Introduction
Multi-cellulære bakterielle samfund spiller en væsentlig rolle i naturlige og menneskeskabte miljøer, og kan være en fordel eller meget skadelig. Disse flercellede kolonier er kendt som biofilm, hvor de enkelte celler er indlejret i en egenproducerede ekstracellulære polymere stoffer (EPS) matrix. EPS kraftigt klæbe cellerne til overfladen, de koloniserer. De tjener som et skjold mod mekaniske og kemiske kræfter og skabe tæt kontakt mellem de omkringliggende celler, lette cellulær kommunikation 1. En biofilm kan ses som et differentieret samfund, hvor cellerne bruger stærkt reguleret, orkestreret processer for at koordinere deres aktiviteter i samfundet, samt på tværs af arter 2-5. Overgangen fra et planktoniske, fritlevende tilstand af vækst til en biofilm tilstand er ofte forbundet med udviklingsprocesser. Et godt eksempel er den grampositive jordbakterie Bacillus subtilis, og derfor et undomesticated belastning tjener som en robust model organisme for at studere de udviklingsmæssige stadier indtil biofilmdannelse. I denne bakterie, bevægelige celler organiserer sig i iøjnefaldende flercellede strukturer, der udfører specialiserede opgaver 4. En gruppe af celler, de matrix-producenter udskiller exopolysaccharider 6, det amyloid protein Tasa 7,8, og overfladen hydrofobicitet protein BslA 9,10; som alle deltager i samling af EPS 11-13.
I betragtning af den overflod af biofilm i naturlige og menneskeskabte nicher og den formodede fatale skader, de kan forårsage, er der et presserende behov for at finde måder at forebygge deres dannelse. Små molekyleinhibitorer kan støtte i opdagelsen af nye regulatoriske veje, enzymer og strukturelle proteiner involveret i biofilm dannelse, og dermed fremme indsigt i de komplekse processer flercellede samfund forsamling. Som B. subtilis er en velundersøgte model for biofilmdannelse 14,15, kan det bruges til at vurdere effekten af forskellige biofilm hæmmere. Denne undersøgelse tackler fire grundlæggende metoder, der er nøglen til evaluering af respons biofilm på inhibitorer med små molekyler. For det første at sikre, at disse inhibitorer har en biofilm-specifikt mål, adskillelse af effekten på planktoniske vækst fra effekten på biofilmdannelse er kritisk. De fleste antibakterielle midler målceller i deres planktoniske vækstfase, men molekyler, der er målrettet biofilmen livsstil er sjældne. Derudover, som molekyler, som ikke påvirker planktoniske vækst er ikke giftige, kan de reducere det selektive pres begunstige antibiotiske resistente mutanter 16. For eksempel, når biofilm behandles med D-aminosyrer eller visse andre cellevæg-interfererende molekyler, de er enten forstyrres eller skilles ad, men disse inhibitorer kun mildt påvirke planktoniske vækst 12,17. I modsætning hertil mange antibiotika drastisk forringe planktoniske vækst, med little eller ingen virkning på biofilmdannelse 17.
For det andet er afgørende indførelse af en homogen og robust eksperimentel rammer at undersøge virkningen af de små molekyler. Vi observerede, at den aktive koncentrationsområde småmolekylære inhibitorer var følsom over for de før-dyrkningsbetingelser og forsøgsopstillingen anvendes til at undersøge virkningen af disse inhibitorer med små molekyler. Forskellige rapporter, især studerer B. subtilis, afslørede variationer i koncentrationsområdet, hvor D-aminosyrer inhiberer dannelsen af pellikeler - de flydende bakterielle biofilm 12,17-19. Resultaterne præsenteres her tyder på, at følgende faktorer tegner sig for forskelle i den aktive koncentrationsområde: pre-dyrkningsbetingelser (logaritmisk 12,17 versus sen-stationær fase 20 vækst), vækstmediet anvendt i præ-kultur tilstand (rig, undefined [Luria Broth, LB] versus defineret [mononatriumglutamatglycerol, MSgg]), inokulationen forholdet og især fjernelse af præ-dyrkningsmediet inden inokulering. Temperaturen af statisk hinde vækst viste en mindre vigtig rolle i aktivitetsområdet af den lille molekyle inhibitor D-leucin, en repræsentativ D-aminosyre anvendes i denne undersøgelse.
