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Neuroscience

माउस मध्यांत्रीय और colonic अनुभाग में Mesenteric अभिवाही तंत्रिका गतिविधि के इन विट्रो रिकॉर्डिंग में

doi: 10.3791/54576 Published: October 25, 2016

Abstract

अभिवाही नसों न केवल सामान्य शरीर विज्ञान के विषय में जानकारी देने के, लेकिन यह भी परेशान homeostasis और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र की ओर परिधि से अलग अंग प्रणालियों के pathophysiological प्रक्रियाओं का संकेत। जैसे, वृद्धि की गतिविधि या mesenteric अभिवाही नसों की 'संवेदीकरण' आंत अतिसंवेदनशीलता और पेट में दर्द सिंड्रोम के pathophysiology में एक महत्वपूर्ण भूमिका आवंटित किया गया है।

Mesenteric अभिवाही तंत्रिका गतिविधि एक अलग आंतों खंड है कि एक उद्देश्य से बनाया अंग स्नान में मुहिम शुरू की है और जिसमें से स्प्लैनकिंक तंत्रिका अलग है, शोधकर्ताओं सीधे तंत्रिका गतिविधि जठरांत्र खंड से सटे आकलन करने के लिए अनुमति देने में इन विट्रो में मापा जा सकता है। गतिविधि मानकीकृत परिस्थितियों में बेस लाइन पर दर्ज किया जा सकता, खंड की बढ़ाव या intraluminally या serosally को जन्म दिया औषधीय यौगिकों के अलावा निम्न के दौरान। इस तकनीक की अनुमति देता हैशोधकर्ता आसानी से नियंत्रण नमूनों में परिधीय तंत्रिका तंत्र को लक्षित दवाओं के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए; इसके अलावा, यह कैसे neuronal गतिविधि की बीमारी के दौरान बदल जाता है पर महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करता है। लेकिन यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि अभिवाही neuronal फायरिंग गतिविधि को मापने केवल जटिल न्यूरोनल में एक रिले स्टेशन झरना संकेत गठन किया है, और शोधकर्ताओं के मन में नहीं सहन अन्य स्तरों (जैसे, पृष्ठीय रूट ganglia, रीढ़ की हड्डी या केंद्रीय तंत्रिका तंत्र पर neuronal गतिविधि को नजरअंदाज करने के लिए करना चाहिए ) आदेश में पूरी तरह से स्वास्थ्य और रोग में जटिल न्यूरोनल शरीर क्रिया विज्ञान को स्पष्ट करने के लिए।

आमतौर पर इस्तेमाल किया अनुप्रयोगों lipopolysaccharide के प्रशासन के जवाब में neuronal गतिविधि का अध्ययन, और चिड़चिड़ा आंत्र सिंड्रोम के पशु मॉडल में अभिवाही तंत्रिका गतिविधि के अध्ययन में शामिल हैं। एक अधिक translational दृष्टिकोण में, अलग-थलग माउस आंतों खंड IBS रोगियों से colonic supernatants से अवगत कराया जा सकता है। इसके अलावा, एक संशोधनइस तकनीक की हाल ही में मानव colonic नमूनों में लागू होना दिखाया गया है।

Introduction

संवेदी संकेतन और दर्द धारणा एक जटिल प्रक्रिया है कि अभिवाही नसों, रीढ़ की हड्डी में न्यूरॉन्स, आरोही और facilitatory और निरोधात्मक रास्ते उतरते और कई अलग अलग मस्तिष्क क्षेत्रों के बीच एक जटिल परस्पर क्रिया का परिणाम है। जैसे, इनमें से एक या अधिक के स्तर के पर परिवर्तन बदल संवेदी संकेतन और रोग राज्यों में आंत का दर्द हो सकता है। संवेदी सिगनल कई तकनीकों के इन सभी विभिन्न पहलुओं का अध्ययन करने के लिए एकल कोशिका के प्रयोगों से लेकर विकसित किया गया है (जैसे, न्यूरॉन्स पर कैल्शियम इमेजिंग) पूरे पशु मॉडल (जैसे, इस तरह के visceromotor प्रतिक्रिया के रूप में व्यवहार प्रतिक्रियाओं)। तकनीक इस पत्र में वर्णित शोधकर्ताओं ने विशेष रूप से छोटी आंत या कृन्तकों में पेट के एक अलग खंड से इन विट्रो में अभिवाही तंत्रिका गतिविधि का आकलन करने के लिए अनुमति देता है। संक्षेप में, एक अलग जठरांत्र खंड (आमतौर पर सूखेपन या कोलोन) एक उद्देश्य से बनाया रिकॉर्डिंग कक्ष एक शारीरिक कश्मीर के साथ perfused में रखा हैrebs समाधान। स्प्लैनकिंक तंत्रिका मुक्त विच्छेदित और एक इलेक्ट्रोड स्प्लैनकिंक या श्रोणि अभिवाही नसों में अभिवाही neuronal गतिविधि के पंजीकरण की अनुमति के लिए जुड़ा हुआ है। तंत्रिका गतिविधि basally या intraluminal दबाव और / या औषधीय यौगिकों कि या तो सीधे रिकॉर्डिंग कक्ष (serosally) में लागू किया जा सकता बढ़ रही है, या intraluminal perfusate (mucosally) के माध्यम के जवाब में अभिवाही मुक्ति 1-6 पर उनके प्रभाव का आकलन करने के लिए दर्ज किया जा सकता । ध्यान से, स्प्लैनकिंक नसों भी अपवाही फाइबर और संवेदी afferents के अलावा viscerofugal afferents होते हैं। पूर्व vivo स्प्लैनकिंक तंत्रिका रिकॉर्डिंग के प्रमुख लाभ में से एक तथ्य यह है कि शोधकर्ताओं ने मॉडुलन या केंद्रीय तंत्रिका तंत्र से इनपुट के बिना तंत्रिका गतिविधि यों कर सकते हैं, तंत्रिका गतिविधि पर स्थानीय रूप से लागू यौगिकों के प्रत्यक्ष प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक की अनुमति है। इसके अलावा, महत्वपूर्ण मापदंडों की निगरानी, के रूप में विवो दृष्टिकोण का उपयोग आवश्यक है (देखें नीचे), एन हैओ अब प्रासंगिक है। इन विट्रो स्प्लैनकिंक रिकॉर्डिंग अंत में बहुत कम समय लेने वाली अपनी इन विवो समकक्ष से।

ऐसे श्लैष्मिक पथपाकर के रूप में अन्य उत्तेजनाओं, वॉन फ्रे बाल का उपयोग कर जांच कर रही या खंड की खींच के जवाब में अभिवाही neuronal गतिविधि, एक संशोधित प्रयोगात्मक स्थापना जिसमें आंतों के ऊतकों नीचे टिकी और longitudinally खोला (जो के विपरीत है में अध्ययन किया जा सकता है एक अक्षुण्ण खंड का उपयोग) हमारे सेटअप, के रूप में पिछले एक मुद्दा 7.8 में वर्णित किया गया था। इसके अलावा, हाल ही में, एक तकनीक कैल्शियम इमेजिंग के माध्यम से colonic दीवार अपने आप में colonic अभिवाही तंत्रिका सक्रियण अध्ययन करने के लिए, फिर से एक नीचे टिकी, longitudinally खंड 9 खोला उपयोग वर्णित किया गया था।

