met de buikholte en superieure mesenteriale ganglion. Ten slotte komen het bindweefsel tussen het distale deel van de dikke darm en de aorta, waarbij de zenuw plaats ligt.
- Identificeer de inferieure mesenterische slagader uitgaande van de abdominale aorta. De lumbale splanchnisch afferente zenuwen kunnen worden geïdentificeerd aan de basis van de lagere mesenterica; loopt evenwijdig aan de slagader (figuur 3).
- Naar aanleiding van de doorsnijding van de zenuw voorzichtig afpellen van de omliggende bindweefsel schede en plagen de zenuw in een aantal fijne draden. Zorg ervoor dat u op een veilige afstand te houden van de dikke darm.
- Teken een van deze enkele draden in de zuig-elektrode, "verbinding" de capillair met omliggende vetweefsel zoals eerder beschreven en voert u de gewenste experimentele protocol.
- Gooi het overtollige weefsel die in het orgaanbad (bijvoorbeeld, nieren, abdominale vaten, spierweefsel), as die kunnen het afferente signaal verstoren.
LET OP: Nifedipine (1 uM) kan aan de Krebs-oplossing voor het geval de afferente zenuw signaal wordt verstoord door spontane intestinale beweging worden toegevoegd als gevolg van gladde spiercellen contracties.
OPMERKING: Geneesmiddelen kunnen op drie verschillende plaatsen worden toegediend: 1) serosally door oplossen van de gewenste verbinding in de Krebs dat de opname kamer perfundeert, 2) direct in het orgaanbad terwijl de perfusie tijdelijk stoppen of 3) intraluminaal door de verbinding plaats in de Krebs oplossing in de injectiespuit station. Desensibilisatie van de afferente zenuw kan optreden wanneer cumulatieve doseringen van een verbinding te snel achter elkaar worden toegediend.
- Euthanaseren van de dieren door middel van een humane methode, plaats hem in de rugligging, het uitvoeren van een middellijn laparotomie en overdreven giet ijskoude Krebs oplossing in de buikholte. OPMERKING: Krebs samenstelling: 118 mM NaCl, 4,75 mM KCl, 1 mM NaH 2PO 4, 22 NaHCO3, 1,2 mM MgSO4, 11 mM D-glucose en 2,5 mM CaCl 2, 3 uM indomethacine.
Figuur 1: Schematisch overzicht van de speciaal gebouwde Recording Kamer en afzuigelektrode gedetailleerd overzicht van de Techni. cal setup met de zuig-elektrode en de opname kamer op zijn plaats. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Representatieve Tracing van de in vitro opname van jejunale afferente zenuwactiviteit Typische opname van jejunale multi-unit afferente zenuwactiviteit (imp.sec -1) (bovenste paneel) bij aanvang en in reactie op 2 ramp uitzettingen tot 60 mmHg. (onderste paneel), en de latere identificatie (wavemark analyse) van verschillende single-eenheden in de zenuw signaal (derde paneel). klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
"Figuur 3" src = "/ files / ftp_upload / 54576 / 54576fig3.jpg" />
Figuur 3:. Neuroanatomy van Colon A) Sensorische informatie van de dikke darm wordt getransporteerd via de lumbale zenuwen colon (LCN) naar het centrale zenuwstelsel, de LCN uitgevoerd in de nabijheid van de onderste mesenterische slagader (IMA). Een gedeelte van de vezels van deze lumbale colon zenuw natuurlijk langs de intermesenteric zenuw (IMN) aan de lumbale zenuwen splanchnische (LSN) vormen. De inferieure mesenterische ganglion (IMG) bevindt zich aan de basis van de IMA van de abdominale aorta. Opname distaal van de IMG is verplicht moeten onderzoekers willen viscerofugal afferente zenuwactiviteit. B) Een schematisch overzicht van de experimentele set-up te bestuderen. Afferente registratie van de LCN wordt uitgevoerd in een orgaan geschieden met behulp van een zuig-elektrode verbonden met het data-acquisitiesysteem. Ramp distensie kan worden uitgevoerd bij het sluiten van de uitlaatpoort en tegelijkertijd de instroom vanKrebs-oplossing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
2. Data Acquisition
- Noteer de zenuwactiviteit via een zuig-elektrode is verbonden met een headstage. Amplify (krijgen 10k) en filteren het signaal (bandpass 500 - 5000 Hz) 20.
