Introduction
Flercelliga bakteriesamhällen spelar viktiga roller i naturliga och antropogena miljöer, och kan vara till nytta eller mycket skadlig. Dessa flercelliga kolonier kallas biofilmer, varvid de enskilda cellerna är inbäddade i en egenproducerade extracellulära polymera substanser (EPS) matris. EPS kraftigt vidhäfta cellerna till ytan de kolonisera. De fungerar som en sköld mot mekaniska och kemiska krafter och skapa en nära kontakt mellan angränsande celler, vilket underlättar cellulär kommunikation 1. En biofilm kan ses som ett differentierat samhälle, där celler använder starkt reglerad, iscensatt processer för att samordna sina insatser i samhället, liksom över arter 2-5. Övergången från ett plankton fritt levande läge för tillväxt till en biofilm tillstånd förknippas ofta med utvecklingsprocesser. Ett bra exempel är de grampositiva jordbakterien Bacillus subtilis och därför en undomesticated stam fungerar som en robust modellorganism för att studera utvecklingsstadier som leder till biofilmbildning. I denna bakterie, rörliga celler organiserar sig i iögonfallande flercelliga strukturer som utför specialiserade arbetsuppgifter 4. En grupp av celler, den matris producenterna utsöndrar exopolysackarider 6, den amyloidprotein Tasa 7,8, och ytan hydrofobicitet proteinet BslA 9,10; vilka alla deltar i sammansättningen av de EPS 11-13.
Med tanke på överflödet av biofilmer i naturliga och antropogena nischer och den förmodade dödliga skador de kan orsaka, det finns ett trängande behov av att hitta sätt att förhindra deras bildning. Småmolekylinhibitorer kan underlätta upptäckten av nya regulatoriska vägar, enzymer och strukturella proteiner involverade i biofilmbildning, och därigenom främja insikter i komplexa processer av flercelliga gemenskap enheten. Som B. subtilis är en väl studerad modell för biofilmbildning 14,15, kan den användas för att utvärdera effekterna av olika biofilm hämmare. Denna studie behandlar fyra grundläggande metoder som är viktiga för att utvärdera svaret av biofilmer på småmolekylinhibitorer. För det första att se till att dessa hämmare har en biofilm-specifikt mål, är separationen av effekten på planktontillväxt från effekten på biofilm formation kritisk. De flesta antibakteriella medel målceller i deras plankton tillväxtfas, men molekyler som riktar sig mot biofilmen livsstil är sällsynta. Dessutom, eftersom molekyler som inte påverkar planktontillväxt är inte giftig, kan de minska selektionstryck gynnar antibiotikaresistenta mutanter 16. Till exempel när biofilmer behandlas med D-aminosyror eller vissa andra cellvägg störande molekyler, de antingen störs eller demonteras, men dessa inhibitorer endast milt påverkar planktontillväxt 12,17. Däremot många antibiotika dramatiskt försämra planktontillväxt, med little eller ingen effekt på bildning av biofilm 17.
För det andra, är avgörande om upprättande av en konsekvent och robust experimentell ram för att studera effekten av små molekyler. Vi observerade att den aktiva koncentrationsområdet av småmolekylinhibitorer var känslig för de pre-odlingsbetingelser och i den experimentuppställning som används för att studera effekten av dessa småmolekylära inhibitorer. Olika rapporter, särskilt de som studerar B. subtilis, visade variationer i koncentrationsintervall vid vilket D-aminosyror hämmar bildningen av pellicles - de flytande bakteriella biofilmer 12,17-19. Resultaten som presenteras här tyder på att följande faktorer hänsyn till skillnader i den aktiva koncentrationsintervall: pre-odlingsbetingelser (logaritmisk 12,17 kontra sen stationär 20 tillväxtfas), tillväxtmediet som används i pre-odlingsbetingelser (rik, odefinierat [Luria Broth, LB] kontra definieras [natriumglutamat-glycerol, MSgg]), inokuleringen förhållandet och i synnerhet avlägsnandet av den pre-kulturmedium före ympning. Temperaturen av statisk hinna tillväxt visade en mindre viktig roll i aktivitetsintervallet för den lilla molekylen hämmaren D-leucin, en representativ D-aminosyra som används i denna studie.
Slutligen, när de biofilmer behandlas med specifika biofilm inhibitorer, robusta och informativa metoder krävs för att karakterisera verkningarna av dessa inhibitorer på biofilm fitness. Här används två metoder för att självständigt karakteriserar effekten av småmolekylära inhibitorer beskrivs i detalj: (1) Effekten på enskilda celler inom en biofilm koloni och deras motståndskraft mot antimikrobiella medel. Celler i biofilmer är vanligtvis mer resistenta mot antibiotika jämfört med fritt levande bakterier 21-23. Även om detta fenomen är multifaktoriell, har förmåga EPS för att minska antibiotika penetration ofta betraktas som en tilltalande förklaring 24
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Att bedöma effekten av småmolekylinhibitorer på hinnan och Biofilm kolonibildning
- Bered en 2x lösning av definierade biofilm framkallande MSgg mediet 25 utan kalciumklorid och järn (III) klorid hexahydrat. Efter filtersterilisering, tillsätt kalciumklorid. Mediet är klar att använda direkt eller den kan lagras vid 4 ° C i mörker.
- Förbered 1x MSgg utspädning på dagen för experimentet.
- Späd 2x MSgg mediet till 1x med sterilt destillerat vatten (pellicles) eller steril 3% varm (80 ° C) agar (biofilmer) och tillsätt jäm (III) klorid-hexahydrat till en slutlig koncentration av 50 ^ M (pellicles) eller 250 pM ( biofilmer). Lägga antibiotika eller småmolekylära hämmare till önskad koncentration och blanda väl. Till exempel, för att erhålla en slutlig koncentration av 0,5 mM D-leucin i 30 ml för att etablera pellicles eller biofilmer, tillsätt 196,6 | il av en 76,3 mM (10 mg / ml) D-leucin stamlösning.
NEJTE:. Den slutliga 1x MSgg sammansättning beskrivs i tabell 1 Jämfört med det ursprungliga receptet 25, innehöll mediet 50 | ig / ml treonin och järnkoncentrationen att växa biofilm kolonier på fast MSgg mediet ökades 2.5x att optimera skrynkliga kolonimorfologi .
- Späd 2x MSgg mediet till 1x med sterilt destillerat vatten (pellicles) eller steril 3% varm (80 ° C) agar (biofilmer) och tillsätt jäm (III) klorid-hexahydrat till en slutlig koncentration av 50 ^ M (pellicles) eller 250 pM ( biofilmer). Lägga antibiotika eller småmolekylära hämmare till önskad koncentration och blanda väl. Till exempel, för att erhålla en slutlig koncentration av 0,5 mM D-leucin i 30 ml för att etablera pellicles eller biofilmer, tillsätt 196,6 | il av en 76,3 mM (10 mg / ml) D-leucin stamlösning.