इस विवो तकनीक का एक वैकल्पिक संस्करण रीढ़ की हड्डी में अभिवाही के प्रवेश के पास न्यूरोनल सक्रियण को मापने के बाहर होते हैं। संक्षेप में, बेहोश जानवर में प्रवण स्थिति, ई रखा गया हैएक तेल से भरे अच्छी तरह से चीरा की त्वचा का उपयोग और एक प्लैटिनम द्विध्रुवी इलेक्ट्रोड 10,11 से अधिक पृष्ठीय नीचे का भाग draping lumbosacral रीढ़ की हड्डी laminectomy के साधन, निर्माण से ब्याज परियोजनाओं की जो अभिवाही तंत्रिका को xposing। इस तकनीक इसके अलावा शोधकर्ताओं ने बारीकी myelinated Aδ-फाइबर से उनकी चालन वेग पर आधारित फाइबर को चिह्नित करने के लिए, और भेद बिना मेलिनकृत सी फाइबर की अनुमति देता है। इसके अलावा, पृष्ठीय rootlets विशेष रूप से संवेदी अभिवाही फाइबर होते हैं, जैसा कि पहले उल्लेख मिश्रित अभिवाही और अपवाही स्प्लैनकिंक नसों के विपरीत।

पृथक पेट क्षेत्रों से इन विट्रो में अभिवाही तंत्रिका मुक्ति रिकॉर्डिंग भी मानव नमूनों का उपयोग किया जा सकता है, स्वतंत्र रूप से प्रकाशित प्रथम आदमी मानव लकीर में colonic अभिवाही तंत्रिका गतिविधि रिकॉर्डिंग पांडुलिपियों नमूनों 12,13 दो अनुसंधान समूहों के रूप में। इस तकनीक के कार्यान्वयन के लिए एक और अधिक आसानी से translati में हो सकता हैमानवीय राज्य के लिए murine डेटा के पर, और शोधकर्ताओं आसानी से अवगत संवेदी तंत्रिका को लक्षित दवाओं की पहचान के लिए अनुमति दे सकता है। अभिवाही तंत्रिका गतिविधि, साथ ही नए चिकित्सीय अभिकर्मकों कि अत्यधिक अभिवाही तंत्रिका गतिविधि लक्ष्य की खोज निस्र्पक के नैदानिक महत्व, अलंकृत क्षेत्र 14-19 में कई विशेषज्ञों ने चर्चा की गई है।

ऊपर उल्लिखित इन विट्रो तकनीक का पूरक है और आमतौर पर अभिवाही तंत्रिका गतिविधि के vivo माप में जाना जाता है। इन विवो neuronal गतिविधि माप के दौरान, तंत्रिका गतिविधि बेहोश पशु के दौरान जो ब्याज की खंड की पहचान की है और बाद में intubated में सीधे मापा जा सकता है, और एक तरल आयल भरा अच्छी तरह से पेट की दीवार और कृंतक 20 की त्वचा का उपयोग निर्माण किया है। ब्याज की अभिवाही तंत्रिका तो, पहचान sectioned और एक द्विध्रुवी इलेक्ट्रोड प्लैटिनम पर रखा, neuronal गतिविधि की अनुमति है measuremenटी। इस तकनीक को बेहोश जानवरों यद्यपि जीने में अभिवाही तंत्रिका गतिविधि मिलाना शोधकर्ता अनुमति देता है; जैसे, एक ऐसी ल्यूमिनल बढ़ाव या एक यौगिक की नसों में प्रशासन के रूप में हस्तक्षेप का जवाब neuronal गतिविधि का अध्ययन कर सकते हैं।

ट्रांसलेशनल अनुसंधान आजकल मुख्य रूप से मानव व्युत्पन्न supernatants के आवेदन पर केंद्रित है (जैसे।, Colonic बायोप्सी, खेती परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear, आदि से) मध्यांत्रीय और / या colonic माउस afferents 21,22 पर। शोधकर्ताओं ने सीधे, या तो अंग स्नान में या intraluminal समाधान है कि आंत्र खंड perfuses में supernatants आवेदन कर सकते हैं इसलिए serosal श्लैष्मिक आवेदन बनाम की है कि अंतर प्रभाव अभिवाही तंत्रिका मुक्ति पर अध्ययन किया जा सकता है। जैसे, यह दिखाया गया था चिड़चिड़ा आंत्र सिंड्रोम के साथ रोगियों से कि colonic श्लैष्मिक बायोप्सी supernatans माउस colonic afferents, गिनी पिग submucous न्यूरॉन्स और माउस पृष्ठीय रूट में अतिसंवेदनशीलता पैदा कर सकता हैनाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स 21,23,24।

अंत में, neuronal गतिविधि रिकॉर्डिंग mesenteric तक ही सीमित नहीं है और / या श्रोणि न्यूरॉन्स जठरांत्र पथ innervating। दूसरों को दिखा दिया है कि तंत्रिका रिकॉर्डिंग संयुक्त घुटने से 25 की आपूर्ति afferents में प्रदर्शन किया जा सकता है, जबकि दूसरों को मूत्राशय अभिवाही तंत्रिका गतिविधि की विशेषता है के रूप में अच्छी तरह से 26-28, और दिखा दिया कि मूत्राशय से श्रोणि afferents के रूप में अच्छी तरह से जठरांत्र संबंधी मार्ग एकाग्र, संभवतः न्यूरोनल में जिसके परिणामस्वरूप crosstalk 29।

Protocol

नीचे वर्णित सभी पशु प्रयोगों के लिए मेडिकल एथिक्स समिति और एंटवर्प विश्वविद्यालय (फाइल संख्या 2012-42) में प्रायोगिक पशुओं के उपयोग के द्वारा अनुमोदित किया गया।