Endelig, når de biofilm behandles med specifikke biofilm inhibitorer, der kræves robuste og informative metoder til at karakterisere effekten af disse inhibitorer på biofilm fitness. Her er to metoder til selvstændigt karakteriserer virkningen af småmolekylære inhibitorer beskrevet detaljeret: (1) Virkningen på enkeltceller i en biofilm koloni og deres resistens over for antimikrobielle midler. Celler i biofilm er typisk mere resistente over for antibiotika sammenlignet med fritlevende bakterier 21-23. Mens dette fænomen er multifaktoriel, blev evnen af EPS til at reducere antibiotikum penetration ofte betragtes som en tiltalende forklaring 24
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vurdering af Virkning af småmolekyleinhibitorer på hinde og biofilm Colony Formation
- Der fremstilles en 2x opløsning af definerede biofilm-inducerende MSgg medium 25 uden calciumchlorid og jern (III) chlorid-hexahydrat. Efter filtersterilisering, tilsæt calciumchlorid. Mediet er klar til brug direkte eller det kan opbevares ved 4 ° C i mørke.
- Forbered 1x MSgg fortynding på dagen for eksperimentet.
- Fortynd 2x MSgg medium til 1x med sterilt destilleret vand (pellikeler) eller steril 3% varm (80 ° C) agar (biofilm) og tilføje jern (III) chlorid-hexahydrat til en slutkoncentration på 50 uM (pellikeler) eller 250 uM ( biofilm). Tilføj antibiotika eller småmolekylære inhibitorer til den ønskede koncentration og bland godt. For eksempel for at opnå en endelig koncentration på 0,5 mM D-leucin i 30 ml for at etablere pellikeler eller biofilm, tilsættes 196,6 pi af en 76,3 mM (10 mg / ml) D-leucin stamopløsning.
INGENTE:. Den endelige 1x MSgg sammensætning er beskrevet i tabel 1 Sammenlignet med den oprindelige opskrift 25, mediet indeholdt 50 ug / ml threonin og jernkoncentrationen at vokse biofilm kolonier på fast MSgg medium blev forøget 2.5x at optimere rynket kolonimorfologi .
- Fortynd 2x MSgg medium til 1x med sterilt destilleret vand (pellikeler) eller steril 3% varm (80 ° C) agar (biofilm) og tilføje jern (III) chlorid-hexahydrat til en slutkoncentration på 50 uM (pellikeler) eller 250 uM ( biofilm). Tilføj antibiotika eller småmolekylære inhibitorer til den ønskede koncentration og bland godt. For eksempel for at opnå en endelig koncentration på 0,5 mM D-leucin i 30 ml for at etablere pellikeler eller biofilm, tilsættes 196,6 pi af en 76,3 mM (10 mg / ml) D-leucin stamopløsning.
- Efter størkning af agaren, tørre faste MSgg plader i en biologisk stinkskab i 30-45 min forud for inokulering.
- For at vælge specifikke inhibitorer, der interfererer med mekanismerne i hinde dannelse (figur 1), udelukke, at de anvendte koncentrationer påvirker planktoniske og statisk vækst.
- Bestem planktoniske vækst (stigning i optisk densitet med tiden i flydende kultur) i en enkel vækstkurve ved at måle den optiske densitet ved 600 nm hver time indtil den stationære vækstfase.
- For at bekræfte, at den målte kultur turbiditet repræsenterer levende celletal, fastlægge antallet af kolonidannende enheder (CFU)af celler i planktoniske vækstfasen fra en rystekultur efter flere tidspunkter.
- For at vurdere virkningen af småmolekylære inhibitorer for statisk pellicle vækst, høst cellerne ved udløb af en 3-dages inkubation ved 23 ° C fra en 24-brønds celle-kultur godt, podet under de samme betingelser som beskrevet i afsnit 1,7-1,9 og bestemme CFU. Til denne kontrol, så brug en hinde-mangelfuld stamme, der mangler operoner koder for de ekstracellulære matrixkomponenter (dvs. B. subtilis Δ EPSH, Δ Tasa).