OPMERKING: Een 50/60 Hz Noise eliminator moeten worden opgenomen in de experimentele opstelling om 50/60 Hz elektrische interferentie ruissignalen verwijderen. Het signaal wordt automatisch gedigitaliseerd en bemonsterd op 20 kHz voor analyse.
3. Analyse 5,20
- Rapporteer de afferente zenuwactiviteit als het totale aantal pulsen / seconde voor de gehele zenuw of gebruik speciale software om verdere analyses uit te voeren, multi-unit onderzoek van de totale zenuwactiviteit bevatten actiepotentialen van verschillende vorm, amplitude en breedte, die overeenkomen met verschillende zenuw unitsIedere afferente vezels (figuur 2).
- Pas individuele wavemarks vooraf gedefinieerde templates, waardoor discriminatie tussen single-eenheden. Vóór bestemming van een piek op een bepaalde wave-merk, een signaal-ruisverhouding van> 2: 1 worden toegepast.
LET OP: Tijdens wavemark analyse, bouwen we een nieuwe template wanneer ten minste 10 soortgelijke pieken worden geïdentificeerd door de analyse software. Templateloze wordt geconstrueerd vormen zeldzamer dan 1 in 50 pieken. Een piek wordt gekoppeld aan een template gebruikt hoofdcomponentenanalyse wanneer ten minste 80% van zijn punten identiek aan de template spike zijn. Sjabloon matching is afhankelijk van de operator, en moet altijd worden uitgevoerd door dezelfde onderzoeker in een geblindeerde wijze. - Bereken de actiepotentiaal antwoorden door het aftrekken van de spontane activiteit bij aanvang (intraluminale druk van 0 mmHg) vanaf de respons tijdens uitzetting op vaste tijdstippen (5 mmHg increment 0 tot 20 mmHg intraluminale druk stappen van 10mmHg vanaf 20 mmHg en verder). Meet de basislijn afferente ontlading met behulp van een bak afmeting van 10 sec.
- Met de enkele eenheid analyse vezels op basis van hun ontlaadprofiel tijdens de uitloop distensie (figuur 4) te classificeren. Bovendien kan een enkele eenheid analyse worden gebruikt om de chemotherapie gevoelig profiel van verschillende eenheden te bestuderen, aangezien niet alle soorten eenheden dezelfde veranderde afvuren activiteit wordt weergegeven in reactie op een geneesmiddel of samenstelling.
- Classificeren vezels zo laagdrempelig vezels ( 'LT', meestal uit te oefenen verhoogde ontlading bij de lagere uitzetting drukken), hoge drempel vezels ( 'HT', uit te oefenen verhoogde afvoer op het hoogste distensie druk), een breed dynamisch bereik vezels ( 'WDR', demonstreren verhoogde vuren gedurende de gehele oprit uitzetting) of mechanisch ongevoelig afferente ( 'MIA', zenuwvezels die meestal niet reageren op uitzettingen oprit) 5; 20.
- Versneld de zenuw stoken reactie bij 20 mmHg als de percentage van de maximale respons vuren tijdens uitzetting (LT%) als het weerspiegelt de mate van schieten op lage distensie druk.
OPMERKING: Daarom zijn LT vezels gekenmerkt door een LT%> 55%, terwijl HT worden gedefinieerd door een waarde van <15%. Waarden voor WDR eenheden liggen tussen 15 en 55% (20). Een MIA toont spontane afferente bakken dat wordt beïnvloed door uitzettingen.