1. मध्यांत्रीय के ऊतक तैयार और colonic अभिवाही तंत्रिकाओं

  1. मध्यांत्रीय अभिवाही तंत्रिका की तैयारी
    1. किशोर या वयस्क कृंतक कि स्थानीय नैतिक समिति द्वारा प्रयोग करने से पहले अनुमोदित किया गया है के कृंतक इच्छामृत्यु प्रदर्शन करना (जैसे।, टर्मिनल कार्डियक पंचर, गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था, आदि के द्वारा पीछा किया बेहोश करने की क्रिया)।
      नोट: हम आगे संज्ञाहरण या शल्य चिकित्सा के बाद की देखभाल के लिए आवश्यकता के बिना इस तरह के प्रयोगों में जिसके परिणामस्वरूप जानवरों को बलिदान करने के रूप में ऊतकों आगे इन विट्रो में कार्रवाई कर रहे हैं ग्रीवा अव्यवस्था का इस्तेमाल किया।
      नोट: उम्र attenuate करने के लिए mesenteric अभिवाही mechanosensory कार्यों 30, इसलिए हम शोधकर्ताओं की सलाह है की अवधि के लिए एक विशेष आयु समूह का पालन करने के लिए दिखाया गया हैएक ही प्रयोग।
    2. लापरवाह स्थिति में बलिदान प्रयोगशाला पशु प्लेस और एक छुरी का उपयोग कर त्वचा और पेट की मांसपेशियों परत के माध्यम से एक उदर midline चीरा प्रदर्शन, जघन हड्डी तक xyphoid प्रक्रिया से बढ़ा।
    3. आदेश (क्रेब्स रचना बाहर सुखाने से अंतर पेट के ऊतकों को रोकने के लिए ठंड क्रेब्स समाधान के साथ उदर गुहा स्नान: 120.03 मिमी NaCl, 6.22 मिमी KCl, 1.57 मिमी नः 2 4 पीओ, 15.43 मिमी 3 NaHCO, 1.21 मिमी MgSO 4, 11.52 मिमी डी ग्लूकोज और 1.52 मिमी 2 CaCl)।
    4. तेजी से तुरंत duodenojejunal वंक की distally शुरू छोटी आंत के लगभग 20 सेमी excising, देखभाल नहीं ले जा आसपास के ढांचे को नुकसान करने और आंत्र के अन्त्रपेशी, जो मध्यांत्रीय रक्त वाहिकाओं और अभिवाही नसों शामिल हैं, को बरकरार रखते हुए तेज कैंची का उपयोग पूरे सूखेपन आबकारी।
      नोट: उदर गुहा में मात्र मध्यांत्रीय विच्छेदन के लिए, एक का उपयोग करने की जरूरत नहीं हैइस के रूप में एक stereomicroscope, आसानी से नग्न आंखों से देखे जा सकते हैं।
    5. बर्फ ठंड क्रेब्स समाधान में excised सूखेपन की जगह और बर्फ पर रखने, जबकि carbogen (95% हे 2, 5% सीओ 2) के साथ लगातार क्रेब्स समाधान oxygenating।
    6. लगभग 3 सेमी लंबे छोरों में तेज कैंची के साथ सूखेपन कट। संबंधित पाश के केंद्र के पास कहीं वाहिकाओं और स्प्लैनकिंक तंत्रिका युक्त mesenteric बंडल का निरीक्षण करें।
    7. ल्यूमिनल सामग्री हटाने और काइम के रूप में इन पाचक एंजाइम है कि इन विट्रो में ऊतक के नमूने की गिरावट में तेजी लाने जाएगा रोकने के लिए एक कुंद कैथेटर का उपयोग कर क्रेब्स समाधान के साथ प्रत्येक खंड फ्लश।
      नोट:, निस्तब्धता दौरान पाश के लुमेन को नुकसान नहीं के रूप में विल्ली के विनाश के मध्यस्थों कि अभिवाही तंत्रिका गतिविधि को बदल सकते हैं की रिहाई का परिणाम देगा ख्याल रखना।
    8. अभिवाही तंत्रिका गतिविधि को मापने के लिए खंड को पहचानें (जैसे, पहले मध्यांत्रीय segmeNT distally एक उद्देश्य से बनाया रिकॉर्डिंग कक्ष एक सिलिकॉन elastomer परत के साथ लेपित में) Treitz का बंधन या duodenojejunal वंक, और इस जगह की।
      नोट: सूखेपन की शुरुआत anatomically छोटी आंत जहां Treitz के बंधन छोटी आंत पार के हिस्से के रूप में परिभाषित किया गया है, यह भी duodenojejunal वंक बुलाया।
      नोट: अच्छी तरह से प्रयोग के शुरू होने से पहले अग्रिम में एक पतली परत के साथ सिलिकॉन elastomer रिकार्डिंग कक्ष के तल को कवर किया। इस इलास्टोमेर परत की तैयारी निर्माता के निर्देशों के अनुसार 1 किया जाना चाहिए।
    9. चैम्बर गर्म के साथ लगातार छिड़कना, 10 मिलीग्राम / मिनट की दर से क्रेब्स समाधान carbogenated और 34 डिग्री सेल्सियस पर रिकार्डिंग कक्ष निरंतर में क्रेब्स 'तापमान रखने के लिए।
    10. अंग स्नान में मध्यांत्रीय खंड माउंट इतना है कि मौखिक अंत सिरिंज ल्यूमिनल प्रवाह और एबोरल अंत बहिर्वाह को जोड़ता उपलब्ध कराने के ड्राइवर से जुड़ा है। थोड़ा सेंटखंड उबकना लेकिन अत्यधिक तनाव लागू करने के लिए नहीं ख्याल रखना। दोनों मजबूती में और बहिर्वाह बंदरगाहों के लिए 4/0 रेशम संयुक्ताक्षर का उपयोग कर समाप्त होता है संलग्न।
    11. मौखिक अंत करने के लिए सिरिंज चालक देते हैं, और 10 एमएल / घंटा की दर से intraluminally क्रेब्स समाधान (गैर ऑक्सीजन, परिवेश के तापमान) के साथ मध्यांत्रीय खंड छिड़कना।
    12. सिलिकॉन elastomer नीचे की परत के खिलाफ मुहिम शुरू की आंतों खंड फ्लैट की अन्त्रपेशी पिन, कीट पिन का उपयोग कर। आदेश mesenteric बंडल के दृश्य का अनुकूलन करने में अन्त्रपेशी फैलाए, बंडल या सूखेपन पर दबाव डालती नहीं है।
    13. उत्पादन बंदरगाह बंद करके एक परीक्षण रैंप बढ़ाव (ख़बरदार इन्फ्रा) निष्पादित करें जब तक आंतों खंड के intraluminal दबाव 60 एमएमएचजी, आदेश है कि कोई intraluminal क्रेब्स समाधान घुड़सवार खंड से लीक कर रहा है सत्यापित करने के लिए पहुंचता है। रुकावट के बिना intraluminal दबाव में एक चिकनी वृद्धि का निरीक्षण करें।
    14. खंड के छोटे संकुचन का निरीक्षण करें (क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला wavते) प्रारंभिक बढ़ाव चरण के दौरान। यदि आवश्यक हो, क्रेब्स समाधान के लिए एल प्रकार कैल्शियम चैनल ब्लॉकर nifedipine की 1 माइक्रोन जोड़कर क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला गतिविधि ब्लॉक।
      नोट: nifedipine के अलावा क्रेब्स समाधान के लिए atropine के 1 माइक्रोन जोड़ना, पूरी तरह से आंतों खंड पंगु बना देगा। हालांकि हम अभिवाही तंत्रिका रिकॉर्डिंग पर इस्तेमाल करते हैं और atropine के प्रभाव के साथ कोई व्यक्तिगत अनुभव है।
    15. एक stereomicroscope के तहत, धीरे धीरे दो छोटे चिमटी के साथ यह tugging, देखभाल करने के जहाजों और अभिवाही तंत्रिका कि वसा ऊतकों में दफन झूठ को नुकसान नहीं द्वारा अन्त्रपेशी से वसा ऊतक बंद छील करने के लिए शुरू करते हैं।
    16. सूखेपन से एक दूरस्थ दूरी पर प्रारंभ करें, और mesenteric बंडल में दोनों रक्त वाहिकाओं को बेनकाब।