BEMÆRK: Denne stamme er i stand til at vokse under statiske betingelser, men i modsætning til en hinde-dannende vildtype, er deficient i evnen til at flyde til væske-luft-grænsefladen, hvor væksten er begunstiget på grund af øget iltindhold 26. Således er denne ekstracellulære Matrix- og hinde-mangelfuld stamme er en anbefalet referencestamme at vurdere væksten under statiske forhold.
BEMÆRK: For den specifikke exrigelig af den ikke-kanoniske D-aminosyre D-leucin beskrevet nedenfor, en virkning på planktoniske og statisk vækst ved koncentrationer, der forstyrret hinde dannelse blev udelukket 12,17. Metoderne til bestemmelse planktoniske og statisk vækst er beskrevet detaljeret 17.
Figur 1. Konceptuel overblik for identifikation af en robust forsøgsopstilling for at vurdere den specifikke hæmning af biofilm-dannelse. Kriterier for små molekyleinhibitorer der angiver specifikke forstyrrelser biofilmdannelse uden udtalt effekt på planktoniske vækst Selection. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Streak ud B. subtilis fra en -80 ° C lager (LB culture af 10 9 celler / ml frosset i 20% glycerol) for at isolere enkelte kolonier på en LB-1,5% agar plade med en steril spids eller applikatorpind.
- Vokse natten over ved 30 ° C.
- Kritiske trin: For en robust hinde inhibering med de ikke-kanoniske D-aminosyrer, såsom D-leucin, vokser en enkelt koloni plukket fra LB-1,5% agarplade i 3 ml LB-bouillon ved 37 ° C i 4 timer i en rysteinkubator (rystehastighed 200 rpm). Erstatte LB bouillon med biofilm-inducerende MSgg medium før podning ved centrifugering 1,5 ml starterkultur i 4 minutter ved 6.000 xg, omhyggeligt fjernelse af supernatanten og resuspendering af pelleten i 1,5 ml MSgg medium. Resten af kulturen kan kasseres.
Vigtigt: For at sikre robusthed i systemet, skal den optiske densitet ved 600 nm (OD 600) af det vaskede starterkultur være mellem 0,6 og 1. - Under væksten af starterkultur, udarbejde en 12-brønd celle-kultur multiplade plade containing 3 ml MSgg medium uden eller med et koncentrationsområde af det lille molekyle inhibitor (f.eks, 0,3, 0,5, 1 mM D-leucin 17). For at udelukke randeffekter, distribuere placeringen af forskellige koncentrationer over multiplade plade. Alternativt kan du bruge 24-brønd celle-kultur multiplade plader indeholdende 1,5 ml MSgg medium.
- Inokulering brøndene i 12-brønds celle-kultur multiplade plade med 3 pi af det vaskede starterkultur (1: 1.000 fortynding).
BEMÆRK: En lavere fortyndingsforhold, dvs. 1: 500 kan anvendes. Dette reducerer udviklingstiden af pellikeler. - Dyrk de pellikeler ved 23 ° C under statiske betingelser i tre dage. Flyt ikke pellikeler løbet af denne tid, da det kan påvirke det endelige overflademorfologi af hinden.
- Anskaf billeder med en kikkert og homogen eksponering af lyn. Alternativt kan du tage et billede af de pellikeler med en høj opløsning kamera. At undgå artefakter forårsaget af inconsistelt lys vinkler og skygger, tage top-down billeder med kameraet monteret på et stativ og bruge en blød og stor lyskilde ved 45 ° fra begge sider.
BEMÆRK: En alternativ metode til at studere B. subtilis multicellularity er biofilmen koloniassay på fast, biofilm-inducerende MSgg medium. Ligesom pellikeler, dette assay tillader studiet af spatiotemporale processer. Når det aktive vifte af småmolekylære inhibitorer bestemmes, kan studeres deres virkning på biofilm kolonidannelse. - At vokse biofilm kolonier, symmetrisk spot 1,5 pi af uvaskede præ-kultur (trin 1.7) efter tørring MSgg 1,5% agar plade ved hjælp af en skabelon - 4 dråber pr petriskål på 8,5 cm i diameter. Lad dråberne adsorberer til pladen, før du flytter dem.