- Efter stelning av ägarn, torka de fasta MSgg plattor i en biologisk huv för 30-45 min före ympningen.
- Att välja specifika hämmare som stör mekanismerna för hinna bildning (Figur 1), utesluter att de koncentrationer som används påverkar plankton och statisk tillväxt.
- Bestämma planktontillväxt (ökning i optisk densitet med tiden i vätskekultur) på ett enkelt tillväxtkurva genom att mäta den optiska densiteten vid 600 nm varje timme tills den stationära tillväxtfasen.
- För att bekräfta att den uppmätta kultur grumlighet representerar levande celltal, fastställa antalet kolonibildande enheter (CFU)av celler i planktontillväxtfasen från en skakkultur efter flera tidpunkter.
- För att bedöma effekten av småmolekylinhibitorer på statisk hinna tillväxt, skörd celler i slutet av en tre dagars inkubation vid 23 ° C från en 24-brunnscellodlings väl, ympades under samma betingelser som beskrivs i avsnitt 1,7-1,9 och bestämma CFU. För denna kontroll, använd en tunn fattiga stammen som saknar operoner som kodar för de extracellulära matrixkomponenter (dvs, B. subtilis Δ epsH, Δ Tasa).
OBS: Denna stam kan växa under statiska betingelser, men i motsats till en pellikel bildande vild typ, är det bristfälliga i förmågan att flyta med det vätskeluftgränssnittet, där tillväxten gynnas på grund av ökade syrenivåer 26. Således är denna extracellulära matrix- och hinnan fattiga stammen en rekommenderad referensstam för att bedöma tillväxt under statiska betingelser.
OBS: För specifik exriklig av den icke-kanoniska D-aminosyra D-leucin som beskrivs nedan, en effekt på plankton och statisk tillväxt vid koncentrationer som störde pellikel bildning var uteslutet 12,17. Metoder för att beräkna plankton och statisk tillväxt beskrivs i detalj 17.
Figur 1. Konceptuell översikt för identifiering av en robust experimentuppställning för att bedöma den specifika hämningen av biofilmbildning. Kriterier för småmolekylinhibitorer som indikerar specifik störning med biofilm formation utan uttalad effekt på planktontillväxt Selection. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Strimma ut B. subtilis från en -80 ° C lager (LB Culture av 10 9 celler / ml som frysts i 20% glycerol) för att isolera enskilda kolonier på en LB-1,5% agarplatta med en steril spets eller applikator pinne.
- Växa över natten vid 30 ° C.
- Kritiskt steg: För en robust pellikel hämmande genom icke-kanoniska D-aminosyror, såsom D-leucin, växer en enda koloni plockas från LB-1,5% agarplatta i 3 ml LB-buljong vid 37 ° C under 4 h i en skakinkubator (skakningar hastighet 200 rpm). Ersätta LB-buljong med biofilm-inducerande MSgg mediet före ympning genom att centrifugera 1,5 ml startkultur under 4 min vid 6000 xg, noggrant avlägsnande av supernatanten och återsuspendering av pelleten i 1,5 ml MSgg medium. Resten av kulturen kan kasseras.
Viktigt: För att säkerställa robustheten i systemet, bör den optiska densiteten vid 600 nm (OD 600) av den tvättade startkulturen vara mellan 0,6 och 1. - Under tillväxten av startkulturen, förbereda en 12-brunnars cellodlings multidish platta containing 3 ml MSgg-medium utan eller med ett koncentrationsområde av den lilla molekylen hämmare (t ex, 0,3, 0,5, 1 mM D-leucin 17). För att utesluta kanteffekter, distribuera placeringen av de olika koncentrationer över multidish plattan. Alternativt kan du använda 24-brunnscellodlings multidish plattor innehållande 1,5 ml MSgg medium.
- Inokulera brunnarna i 12-brunnars cellodlings multidish platta med 3 | il av den tvättade startkultur (1: 1000 utspädning).
OBS: En lägre utspädningsförhållandet, det vill säga 1: 500 kan användas. Detta minskar utvecklingstiden för pellicles. - Odla pellicles vid 23 ° C under statiska betingelser i tre dagar. Flytta inte pellicles under denna tid, eftersom det kan påverka den slutliga ytan morfologi hinna.
- Förvärva bilder med en kikare och homogen exponering av blixtnedslag. Alternativt kan du ta en bild av pellicles med en kamera med hög upplösning. För att undvika artefakter som orsakas av inconsistält ljus vinklar och skuggor, ta top-down bilder med kameran fastsatt på ett stativ och använda en mjuk och stor ljuskälla vid 45 ° från båda sidor.
OBS: En alternativ metod för att studera B. subtilis flercellighet är biofilmen kolonianalys på fast, biofilm framkallande MSgg medium. Liksom pellicles tillåter denna analys studiet av Spatiotemporal processer. När det aktiva området av småmolekylinhibitorer bestäms, kan studeras deras effekt på biofilm kolonibildning. - Att växa biofilm kolonier, symmetriskt plats 1,5 pl av otvättade pre-kultur (steg 1,7) på den torkade MSgg 1,5% agarplatta med hjälp av en mall - 4 droppar per petriskål av 8,5 cm i diameter. Låt dropparna absorberas till plattan innan du flyttar dem.
OBS: Mallen hjälper till att få en jämn fördelning av biofilmen kolonierna inom det område där cellerna odlas. För att förbereda mall, dra den totala arealen av tillväxt på original skalor, dela det lika sektyttersta randområdena och markera centrum. För en rund petriskål med 8,5 cm diameter, tilldelar denna 14 cm 2 till en biofilm koloni. - Inkubera plattorna vid 30 ° C under tre dagar. Under denna tid, biofilms kolonier utvecklas och bildar en tredimensionell, rynkig struktur.
- Ta bilder som i steg 1,11.
2. Etanol Resistance Assay
- Väx biofilmer som beskrivs i steg 1,1-1,7 och 1,12-1,14.
- Efter 68 h tillväxt vid 30 ° C, skär biofilm kolonier i två lika delar med hjälp av ett rakblad och mallen.