    17. एक पतली, सफेद धागा वसा ऊतकों में समझाया रूप में दोनों जहाजों के बीच में अभिवाही तंत्रिका मध्यांत्रीय का निरीक्षण करें। केवल धीरे वसा ऊतकों को दूर छीलने चिमटी जब उपयोग करके सूखेपन की ओर काटना अधिक proximallyदोनों mesenteric वाहिकाओं और / या अभिवाही तंत्रिका की प्रारंभिक पहचान मुश्किल है।
    18. , तंत्रिका करने के लिए वसा ऊतकों को हटाने के द्वारा पक्षपाती खंड कई मिलीमीटर की दूरी पर मुक्त करने के मध्यांत्रीय mesenteric तंत्रिका काटना।
    19. तंत्रिका ऊतक तेज कैंची का उपयोग आड़ा काट। यदि आवश्यक हो, धीरे छोटे चिमटी के साथ यह tugging द्वारा शेष वसा और संयोजी ऊतक, साथ ही epineuronal म्यान से छील।
    20. एक micromanipulator का प्रयोग, सक्शन इलेक्ट्रोड की नोक, सवार के साथ एक सिरिंज से जुड़ा है, अंग स्नान में कम; तो, सवार से छेड़छाड़, धीरे अंग स्नान इतना है कि इलेक्ट्रोड की नोक क्रेब्स समाधान (चित्रा 1) में डूबे हुए है से कुछ क्रेब्स समाधान aspirate। सुनिश्चित करें कि क्रेब्स समाधान सक्शन इलेक्ट्रोड के अंदर तार इलेक्ट्रोड शामिल किया गया है।
      नोट: borosilicate ग्लास सक्शन केशिका कि तार इलेक्ट्रोड प्रयोग हमें की शुरुआत से पहले तैयार करें जिसमेंएक विंदुक खींचने हैैं।
    21. सक्शन इलेक्ट्रोड की नोक तुरंत transected अभिवाही तंत्रिका किनारा करने के लिए अगले स्थिति और इसकी पूरी लंबाई पर केशिका में transected तंत्रिका कतरा आकर्षित।
    22. कुछ वसा ऊतकों की ओर इलेक्ट्रोड की नोक पैंतरेबाजी और गिलास केशिका में इस aspirate जबकि मजबूती, सवार के साथ श्वास जिससे यंत्रवत् 'सील' अंग स्नान की सामग्री से केशिका में तंत्रिका।
    23. , अभिवाही तंत्रिका गतिविधि डाटा अधिग्रहण प्रणाली का उपयोग करते हैं, जैसे की रिकॉर्डिंग सत्यापित करें फायरिंग (ख़बरदार इन्फ्रा) अभिवाही में एक रैंप बढ़ाव प्रेरित वृद्धि के प्रदर्शन से। सक्शन इलेक्ट्रोड में तंत्रिका के अलगाव के बाद, ताकि वास्तविक प्रयोगों के प्रदर्शन से पहले एक स्थिर राज्य सहज अभिवाही तंत्रिका गतिविधि प्राप्त करने के लिए 15 मिनट के लिए तैयारी स्थिर।
    24. रैंप बढ़ाव को करने के लिए, उत्पादन बंदरगाह बंद करके आंतों खंड फैलाना स्नातक के लिए अग्रणीआंतों खंड (60 एमएमएचजी तक) में दबाव में यौन वृद्धि। केवल वांछित प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल जब लगातार तीन रैंप distensions (एक 15 मिनट के अंतराल के साथ) एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य बहु इकाई निर्वहन (चित्रा 2) उपज प्रदर्शन करते हैं।
  2. काठ का स्प्लैनकिंक अभिवाही की तैयारी (colonic अभिवाही तंत्रिका)
    ध्यान दें: colonic अभिवाही नसों के विच्छेदन के एक अधिक विस्तृत विच्छेदन की आवश्यकता है। पूर्व 'मध्यांत्रीय' प्रोटोकॉल से विचलन के नीचे सूचीबद्ध हैं:
    1. , एक मानवीय विधि के माध्यम से पशु euthanize लापरवाह स्थिति में यह जगह है, एक midline laparotomy प्रदर्शन और जरूरत से ज्यादा उदर गुहा में बर्फ ठंड क्रेब्स समाधान डालना। नोट: क्रेब्स रचना: 118 मिमी NaCl, 4.75 मिमी KCl, 1 मिमी नः 2 4 पीओ, 22 NaHCO 3, 1.2 मिमी MgSO 4, 11 मिमी डी ग्लूकोज और 2.5 मिमी CaCl 2, 3 माइक्रोन के इंडोमिथैसिन।
      नोट: नोट क्रेब्स समाधान की बदल रचना; इंडोमिथैसिन इतने में जोड़ा जाता हैआदेश prostaglandins द्वारा अभिवाही तंत्रिका गतिविधि के परिवर्तन को रोकने के लिए lution।
    2. वसा ऊतकों, मूत्राशय और आंतरिक जननांग त्यागें, और धीरे उदर गुहा में एक तरफ छोटी आंत पाली। पेट से बरकरार mesenteric नसों के साथ पेट के बाहर का हिस्सा की एक विस्तारित prelevation प्रदर्शन करना।
      नोट: महत्वपूर्ण स्थलों कि इस विच्छेदन में शामिल किया जा सकता ऊतकों की आगे की तैयारी सहायता करने के लिए उदर महाधमनी और रग कावा, बायां गुर्दा और श्रोणि मंजिल मांसलता शामिल हैं।
      नोट: विच्छेदन के दौरान, पेट और पेट महाधमनी के बीच जोड़ने के ऊतकों पर कर्षण लागू करने के लिए नहीं ख्याल रखना इस क्षेत्र के रूप में काठ स्प्लैनकिंक नसों शामिल हैं।
    3. सिलिकॉन elastomer चैम्बर रिकॉर्डिंग अटे में ऊतक खंड स्थानांतरण। छोड़ दिया वृक्क धमनी, जो उदर महाधमनी से निकलती है, एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में प्रयोग करें। एबोरल दिशा में उदर महाधमनी का पालन करें, बेहतर mesenteri मुठभेड़ग धमनी सीलिएक और बेहतर mesenteric नाड़ीग्रन्थि के साथ एक साथ। अंत में, पेट और महाधमनी, जिसमें ब्याज की तंत्रिका स्थित है के बाहर का हिस्सा के बीच जोड़ने के ऊतकों पर पहुंचें।
    4. अवर mesenteric धमनी उदर महाधमनी से होने वाले को पहचानें। काठ का स्प्लैनकिंक अभिवाही तंत्रिका अवर mesenteric धमनी के आधार पर पहचाना जा सकता है; यह धमनी (चित्रा 3) के समानांतर चलता है।
    5. तंत्रिका की transection के बाद, धीरे आसपास के संयोजी ऊतक म्यान से छील और कई ठीक धागे में तंत्रिका तंग। बृहदान्त्र से एक सुरक्षित दूरी बनाए रखने के लिए सुनिश्चित करें।
    6. सक्शन इलेक्ट्रोड, 'सील' वसा ऊतकों के आसपास के रूप में पहले से वर्णित है और वांछित प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल प्रदर्शन के साथ केशिका में इन एकल धागे से एक ड्रा।
    7. किसी भी ज़रूरत से ज़्यादा ऊतक कि अंग स्नान (जैसे, गुर्दे, पेट वाहिकाओं, मांसपेशियों के ऊतकों), एक में मौजूद है त्यागेंइन अभिवाही संकेत खलल पड़ सकता है।
      नोट: Nifedipine (1μM) चिकनी पेशी सेल संकुचन के कारण मामले में क्रेब्स समाधान अभिवाही तंत्रिका संकेत सहज आंत्र आंदोलन से परेशान है करने के लिए जोड़ा जा सकता है।
      नोट: 3) intraluminally ब्याज की यौगिक भंग द्वारा 1) serosally क्रेब्स में वांछित यौगिक है कि 2) अंग स्नान में सीधे रिकार्डिंग कक्ष perfuses, जबकि अस्थायी रूप से छिड़काव को रोकने या भंग द्वारा: ड्रग्स तीन अलग-अलग स्थलों पर दिलाई जा सकती है सिरिंज ड्राइव में क्रेब्स समाधान में। अभिवाही तंत्रिका की असंवेदीकरण हो सकता है जब एक यौगिक का संचयी dosages भी तेजी से लगातार प्रशासित रहे हैं।

