Protocol
1. processable पानी संश्लेषण
- एक 250 मिलीलीटर दौर नीचे फ्लास्क में एनिलिन भंग (1 मिलीलीटर, 11 mmol) क्लोरोफॉर्म के 60 मिलीलीटर में पूरी तरह से। 5 मिनट के लिए 600 rpm और बर्फ के साथ 0-5 डिग्री सेल्सियस तक शांत में हिलाओ। यह आमतौर पर 15-20 मिनट (चित्रा 2A) लेता है।
- सोडियम dodecyl बेंजीन Sulphonate (NaDBS) (7.44 छ, 21 mmol) एक दौर तली फ्लास्क में एनिलिन समाधान में जोड़े जबकि 600 rpm पर क्रियाशीलता।
- 20 मिलीलीटर पानी में अमोनियम persulphate (ए पी) (3.072 जी, 13.5 mmol) को भंग करने और जोड़ने यह सब बूंद के लिहाज से 30 मिनट से अधिक प्रतिक्रिया overheating से बचने के लिए।
- 24 घंटे के लिए 0-5 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया के लिए बाहर ले, और यह एक और 24 घंटे के लिए कमरे के तापमान तक पहुँचने के लिए अनुमति देते हैं।
- निरीक्षण प्रतिक्रिया मिश्रण शुरू में 15 मिनट के बाद दूधिया सफेद बारी है, तो गहरे भूरे रंग 2 घंटे के बाद, और अंत में 24 घंटा (चित्रा 2 बी-एफ) के बाद गहरे हरे रंग के लिए।
- एक Buchner कीप के साथ पानी-NaDBS समाधान फ़िल्टर। 80 मिलीलीटर क्लोरोफॉर्म और के रूप में 120 मिलीलीटर पानी के साथ मिक्सeparation कीप (चित्रा 2 जी)।
- कमरे के तापमान पर 24 घंटे के लिए समाधान सेते हैं और जुदाई कीप से गहरे हरे रंग पानी जमा है, जलीय सतह पर तैरनेवाला में unreacted NaDBS और ए पी जा रही है।
2. पानी जांच मिश्रण और पराबैंगनी विकिरण
- क्लोरोफॉर्म-पानी के साथ पानी समाधान 10x पतला (1: 3 वी / वी) और एक microfuge ट्यूब में 15 मिनट के लिए कमाल की कोमल द्वारा जांच डीएनए oligonucleotides के 6.4 μmol से पतला पानी के 200 μl मिश्रण।
- 2 मिनट के लिए एक crosslinker में 1,200 μJ / सेमी यूवी की 2 के साथ पानी-डीएनए समाधान चमकाना। यह महत्वपूर्ण है कि यूवी जोखिम संकेत राशि तक सीमित है। यूवी के लिए विस्तारित जोखिम पानी में प्रतिदीप्ति परिवर्तन, पानी और डीएनए के सहसंयोजक पार से जोड़ने के कारण होने की संभावना समझौता।
- 6 मिनट के लिए 17,000 XG पर centrifugation द्वारा गोली परिसरों, और फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) से धो लें। फिर गोली, और पीबीएस में फिर से निलंबित।
3. एचपानी-जांच के ybridization
- पानी जांच परिसरों के 200 μl के लिए 100 माइक्रोन के पूरक डीएनए oligonucleotides के 8 μl न्यूक्लिक एसिड जोड़ें या लक्ष्य।
- 40 पर 15 मिनट के लिए समाधान मिश्रण कमाल से संकरण प्रदर्शन करना सी।
- 6 मिनट के लिए 17,000 XG पर centrifugation द्वारा पानी परिसरों गोली। पीबीएस के साथ धोने और पानी में फिर से निलंबित।
4. उत्सर्जन स्थिर राज्य प्रतिदीप्ति माप
- 250 एनएम पर एक साथ 96 microplate में अलग उपचार से पानी जोड़ें और उत्तेजना से 270-850 एनएम रेंज में उत्सर्जन प्रतिदीप्ति उपाय। पानी के लिए एक उत्सर्जन चोटी के 500 एनएम के आसपास मनाया जाना चाहिए।
5. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी संकरित द्वैध का मापन
- 48 घंटे के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर एक borosilicate ग्लास coverslip और सूखे पर कोट पानी गिरा।
- एक सूखे पानी फिल्म पर जांच (100 सुक्ष्ममापी के 8 μl) जोड़ें और पराबैंगनी प्रकाश (1,200 μJ / 2 सेमी के साथ यह चमकाना
- 48 घंटे के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस के साथ पानी जांच फिल्म और सूखी धो लें।
- लक्ष्य न्यूक्लिक एसिड जोड़कर 15 मिनट के लिए संकरण प्रदर्शन करना। यह एक जैविक नमूने या एक नियंत्रण लक्ष्य oligonucleotide (100 सुक्ष्ममापी के 8 μl) हो सकता है। एक पीबीएस धोने के साथ पालन करें।