Figur 2. Exempel experimentell design för att bedöma motståndet av biofilm koloniceller till steriliseringsmedel. (A) mall som används för en jämn fördelning av biofilm kolonier över en petriskål och för kapning. (B)Top-down bilder av obehandlat vildtyp biofilm som odlas för 68 timmar på fast definierade biofilm framkallande MSgg medium vid 30 ° C. Utvidgningen visar hur en biofilm koloni kan skäras i två lika stora delar. (C) De två lika stora biofilms halvor behandlas lika (kontroll, PBS) eller med antingen PBS eller steriliseringsmedel och bearbetas såsom beskrivits. Skala bar. 1 cm Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Lyft försiktigt varje halva av biofilmen koloni från agarplattan med en liten spatel och flytta den till en 1,5 ml mikrocentrifugrör innehållande 500 | il av fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS). Om nödvändigt, skrapa de återstående cellerna från plattan och överföra dem till mikrocentrifugrör samt.
OBS: Den andra halvan av biofilmen kolonin behandlas differentiellt, beroende på om det är kontroll eller för att testa beständigheten mot Sterilizing medel. - För kontrollen, inkubera den andra halvan av biofilmen koloni i 500 | il PBS som i steg 2,3. För att bedöma motståndet mot steriliseringsmedel, överföra den andra halvan av biofilmen kolonin till 500 pl 50% (v / v) etanol.
OBS: Alternativ steriliseringsmedel, såsom natriumhypoklorit, kan användas. För alla steriliseringsmedel som används, bestämma den aktiva tiden koncentration och inkubation i ett förberedande experiment. - Inkubera biofilm kolonier under 10 min på bänken-top vid rumstemperatur.
- Centrifugera biofilm kolonier för 5 minuter vid 18.000 xg och försiktigt bort supernatanten med en pipett. Tillsätt 300 pl av PBS.
- Sonikera cellerna milt (amplitud 10%, puls 5 sek) med mikro av en sonikator.
OBS! Sonication energi måste vara tillräckligt för att separera biofilm aggregat. Däremot kan alltför hård ultraljudsbehandling lysera cellerna. Bekräfta i förväg genom ljusmikroskop att sonication energisom används inte lysera cellerna och att alla aggregat är upplösta. - Lägg 700 pl av PBS till en slutlig volym av 1 ml. Utför en serieutspädning (10 -7) i PBS och sprida 100 pl 3 utspädningar på en LB-1,5% agarplatta med sterila glaspärlor.
OBS: De optimala utspädningar som skall pläteras bör fastställas i ett preliminärt experiment, eftersom detta beror på mängden av celler i biofilmen koloni av intresse och överlevnadsgraden hos de celler som svar på steriliseringsmedlet. - Inkubera plattorna över natten vid 30 ° C, räkna CFU och bestämma CFU / ml. Från den slutliga CFU / ml av varje halv biofilm kolonier, beräkna andelen överlevande.
OBS: Om de utförs och analyseras såsom beskrivits, de två halvorna av styr biofilmen kolonin och den obehandlade kontra etanol aminbehandlade halvan av den obehandlade biofilm kolonin bör ge skillnader under 10% i viabla cellräkningar, kontroll av symmetri eller motståndet av kolonin , respectively. Alternativt kan resultaten vara representerade totalt CFU. Cellantalet för kontroll och obehandlade biofilm koloni bör förbli i samma storleksordning. Däremot är cellräkningar av etanolbehandlade halvan av en liten molekyl behandlad biofilm koloni väntas sjunka med minst två tiopotenser att kräva en ökad känslighet för steriliseringsmedlet.
3. Biofilm Colony Provberedning för Svepelektronmikroskopi
- Väx biofilm kolonier som beskrivs i steg 1,1-1,7 och 1,12-1,14.
- Bered en färsk sats av 2% (volym / volym) glutaraldehyd, 3% (volym / volym) paraformaldehyd-lösning i 100 mM natriumkakodylat, 5 mM kalciumklorid-buffert, pH 7,3. Förbered 5 ml fixativ för varje petriskål med 8,5 cm diameter.
VARNING: Glutaraldehyd och paraformaldehyd är farliga. Hantera dem med säkerhetsutrustning i en kemisk huva. Kasta lösningar och kontaminerat material till hazligt avfall. - Försiktigt fixativ till biofilm kolonier, utan dispense direkt ovanpå biofilmer.
OBS: På grund av den hydrofoba karaktären av biofilmen koloni, kolonierna lösgöra långsamt från ägarn och börja flyta. - försegla försiktigt plattorna med en remsa av Parafilm. Inkubera på en roterande skakanordning under 2 h vid rumstemperatur och därefter överföra plattorna till 4 ° C under natten.
- Nästa dag, försiktigt bort vätskan med en Pasteur glaspipett ansluten till en vakuumpump.
- Tillsätt försiktigt 10 ml 100 mM natriumkakodylat, 5 mM kalciumklorid buffert att tvätta biofilmen och inkubera i 5 min. Försiktigt bort vätskan med Pasteur glaspipett från hörnet av plattan för att undvika skador på biofilm och tillsätt färsk tvättlösning genom försiktig pipettering. Upprepa detta steg en gång.
- För uttorkning av biofilm kolonier, fortsätt med följande steg: 2x 5 min i DDH 2 O; 2x 20 min i 30% etanol; 2x 20 minuter i 50% etanol; 2x 20 min i 70% etanol; 2x 20 min i 96% etanol; 2x 30 min i 100% etanol.
- Tillsätt 15 ml vätska för varje petriskål med 8,5 cm diameter i varje steg och ta bort vätskan noggrant efter varje inkubation.
- Använda en av två olika metoder för torkning av proverna från etanol.
- För lufttorkning ur etanol:
- Skär ett cellulosafilterpapper (diameter 9 cm) i kvartal. dränka kort kvart i 100% etanol, och sedan försiktigt överföra en flytande biofilm koloni på den. Sätta den våta filterpapper i en petriskål fodrad med ett filterpapper. Täck petriskål och låt biofilm kolonier torka över natten i en kemisk huv.
- För kritisk punkt (CP) -drying användning av koldioxid (CO 2) som övergångsvätskan:
- Fylla 75% av den kritiska punkten torkmaskin kammare med 100% etanol. Överför proverna i en hållare, varje prov i sin egen cHamber. Om det behövs, skär biofilmen med sax i mindre bitar. Lämnar proverna nedsänkta i etanol under all hantering. Sedan överföra hållaren in i kammaren och stäng kammaren tätt.
- Kyla kammaren till 7 ° C och börja omröring. Fylla kammaren fullständigt med flytande CO2. Under en 7 min inkubation tid, låt etanolen blandas med CO2. Då, ladda ur 25% av lösningen.
OBS: Töm inte kammaren under nivån för provet. - Upprepa steg 3.8.2.2 fyra gånger.
- Upprepa steg 3.8.2.2 fem gånger med en inkubationstid på endast 5 min. Slutligen bör etanolen vara helt ersättas av CO2.