Figuur 4:. Schematische weergave van de verschillende afferente vezelunits basis van hun mechanosensitieve profielgegevens ingedeeld gebaseerd op het percentage (LT%) van hun verbrandingssnelheid bij 20 mmHg druk distensie opzichte van de maximale respons vuren tijdens uitzetting. Lage drempel vezels (linksboven) voornamelijk een verhoogde zenuwactiviteit tonen bij lage distensie drukken, resulterend in een LT% van meer dan 55%. Hoge drempel eenheden (rechtsbovenpaneel) daarentegen alleen een verhoging van vuren op schadelijke drukken (LT% <15) weergegeven. Breed dynamisch bereik vezels (linker paneel) vertonen een geleidelijke toename zenuwactiviteit tijdens de gehele uitzetting (% LT variërend tussen 15 en 55), terwijl mechanisch ongevoelig vezels (onderste rechter paneel) niet reageren op toenemende uitzetting druk. LT%: (afferente vuren op 20 mmHg / maximale afferente afvuren) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Jejunale afferente zenuwactiviteit werd gemeten bij basislijn en respons op distensie helling 9 in acht weken oude mannelijke OF-1-muizen. De dieren werden in groepen gehuisvest in gestandaardiseerde condities (6 dieren per kooi, 20-22 ° C, luchtvochtigheid 40 - 50%, 12 uur licht-donker cyclus) met onbeperkte toegang tot water en regelmatige chow tik. Jejunale segmenten van muizen weergegeven onregelmatige spontane afferente zenuwactiviteit bij aanvang op een intraluminale druk van 0 mmHg (gemiddelde spontane activiteit 11.47 ± 3.31 imp / sec).
De jejunale afferente zenuwactiviteit verhoogd na het uitvoeren van ramp uitzettingen tot 60 mmHg. Meestal wordt de toename van afferente zenuwactiviteit na de stijging intraluminale druk gekenmerkt door een bifasische respons (figuur 5), bestaande uit een initiële snelle toename afvuren activiteit tot de intraluminale druk 20 mmHg bereikt, which kan vooral worden toegeschreven aan de verhoogde vuursnelheid van lage drempel vezels. Dit wordt dan gevolgd door een plateaufase, waarna een tweede verhoging afvuren activiteit verder kan worden waargenomen vanaf 40 mmHg, die de activering van voornamelijk hoge drempel vezels.
Op basis van hun golfvormen kunnen enkele eenheden worden onderscheiden in elk meerdere eenheden opnemen en geclassificeerd in een van de genoemde vier categorieën. 9 in muizen We onderscheiden 40 verschillende eenheden (4,44 ± 1,01 eenheden / jejunale afferente zenuw), met de LT-eenheden de meest voorkomende die, gevolgd door WDR en HT vezels (figuur 6). Het afvuren activiteit van de verschillende eenheden in reactie op distensie ramp kan worden waargenomen in Figuur 7.
