circadian घड़ी Arabidopsis transcriptome की एक तिहाई के बारे में नियंत्रित करता है, लेकिन जीनों का प्रतिशत है कि timekeeping में वापस खिलाओ अनजान बनी हुई है। यहाँ हम एक विधि कल्पना तेजी से एक circadian संवाददाता क्षणिक मूलतत्त्वों में व्यक्त की luminescent इमेजिंग का उपयोग Arabidopsis के किसी भी उत्परिवर्ती लाइन में circadian phenotypes आकलन करने के लिए।
The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable biotic and abiotic stress. Conversely, disruption of circadian timekeeping severely compromises plant health and reduces agricultural crop yields. It is therefore imperative that we understand the intricate regulation of circadian rhythms in plants, including the factors that affect motion of the transcriptional clockwork itself.
Testing circadian defects in the model plant Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) traditionally involves crossing specific mutant lines to a line rhythmically expressing firefly luciferase from a circadian clock gene promoter. This approach is laborious, time-consuming, and could be fruitless if a mutant has no circadian phenotype. The methodology presented here allows a rapid initial assessment of circadian phenotypes. Protoplasts derived from mutant and wild-type Arabidopsis are isolated, transfected with a rhythmically expressed luminescent reporter, and imaged under constant light conditions for 5 days. Luminescent traces will directly reveal whether the free-running period of mutant plants is different from wild-type plants. The advantage of the method is that any Arabidopsis line can efficiently be screened, without the need for generating a stably transgenic luminescent clock marker line in that mutant background.
अधिकांश रहने वाले जीवों में पर्यावरण के लिए दैनिक परिवर्तन की कुशल बातचीत सहायता करने के लिए एक अंतर्जात टाइमकीपर के पास है। इस टाइमकीपर, circadian घड़ी, बाहरी वातावरण में उम्मीद के मुताबिक परिवर्तन की आशा चयापचय और एक जीव के शरीर क्रिया विज्ञान के कई पहलुओं को नियंत्रित करता है। उदाहरण के लिए पौधों में, अस्थायी उम्मीद के मुताबिक रोगज़नक़ या शाकाहारी हमलों की प्रत्याशा दृढ़ता से समग्र संवेदनशीलता कम कर देता है 1 – 4। स्टार्च चयापचय कसकर circadian घड़ी द्वारा विनियमित है पिछले सुनिश्चित करने के लिए कि स्टार्च भंडार सुबह तक कि क्या लंबे या छोटे दिन शर्तों 5 से बढ़ी। दरअसल, 24 घंटा पर्यावरण शो वृद्धि की विकास दर मिलान circadian घड़ियों के साथ पौधों, कार्बन स्थिरीकरण दरों में और जीवित रहने की दरों बेमेल अवधि 6 के एक घड़ी चल पौधों की तुलना में। इन सभी प्रक्रियाओं में circadian लय का व्यापक प्रभाव एक तिहाई तक की लयबद्ध विनियमन से काफी हद तक उठताArabidopsis 7 में कुल transcriptome की। ये लयबद्ध जीन उत्पादों चयापचय मार्ग, हार्मोन संकेतन, और तनाव प्रतिक्रियाओं 7 सहित सेलुलर प्रक्रियाओं की एक व्यापक श्रेणी में शामिल कर रहे हैं। उस के शीर्ष पर, प्रोटीन समारोह का सीधा circadian विनियमन फोस्फोराइलेशन 8 के circadian विनियमन और सबसे शायद अन्य के बाद translational संशोधनों (PTMs) द्वारा स्थापित है।