- Under den sista omgången, tom endast 5% av kammaren. Stäng av omrörning och kylning. Börja värma kammaren till 42 ° C. Vid en temperatur av 31,1 ° C och ett tryck av 73,9 bar, flytande CO2 når sin kritiska punkt, den stat där gasformiga phase har samma densitet som den flytande fasen av lösningsmedlet 27. När temperaturen når 42 ° C, inkubera i 10 min. Vid 42 ° C, CO 2 i kammaren existerar som superkritisk gas.
OBS: Ständigt kontrollera trycket av kammaren. Trycket bör inte överstiga 120 bar vid 42 ° C. - Börja med att långsamt släppa gasen med kontinuerlig uppvärmning. Detta håller proverna i CO 2-gas fas och förhindrar deformering av provexemplaret morfologi genom spännvätskeytan. Ställ in flödesmätaren till 5 L / tim genom fininställning doseringsventilen att styra flödesmätaren. Vänta tills all trycket i kammaren släpps. Nu öppnar kammaren och ta prover noggrant ur hållaren.
- För lufttorkning ur etanol:
- Belägga ett elektronmikroskopi stub med kol tejp. Med hjälp av pincett, noggrant överföra biofilm kolonierna på stubben. Anslut varje koloni till stubben genom att lägga till en tunn bro från bilenbon band, vilket är avgörande för laddnings eliminering under elektronstrålen. I detta skede, hantera biofilm kolonier med försiktighet eftersom de är mycket bräcklig. Förvara proverna i en torkapparat under minst 24 timmar eller tills undersökning.
- Dagen för undersökning med svepelektronmikroskop, sputter-belägga biofilm kolonier för två minuter i en 60 ° vinkel i en guld-palladium sputter beläggnings. Upprepa detta steg två gånger och rotera proverna med 120 ° i mellan. Vid slutet, sputter-coat proverna en gång under 3 min från toppen. 20 nm tunt lager av guld-palladium förbättrar ledningsförmågan och förbättrar kontrasten av provet för avbildning i SEM.
- Lagra proverna i en exsickator för att undvika rehydratisering av provet 28 fram till avbildning med svepelektronmikroskop 29,30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Pellikeln-analysen är en metod för att studera de starkt reglerade och dynamiska processer av B. subtilis flercellighet. Förutom detta är pellikeln assay lämpad för att testa ett intervall av antingen pre-starter villkor eller små molekylära koncentrationer i en enda cell-kultur multidish platta i ett experiment. Emellertid B. subtilis hinna bildning är känslig för de pre-odlingsbetingelser (t.ex., tillväxtmedium av pre-kulturen och dess tillväxtfasen), inokuleringen förhållandet och avlägsnandet av den pre-kulturmediet. Vi har därför först screenas för en experimentuppställning som tillät oss att reproducera hinna hämning av D-leucin. Våra resultat visar att reproducerbar pellikel inhibering av D-leucin kan erhållas om cellerna är pre-odlades i odefinierat, rikt LB-medium till en mid-logaritmisk tillväxtfas (enstaka koloni i 3 ml LB vid 37 ° C under 4 h med skakning ), centrifugerades ner och åter-suspenderades i definierat MSgg medium före en 1: 1000 inoculatjon (figur 3A). När cellerna odlades i MSgg medium till mitten av logaritmisk tillväxtfas (enskild koloni i 1 ml LB under 2 h, åter-utspätt 1: 100 till 3 ml MSgg, och odlades under 5 h vid 37 ° C med skakning vid 200 rpm), gjorde avlägsnande av den pre-kulturmediet inte ha en effekt på D-leucin-aktivitet. Celler odlade till den stationära tillväxtfasen (enskild koloni i 1 ml LB under 2 h, re-spädda 1: 100 till 3 ml MSgg, och odlas i upp till 20 h i en rulle vid rumstemperatur) och tvättades i MSgg medium före ympning var mindre känsliga. Emellertid skulle denna ökning av resistens mot pellikeln hämmande effekt av D-leucin bero på den högre celltäthet av pre-kultur, vilket ökar inokulering förhållandet. Inokuleringen förhållandet av förkulturen till den statiska tillväxt i MSgg mediet, dvs., ett: 500 eller 1: 1000, påverkade aktivitetsintervallet för D-leucin och tiden för pellikel utveckling (figur 3B). Hinna inhibition av D-leucin inträffadevid olika tillväxttemperaturer (23 ° C och 30 ° C, figur 3C). Viktigare, medan känsligheten hos celler till D-leucin beror på de pre-odlingsbetingelser, reproducerbarheten av de fenomen vid olika temperaturer visar att pellikel inhibering genom den lilla molekylen D-leucin har robusta funktioner.
. Figur 3. Exempel resultat som visar effekterna av olika pre-odlingsbetingelser på hinnan hämning av D-leucin Flera parametrar måste bedömas för att erhålla en robust experimentuppställning, inklusive: (A) avlägsnande av föroreningar från förodling tillväxt medium (inte tvättas mot tvättat), odlingsmedium av pre-kultur (rik, odefinierade LB-medium eller definierade biofilm-inducerande MSgg medium), och tillväxttillstånd pre-kultur (logaritmisk mot stationär tillväxtfas), (B) ympning förhållande (1: 1000 kontra 1: 500) av pre-kulturen i den slutliga pellikel tillväxtmediet, och (C) tillväxttemperatur (23 ° C kontra 30 ° C) B.. subtilis NCIB 3610-celler odlades i mediet anges (LB eller MSgg) under 4 h vid 37 ° C eller vid rumstemperatur över natt (o / n) med skakning, och pre-kulturmedium ersattes med MSgg om indikerat (tvättas eller inte tvättas). Slutligen tillsattes startkulturen ympades en: 1000 om inte annat anges och pellicles odlades under statiska betingelser vid 23 ° C under tre dagar. Top-down fotografier förvärvades med en kamera. Väl diameter är 22 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Efter identifiering av pre-odlingsbetingelser och en experimentell uppställning som tillåts för en reproducerbar aktivitetsintervallet för D-leucin på pellikel bildning (förkultur odlades i LB till en mid-logaritmisk tillväxtfas, tvättades i MSgg, späddes 1: 1000 och odlades vid 23 ° C under tre dagar), effekten testades för sin robusthet. För detta ändamål, var aktiviteten av D-leucin på hinnan bildning utvärderas i olika modifierade MSgg media (Figur 4). Den aktivitetsintervallet för D-leucin i pellikel inhibering överensstämde i de fem medier som testades, och visar att effekten av D-leucin på pellikel bildning är robust. En liknande trend observerades med D-tyrosin, där hinna inhibition i koncentrationsområdet upp till 2 | iM var konsekvent i flera modifierade MSgg media (lägre järnkoncentration och utbyte av kvävekällan med ammoniumklorid eller kolkälla med glukos, data visad).