Figuur 5:
Figuur 6:. Single Unit Distributie van 40 eenheden genoemd in jejunale afferente neuronen van 9 Wild-type muizen HT: hoge drempel vezels, LT: lage drempel fiber, MIA: mechanisch ongevoelig vezel, WDR: groot dynamisch bereik fiber._blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7:. Pressure-respons curves voor de verschillende soorten van subeenheden in wild-type muizen De single-unit afferente zenuwactiviteit (imp.sec -1) uit de vier verschillende eenheden die kunnen worden geïdentificeerd, in wild-type muizen tijdens de ramp uitzettingen. Een lage drempel fiber (LT, linksboven figuur) wordt gekenmerkt door een aanvankelijke snelle stijging van de vuren activiteit tijdens distensies, terwijl de hoge drempel vezels (HT, linksonder figuur) alleen vertoning toegenomen afvuren tijdens schadelijke intraluminale druk. Breed dynamisch bereik vezels (WDR, de bovenste afbeelding rechts) laten een gestage toename van het afvuren activiteit tijdens de gehele buik, en mechanisch-ongevoelige afferente vezels (MIA, rechtsonder figuur) niet reageren op de toenemende intraluminale druk. waarden repkwalijk gemiddelde afferente ontlading ± sem imp.sec -1. impulsen per seconde Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het protocol in dit document beschrijft een reproduceerbare laboratoriumtechniek om mesenteriale afferente zenuw activiteit in knaagdieren zoals gebruikt door onze groep en anderen 3,4,7,8,12,20,21,31. Kritische stappen in het protocol onder meer de snelle isolatie van het weefsel, het streven van de zenuw streng in de zuig-elektrode en de adequate 'verzegelen' van het glazen capillair van het orgel bad door opzuigen omliggende vetweefsel in het capillair. De opening van de glazen capillaire nauwkeurig moeten worden vastgesteld: een opening die te klein is zal het streven van de zenuw streng compliceren in de elektrode, terwijl een te groot diafragma van de 'afsluiting' van het capillair met vetweefsel zal belemmeren, wat resulteert in redundante achtergrondgeluid dat de analyse (lage signaal-ruis opnamen) belemmeren. Om mogelijk betrouwbare enkele eenheid indeling moet splanchnische afferenten worden verdeeld in verschillende onderdelen om de verminderingaantal eenheden in de opname. Typisch, suggereren wij gericht op maximaal 4 hebben - 5 eenheden in elke opname. Onderzoekers daarom moet de opening op basis van de vezel van belang, en het lab dier dat wordt toegepast aan te passen.
Een ander kritisch punt omvat de toereikende aarding van de experimentele opstelling. De zuig-elektrode en opname kamer moeten adequaat worden geaard en gedekt door een kooi van Faraday om een minimum te beperken storende elektrische velden die de analyse van neuronale activiteit belemmeren, terwijl alle andere apparatuur, waaronder de opname apparaten, moet spuit bestuurder et cetera buiten de kooi worden geïnstalleerd .
Door het opnemen afferente zenuwactiviteit in de nabijheid van het jejunum en colon, kan men het eerste deel van de afferente signaaltransductie isoleren en gemakkelijk te bestuderen en de bijdrage veranderingen die zich voordoen op enige afferente level zonder tussenkomst van de centrale NERVlende systeem. Een van de beperkingen van deze techniek is dat in vitro waarnemingen niet altijd moeiteloos geëxtrapoleerd naar de in vivo omgeving, zoals de in vitro setup bevat slechts één relaisstation in het complex zenuw signaalcascade. Als zodanig moet een breder beeld worden gemaakt waarin alle andere zenders, zoals de ganglia, centraal zenuwstelsel (bijvoorbeeld functionele beeldvorming van de hersenen) en dalen (remmende) efferente pathways.
Een ander voordeel van deze methode is de vrij eenvoudige technische procedure als een niet langer aan het welzijn van het proefdier dat het maag model levert volgen. Anderzijds is het in vitro meten van neuronale activiteit niet geschikt voor het ophelderen van het effect van systemisch toegediende geneesmiddel op afferente zenuwactiviteit, maar onderzoekers theoretisch dit obstakel te overwinnen door systemische toediening van het geneesmiddel of belang voor het dier, gevolgd door het ex vivo in vitro opname van afferente zenuwactiviteit. Men dient echter aandacht voor het feit dat een geneesmiddel in de opname kamer worden verdund door het bad perfusie tijdens de dissectie en verdere opnames zijn. Tenslotte uitvoeren in vitro splanchnicus zenuw opnamen met behulp van genetisch gemanipuleerde dieren waardoor onderzoekers om de rol van verschillende kanalen en receptoren tot expressie gebracht op afferente vezels volledig helderen.