- 40x बढ़ाई पर फ्लोरोसेंट छवियों को प्राप्त करते हैं, एक 500 एनएम लंबे पास फिल्टर के साथ।
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Representative Results
चित्रा 2A polymerization की प्रक्रिया, यानी, ए पी अलावा पहले के शुरू में प्रतिक्रिया सेटअप कब्जा। मिसेल गठन प्रतिक्रिया में प्रारंभिक कदम micellar इंटरफेस में प्रक्रिया-पानी संश्लेषण होता है। चित्रा 2 बी 5 मिनट के बाद एक दूधिया समाधान चलता। 30 मिनट के बाद ए पी प्रतिक्रिया जोड़ा जाता है एक थोड़ा भूरा रंग में बदल जाता है। चित्रा -2 सी oligomers के गठन के साथ जुड़े रंग परिवर्तन को दर्शाता है। चित्रा 2 डी, 4 घंटे के बाद एक गहरे भूरे रंग से पता चलता लघु श्रृंखला पानी के एक उच्च एकाग्रता का संकेत है, साथ सुसंगत एक बहुत ही धीमी प्रतिक्रिया। अंत में 48 घंटा कि क्लोरोफॉर्म-पानी (चित्रा 2 ई) में छितरी हुई है उच्च आणविक भार पानी की एक गहरे हरे रंग समाधान मनाया जा सकता है के बाद। चित्रा 2 एफ एक अच्छी तरह से छितरी हुई है, समरूप पानी को अलग करने कीप में कोई चरण जुदाई के साथ समाधान से पता चलता है।
(चित्रा 2) "1"> सेंसिंग न्यूक्लिक एसिड पायस में बाहर किया जा सकता है या ड्रॉप-लेपित फिल्मों की सतह पर (चित्रा 3)। पानी फिल्मों के बेसल प्रतिदीप्ति अपेक्षाकृत कम है (चित्रा 3 ए)। जांच डीएनए फिल्म पर जोड़ा है, और कमरे के तापमान पर सूखने के लिए अनुमति दी है। उम्मीद डीएनए पानी जटिल रूपों, प्रतिदीप्ति में एक तीव्र वृद्धि मनाया जा सकता है जब (चित्रा 3 बी)। नकारात्मक आरोप लगाया डीएनए से इलेक्ट्रॉन बाढ़ पानी के अणुओं में उच्च इलेक्ट्रॉन घनत्व का कारण बनता है, प्रतिदीप्ति वृद्धि के कारण। जांच-लक्ष्य डुप्लेक्स के संकरण प्रेरित हदबंदी के बाद, पानी प्रतिदीप्ति बेसल तीव्रता (चित्रा 3 सी) के लिए आए। हदबंदी कि समझौता पानी जांच बातचीत संकरण पर डीएनए रीढ़ की हड्डी में परिवर्तन के कारण होता है। इस तकनीक के साथ सेंसिंग न्यूक्लिक एसिड भी पायस (चित्रा 3 डी) में सीधे किया जा सकता है। पायस का उपयोग करने का एक लाभ आधारित प्रणाली प्लेट रीडर उपकरणों के साथ संगतता है। यह पानी प्रतिदीप्ति की एक बेहद सटीक माप परमिट, और फिल्म कोटिंग में अनियमितताओं की वजह से कठिनाइयों से बचा जाता है। पायस प्रारूप में एक पानी आधारित सेंसर अति विशिष्ट है। लक्ष्य oligo में एक भी बेमेल (मिमी) की शुरूआत बेसल पानी प्रतिदीप्ति (चित्रा 3 डी) को बहाल करने में विफल रहता है।
चित्रा 1. यूवी जोखिम द्वारा मध्यस्थता जांच की कुर्की पानी से सेना की टुकड़ी में बढ़ जाती है पानी प्रतिदीप्ति। लक्ष्य न्यूक्लिक एसिड परिणामों के संकरण, और बेसल प्रतिदीप्ति बहुलक का प्रत्यावर्तन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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चित्रा 2. processable पानी के संश्लेषण। (ए) polymerization प्रतिक्रिया का प्रारंभ। (बी) के 5 मिनट के बाद जब ए पी धीरे से जोड़ा जाता है। (सी) 30 मिनट के बाद ए पी अलावा। (D) 1 घंटे के बाद। (ई) 4 घंटे के बाद। (एफ) प्रतिक्रिया के 48 घंटे के बाद ग्रीन उत्पाद है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3. पानी प्रतिदीप्ति का उपयोग न्यूक्लिक एसिड संकरण borosilicate ग्लास पर ड्रॉप-कोटिंग के माध्यम से बनाया (ए) पानी की फिल्म, 40 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए सुखाने के द्वारा पीछा पता लगाने के लिए।। (बी) के जांच के स्थिरीकरण के बाद पानी प्रतिदीप्ति। (सी)पानी-स्थिर जांच के साथ लक्ष्य डीएनए के संकरण के बाद। (डी) पहले और या तो पूरक या एकल बेमेल (मिमी) लक्ष्य ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स साथ संकरण के बाद पानी पायस के 500 एनएम पर प्रतिदीप्ति। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