Figur 4. Känslighet för D-leucin förekommer iolika odlingsmedier. Visas är top-down fotografier av B. subtilis NCIB 3610 pellicles, som odlas under statiska betingelser vid 23 ° C i definierat, biofilm-inducerande MSgg medium eller i olika modifierade MSgg media (kolkällan 0,5% glukos; kvävekälla 0,5% (NH4) 2 SO4, hög järn 250 | iM FeCl3; låg glycerol 0,125% glycerol) under tre dagar, med undantag för den alternativa kvävekällan medium (där pellicles odlades i fem dagar) antingen utan eller med D-leucin vid koncentrationer angivna. Startkulturer odlades under 4 h vid 37 ° C med skakning i odefinierat, rikt LB-medium. Före ympning tvättades cellerna genom centrifugering och återsuspenderades i motsvarande pellikel tillväxtmediet. Startkulturen späddes 1: 1000, är väl diametern 22 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
En alternativ metod för att studera B. subtilis flercellighet är biofilmen kolonianalys på fast MSgg medium. Liksom pellicles tillåter denna analys studiet av Spatiotemporal processer. När väl det aktiva intervallet småmolekylinhibitorer bestäms i pellikeln systemet, kan studeras deras effekt på biofilm kolonibildning. I denna studie var biofilm kolonier användes för att bedöma effekten av D-leucin på motstånd av biofilm kolonier till steriliseringsmedel, eftersom biofilm kolonier är mindre sköra och på den fasta bakgrunden, de är lättare att manipulera. När biofilm kolonier behandlade med D-leucin är utsatta för 50% etanol under 10 min, droppar den procentuella andelen överlevande celler dramatiskt jämfört med det obehandlade fraktionen (Figur 5). Denna metod kan vidareutvecklas för att bedöma effekterna av andra småmolekylinhibitorer och deras effekt på motståndet mot bakteriedödande medel (sterilizing medel eller antibiotika).
Figur 5. Exempel resultat av obehandlat eller behandlat biofilm koloni motstånd mot steriliseringsmedel. Biofilm kolonier av B. subtilis NCIB 3610 fick växa på fast, definierat medium för 68 timmar vid 30 ° C, med eller utan 0,5 mM D-leucin. Efter skärning kolonierna i två lika halvor, var en halv behandlades med PBS (intern kontroll) och den andra hälften med 50% etanol eller PBS (kontroll). Efter mild ultraljudsbehandling, serieutspädning, plätering och räkning av kolonibildande enheter, var andelen överlevande jämfört med den interna kontrollen beräknades. Visas är resultatet av tre oberoende experiment med medelvärden av två (A) eller tre (B, C) replikerar och deras standardavvikelser. Klicka här to se en större version av denna siffra.
Svepelektronmikroskopi (SEM) är ett kraftfullt verktyg som kan användas för att fokusera på den rumsliga arkitekturen av biofilm koloni rynkor, överflödet och lokalisering av EPS och enda cellmorfologin 31. SEM avbildning kräver prover som kan avbildas under högt vakuum. För att undersöka prover under högvakuum betingelser, har alla bulkvattenmolekyler som skall avlägsnas, och därför kräver SEM avbildning dehydratiseringen av provet före avbildning. Alternativt kan prover avbildas under låga vakuumförhållanden i den våta läge genom svepelektronmikroskop (ESEM), där det hydratiserade provet försiktigt torkas i mikroskopet kammaren. För att utvärdera effekterna av småmolekylinhibitorer på biofilm koloni arkitektur, EPS organisation och cellmorfologi, har tre olika typer av prov uttorkning jämfört: torkning i mikroskop under våt mode villkor (ESEM), lufttorkades ur ett lösningsmedel eller kritisk punkt (CP) Torkade med användning av koldioxid som övergångsvätskan. I obehandlade och D-leucin-behandlade B. subtilis biofilm kolonier olika hydra steg enligt den metod som används kunde observeras. Imaging under låga vakuum i den våta läge genom ESEM bevarat mycket naturliga tillstånd av biofilmen kolonin. Men information om en enda cell morfologi och EPS överflöd och arkitektur var knappa, eftersom EPS var fortfarande helt släckt och cellerna inbäddade i EPS (data ej visade). När det gäller uttorkning, CP-torkning var de strängaste förfarandet. Det bort mest strukturellt bundna och bulkvattenmolekyler från vävnaden, vilket motsvarar en volymförlust av 30-70%, beroende på vävnaden 32. I kontrast, konserverade lufttorkning de bundna vattenmolekyler. En embryonal vävnad till exempel förlorat 18% av sin volym efter lufttorkning från det flyktiga lösningsmedlet etanol och 59% efter CP-torkning 32 (figur 6A) . Biofilm kolonier som var uttorkad med etanol och CP-torkade också bevarat sin tredimensionella struktur och EPS verkade som ett spindelnät (Figur 6C). I lufttorkade och CP-orkade prov, effekterna av lågmolekylär hämmare D-leucin på biofilmen koloni arkitektur, en enda cell morfologi och EPS struktur var uppenbar (figur 6B och D). Biofilm kolonier odlade i närvaro av D-leucin var mindre och rynkor var mindre uttalad. D-leucin-behandlade celler långsträckt, en fenotyp som är observed i celler som behandlats med cellvägg-målsökande molekyler 33. Dessutom cellerna klart mindre täckt med EPS och inte tätt anslutna till sina grannceller via EPS som ses i de obehandlade biofilm kolonierna. De presenterade resultaten visar att båda metoderna för biofilm koloni uttorkning, lufttorkas från etanol eller CP torkas med användning av koldioxid som övergångsvätskan ger värdefulla insikter om effekten av små molekyler på enstaka cellmorfologin, liksom på EPS överflöd och arkitektur.