BEMÆRK: Skabelonen hjælper til at få en ligelig fordeling af de biofilm kolonier inden for området, hvor cellerne dyrkes. For at forberede skabelonen, trækker det samlede areal af vækst på originale skalaer, dele det til lige sektors og markere midten. For en runde petriskål på 8,5 cm i diameter, dette tildeler 14 cm2 til en biofilm koloni. - Pladerne inkuberes ved 30 ° C i tre dage. I løbet af denne tid udvikler biofilm kolonier og danner en tredimensionel, rynket struktur.
- Tag billeder som i trin 1.11.
2. Ethanol Resistance Assay
- Dyrk biofilm som beskrevet i trin 1,1-1,7 og 1.12-1.14.
- Efter 68 timers vækst ved 30 ° C, skære biofilm kolonier i to lige store dele ved hjælp af et barberblad og skabelonen.
Figur 2. Eksempel forsøgsdesign at vurdere modstanden af biofilm koloni celler til steriliseringsmidler. (A) Skabelon anvendes til ligelig fordeling af biofilm kolonier på tværs af en petriskål og til skæring. (B)Top-down billeder af ubehandlet vildtype biofilm dyrket i 68 timer på fast defineret biofilm-inducerende MSgg medium ved 30 ° C. Udvidelsen viser, hvordan en biofilm koloni kan skæres i to lige store halvdele. (C) De to lige store halvdele biofilm behandles ens (kontrol, PBS) eller med enten PBS eller steriliserende stof og forarbejdet som beskrevet. Målestok:. 1 cm Klik her for at se en større version af dette tal.
- Løft forsigtigt hver halvdel af biofilm koloni fra agarpladen med en lille spatel og flytte det til et 1,5 ml mikrocentrifugerør indeholdende 500 pi phosphatpufret saltvand (PBS). Hvis det er nødvendigt, skrabe de resterende celler fra pladen og overføre dem til mikrocentrifugerør samt.
BEMÆRK: Den anden halvdel af biofilmen koloni behandles differentielt, alt efter om det er kontrol eller teste modstanden mod SteriLízing agenter. - Til styring, inkuber anden halvdel af biofilmen koloni i 500 pi PBS som i trin 2.3. For at vurdere modstanden mod steriliserende midler, overføre anden halvdel af biofilmen koloni til 500 pi 50% (v / v) ethanol.
kan anvendes Alternative steriliserende midler såsom natriumhypochlorit: NOTE. For alle steriliseringsmidler anvendes, bestemme koncentrationen af aktivt og inkubationstid ved et indledende forsøg. - Inkubér biofilm kolonier i 10 minutter på bench-top ved stuetemperatur.
- Centrifuger biofilm kolonier for 5 minutter ved 18.000 xg og fjern forsigtigt supernatanten med en pipette. Der tilsættes 300 pi PBS.
- Sonikeres cellerne mildt (amplitude 10%, puls 5 sec) med mikrospids af en sonikator.
BEMÆRK: sonication energi skal være tilstrækkelig til separate biofilm aggregater. Dog kan for barsk sonikering lysere cellerne. Bekræft på forhånd ved lysmikroskopi, at sonication energi, ikke lysere cellerne og at alle aggregater opløses. - Tilføj 700 pi PBS til et endeligt volumen på 1 ml. Udfør en seriel fortynding (til 10 -7) i PBS og sprede 100 pi 3 fortyndinger på en LB-1,5% agarplade anvendelse af sterile glasperler.
BEMÆRK: De optimale fortyndinger skal pletteres bør bestemmes i et indledende forsøg, da dette afhænger af mængden af celler i biofilm koloni af interesse og overlevelsesraten for de celler som reaktion på steriliseringsmidlet. - Pladerne inkuberes natten over ved 30 ° C, tælle CFU og bestemme CFU / ml. Fra den sidste CFU / ml af hver den halve biofilm kolonier, beregne procentdelen af overlevende.