De onderzoekers proberen om deze techniek moet ook rekening mee houden dat de identificatie en isolatie van de mesenteriale afferente en bekken afferentia uiteraard basiskennis van de anatomie en technische opleiding vereist uit te voeren, en onderzoekers moeten worden kennis te maken met de basisprincipes van neuronaal elektrofysiologisch.
De in vitro instelling kunt bovendien onderzoekers om mogelijke farmacologische teer gemakkelijk identificerenkrijgt, geeft inzicht in de fysiologische rol van neuronale activiteit en veranderde zintuiglijke signalering in verschillende ziekteprocessen.
In het geval van jejunale afferente metingen kunnen meerdere weefsel segmenten van een enkel dier tegelijkertijd worden bestudeerd, een functie die is nogal moeilijk met behulp van een in-vivo-setup. Onderzoekers moeten echter voorzichtig te interpreteren resultaten van verschillende segmenten, zoals regionale verschillen kon vertekening resultaten. Daarom adviseren wij om consequent meten van afferente zenuwactiviteit van dezelfde site (bijvoorbeeld eerste segment distaal van het ligament van Treitz of duodenojejunal buiging).
Typische huidige en toekomstige toepassingen van deze techniek omvatten het screenen van verbindingen die farmacologische sensibilisatie van mesenterische afferentia kan veranderen tijdens pathologieën die worden gekenmerkt door viscerale overgevoeligheid en pijn. Zoals reeds eerder vermeld, het doel van dese verbindingen kunnen ergens tegengekomen de ingewikkelde zenuwstelsel zich van intrinsieke enterische zenuwstelsel naar de hersenen; als zodanig karakteriseren en moduleren afferente zenuwactiviteit bijdraagt aan het bredere beeld dat ook omvat calcium beeldvorming van de intrinsieke enterische zenuwen en ganglia, de meting van de visceromotor respons als een indicator van viscerale hypersensitiviteit in vivo en functionele beeldvorming, onder andere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sodium chloride (NaCl) | VWR Chemicals | 27,810,295 | compound Krebs solution |
| potassium chloride (KCl) | Acros organics | 196770010 | compound Krebs solution |
| sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4) | VWR Chemicals | 1,063,461,000 | compound Krebs solution |
| sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | 1,063,291,000 | compound Krebs solution |
| magnesium sulfate (MgSO4) | Merck | 1,058,861,000 | compound Krebs solution |
| calcium chloride (CaCl2) | Merck | 23,811,000 | compound Krebs solution |
| D-glucose | VWR Chemicals | 1011175P | compound Krebs solution |
| Distilled water | compound Krebs solution | ||
| PVC tubing | Scientific Laboratory Supplies | The intestinal segment should be mounted over PVC tubing | |
| Silicone tubing | Scientific Laboratory Supplies | The rest of the tubing, ideally silicone-based - more easily dislodging of debris in the tubing | |
| Silk thread | Pearsall Limited | 10B15S220 | Attachment of the segment over the PVC tubing |
| Syringe driver | Harvard Apparatus | 55-2222 | Intraluminal infusion of Krebs |
| Binocular - including 10X magnification in oculair | Zeiss STEMI 2000 | Optimal visualization for the dissection of the afferent nerve | |
| Homeothermic Blanket Control Unit | Harvard Apparatus | 507214 | Heating of the organ chamber |
| Custom made organ bath with Sylgard covered bottom | |||
| Spike2 software | Recording and analysis of the data | ||
| Insect pins, 500 pieces, stainless steel, diameter 0.2 mm | Austerlitz insect pins minutiens | Dissection of the afferent nerve | |
| Tweezer Dumont #5 inox 11 cm | World Precision Instrument | 500341 | Dissection of the afferent nerve |