आकृति 1
चित्रा 1: उद्देश्य से बनाया रिकॉर्डिंग कक्ष और सक्शन इलेक्ट्रोड के योजनाबद्ध अवलोकन तकनीक की विस्तृत अवलोकन। सक्शन इलेक्ट्रोड और जगह में रिकार्डिंग कक्ष के साथ कैलोरी सेटअप। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: मध्यांत्रीय अभिवाही तंत्रिका गतिविधि की इन विट्रो रिकॉर्डिंग के प्रतिनिधि ट्रेसिंग आधारभूत और 2 रैंप distensions जब तक 60 एमएमएचजी के जवाब में मध्यांत्रीय बहु इकाई अभिवाही तंत्रिका गतिविधि (imp.sec -1) (ऊपरी पैनल) की विशिष्ट रिकॉर्डिंग। (कम पैनल), और तंत्रिका संकेत (तीसरे पैनल) में अलग एकल इकाइयों के बाद पहचान (wavemark विश्लेषण)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 3:। बृहदान्त्र एक की neuroanatomy) आंतों से संवेदी जानकारी LCN अवर mesenteric धमनी (आईएमए) के करीब निकटता में चलाने के साथ केंद्रीय तंत्रिका तंत्र की ओर काठ colonic तंत्रिकाओं (LCN) के माध्यम से अवगत करा दिया है। इस काठ colonic तंत्रिका तंतुओं से के एक हिस्से को पाठ्यक्रम intermesenteric तंत्रिका (IMN) के साथ काठ स्प्लैनकिंक तंत्रिकाओं (LSN) के रूप में होगा। अवर mesenteric नाड़ीग्रन्थि (आईएमजी) उदर महाधमनी से आईएमए के मूल में स्थित है। आईएमजी की distally रिकॉर्डिंग अनिवार्य शोधकर्ताओं viscerofugal अभिवाही तंत्रिका गतिविधि। बी) प्रयोगात्मक सेट अप का एक योजनाबद्ध अवलोकन अध्ययन करना चाहते हैं चाहिए। LCN की अभिवाही रिकॉर्डिंग एक सक्शन डाटा अधिग्रहण प्रणाली से जुड़े इलेक्ट्रोड के माध्यम से एक अंग दोनों में किया जाता है। रैंप बढ़ाव आउटलेट बंदरगाह के बंद होने पर प्रदर्शन किया जा सकता है, जबकि के प्रवाह को जारी रखनेक्रेब्स समाधान है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

2. डाटा अधिग्रहण

  1. एक सक्शन एक headstage से जुड़े इलेक्ट्रोड के माध्यम से तंत्रिका गतिविधि रिकॉर्ड। बढ़ाना (लाभ 10k) और संकेत (bandpass 500 - 5000 हर्ट्ज) फिल्टर 20।
    नोट: एक 50/60 हर्ट्ज शोर एलिमिनेटर 50/60 हर्ट्ज बिजली के हस्तक्षेप शोर संकेतों को दूर करने के क्रम में प्रयोगात्मक सेटअप में शामिल किया जाना चाहिए। संकेत स्वचालित रूप से डिजीटल और विश्लेषण के लिए 20 kHz पर नमूना है।