Circadian घड़ी है कि इस दैनिक ट्रांसक्रिप्शनल reprogramming ड्राइव के केंद्र में ट्रांसक्रिप्शनल के एक नेटवर्क / translational प्रतिक्रिया छोरों (TTFLs), सुबह-व्यक्त जीनों सहित निहित है circadian घड़ी एसोसिएटेड 1 (CCA1) और देर लम्बी hypocotyl (LHY) उस अभिव्यक्ति को दबाने – 11 लक्स ARRHYTHMO (लक्स), जल्दी फूल 3 (ELF3), और ELF4 9; कैब 1 (TOC1), gigantea (सैनिक) और शाम जटिल (ईसी) के सदस्यों की शाम जीन समय की। साथ में बुद्धिज PSEUDO प्रतिक्रिया नियामक -genes (PRR3, 5, 7, और 9), TOC1 CCA1 / LHY अभिव्यक्ति represses जबकि चुनाव आयोग एक सकारात्मक नियामक 12 के रूप में कार्य – 14। TTFL नेटवर्क घटक की, प्रतिक्रिया तंत्र के लिए अतिरिक्त के बाद ट्रांसक्रिप्शनल और बाद translational विनियमन ट्यूनिंग circadian लय में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। आज की तारीख में सबसे प्रचुर मात्रा में प्रोटीन पर PTM circadian घड़ी की पहचान फोस्फोराइलेशन 15 है। कैसिइन Kinase 2 (CK2) द्वारा CCA1 के फोस्फोराइलेशन उसके प्रवर्तकों 16 निशाना बनाने के लिए बाध्यकारी और circadian घड़ी 17 के तापमान को मुआवजे के लिए महत्वपूर्ण है को प्रभावित करता है। PRR प्रोटीन विभिन्न circadian चक्र से अधिक phosphorylated रहे हैं, और TOC1 के फोस्फोराइलेशन इसके नकारात्मक नियामक के साथ बातचीत को प्रभावित करता है, शाम को चरणबद्ध घड़ी घटक ZEITLUPE (ZTL) 18। इन उदाहरणों वर्णन कैसे PTMs और प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत धुन TTFL नेटवर्क एक 24 घंटे की मेंट्रांसक्रिप्शनल थरथरानवाला। ट्रांसक्रिप्शनल घड़ी नेटवर्क और इसके नियमन के लिए एक अधिक विस्तृत परिचय के लिए, उत्कृष्ट हाल ही में समीक्षा (जैसे संदर्भ 15) उपलब्ध हैं।
लेकिन, क्या कम स्पष्ट रहता है किस हद तक ताल विनियमित प्रक्रियाओं और सेलुलर चयापचय के अन्य पहलुओं timekeeping तंत्र ही में वापस खिलाने के लिए है। घड़ी दोष के लिए Arabidopsis म्यूटेंट के व्यापक प्रदर्शन आगे समझने की जो तंत्र या संकेत दे रास्ते एक TTFL नेटवर्क से 24 घंटा लय की पीढ़ी में शामिल किया जा सकता हासिल कर सकता है। यह अंत करने के लिए, किम और सोमर्स पहले प्रकाशित किसी भी Arabidopsis लाइन 19 में घड़ी समारोह के कुशल और तेजी से विश्लेषण के लिए एक ब्रेक के माध्यम से विधि। मूलतत्त्वों में क्षणिक अभिव्यक्ति के उपयोग पर आधारित, इस पद्धति स्थिर ट्रांसजेनिक लाइनों के लिए जरूरत से बढ़कर है या luminescent घड़ी मार्कर लाइनों को पार करती है। यहाँ, हम एक उच्च उपज मूलतत्त्व isolatio कल्पनाn विधि 20 एक अनुकूलित प्रोटोकॉल के साथ संयुक्त एक 96 अच्छी तरह से थाली रीडर में क्षणिक व्यक्त की घड़ी मार्करों के luminescent इमेजिंग द्वारा circadian दोष स्क्रीन करने के लिए।
हम कार्यप्रणाली यहाँ सफलतापूर्वक वर्णित बदल circadian लय का पता लगाता पुष्टि करने के लिए अच्छी तरह से विशेषता घड़ी म्यूटेंट को जंगली प्रकार के सहयोगी 0 Arabidopsis की तुलना करेंगे। ल्यूक 19: CCA1pro, इन लाइनों से निकाली गई Protoplasts एक संवाददाता का निर्माण कि circadian CCA1 प्रमोटर से जुगनू luciferase व्यक्त के साथ ट्रांसफ़ेक्ट हैं। Luciferase multistep प्रतिक्रिया जिसमें luciferin इलेक्ट्रॉनिक रूप में उत्साहित करने के लिए बदल जाती है oxyluciferin कि प्रकाश 21 उत्सर्जन करता है, जो इन मूलतत्त्वों में अवधि, आयाम और ट्रांसक्रिप्शनल लय के चरण का आकलन करने के लिए समय के साथ imaged है उत्प्रेरित।
प्रोटोकॉल के तीन प्रमुख भागों के होते हैं; मूलतत्त्वों को अलग-थलग, संवाददाता प्लाज्मिड, और luminescent आईएम के साथ protoplasts परासंक्रमितउम्र बढ़ने। इन तीन भागों हमेशा हौसले से तैयार buffers और अभिकर्मकों का उपयोग कर एक ही दिन पर किया जाना चाहिए। संयंत्र के विकास और रिपोर्टर प्लाज्मिड की पर्याप्त मात्रा की शुद्धि के लिए अग्रिम में किया जाना चाहिए और इस प्रोटोकॉल में कल्पना नहीं कर रहे हैं।