BEMÆRK: Når udført og analyseret som beskrevet, de to halvdele af kontrol biofilm koloni og den ubehandlede versus ethanol-behandlet halvdelen af den ubehandlede biofilm koloni skulle give forskelle på under 10% i antal levedygtige celler, der verificerer symmetrien eller modstanden af kolonien , respectively. Alternativt kan resultaterne være repræsenteret i alt CFU. De celletal af kontrollen og ubehandlet biofilm koloni bør forblive i den samme størrelsesorden. I modsætning hertil er celletællinger af ethanol-behandlede halvdel af et lille molekyle-behandlede biofilm koloni forventes at falde med mindst to størrelsesordener krav for en øget følsomhed over steriliseringsmidlet.
3. Biofilm Colony Sample Forberedelse til scanning Electron Microscopy
- Grow biofilm kolonier som beskrevet i trin 1,1-1,7 og 1.12-1.14.
- Der fremstilles en frisk batch af 2% (v / v) glutaraldehyd, 3% (v / v) paraformaldehyd-opløsning i 100 mM natriumcacodylat, 5 mM calciumchlorid, pH 7,3. Forbered 5 ml fiksativ i hver petriskål på 8,5 cm i diameter.
ADVARSEL: Glutaraldehyd og paraformaldehyd er farlige. Håndtere dem med sikkerhedsudstyr i en kemisk hætte. Kassér de løsninger og de forurenede materialer til hazardous affald. - Forsigtigt tilføje fiksativ til biofilm kolonier, uden afgivelse direkte på toppen af biofilm.
BEMÆRK: På grund af den hydrofobe karakter af biofilmen koloni, kolonierne langsomt løsnes fra agar og begynder at flyde. - forsegle forsigtigt pladerne med en stribe af Parafilm. Inkuber på et roterende rysteapparat i 2 timer ved stuetemperatur og efterfølgende overføre pladerne til 4 ° C natten over.
- Den næste dag, forsigtigt fjerne væske med en Pasteur glaspipette forbundet til en vakuumpumpe.
- Derefter tilsættes forsigtigt 10 ml 100 mM natriumcacodylat, 5 mM calciumchlorid puffersystemer at vaske biofilmen og inkuberes i 5 min. Fjern forsigtigt væsken med Pasteur glaspipette fra hjørnet af pladen for at undgå at beskadige biofilm og tilsæt frisk vask løsning ved forsigtig pipettering. Gentag dette trin én gang.
- For dehydrering af biofilm kolonier, fortsætte med følgende trin: 2x 5 min i Hedeselskabet 2 O; 2x 20 min i 30% ethanol; 2x 20 minutter i 50% ethanol; 2x 20 minutter i 70% ethanol; 2x 20 min i 96% ethanol; 2x 30 min i 100% ethanol.
- Tilsættes 15 ml væske til hver petriskål på 8,5 cm i diameter i hvert trin og fjern væsken forsigtigt efter hver inkubation.
- Brug en af to forskellige metoder til tørring af prøverne fra ethanol.
- For lufttørring fra ethanol:
- Skær en cellulose filterpapir (diameter 9 cm) i kvarte. Kort nedsænkes en fjerdedel i 100% ethanol, og derefter overføre omhyggeligt én flydende biofilm koloni på det. Sætte den våde filterpapir i en petriskål foret med et filtrerpapir. Dæk petriskålen og lad biofilm kolonier tørre natten over i en kemisk hætte.
- For kritiske punkt (KP) -drying hjælp kuldioxid (CO 2) som overgangen væske:
- Fyld 75% af det kritiske punkt tørring maskine kammer med 100% ethanol. Overfør prøverne i en holder, hver prøve i sin egen cHamber. Hvis det er nødvendigt, skæres biofilmen med en saks i mindre stykker. Lad prøverne nedsænket i ethanol under hele håndteringen. Overfør derefter holderen ind i kammeret og lukker kammeret stramt.
- Afkøle kammeret til 7 ° C og begynd omrøring. Fylde kammeret helt med flydende CO2. Under en 7 min inkubationstid, lad ethanol blandes med CO 2. Derefter udledning 25% af opløsningen.
BEMÆRK: Må ikke tømmes kammeret under niveauet for prøven. - Gentag trin 3.8.2.2 fire gange.
- Gentag trin 3.8.2.2 fem gange med en inkubationstid på kun 5 min. Endelig bør ethanol fuldstændigt erstattet af CO 2.