Figur 6. Små molekyler kan ändra den stora och liten skala av biofilmen koloni arkitektur. Biofilm kolonier av B. subtilis NCIB 3610 vuxen (A och D) i frånvaro eller (B och D) i närvaro av 0,5 mM D-leucin under 72 timmar vid 30 ° Cpå fast MSgg medium fixerade såsom beskrivits i protokollet och torkas ur etanol enligt följande: (A och B) lufttorkas och (C och D) CP torkas med användning av koldioxid som övergångsvätskan. Här visas uppifrån kikare bilder av biofilm kolonier (vänster, övre paneler), uppifrån och ned fotografier av de torkade biofilm kolonierna monterade på elektronmikroskopi stubbar innan guld palladium-beläggning (vänster, lägre paneler), låg och hög förstoring bilder som förvärvats av SEM för att visa 3D-arkitektur biofilm koloni rynkor eller enda cell morfologi / EPS organisation. Skala barer från vänster till höger. 5 mm, 100 pm, 2 um Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| 1.925 mM | pottassium Fosfat, monobasiskt |
| 3.075 mM | kaliumfosfat, dibasiskt |
| 100 mM | 3- (N morfolino) propansulfonsyra, pH 7,1 |
| 2 mM | magnesiumkloridhexahydrat |
| 700 | iM | kalciumklorid vattenfri |
| 50 ^ M en | järn (III) klorid-hexahydrat |
| 125 ^ M b | |
| 1 ^ M | zinkklorid vattenfri |
| 2 ^ M | tiaminhydroklorid |
| 50 | j, g / ml | tryptofan |
| 50 | j, g / ml | fenylalanin |
| 50 | j, g / ml | treonin |
| 0,5% (volym / volym) | glycerol vattenfri |
| 0,5% (vikt / volym) | L-glutaminsyra mononatrium- alter hydrat |
| en för hinna analys b för biofilm analys | |
Tabell 1. Slutligt 1x MSgg komposition som används i denna studie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bacillus subtilis bildar robusta och mycket strukturerade biofilmer både i flytande (pellicles) och på fast medium (kolonier). Därför fungerar den som en idealisk modellorganism för att karaktärisera verkningsmekanismen för specifika biofilm hämmare. På fasta medier, celler bildar flercelliga strukturer med särdrag som inte är uppenbart i pellicles, som rynkor som strålar ut från centrum till kanten. Således pellicles och kolonier är kompletterande system för att studera B. subtilis flercellighet.
Målet med denna studie är att utveckla en B. subtilis modellsystem för biofilm (pellicles och kolonier) hämning. Flera steg är kritiska för reproducerbarhet av biofilmen störningar uppsats. Ett första kritiska steget är att bekräfta att effekten på biofilmbildande är inte beror på en allmän toxicitet för bakterier som odlats i plankton livsstil. Detta kan anses vara genom att jämföra effekten av en given koncentration av somköpcentret molekyl hämmare på den relativa biofilmen inhibering av effekten av denna molekyl på planktontillväxt. En dramatiskt starkare effekt på biofilm utveckling kan säkerställa identifiering av mål mekanismer som är specifikt viktiga för utvecklingen av biofilmer. Vidare visar vikten av de pre-odlingsbetingelser till utvecklingen av pellicles och deras känslighet för små molekyler den här beskrivna studien. Innan karakterisera effekten av små molekyler, reproducerbara och robusta experimentella betingelser (t.ex. hinna tillväxttemperatur och brist på känslighet för mediernas sammansättning) för att testa deras effekter bör definieras. Att hitta sådana förhållanden, media pre-odlingsbetingelser, bör övervägas tillväxtfas av pre-kultur, pre-odlingsmedier borttagning, tillväxttemperatur och tillväxtmedier.
En stor utmaning, när en specifik inhibitor för biofilmbildning hittas är att hitta kvantitativoch kvalitativa metoder som karakteriserar effekterna av dessa småmolekylinhibitorer på biofilm utveckling och motstånd. Här är två viktiga metoder beskrivs i detalj som kan användas för att bedöma effekterna av sådana inhibitorer. Först presenterar vi en enkel kvantitativ metod som reproducerbart kan sondera motståndet behandlade kontra obehandlade koloni biofilmer till baktericider, såsom etanol. Representativa resultat visas för känsligheten hos D-leucin-behandlade biofilm kolonier till 50% etanol. Emellertid kan denna essä lätt ändras genom att använda olika steriliseringsmedel eller antibiotika. För det andra är en SEM metod som beskrivs i detalj som tillåter hög upplösning undersökning av ändringarna i biofilmen kolonin som orsakas av lågmolekylär hämmare i flera kompletterande nivåer: den övergripande strukturen, organisationen och överflöd av EPS matrisen och dess komponenter, och encelliga morfologier i hela biofilm. Vi noterar att två metoder för dehydratipå (lufttorkning från 100% etanol eller CP-torkning med användning av koldioxid som övergångs vätska) kan användas lika under SEM provberedningen av en biofilm koloni. Viktigt framgångsrik fixering av biofilmen provet bygger till stor del på de hydrofoba egenskaperna hos biofilmen kolonin. Denna hydrofoba är en inneboende egenskap hos B. subtilis biofilmer på grund av det hydrofoba ytskiktet 10,34.
Flera tillvägagångssätt har använts tidigare för att studera biofilm montering och utveckling med B. subtilis som en modellorganism 35. Ett antal oberoende studier visat effekterna av media sammansättning på biofilm utveckling 36-38. Hittills dock en systematisk utvärdering av effekterna av media sammansättning på biofilm inhibition var, såvitt vi vet, saknas. Denna studie visar att medan hinna hämning av B. subtilis av små molekyler är känsliga för pre-odlingsbetingelser, är det unaffected av effekterna av temperatur och media sammansättning, och således användbara för systematiska skärmar småmolekylinhibitorer. Dessutom har vi etablerat en enkel, reproducerbar och kvantitativ metod för att bedöma motståndet av obehandlat eller lågmolekylär hämmare behandlade biofilm kolonier till antibakteriella medel, som för närvarande saknas i biofilmen modellorganismen B. subtilis.
B. subtilis biofilmer i kombination med fluorescerande reportrar kan föras vidare för att leta efter småmolekylära hämmare som riktar antingen en specifik utvecklingssteg av biofilmbildning eller en särskild undergrupp av celler i biofilmen. De häri beskrivna metoderna tillhandahåller inte enda cell upplösning i termer av genuttryck inom biofilmen. Metoder för EPS matris genuttryck analys inom B. subtilis biofilmer på enskild cellnivå etablerades framgångsrikt 39.
Bakteriella biofilmer är av crucial betydelse i jordbruk, industri och kliniska inställningar. I en jordbruks sammanhang ökar kapaciteten för att bilda biofilmer växtvärden koloniseringen av många växtpatogener 40, och i en klinisk kontext, biofilmer är till sin natur resistenta mot antimikrobiella medel 21 och är kärnan i många långlivade och kroniska bakterieinfektioner. Dessutom är det nu erkänt att biofilmer har stora kostnadskonsekvenser för industrin eftersom de är extremt svårt att ta bort och kontrollera 41. Således kommer att utveckla en experimentell ram för att studera mikrobiella biofilm hämmare ger betydande jordbruks 42,43, kliniska 21,44 och tekniska 45-47 framsteg.