3. विश्लेषण 5,20

  1. पूरे तंत्रिका के लिए आवेगों की कुल संख्या / दूसरे के रूप में अभिवाही तंत्रिका निर्वहन रिपोर्ट या विशेष सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए आगे विश्लेषण करने के लिए, के रूप में समग्र तंत्रिका गतिविधि की बहु इकाई रिकॉर्डिंग अलग आकार, आयाम और चौड़ाई की कार्रवाई की क्षमता शामिल है, अलग अलग तंत्रिका करने के लिए इसी इकाइयोंप्रत्येक अभिवाही फाइबर में (चित्रा 2)।
  2. पूर्वनिर्धारित टेम्पलेट्स के लिए अलग-अलग wavemarks, एकल इकाइयों के बीच भेदभाव की अनुमति के मिलान। 1 लागू किया जाना चाहिए: एक निश्चित लहर-चिह्न, के> 2 एक संकेत करने वाली शोर अनुपात करने के लिए एक कील के आवंटन से पहले।
    नोट: wavemark विश्लेषण के दौरान, हम एक नए टेम्पलेट जब कम से कम 10 समान spikes विश्लेषण सॉफ्टवेयर द्वारा की पहचान कर रहे हैं का निर्माण। कोई टेम्पलेट 50 spikes में 1 से दुर्लभ आकृतियों के लिए निर्माण किया है। एक कील जब अपने अंक में से कम से कम 80% टेम्पलेट कील के समान हैं सिद्धांत घटक विश्लेषण का उपयोग कर एक टेम्पलेट के लिए मिलान किया जाता है। टेम्पलेट मिलान ऑपरेटर पर निर्भर है, और हमेशा एक अंधे तरीके से एक ही अनुसंधानकर्ता द्वारा किया जाना चाहिए।
  3. आधारभूत पर सहज गतिविधि (निश्चित समय बिंदुओं पर बढ़ाव 0 से 20 एमएमएचजी intraluminal दबाव से वेतन वृद्धि के 5 एमएमएचजी दौरान प्रतिक्रिया से (0 एमएमएचजी के intraluminal दबाव) को घटा कर कार्रवाई संभावित प्रतिक्रियाओं की गणना 10 की वेतन वृद्धि20 एमएमएचजी से एमएमएचजी के बाद)। उपाय आधारभूत अभिवाही निर्वहन 10 सेकंड की एक बिन आकार का उपयोग करते हुए।
  4. रैंप बढ़ाव (चित्रा 4) के दौरान उनकी मुक्ति प्रोफ़ाइल पर आधारित फाइबर वर्गीकृत करने के लिए एकल इकाई विश्लेषण का प्रयोग करें। इसके अलावा, एकल इकाई विश्लेषण इकाइयों के विभिन्न प्रकार के chemosensitive प्रोफ़ाइल का अध्ययन करने के लिए, के रूप में नहीं इकाइयों के सभी प्रकार के एक दवा या यौगिक के जवाब में एक ही बदल फायरिंग की गतिविधि प्रदर्शित करेगा उपयोग किया जा सकता है।
  5. सीमा से कम फाइबर ( 'एलटी', कम बढ़ाव दबाव पर आम तौर पर वृद्धि हुई डालती निर्वहन), उच्च सीमा फाइबर ( 'हिंदुस्तान टाइम्स', उच्चतम बढ़ाव के दबाव में वृद्धि हुई निर्वहन लागू), व्यापक गतिशील रेंज फाइबर ( 'WDR' के रूप में फाइबर वर्गीकृत, प्रदर्शन पूरे रैंप बढ़ाव के दौरान वृद्धि हुई गोलीबारी) या यंत्रवत् असंवेदनशील अभिवाही ( 'मिया', तंत्रिका तंतुओं कि आम तौर पर distensions रैंप का जवाब नहीं है) 5, 20।
  6. पी के रूप में 20 एमएमएचजी में तंत्रिका गोलीबारी प्रतिक्रिया व्यक्त करेंबढ़ाव (एलटी%) के रूप में यह कम बढ़ाव दबाव पर गोलीबारी की हद को दर्शाता दौरान अधिकतम फायरिंग प्रतिक्रिया के ercentage।
    नोट: इसलिए, एलटी फाइबर, एक एलटी%> 55% की विशेषता है, जबकि हिंदुस्तान टाइम्स <15% के एक मूल्य द्वारा परिभाषित कर रहे हैं। WDR इकाइयों के लिए मान 15 और 55% (20) के बीच सीमा। एक मिया सहज अभिवाही गोलीबारी कि distensions से अप्रभावित है दिखाता है।

चित्रा 4
चित्रा 4:। विभिन्न अभिवाही फाइबर इकाइयों को अपने Mechanosensitive प्रोफाइल के आधार पर की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व इकाइयों बढ़ाव के दौरान अधिकतम फायरिंग प्रतिक्रिया की तुलना में 20 एमएमएचजी बढ़ाव दबाव में उनके फायरिंग दर का प्रतिशत (एलटी%) पर आधारित वर्गीकृत कर रहे हैं। सीमा से कम फाइबर (ऊपरी बाएं पैनल) मुख्य रूप से कम बढ़ाव दबाव पर एक वृद्धि की तंत्रिका गतिविधि प्रदर्शन, 55% से अधिक की एक एलटी% हो जाती है। उच्च सीमा इकाइयों (ऊपरी दाहिनेपैनल) इसके विपरीत केवल हानिकारक दबाव पर फायरिंग दर (% एलटी <15) में वृद्धि प्रदर्शित करते हैं। वाइड गतिशील रेंज फाइबर (निचले बाएं पैनल), पूरे बढ़ाव दौरान तंत्रिका गतिविधि में एक क्रमिक वृद्धि (% 15 और 55 के बीच लेकर एलटी) प्रदर्शित जबकि यंत्रवत् असंवेदनशील फाइबर (निचले सही पैनल) बढ़ाव के दबाव में वृद्धि करने के लिए जवाब नहीं है। एलटी%: (अभिवाही 20 एमएमएचजी / अधिक से अधिक अभिवाही गोलीबारी पर गोलीबारी) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Representative Results

मध्यांत्रीय अभिवाही तंत्रिका गतिविधि बेस लाइन पर मापा गया था और जवाब में 9 में से 1 चूहों आठ सप्ताह पुराने पुरुष में बढ़ाव रैंप पर। असीमित उपयोग के साथ पानी और नियमित रूप से चाउ दोहन करने के लिए पशु (50%, 12 घंटा प्रकाश अंधेरे चक्र - - 22 डिग्री सेल्सियस, आर्द्रता 40 पिंजरे प्रति 6 जानवरों, 20) मानकीकृत परिस्थितियों में समूहों में रखे थे। चूहों के मध्यांत्रीय खंडों 0 एमएमएचजी के एक intraluminal दबाव में बेस लाइन पर अनियमित सहज अभिवाही तंत्रिका मुक्ति प्रदर्शित (सहज गतिविधि का मतलब यह 11.47 ± 3.31 छोटा सा भूत / सेक)।

मध्यांत्रीय अभिवाही तंत्रिका गतिविधि 60 एमएमएचजी तक रैंप distensions अप प्रदर्शन पर वृद्धि हुई है। आमतौर पर, intraluminal दबाव में वृद्धि के बाद अभिवाही तंत्रिका गतिविधि में वृद्धि हुई है, एक biphasic प्रतिक्रिया (चित्रा 5) की विशेषता है कि गोलीबारी गतिविधि में एक प्रारंभिक तेजी से वृद्धि जब तक intraluminal दबाव 20 एमएमएचजी तक पहुँच जाता से मिलकर, जोज मुख्य रूप से कम सीमा फाइबर की फायरिंग दर में वृद्धि हुई करने के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। यह तो एक पठार चरण, जिसके बाद गोलीबारी की गतिविधि में एक दूसरी वृद्धि 40 एमएमएचजी के बाद से मनाया जा सकता है, मुख्य रूप से उच्च सीमा फाइबर की सक्रियता का प्रतिनिधित्व करने के बाद है।

उनकी waveforms के आधार पर, एकल इकाइयों प्रत्येक बहु इकाई रिकॉर्डिंग में भेदभाव और aforementioned चार श्रेणियों में से एक में वर्गीकृत किया जा सकता है। 9 चूहों में, हम 40 विभिन्न इकाइयों (4.44 ± 1.01 इकाइयों / मध्यांत्रीय अभिवाही तंत्रिका) भेदभाव, सबसे अधिक प्रचलित हैं, WDR और हिंदुस्तान टाइम्स फाइबर (चित्रा 6) के द्वारा पीछा किया जा रहा है एलटी इकाइयों के साथ। जवाब में विभिन्न इकाइयों की फायरिंग गतिविधि बढ़ाव रैंप पर चित्रा 7 में मनाया जा सकता है।