यहाँ, हम Arabidopsis लाइनों में circadian अवधि दोष, मूलतत्त्व अलगाव, अभिकर्मक, और luminecent इमेजिंग सहित स्क्रीन करने के लिए एक तेजी से परख प्रस्तुत करते हैं। जंगली प्रकार में circadian अवधि Arabidopsis और घड़ी म्यूटेंट cca1 / LHY, ZTL, और CCA1 -OX एक CCA1pro से luminescence के माप से गणना की गई: ल्यूक रिपोर्टर और अधिक समय का उपयोग करते हुए पूरे पौधों से उत्पन्न प्रकाशित आंकड़ों के साथ लगातार हो पाया ट्रांसजेनिक दृष्टिकोण लेने वाली (तालिका 2)। Arabidopsis म्यूटेंट स्क्रीन करने के लिए इस परख का प्रयोग ट्रांसजेनिक luminescent लाइनों उत्पन्न करने के लिए प्रारंभिक आवश्यकता है, जो समय लगता है और केवल प्रकट हो सकता है कि एक विशेष उत्परिवर्ती जंगली प्रकार लय दर्शाती बचा जाता है। इस प्रोटोकॉल का एक स्पष्ट लाभ यह है कि किसी भी Arabidopsis लाइन बदल circadian लय ट्रांसक्रिप्शनल, जो अधिक पौधों में timekeeping प्रभावित करने वाले जीन की पहचान में मदद मिलेगी के लिए कम समय में जांच की जा सकती है।
<p class= "Jove_content"> protoplasts के अलगाव श्रमसाध्य हो सकता है, उत्परिवर्ती लाइन एक dwarfed phenotype प्रदर्शित करता है, खासकर अगर। Protoplasts पैदा करने के लिए पहले की रिपोर्ट तरीकों पतली स्ट्रिप्स और वैक्यूम एंजाइम समाधान के साथ स्ट्रिप्स घुसपैठ एंजाइमों सेल दीवारों 26,27 तक पहुँचने के लिए अनुमति देने के लिए में पत्ते या पौध काटने शामिल है। बाद में पाचन एंजाइम समाधान में protoplasts जारी करने के लिए अंधेरे में कम से कम 3 घंटा ऊष्मायन की आवश्यकता है। जब वैक्यूम घुसपैठ लागू नहीं है, 18 घंटा के लिए ऊष्मायन समय को सलाह दी जाती है। यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल में, वैक्यूम घुसपैठ अनावश्यक क्योंकि एपिडर्मल सेल एंजाइमों को अभेद्य परत टेप द्वारा हटा दिया जाता है। जब संयंत्र सामग्री काटने से protoplasts पैदा यह पाचन के बाद सेल की दीवार के मलबे से अलग protoplasts के लिए आवश्यक है; यह आम तौर पर समाधान छानने या एक चीनी ढाल 27,26 पर यह सफ़ाई के द्वारा किया जाता है। इधर, किसी भी पचाया नहीं ऊतक आटोक्लेव टेप के बाद पर रहेगापाचन, इसलिए निस्पंदन और चीनी protoplasts की ढाल शुद्धि छोड़ा जा सकता है। वहाँ है कि तनाव लंबे समय तक protoplasting प्रक्रियाओं से उत्पन्न सेल व्यवहार्यता और circadian घड़ी को प्रभावित करता है एक मौका है। टेप आधारित protoplasting विधि यहाँ 20 से कल्पना protoplasts के एक उच्च संख्या पैदावार; और एक circadian समय श्रृंखला पर कोशिकाओं की व्यवहार्यता दिया और protoplasts और पूरे पौध (तालिका 2) के मिलान की अवधि लंबाई, यहाँ वर्णित कार्यप्रणाली वैकल्पिक तरीकों से अधिक पसंद है protoplasts उत्पन्न करते हैं।प्रोटोकॉल के अभिकर्मक कदम के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है कि protoplasts की व्यवहार्यता पर प्रभाव डालता है। खूंटी समाधान (3.4 कदम) इस समाधान में डीएनए सेल में वितरित किया जाना है, और दोनों ऊष्मायन समय और खूंटी का प्रतिशत अनुभव से निर्धारित किया जाना चाहिए सक्षम बनाता है। मानक एकाग्रता, 20% है कम सांद्रता परिवर्तन दक्षता और उच्च कम करने के साथसांद्रता व्यवहार्यता 28 को कम करने। ऊष्मायन समय पांच मिनट के रूप में के रूप में कम protoplasts 27 के कुशल अभिकर्मक उपज सकता है।
protoplasts किसी भी luminescent इमेजिंग मंच पर imaged किया जा सकता है। इस वीडियो में, हम, जो उच्च throughput प्रदर्शन और लगातार मापन के लिए अनुमति देता है (~ 20 μE की एक संयुक्त तीव्रता पर लाल और नीले रंग के एल ई डी, 630 और 470 एनएम, क्रमश) एक luminescence प्लेट बाहरी रोशनी से सुसज्जित पाठक का इस्तेमाल किया है। अन्य इमेजिंग उपकरणों, इस तरह के विकल्प प्लेट पाठकों या setups के एक आरोप युग्मित डिवाइस (सीसीडी) कैमरा के आसपास आधारित रूप में है कि luminescence का पता लगाता है, लंबे समय के रूप में अच्छी तरह से समान रूप से लागू किया जा सकता