De nuvarande metoderna är begränsade till B. subtilis. Vi uppmuntrar följer de beskrivna kvantitativa och kvalitativa begrepp att studera biofilm specifika småmolekylinhibitorer i andra arter. Dessutom Hänför sig denna studie till ett specifikt exempel för biofilm inhibition av D-leucin, tidigare 17 flera specifika biofilm inhibitorer publicerats. Viktigt var D-leucin redan karakteriseras som en anti-biofilm molekyl i växtpatogen Xanthomonas citri 48, presenterar möjliga likheter mellan växt kolonisering och biofilmbildning. Biofilmbildning (hinna och rugose kolonibildning) är också vanligt i humana patogener (t.ex. Pseudomonas aeruginosa 49-51 och uropatogen Escherichia coli 52,53). De beskrivna metoderna kan vidareutvecklas för att söka efter specifika läkemedel som hämmar biofilmbildning och minska biofilm-medierad resistens mot antimikrobiella medel i klinisk forskning. Sammantaget kan de metoder som beskrivs här användas som en grund för att utveckla kvantitativa och kvalitativa begrepp att studera biofilmspecifika små molekylhämmare i andra arter också.
nt "> Sammanfattningsvis ger vi en enkel och användbar verktygslåda som visar de potentiella styrkor och fallgropar att använda B. subtilis för att studera biofilm-hämmare.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Luria Broth, Lennox | Difco | 240230 | |
| Bacto Agar | Difco | 214010 | |
| potassium phosphate monobasic | Sigma, 136.09 g/mol | P0662-500G | |
| potassium phosphate dibasic | Fisher Scientific, 174.18 g/mol | BP363-1 | |
| 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid | Fisher Scientific, 209.27 g/mol | BP308-500 | |
| magnesium chloride hexahydrate | Merck, 203.30 g/mol | 1.05833.0250 | |
| calcium chloride anhydrous | J.T. Baker, 110.98 g/mol | 1311-01 | |
| manganese(II) chloride tetrahydrate | Sigma, 197.91 g/mol | 31422-250G-R | |
| iron(III) chloride hexahydrate | Sigma, 270.30 g/mo) | F2877-500G | |
| zinc chloride anhydrous | Acros Organics, 136.29 g/mol | 424592500 | |
| thiamine hydrochloride | Sigma, 337.27 g/mol | T1270-100G | |
| L-tryptophan | Fisher Scientific, 204.1 g/mol | BP395-100 | |
| L-phenylalanine | Sigma, 165.19 g/mol | P5482-100G | |
| L-threonine | Sigma, 119.12 g/mol | T8625-100G | |
| glycerol anhydrous | Bio-Lab Itd | 712022300 | |
| L-glutamic acid monosodium salts hydrate | Sigma, 169.11 g/mol | G1626-1KG | |
| D-leucine | Sigma, 169.11 g/mol | 855448-10G | |
| ethanol anhydrous | Gadot | 830000054 | |
| razor blade | Eddison | NA | |
| circular cellulose filter papers | Whatman, 90 mm | 1001-090 | |
| glutaraldehyde | EMS (Electron Micoscopy Science), 25% in water | 16220 | |
| paraformaldehyde | EMS, 16% in water | 15710 | |
| sodium cacodylate | Merck, 214.05 g/mol | 8.2067 | |
| calcium chloride 2-hydrate | Merck, 147.02 g/mol | 1172113 | |
| stub-aluminium mount | EMS, sloted head | 75230 | |
| carbon adhesive tape | EMS | 77825-12 | |
| Shaker 37 °C | New Brunswick Scientific Innowa42 | NA | |
| Centrifuge | Eppendorf table top centrifuge 5424 | NA | |
| Digital Sonifier, Model 250, used with Double Step Microtip | Branson | NA | |
| Incubator 30 °C | Binder | NA | |
| Incubator 23 °C | Binder | NA | |
| Filter System, 500 ml, polystyrene | Cornig Incorporated | NA | |
| Rotary Shaker - Orbitron Rotatory II | Boekel | NA | |
| S150 Sputter Coater | Edwards | NA | |
| CPD 030 Critical Point Dryer | BAL-TEC | NA | |
| Environmental Scanning Electron Microscope | XL30 ESEM FEG Philips (FEI) | NA |
References
- Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R.
- Stoodley, P., Sauer, K., Davies, D. G., Costerton, J. W. Biofilms as complex differentiated communities. Annu Rev Microbiol. 56, 187-209 (2002).
- Miller, M. B., Bassler, B. L.
- Aguilar, C., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. Thinking about Bacillus subtilis as a multicellular organism. Curr Opin Microbiol. 10, 638-643 (2007).
- Kolter, R., Greenberg, E. P. Microbial sciences: the superficial life of microbes. Nature. 441, 300-302 (2006).
- Kearns, D. B., Chu, F., Branda, S. S., Kolter, R., Losick, R. A master regulator for biofilm formation by Bacillus subtilis. Mol Microbiol. 55, 739-749 (2005).
- Branda, S. S., Chu, F., Kearns, D. B., Losick, R., Kolter, R. A major protein component of the Bacillus subtilis biofilm matrix. Mol Microbiol. 59, 1229-1238 (2006).
- Romero, D., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. Amyloid fibers provide structural integrity to Bacillus subtilis biofilms. Proc Natl Acad Sci USA. 107, 2230-2234 (2010).
- Kobayashi, K., Iwano, M. BslA(YuaB) forms a hydrophobic layer on the surface of Bacillus subtilis biofilms. Mol Microbiol. 85, 51-66 (2012).
- Hobley, L., et al. BslA is a self-assembling bacterial hydrophobin that coats the Bacillus subtilis biofilm. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 13600-13605 (2013).
- Romero, D., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. An accessory protein required for anchoring and assembly of amyloid fibres in B. subtilis biofilms. Mol Microbiol. 80, 1155-1168 (2011).
- Kolodkin-Gal, I., et al. D-amino acids trigger biofilm disassembly. Science. 328, 627-629 (2010).
- Chan, Y. G., Kim, H. K., Schneewind, O., Missiakas, D. The capsular polysaccharide of Staphylococcus aureus is attached to peptidoglycan by the LytR-CpsA-Psr (LCP) family of enzymes. J Biol Chem. 289, 15680-15690 (2014).
- Mielich-Suss, B., Lopez, D. Molecular mechanisms involved in Bacillus subtilis biofilm formation. Environ Microbiol. 17, 555-565 (2014).
- Cairns, L. S., Hobley, L., Stanley-Wall, N. R. Biofilm formation by Bacillus subtilis: new insights into regulatory strategies and assembly mechanisms. Mol Microbiol. 93, 587-598 (2014).
- Chen, M., Yu, Q., Sun, H. Novel strategies for the prevention and treatment of biofilm related infections. Int J Mol Sci. 14, 18488-18501 (2013).