न्यूक्लिक एसिड की एक पानी आधारित सेंसर आदेश डीएनए और आरएनए के साथ बातचीत करने के लिए पानी में बहुलक के solubilization की आवश्यकता है। पानी में पानी के फैलाव surfactants का उपयोग कर पूरा किया है, micelles के गठन के रूप में पहले 8 की सूचना दी। यहां इस्तेमाल किया 4-sulfophthalic एसिड की dodecyl एस्टर की तरह अन्य anionic surfactants NaDBS के अलावा, Nonyl फिनोल ethoxylate, या cetyltrimethyl अमोनियम ब्रोमाइड की तरह cationic surfactants तरह nonionic surfactants भी processable पानी 9,10 के संश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। 1 दाढ़ अनुपात: संश्लेषण यहाँ वर्णित anionic surfactant NaDBS एक 2 पर मोनोमर एनिलिन को जोड़ा गया का एक निश्चित अनुपात के साथ शुरू होता है। surfactant NaDBS एक उच्च hydrophile-lipophile संतुलन (HLB) एनिलिन मोनोमर micellar बहुलक तेल की बूंदों और पानी के बीच संतुलन स्थापित करके क्लोरोफॉर्म-पानी में emulsified के polymerization की इजाजत दी है। ऑक्सीडेंट ए पी एस तो एक 1 पर जोड़ा गया है: 1.5 दाढ़ अनुपात जीआर के micelles उत्पन्न करने के लिएपानी, जहां भीतरी कोर एक nucleating एजेंट के रूप में कार्य करता है कारण। यह monomers के पूंछ कुर्की करने के लिए सिर करने के लिए, जबकि भी आसपास के विलायक 11,12 के साथ गतिशील संतुलन में पानी रखने के लिए सुराग। उच्च आणविक भार पॉलिमर जब तक एक नियंत्रित तरीके से प्रतिक्रिया आय 13 बनते हैं। इस प्रोटोकॉल कणों कि 50 एनएम से 1500 एनएम 3 करने के लिए सीमा उत्पन्न होगा। एक प्रतिक्रिया है, जहां पानी अभी तक धीरे धीरे बढ़ता घुलनशील बनी हुई है स्थापित करने के लिए गंभीर ऑक्सीडेंट ए पी एस, कम तापमान, और मजबूत protonic एसिड के अभाव की धीमी है। अभिकारक अनुपात के कुछ अनुकूलन अच्छी तरह छितरी हुई पानी उत्पन्न करने के लिए आवश्यक हो सकता है। पानी इस विधि द्वारा संश्लेषित एक वर्ष से अधिक एक पायस के रूप में के लिए स्थिर है। के रूप में फैलाव की HLB संतुलन बाधित हो सकता है अत्यधिक कमजोर पड़ने से बचा जाना चाहिए, पानी वेग के कारण। उच्च गति मिश्रण समाधान में पानी रखने के लिए कर सकते हैं। बिल्कुल सही घुलनशीलता वांछनीय नहीं है, के रूप में यह गोली formati बंद करना होगापर है, जो एक पायस आधारित सेंसर में संकरण प्रक्रियाओं के लिए एक महत्वपूर्ण कसौटी है।
पैदा करने के बाद पानी छितरी हुई है, डीएनए जांच ओलिगोस इलेक्ट्रोस्टैटिक बातचीत के माध्यम से बहुलक मैट्रिक्स से जुड़े होते हैं। पानी imine समूहों के संपर्क और डीएनए की रीढ़ की फॉस्फेट अनायास होते हैं। गैर विशिष्ट पानी-न्यूक्लिक एसिड बातचीत जटिल जैविक नमूने 14 में analyte संवेदन को मुश्किल। पानी और जांच के लिए डीएनए के बीच सहयोग को सहज बातचीत से प्रतिष्ठित किया जा सकता प्राप्त करने के लिए, जटिल यूवी के साथ विकिरणित है। यूवी-ट्रिगर प्रभारी स्थानीयकरण से प्रेरित ध्रुवीय moieties के सृजन बहुलक सतह से 15 के wettability बढ़ जाती है। इष्टतम जोखिम लगभग 2 मिनट है, और अगर 500 एनएम पर पानी प्रतिदीप्ति मोटे तौर पर 5X (चित्रा 3) ऊंचा है की पुष्टि की जा सकती है। अधिक जोखिम यूवी के लिए परिसर के पानी और डीएनए है, जो electrostatic बातचीत के विपरीत, डो के बीच crosslinking करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैंपानी प्रतिदीप्ति की ऊंचाई का कारण नहीं है।