चित्रा 5
चित्रा 5: जी> Mesenteric अभिवाही तंत्रिका निर्वहन (imp.sec - 1)। पूरे तंत्रिका के लिए रैंप पर बढ़ाव के दौरान रैंप बढ़ाव के दौरान जंगली प्रकार चूहों में mesenteric बहु इकाई अभिवाही तंत्रिका छुट्टी (छोटा सा भूत / सेकंड -1) जंगली प्रकार चूहों में। मान SEM मतलब ± अभिवाही मुक्ति का प्रतिनिधित्व करते हैं, एन = 9 चूहों। imp.sec -1:। प्रति सेकंड आवेगों यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6:। 40 9 जंगली प्रकार चूहों से मध्यांत्रीय अभिवाही तंत्रिकाओं में पहचान की इकाइयों की एकल यूनिट वितरण हिंदुस्तान टाइम्स: उच्च सीमा फाइबर, एलटी: सीमा से कम फाइबर, मिया: यंत्रवत् असंवेदनशील फाइबर, WDR: व्यापक गतिशील रेंज फाइबर।_blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 7
चित्रा 7:। जंगली प्रकार चूहों में सब यूनिटों के विभिन्न प्रकार के दबाव प्रतिक्रिया घटता एकल इकाई अभिवाही तंत्रिका छुट्टी (imp.sec -1) चार अलग-अलग इकाइयों कि रैंप के दौरान पहचाना जा सकता है प्रकार के जंगली चूहों में से distensions। एक सीमा से कम फाइबर (एलटी, ऊपरी बाएँ आंकड़ा), distensions के दौरान फायरिंग की गतिविधि में एक प्रारंभिक तेजी से वृद्धि की विशेषता है whilst उच्च सीमा फाइबर (हिंदुस्तान टाइम्स, निचले बाएँ आंकड़ा) केवल प्रदर्शन हानिकारक intraluminal दबाव के दौरान फायरिंग में वृद्धि हुई। वाइड गतिशील रेंज फाइबर (डब्ल्यूडीआर, ऊपरी सही आंकड़ा) पूरे बढ़ाव के दौरान फायरिंग की गतिविधि में लगातार वृद्धि हुई है, और mechano-असंवेदनशील अभिवाही फाइबर (मिया, निचले सही आंकड़ा) intraluminal के दबाव में वृद्धि का जवाब नहीं दिखा। मान प्रतिनिधिSEM imp.sec -1 मतलब ± अभिवाही मुक्ति क्रोध:। प्रति सेकंड आवेगों यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

इस पत्र में प्रोटोकॉल एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रयोगशाला तकनीक का वर्णन के रूप में हमारे समूह और अन्य लोगों द्वारा इस्तेमाल किया 3,4,7,8,12,20,21,31 कृन्तकों में mesenteric अभिवाही तंत्रिका गतिविधि का अध्ययन करने के लिए। प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम ऊतक के तेजी से अलगाव, सक्शन इलेक्ट्रोड में तंत्रिका कतरा की आकांक्षा और पर्याप्त केशिका में आसपास वसा ऊतकों aspirating द्वारा अंग स्नान से गिलास केशिका के 'सील' शामिल हैं। कांच केशिका के एपर्चर ठीक निर्धारित किया जाना चाहिए: एक छेद है कि बहुत छोटा है, इलेक्ट्रोड में तंत्रिका कतरा की आकांक्षा को मुश्किल होगा, जबकि एक भी व्यापक एपर्चर वसा ऊतकों के साथ केशिका के 'सील' में बाधा होगी, बेमानी है, जिसके परिणामस्वरूप पृष्ठभूमि शोर है कि विश्लेषण (कम संकेत करने वाली शोर रिकॉर्डिंग) प्रभावित होगा। विश्वसनीय एकल इकाई वर्गीकरण के लिए अनुमति देने के लिए, स्प्लैनकिंक afferents आदेश को कम करने के विभिन्न किस्में में विभाजित किया जाना चाहिएरिकॉर्डिंग में इकाइयों की संख्या। प्रत्येक रिकॉर्डिंग में 5 इकाइयों - आमतौर पर, हम 4 की एक अधिकतम करने के लिए लक्ष्य का सुझाव है। शोधकर्ताओं इसलिए एपर्चर हित के फाइबर पर आधारित है, और प्रयोगशाला जानवर है कि लागू किया जाता है समायोजित करने के लिए चाहिए।

एक अन्य महत्वपूर्ण बिंदु प्रयोगात्मक स्थापना के लिए पर्याप्त ग्राउंडिंग शामिल हैं। सक्शन इलेक्ट्रोड और रिकॉर्डिंग कक्ष पर्याप्त रूप से आधारित होना चाहिए और आदेश में बिजली के क्षेत्रों है कि neuronal गतिविधि के विश्लेषण में बाधा हस्तक्षेप को कम करने, रिकॉर्डिंग apparatuses सहित अन्य सभी उपकरण, जबकि सिरिंज ड्राइवर वगैरह पिंजरे के बाहर स्थापित किया जाना चाहिए में एक फैराडे पिंजरे द्वारा कवर ।

सूखेपन या पेट के पास में अभिवाही तंत्रिका गतिविधि रिकॉर्डिंग करके, एक अभिवाही संकेत पारगमन श्रृंखला के पहले भाग को अलग कर सकते हैं और आसानी से योगदान और परिवर्तन है कि केंद्रीय nerv से हस्तक्षेप के बिना एकमात्र अभिवाही स्तर पर होते अध्ययनous प्रणाली। इस तकनीक की सीमाओं में से एक तथ्य यह है कि इन विट्रो टिप्पणियों में हमेशा सरल, विवो स्थापित करने के लिए extrapolated नहीं किया जा सकता क्योंकि इन विट्रो सेटअप केवल जटिल तंत्रिका संकेत झरना में एक रिले स्टेशन को शामिल किया गया है। इस तरह के रूप में, एक व्यापक तस्वीर ऐसी पृष्ठीय रूट ganglia, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (जैसे, कार्यात्मक ब्रेन इमेजिंग) और उतरते (निरोधात्मक) अपवाही रास्ते के रूप में अन्य सभी स्टेशनों, को शामिल किया जाना चाहिए।

इस पद्धति का एक और फायदा है, बल्कि साधारण तकनीकी प्रक्रिया गठन के रूप में एक नहीं रह प्रयोगशाला जानवर है कि जठरांत्र नमूना प्रदान करता है की भलाई पर नजर रखने के लिए किया है। दूसरी ओर neuronal गतिविधि की इन विट्रो माप अभिवाही तंत्रिका मुक्ति पर एक प्रणालीबद्ध प्रशासित दवा के प्रभाव elucidating के लिए उपयुक्त नहीं है, लेकिन शोधकर्ताओं ने सैद्धांतिक रूप से प्रणालीबद्ध दवा ओ प्रशासन द्वारा इस बाधा को दूर कर सकते हैंजानवर को एफ ब्याज, अभिवाही तंत्रिका गतिविधि के पूर्व vivo में इन विट्रो रिकॉर्डिंग द्वारा पीछा किया। हालांकि, एक तथ्य यह है कि रिकार्डिंग कक्ष में किसी भी दवा वर्तमान विच्छेदन और बाद में रिकॉर्डिंग के दौरान स्नान छिड़काव के कारण पतला हो जाएगा करने के लिए चौकस होना चाहिए। अंत में, आनुवंशिक रूप से इंजीनियर जानवरों का उपयोग कर स्प्लैनकिंक तंत्रिका रिकॉर्डिंग विट्रो में प्रदर्शन शोधकर्ताओं ने पूरी तरह से अलग अलग चैनलों और रिसेप्टर्स अभिवाही फाइबर पर व्यक्त की भूमिका स्पष्ट करने के लिए अनुमति दे सकता है।