है के रूप रोशनी प्रकाश संश्लेषण के लिए उपलब्ध है। एक सीसीडी कैमरा एक चलाया कैबिनेट पर घुड़सवार का उपयोग करने का लाभ यह है कि प्रकाश है और तापमान प्रोग्राम किया जा सकता है। एक नुकसान यह है, अब समय आ गया है पर कब्जा अंधेरे की लंबी अवधि है कि उपद्रव के अलावा protoplasts के लिए तनाव का कारण बन सकता है शुरूअंतर्जात timekeeping हैैं। की जो प्रयोगात्मक मंच चुना जाता है भले ही, सेटिंग्स का समायोजन पौध या परिपक्व पौधों के लिए सेटिंग्स की तुलना में आवश्यक होने की संभावना है। हमारे अनुभव में, अभिकर्मक और / या इमेजिंग बफर में luciferin के दौरान संवाददाता प्लाज्मिड की सांद्रता बढ़ रही किसी भी अनियमित या जल्दी कमी लाने लय कि प्रारंभिक प्रयोगों में हो सकता है हल हो सकता है।
भविष्य प्रयोगों में, कार्यप्रणाली यहाँ वर्णित किसी भी उत्परिवर्ती Arabidopsis लाइन के circadian phenotype अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है। मामूली संशोधनों के साथ, timekeeping पर जैसे विभिन्न दवाओं का असर इस सेटअप में अध्ययन किया जा सकता है। इसके अलावा, अभिकर्मक, जीन मुंह बंद 19 के लिए कृत्रिम microRNA शामिल करने के लिए आगे इस प्रोटोकॉल के बहुमुखी प्रतिभा के विस्तार के लिए संशोधित किया जा सकता है। प्रोटोकॉल चावल protoplasts उत्पन्न करने के लिए अच्छी तरह से स्थापित कर रहे हैं 29 और यहाँ प्रस्तुत इमेजिंग प्रोटोकॉल समान रूप से हमारे यू और आगे के लिए लागू किया जा सकताआर्थिक रूप से महत्वपूर्ण monocot फसल पौधों में घड़ी की nderstanding।
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank Prof. David Somers and Dr. Jeongsik Kim for the luciferase reporter plasmid and initial method development. Prof. Karen Halliday kindly provided all the circadian mutant lines used in this study. This research was supported by Royal Society research grants RS120372 and RS140275. GvO is a Royal Society University Research Fellow (UF110173).
CELLULYSIN Cellulase, Trichoderma viride | Merck Millipore | 219466 | |
Pectinase R10 | Sigma Aldrich | P2401 | |
D-mannitol | Sigma Aldrich | M4125 | |
CaCl2 | Sigma Aldrich | C4901 | |
KCl | Sigma Aldrich | P3911 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A4503 | |
MES | Acros Organics | 327765000 | |
NaCl | Acros Organics | 327300010 | |
Glucose | Fischer Scientific | G/0500/60 | |
MgCl2 | Sigma Aldrich | M2670 | |
Polyethylene glycol (PEG) 4000 | Acros Organics | 434630010 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F4135 | |
D-Luciferin, Firefly | Biosynth AG | L-8200 | Dissolve luciferin powder in 0.1M trisphosphate buffer pH 8.0 to a concentration of 50mM |
Ampicillin | Sigma Aldrich | A9618 | |
Comply Steam Indicator Tape | 3M | 1222 | |
Magic Tape | 3M | 819-1460 | |
Petri Dishes | Scientific Laboratory Supplies | SLS2002 | |
Microplate, 96 well, flat bottom, white | Greiner Bio-One | 655075 | |
TopSeal-A, adhesive lids for 96-well plates | Perkin Elmer | 6050195 | |
Syringe, 10 ml, w/o needle | BD Plastipak | 302188 | |
Syringe filter 0.22 µm | Merck Millipore | SLGP033RS | |
Biological Rhythms Analysis Software System (BRASS) | Free download at amillar.org | ||
QIAfilter Maxiprep Kit | Qiagen | 12262 | |
Modified Fuch-Rosenthal counting chamber, double cell | Hawksley | AC6000 | |
Bright field microscope | Optika Microscopes | B-150POL-B | |
LB942 TriStar2 multimode reader, with luminescence module | Berthold Technologies Ltd | 57947/57948 |