सेंसर पैदा करने की प्रक्रिया को आसान और तेज है। polymerization प्रतिक्रिया 48 घंटे unreacted ऑक्सीडेंट और NaDBS से अलग करने के लिए 24 घंटे के बाद के बाद पूरा हो गया है। संश्लेषण शेयर इस लेख में प्रोटोकॉल के द्वारा उत्पादित पानी की मात्रा के रूप में कभी कभी बाहर ले जाने की आवश्यकता होगी एक सेंसर में इस्तेमाल राशि के लिए बहुत बड़ी रिश्तेदार है। उच्च सांद्रता में पानी पायस स्थिर है; हालांकि, किसी भी कमजोर पड़ने कि जांच लगाव के दौरान होता है पानी की वर्षा करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, सेंसर प्रदर्शन समझौता। पानी जांच परिसरों का तत्काल उपयोग के लक्ष्य का पता लगाने के लिए इस मुद्दे से बचना होगा। साथ में, परिसरों और संकरण के निर्माण के एक घंटे के तहत किया जा सकता है। पानी जांच फिल्मों अधिक स्थिर हैं और लंबी अवधि के भंडारण के बाद इस्तेमाल किया जा सकता है। इस सेंसर तकनीक की एक सीमा है कि यह अत्यधिक बहुसंकेतन के लिए उत्तरदायी नहीं है। प्रत्येक पता लगाने घटना एक अलग ट्यूब में बाहर किया जाना चाहिए। फिल्में हो सकती हैबहुसंकेतन के लिए एक बेहतर स्वरूप प्रदान के रूप में विभिन्न जांच एक फिल्म के विभिन्न क्षेत्रों पर देखा जा सकता है। एक नमूना मौके सरणी पर लागू किया जा सकता है, और प्रत्येक स्थान पर प्रतिदीप्ति एक अलग जीन की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया।
पता लगाने तंत्र यहाँ वर्णित अन्य प्रणालियों पर कई लाभ प्रदान करता है। पानी से जुड़े एक हदबंदी तंत्र के माध्यम से न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने की खबरों के डीएनए ओलिगोस 5 जांच से जुड़ी fluorophores पर भरोसा करते हैं। अन्य रणनीतियों जांच, जो लक्ष्य न्यूक्लिक एसिड 16-17 में एकल आधार जोड़ी अंतर भेद करने में विफल के सहसंयोजक लगाव का उपयोग करें। लेबलिंग या इस प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में पता लगाने के अन्य माध्यमिक मोड की चूक विद्युत सक्रिय पानी के अन्य गुणों का उपयोग करने के लिए अवसर पैदा करता है। सेंसर प्रतिक्रिया इस प्रकार विद्युत गुण सेंसर की कुर्की-टुकड़ी गतिशीलता से बदल की माप के लिए बढ़ाया जा सकता है। प्रयोगशालाओं कि इस तकनीक को अपनाने रों मिलेगाEnsor प्रणाली तेजी से और सीधा करने के अलावा लागत प्रभावी हो।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aniline | Fisher Scientific | A7401-500 | ACS, liquid, refrigerated |
| Ammonium peroxydisulfate | Fisher Scientific | A682-500 | ACS, crystalline |
| Sodium dodecylbenzene sulfonate | Pfaltz & Bauer | D56340 | 95% solid |
| Chloroform | Fisher Scientific | MCX 10601 | Liquid |
| DNA primers | MWG operon | n/a | custom DNA sequence ~20 bps |
| Microplate | USA Scientific | 1402-9800 | 96 well, polypropylene as it is unreactive to chloroform |
| Microplate Adhesive Film | USA Scientific | 2920-0000 | Reduces well-to-well contamination, sample spillage and evaporation |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-D | PANI coated on UV irradiated cover glass |
| UV crosslinker | UVP | HL-2000 | Energy: X100 μJ/cm2; Time: 2 min |
| Hybridization Oven | VWR | 01014705 T | Temperature: 400 °C; with rocking for 15 min |
| Glass Apparatus | Fisher Scientific | Three necked round bottom flask for reaction; dropping funnel, stoppers, condenser, separating funnel | |
| Microscope | Leica Microsystems | Leica IMC S80 | Magnification 20X; Pseudo color 536 nm; Exposure 86 msec; Gain 1.0x; Gamma 1.6 |
| Microplate Reader | Molecular Devices | 89429-536 |
References
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