शोधकर्ताओं ने इस तकनीक को भी ध्यान में रखें कि पहचान और mesenteric अभिवाही और श्रोणि afferents के अलगाव को स्पष्ट रूप से बुनियादी शरीर रचना विज्ञान और तकनीकी प्रशिक्षण के ज्ञान की आवश्यकता में रखना चाहिए लागू करने के प्रयास में है, और शोधकर्ताओं न्यूरोनल इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के बुनियादी सिद्धांतों से परिचित होना चाहिए।

इन विट्रो सेटिंग इसके अलावा शोधकर्ताओं आसानी से संभव औषधीय टार की पहचान करने की अनुमति देता हैहो जाता है, और कई रोग प्रक्रियाओं में neuronal गतिविधि के रूप में अच्छी तरह से बदल दिया संवेदी संकेत के शारीरिक भूमिका पर अंतर्दृष्टि प्रदान करता है।

मध्यांत्रीय अभिवाही माप के मामले में, एक भी पशु के कई ऊतक क्षेत्रों, एक साथ अध्ययन किया जा सकता है कि एक विशेषता यह है कि उससे भी मुश्किल है एक विवो सेटअप का उपयोग कर। शोधकर्ताओं ने हालांकि सावधानी से विभिन्न क्षेत्रों से प्राप्त परिणामों की व्याख्या करना चाहिए, क्षेत्रीय मतभेद पूर्वाग्रह परिणाम के रूप में कर सकता है। इसलिए हम लगातार एक ही साइट (distally Treitz का बंधन या duodenojejunal वंक से जैसे, पहले खंड) से अभिवाही तंत्रिका गतिविधि को मापने के लिए सिफारिश करेंगे।

इस तकनीक की खासियत वर्तमान और भविष्य के अनुप्रयोगों औषधीय यौगिकों कि विकृतियों कि आंत अतिसंवेदनशीलता और दर्द की विशेषता है के दौरान mesenteric afferents को संवेदनशील बनाने को बदल सकते हैं की स्क्रीनिंग शामिल। जैसा कि पहले ही से पहले उल्लेख किया है, का लक्ष्यएसई यौगिकों मस्तिष्क को आंतों का आंतरिक तंत्रिका तंत्र से लेकर जटिल तंत्रिका तंत्र के साथ कहीं से सामना हो सकता है; इस तरह, निस्र्पक और अभिवाही तंत्रिका गतिविधि नियमन व्यापक तस्वीर भी है कि आंतरिक आंतों नसों और पृष्ठीय रूट ganglia की कैल्शियम इमेजिंग शामिल करने के लिए योगदान के रूप में, विवो में आंत का अतिसंवेदनशीलता का सूचक है, और कार्यात्मक ब्रेन इमेजिंग के रूप में visceromotor प्रतिक्रिया की माप, दूसरों के बीच में।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
sodium chloride (NaCl) VWR Chemicals 27,810,295 compound Krebs solution
potassium chloride (KCl) Acros organics 196770010 compound Krebs solution
sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4) VWR Chemicals 1,063,461,000 compound Krebs solution
sodium bicarbonate (NaHCO3) Merck 1,063,291,000 compound Krebs solution
magnesium sulfate (MgSO4) Merck 1,058,861,000 compound Krebs solution
calcium chloride (CaCl2) Merck 23,811,000 compound Krebs solution
D-glucose VWR Chemicals 1011175P compound Krebs solution
Distilled water compound Krebs solution
PVC tubing Scientific Laboratory Supplies The intestinal segment should be mounted over PVC tubing
Silicone tubing Scientific Laboratory Supplies The rest of the tubing, ideally silicone-based - more easily dislodging of debris in the tubing
Silk thread Pearsall Limited 10B15S220 Attachment of the segment over the PVC tubing
Syringe driver Harvard Apparatus 55-2222 Intraluminal infusion of Krebs
Binocular - including 10X magnification in oculair Zeiss STEMI 2000 Optimal visualization for the dissection of the afferent nerve
Homeothermic Blanket Control Unit Harvard Apparatus 507214 Heating of the organ chamber
Custom made organ bath with Sylgard covered bottom
Spike2 software Recording and analysis of the data
Insect pins, 500 pieces, stainless steel, diameter 0.2 mm Austerlitz insect pins minutiens Dissection of the afferent nerve
Tweezer Dumont #5 inox 11 cm World Precision Instrument 500341 Dissection of the afferent nerve
Scissors, spring, 14 cm World Precision Instrument 15905 Dissection of the afferent nerve
DB digitimer  NL 108T2/10 pressure transducer
Micromanipulator Narishige M-3333 3D manipulation of the suction electrode
Micromanipulator X-4 rotating block 3D manipulation of the suction electrode
Micromanipulator GJ-8 magnetic stand 3D manipulation of the suction electrode
LightSource Euromex Microscopes Holland EK-1 Optimal visualization for the dissection of the afferent nerve
CED 1401 Recording Apparatus Recording of afferent nerve activity
Humbug 50/60 Hz Noise Eliminator Quest Scientific Instruments Elimination of background noise
Infusion Pump Gibson Minipuls 2 Infusion of the organ chamber in which the segment is mounted
Microelectrode Holder Half Cells 1.5 mm World Precision Instrument MEH2SW Suction electrode for isolation of the afferent fiber
Borosilicate Glass Capillaries, 300 pc; 1.5/0.84 OD/ID World Precision Instrument 1B150-4 Capillary for the isolation of the afferent nerve

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References

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माउस मध्यांत्रीय और colonic अनुभाग में Mesenteric अभिवाही तंत्रिका गतिविधि के <em>इन विट्रो</em> रिकॉर्डिंग <em>में</em>
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Nullens, S., Deiteren, A., Jiang, W., Keating, C., Ceuleers, H., Francque, S., Grundy, D., De Man, J. G., De Winter, B. Y. In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments. J. Vis. Exp. (116), e54576, doi:10.3791/54576 (2016).More

Nullens, S., Deiteren, A., Jiang, W., Keating, C., Ceuleers, H., Francque, S., Grundy, D., De Man, J. G., De Winter, B. Y. In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments. J. Vis. Exp. (116), e54576, doi:10.3791/54576 (2016).

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