- Under den sidste runde, tom kun 5% af kammeret. Sluk for omrøring og afkøling. Begynd opvarmning af kammeret til 42 ° C. Ved en temperatur på 31,1 ° C og et tryk på 73,9 bar, den flydende CO2 når sit kritiske punkt, den tilstand, hvor den gasformige phase har samme massefylde som den flydende fase af de 27 opløsningsmiddel. Når temperaturen når 42 ° C, inkuberes i 10 min. Ved 42 ° C, CO2 i kammeret eksisterer som superkritisk gas.
BEMÆRK: Konstant kontrollere trykket i kammeret. Trykket bør ikke overstige 120 bar ved 42 ° C. - Begynd langsomt frigive gassen med kontinuerlig opvarmning. Dette holder prøverne i CO 2 -gas fase og forhindrer deformation af prøven morfologi gennem væsken overfladespænding. Sæt flowmåleren til 5 l / t ved finjustering doseringsventilen styrer flowmåleren. Vent indtil alt trykket i kammeret frigives. Nu åbner kammeret og fjern prøverne forsigtigt ud af holderen.
- For lufttørring fra ethanol:
- Coat en elektron mikroskopi stub med carbon tape. Med hjælp fra en pincet, omhyggeligt overføre biofilm kolonier på stub. Forbinde hver koloni til stubben ved at tilføje en tynd bro fra bilbon tape, som er afgørende for charge elimination under elektronstrålen. På dette stadium, håndtere biofilm kolonier med forsigtighed, da de er meget skrøbelige. Opbevar prøverne i en ekssikkator i mindst 24 timer, eller indtil eksamen.
- Dagen for undersøgelsen med scanning elektron mikroskop, sputter-coat de biofilm kolonier for 2 min i en 60 ° vinkel i en guld-palladium sputter-coater. Gentag dette trin to gange og rotere prøverne med 120 ° i mellem. Ved udgangen, sputter-coat prøverne én gang i 3 min fra toppen. Den 20 nm tyndt lag guld-palladium forbedrer ledningsevne og forbedrer kontrasten i stikprøven til billeddannelse i SEM.
- Opbevare prøverne i et tørreapparat for at undgå rehydratisering af prøven 28 indtil billeddannelse med et scanningselektronmikroskop 29,30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hinden analysen er en metode til at undersøge de stærkt regulerede og dynamiske processer af B. subtilis multicellularity. Ud over dette, er hinden assayet egnet til at teste en række af enten præ-starter betingelser eller små molekyler koncentrationer i en enkelt celle-kultur multiplade plade i ét eksperiment. Imidlertid B. subtilis hinde dannelse er følsom over for de før-dyrkningsbetingelser (f.eks vækstmedium af præ-kulturen og dens vækstfase), podningen forholdet og fjernelsen af præ-dyrkningsmediet. Vi har derfor først screenet for en forsøgsopstilling, der tillod os at reproducere hinde hæmning af D-leucin. Vores resultater viser, at der kan opnås reproducerbar hinde inhibering med D-leucin, hvis cellerne er præ-dyrket i udefineret, rigt LB-medium til en mid-logaritmisk vækstfase (enkelt koloni i 3 ml LB ved 37 ° C i 4 timer under omrystning ), centrifugeret ned og resuspenderet i defineret MSgg medium før en 1: 1.000 inoculation (figur 3A). Når cellerne blev dyrket i MSgg medium til det midt-logaritmisk vækstfase (enkelt koloni i 1 ml LB i 2 timer, re-fortyndet 1: 100 til 3 ml MSgg, og dyrket i 5 timer ved 37 ° C under omrystning ved 200 rpm), gjorde fjernelse af den før-dyrkningsmediet ikke har en effekt på D-leucin aktivitet. Celler dyrket til den stationære vækstfase (enkelt koloni i 1 ml LB i 2 timer, re-fortyndet 1: 100 til 3 ml MSgg, og dyrket i op til 20 timer i en rulle ved stuetemperatur) og vasket i MSgg medium før podning var mindre følsomme. denne stigning i resistens mod hinde hæmning virkningen af D-leucin, kunne imidlertid skyldes den højere celledensitet af præ-kultur, hvilket øger podning ratio. Inokulationen mellem den præ-kultur til den statiske vækst i MSgg medium, dvs. 1: 500 eller 1: 1000, påvirket aktiviteten vifte af D-leucin og tidspunktet for hinde udvikling (figur 3B). Hinde inhibering med D-leucin forekomved forskellige vækst- temperaturer (23 ° C og 30 ° C, figur 3C). Vigtigt er det, medens følsomheden af celler til D-leucin afhænger af de præ-dyrkningsbetingelser, reproducerbarheden af fænomenerne ved forskellige temperaturer viser, at hinde inhibering med lille molekyle D-leucin har robuste funktioner.