| Scissors, spring, 14 cm | World Precision Instrument | 15905 | Dissection of the afferent nerve |
| DB digitimer | NL 108T2/10 | pressure transducer | |
| Micromanipulator | Narishige | M-3333 | 3D manipulation of the suction electrode |
| Micromanipulator | X-4 rotating block | 3D manipulation of the suction electrode | |
| Micromanipulator | GJ-8 magnetic stand | 3D manipulation of the suction electrode | |
| LightSource | Euromex Microscopes Holland EK-1 | Optimal visualization for the dissection of the afferent nerve | |
| CED 1401 Recording Apparatus | Recording of afferent nerve activity | ||
| Humbug 50/60 Hz Noise Eliminator | Quest Scientific Instruments | Elimination of background noise | |
| Infusion Pump | Gibson Minipuls 2 | Infusion of the organ chamber in which the segment is mounted | |
| Microelectrode Holder Half Cells 1.5 mm | World Precision Instrument | MEH2SW | Suction electrode for isolation of the afferent fiber |
| Borosilicate Glass Capillaries, 300 pc; 1.5/0.84 OD/ID | World Precision Instrument | 1B150-4 | Capillary for the isolation of the afferent nerve |
References
- Donovan, J., Grundy, D. Endocannabinoid modulation of jejunal afferent responses to LPS. Neurogastroenterol Motil. 24 (10), 956-e465 (2012).
- Gregersen, H., Jiang, W., Liao, D., Grundy, D. Evidence for stress-dependent mechanoreceptors linking intestinal biomechanics and sensory signal transduction. Exp Physiol. 98 (1), 123-133 (2013).
- Keating, C., et al. Afferent hypersensitivity in a mouse model of post-inflammatory gut dysfunction: role of altered serotonin metabolism. J Physiol. 586 (18), 4517-4530 (2008).
- Liu, C. Y., Jiang, W., Muller, M. H., Grundy, D., Kreis, M. E. Sensitization of mesenteric afferents to chemical and mechanical stimuli following systemic bacterial lipopolysaccharide. Neurogastroenterol Motil. 17 (1), 89-101 (2005).
- Deiteren, A., et al. Mechanisms contributing to visceral hypersensitivity: focus on splanchnic afferent nerve signaling. Neurogastroenterol Motil. 27 (12), 1709-1720 (2015).
- Nullens, S., et al. The effect of prolonged CLP-induced sepsis on mesenteric afferent nerve activity in mice. Neurogastroenterol Motil. 27 (Suppl 2), 22 (2015).
- Brierley, S. M., Jones, R. C. III, Gebhart, G. F., Blackshaw, L. A. Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice. Gastroenterology. 127 (1), 166-178 (2004).
- Feng, B., Gebhart, G. F. In vitro functional characterization of mouse colorectal afferent endings. J Vis Exp. (95), e52310 (2015).
- Travis, L., Spencer, N. J. Imaging stretch-activated firing of spinal afferent nerve endings in mouse colon. Front Neurosci. 7, 179 (2013).
- De Schepper, H. U., et al. TRPV1 receptor signaling mediates afferent nerve sensitization during colitis-induced motility disorders in rats. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294 (1), G245-G253 (2008).
- Sengupta, J. N., Gebhart, G. F. Characterization of mechanosensitive pelvic nerve afferent fibers innervating the colon of the rat. J Neurophysiol. 71 (6), 2046-2060 (1994).
- Jiang, W., et al. First-in-man': characterising the mechanosensitivity of human colonic afferents. Gut. 60 (2), 281-282 (2011).
- Peiris, M., et al. Human visceral afferent recordings: preliminary report. Gut. 60 (2), 204-208 (2011).
- Brookes, S. J., Spencer, N. J., Costa, M., Zagorodnyuk, V. P. Extrinsic primary afferent signalling in the gut. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (5), 286-296 (2013).
- Bulmer, D. C., Grundy, D. Achieving translation in models of visceral pain. Curr Opin Pharmacol. 11 (6), 575-581 (2011).