- Bucher, T., Oppenheimer-Shaanan, Y., Savidor, A., Bloom-Ackermann, Z., Kolodkin-Gal, I. Disturbance of the bacterial cell wall specifically interferes with biofilm formation. Environ Microbiol Rep. 7, 990-1004 (2015).
- Sarkar, S., Pires, M. M. D-Amino acids do not inhibit biofilm formation in Staphylococcus aureus. PLoS One. 10, e0117613 (2015).
- Wei, W., Bing, W., Ren, J., Qu, X. Near infrared-caged D-amino acids multifunctional assembly for simultaneously eradicating biofilms and bacteria. Chem Commun (Camb). 51, 12677-12679 (2015).
- Leiman, S. A., et al. D-amino acids indirectly inhibit biofilm formation in Bacillus subtilis by interfering with protein synthesis. J Bacteriol. 195, 5391-5395 (2013).
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Davies, D. Understanding biofilm resistance to antibacterial agents. Nat Rev Drug Discov. 2, 114-122 (2003).
- Olsen, I. Biofilm-specific antibiotic tolerance and resistance. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 34, 877-886 (2015).
- Tseng, B. S., et al. The extracellular matrix protects Pseudomonas aeruginosa biofilms by limiting the penetration of tobramycin. Environ Microbiol. 15, 2865-2878 (2013).
- Branda, S. S., Gonzalez-Pastor, J. E., Ben-Yehuda, S., Losick, R., Kolter, R. Fruiting body formation by Bacillus subtilis. Proc Natl Acad Sci USA. 98, 11621-11626 (2001).
- Holscher, T., et al. Motility, Chemotaxis and Aerotaxis Contribute to Competitiveness during Bacterial Pellicle Biofilm Development. J Mol Biol. 427, 3695-3708 (2015).
- Bray, D. Methods in Biotechnology. 13, Humana Press Inc. 235-243 (2000).
- Ensikat, H. J., Ditsche-Kuru, P., Barthlott, W. Scanning electron microscopy of plant surfaces: simple but sophisticated methods for preparation and examination. 1, Formatex Research Center. 248-255 (2010).
- Hayat, M. A. Principles and techniques of scanning electron microscopy: Biological applications. 2, Van Nostrand Reinhold Company. (1976).
- Schatten, H. Scanning Electron Microscopy for the Life Sciences. , Cambridge University Press. (2013).
- Bridier, A., Meylheuc, T., Briandet, R. Realistic representation of Bacillus subtilis biofilms architecture using combined microscopy (CLSM, ESEM and FESEM). Micron. 48, 65-69 (2013).
- Boyde, A., MacOnnachie, E. Volume changes during preparation of mouse embryonic tissue for scanning electron microscopy. SCANNING. 2, 149-163 (1979).
- Yao, Z., Kahne, D., Kishony, R. Distinct single-cell morphological dynamics under beta-lactam antibiotics. Mol Cell. 48, 705-712 (2012).
- Epstein, A. K., Pokroy, B., Seminara, A., Aizenberg, J. Bacterial biofilm shows persistent resistance to liquid wetting and gas penetration. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 995-1000 (2011).
- Vlamakis, H., Chai, Y., Beauregard, P., Losick, R., Kolter, R. Sticking together: building a biofilm the Bacillus subtilis way. Nat Rev Microbiol. 11, 157-168 (2013).
- Shemesh, M., Chai, Y. A combination of glycerol and manganese promotes biofilm formation in Bacillus subtilis via histidine kinase KinD signaling. J Bacteriol. 195, 2747-2754 (2013).
- Kolodkin-Gal, I., et al. Respiration control of multicellularity in Bacillus subtilis by a complex of the cytochrome chain with a membrane-embedded histidine kinase. Genes Dev. 27, 887-899 (2013).
- Oppenheimer-Shaanan, Y., et al. Spatio-temporal assembly of functional mineral scaffolds within microbial biofilms. npj Biofilms and Microbiomes. 2, 15031 (2016).
- Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry. J Vis Exp. , e3796 (2012).
- Bogino, P. C., Oliva Mde, L., Sorroche, F. G., Giordano, W. The role of bacterial biofilms and surface components in plant-bacterial associations. Int J Mol Sci. 14, 15838-15859 (2013).
- Fratamico, P. M., Annous, B. A., Guenther, N. W. Biofilms in the Food and Beverage Industires. 1, Woodhead Publishing. (2009).
- Gao, G., et al. Effect of biocontrol agent Pseudomonas fluorescens 2P24 on soil fungal community in cucumber rhizosphere using T-RFLP and DGGE. PLoS One. 7, e31806 (2012).
- Chen, Y., et al. Biocontrol of tomato wilt disease by Bacillus subtilis isolates from natural environments depends on conserved genes mediating biofilm formation. Environ Microbiol. 15, 848-864 (2013).
- Bryers, J. D.
- Logan, B. E. Exoelectrogenic bacteria that power microbial fuel cells. Nat Rev Microbiol. 7, 375-381 (2009).
- Nevin, K. P., Woodard, T. L., Franks, A. E., Summers, Z. M., Lovley, D. R. Microbial electrosynthesis: feeding microbes electricity to convert carbon dioxide and water to multicarbon extracellular organic compounds. MBio. 1, (2010).
- Torres, C. I., et al. A kinetic perspective on extracellular electron transfer by anode-respiring bacteria. FEMS Microbiol Rev. 34, 3-17 (2010).
- Li, J., Wang, N. Foliar application of biofilm formation-inhibiting compounds enhances control of citrus canker caused by Xanthomonas citri subsp. citri. Phytopathology. 104, 134-142 (2014).
- Okegbe, C., Price-Whelan, A., Dietrich, L. E. Redox-driven regulation of microbial community morphogenesis. Curr Opin Microbiol. 18, 39-45 (2014).
- Mann, E. E., Wozniak, D. J. Pseudomonas biofilm matrix composition and niche biology. FEMS Microbiol Rev. 36, 893-916 (2012).
- Bouffartigues, E., et al. Sucrose favors Pseudomonas aeruginosa pellicle production through the extracytoplasmic function sigma factor SigX. FEMS Microbiol Lett. 356, 193-200 (2014).
- Wu, C., Lim, J. Y., Fuller, G. G., Cegelski, L. Quantitative analysis of amyloid-integrated biofilms formed by uropathogenic Escherichia coli at the air-liquid interface. Biophys J. 103, 464-471 (2012).
- Serra, D. O., Richter, A. M., Hengge, R. Cellulose as an Architectural Element in Spatially Structured Escherichia coli Biofilms. J Bacteriol. 195, 5540-5554 (2013).