. Figur 3. Eksempel resultater, som viser effekterne af forskellige præ-dyrkningsbetingelser på hinde inhibering med D-leucin Flere parametre skal vurderes for at opnå et robust forsøgsopstilling, herunder: (A) fjernelse af kontaminanter fra væksten forkultur medium (ikke vasket versus vasket), vækstmedium af præ-kultur (rig, undefined LB-medium eller defineret biofilm-inducerende MSgg medium), og væksten tilstand af præ-kultur (logaritmisk versus stationære vækstfase), (B) podning ratio (1: 1.000 versus 1: 500) af for-kulturen i den endelige hinde vækstmedium og (C) væksttemperatur (23 ° C versus 30 ° C) B.. subtilis NCIB 3610 celler blev dyrket i mediet angivet (LB eller MSgg) i 4 timer ved 37 ° C eller ved stuetemperatur natten over (o / n) under omrystning, og præ-dyrkningsmediet blev erstattet af MSgg hvis indiceret (vasket eller ikke-vasket). Endelig blev starterkulturen inokuleret 1: 1,000, hvis ikke andet er angivet, og pellikeler blev dyrket under statiske betingelser ved 23 ° C i tre dage. Top-down fotografierne blev erhvervet med et kamera. Nå diameter er 22 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Efter identificering af præ-dyrkningsbetingelser og en forsøgsopstilling, der tillades for en reproducerbar aktivitet række D-leucin på hinde formation (forkultur dyrket i LB til en mid-logaritmisk vækstfase, vasket i MSgg, fortyndet 1: 1.000 og dyrket ved 23 ° C i tre dage), virkningen blev testet for dets robusthed. Til dette formål, blev aktiviteten af D-leucin på hinde dannelse vurderet i forskellige modificerede MSgg medier (figur 4). Aktiviteten vifte af D-leucin i hinde inhibering var konsistent i de fem testede medier, og viser, at virkningen af D-leucin på hinde dannelse er robust. En lignende tendens blev observeret med D-tyrosin, hvor hinde inhibering i koncentrationsområde på op til 2 uM var konsistent i flere modificerede MSgg medier (lavere jernkoncentration og udskiftning af nitrogenkilden med ammoniumchlorid eller carbonkilden med glucose, data ikke vist).
Figur 4. Følsomhed over for D-leucin forekommer iforskellige vækst- medier. Vist er top-down fotografier af B. subtilis NCIB 3610 pellikeler, dyrkes under statiske betingelser ved 23 ° C i defineret, biofilm-inducerende MSgg medium eller i forskellige modificerede MSgg medier (carbonkilde 0,5% glucose; nitrogenkilde 0,5% (NH4) 2SO 4; højt jernindhold 250 uM FeCl3; lav glycerol 0,125% glycerol) i tre dage, med undtagelse af den alternative nitrogenkilde medium (hvor pellikeler blev dyrket i fem dage) enten uden eller med D-leucin ved koncentrationer angivet. Starterkulturer blev dyrket i 4 timer ved 37 ° C under omrystning i udefineret, rigt LB-medium. Før inokulering blev cellerne vasket ved centrifugering og resuspenderet i den tilsvarende hinde vækstmediet. Den starterkultur blev fortyndet 1: 1000, godt diameter er 22 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
En alternativ metode til at studere B. subtilis multicellularity er biofilmen koloniassay på fast MSgg medium. Ligesom pellikeler, dette assay tillader studiet af spatiotemporale processer. Når det aktive vifte af småmolekylære inhibitorer bestemmes i hinden systemet, kan studeres deres virkning på biofilm kolonidannelse. I denne undersøgelse blev biofilm kolonier anvendt til at vurdere virkningen af D-leucin på modstanden af biofilm kolonier til steriliserende midler, fordi biofilm kolonier er mindre skrøbelige og på den faste baggrund, de er lettere at manipulere. Når biofilm kolonier behandlet med D-leucin udsættes for 50% ethanol i 10 minutter, dråber procentdelen af overlevende celler dramatisk sammenlignet med den ubehandlede fraktion (figur 5). Denne metode kan udvikles yderligere for at vurdere virkningen af andre små molekyler inhibitorer og deres effekt på resistens over for bakteriedræbende midler (sterilders agenter eller antibiotika).