- De Winter, B. Y., De Man, J. G. Interplay between inflammation, immune system and neuronal pathways: effect on gastrointestinal motility. World J Gastroenterol. 16 (44), 5523-5535 (2010).
- Akbar, A., Yiangou, Y., Facer, P., Walters, J. R., Anand, P., Ghosh, S. Increased capsaicin receptor TRPV1-expressing sensory fibres in irritable bowel syndrome and their correlation with abdominal pain. Gut. 57 (7), 923-929 (2008).
- De Schepper, H. U., et al. TRPV1 receptors on unmyelinated C-fibres mediate colitis-induced sensitization of pelvic afferent nerve fibres in rats. J Physiol. 586 (21), 5247-5258 (2008).
- Vermeulen, W., et al. Role of TRPV1 and TRPA1 in visceral hypersensitivity to colorectal distension during experimental colitis in rats. Eur J Pharmacol. 698 (1-3), 404-412 (2013).
- Booth, C. E., Shaw, J., Hicks, G. A., Kirkup, A. J., Winchester, W., Grundy, D. Influence of the pattern of jejunal distension on mesenteric afferent sensitivity in the anaesthetized rat. Neurogastroenterol Motil. 20 (2), 149-158 (2008).
- Hughes, P. A., et al. Sensory neuro-immune interactions differ between irritable bowel syndrome subtypes. Gut. 62 (10), 1456-1465 (2013).
- Hughes, P. A., et al. Immune derived opioidergic inhibition of viscerosensory afferents is decreased in Irritable Bowel Syndrome patients. Brain Behav Immun. 42, 191-203 (2014).
- Buhner, S., et al. Neuronal activation by mucosal biopsy supernatants from irritable bowel syndrome patients is linked to visceral sensitivity. Exp Physiol. 99 (10), 1299-1311 (2014).
- Wouters, M. M., et al. Histamine Receptor H1-mediated Sensitization of TRPV1 Mediates Visceral Hypersensitivity and Symptoms in Patients With Irritable Bowel Syndrome. Gastroenterology. , (2016).
- Brenn, D., Richter, F., Schaible, H. G. Sensitization of unmyelinated sensory fibers of the joint nerve to mechanical stimuli by interleukin-6 in the rat: an inflammatory mechanism of joint pain. Arthritis Rheum. 56 (1), 351-359 (2007).
- Christianson, J. A., Liang, R., Ustinova, E. E., Davis, B. M., Fraser, M. O., Pezzone, M. A. Convergence of bladder and colon sensory innervation occurs at the primary afferent level. Pain. 128 (3), 235-243 (2007).
- Daly, D. M., Chess-Williams, R., Chapple, C., Grundy, D. The inhibitory role of acetylcholine and muscarinic receptors in bladder afferent activity. Eur Urol. 58 (1), 22-28 (2010).
- Minagawa, T., Wyndaele, M., Aizawa, N., Igawa, Y., Wyndaele, J. J. Mechanisms of pelvic organ cross-talk: 2. Impact of colorectal distention on afferent nerve activity of the rat bladder. J Urol. 190 (3), 1123-1130 (2013).
- Wyndaele, M., et al. Mechanisms of pelvic organ crosstalk: 1. Peripheral modulation of bladder inhibition by colorectal distention in rats. J Urol. 190 (2), 765-771 (2013).
- Keating, C., Nocchi, L., Yu, Y., Donovan, J., Grundy, D. Ageing and gastrointestinal sensory function: Altered colonic mechanosensory and chemosensory function in the aged mouse. J Physiol. , (2015).
- Valdez-Morales, E. E., et al. Sensitization of Peripheral Sensory Nerves by Mediators From Colonic Biopsies of Diarrhea-Predominant Irritable Bowel Syndrome Patients: A Role for PAR2. Am J Gastroenterol. 108 (10), 1634-1643 (2013).