Figur 5. Eksempel resultater af ubehandlet eller behandlet biofilm koloni modstand mod en steriliseringsmiddel. Biofilm kolonier af B. subtilis NCIB 3610 blev dyrket på fast, defineret medium for 68 timer ved 30 ° C, med eller uden 0,5 mM D-leucin. Efter skæring kolonierne i to lige store halvdele, blev den ene halvdel behandlet med PBS (intern kontrol) og den anden halvdel med 50% ethanol eller PBS (kontrol). Efter mild sonikering, seriel fortynding, plating og optælling af de kolonidannende enheder blev procentdelen af overlevende i forhold til den interne kontrol beregnet. Vist er resultaterne af tre uafhængige forsøg med gennemsnittet af to (A) eller tre (B, C) replikerer og deres standardafvigelser. Klik her to se en større version af dette tal.
Scanning elektronmikroskopi (SEM) er et kraftfuldt værktøj, der kan bruges til at fokusere på den rumlige arkitektur biofilm koloni rynker, overflod og lokalisering af EPS og enkelt celle morfologi 31. SEM billeddannelse kræver stikprøver, som kan afbildes under højvakuum. For at undersøge prøver under højvakuum betingelser, alle bulk-vandmolekyler skal fjernes, og derfor SEM billeddannelse kræver dehydrering af før billeddannelse prøven. Alternativt kan prøver afbildes under lave vakuumbetingelser i våd tilstand ved scanning miljømæssig elektronmikroskopi (ESEM), hvor den hydratiserede prøve forsigtigt tørret i mikroskopet kammeret. For at vurdere virkningerne af små molekyler inhibitorer på biofilm koloni arkitektur, EPS organisation og cellemorfologi blev tre forskellige typer prøve dehydrering sammenlignet: tørring i mikroskopet under våde mode betingelser (ESEM), lufttørret fra et opløsningsmiddel eller kritisk punkt (CP) Hong tørrede under anvendelse af carbondioxid som overgangen fluid. I ubehandlede og D-leucin-behandlede B. subtilis biofilm kolonier forskellige hydrering etaper efter den anvendte metode kunne observeres. Imaging under lave vakuum i våd tilstand ved ESEM bevaret den meget naturlig tilstand af biofilmen koloni. Men oplysninger om enkelt celle morfologi og EPS overflod og arkitektur var knappe, som EPS stadig var fuldstændigt hydratiseret, og cellerne blev indlejret i EPS (data ikke vist). Med hensyn til dehydrering, CP-tørring var den strengeste procedure. Den fjernede mest strukturelt bundne og bulk vandmolekyler fra vævet, der tegner sig for et tab på 30-70% volumen, afhængigt af vævet 32. I modsætning hertil lufttørring bevaret de bundne vandmolekyler. Et embryonisk væv for eksempel mistet 18% af sin volumen efter lufttørring fra det flygtige opløsningsmiddel ethanol og 59% efter CP-tørring 32 (figur 6A) . Biofilm kolonier, som blev dehydreret med ethanol og CP-tørret også bevaret deres tredimensionale struktur, og EPS optrådte som et edderkoppespind (figur 6C). I lufttørrede og CP-tørrede prøver, virkningerne af den lille molekyle hæmmer D-leucin på biofilmen koloni arkitektur, enkelt celle morfologi og EPS struktur var tilsyneladende (figur 6B og D). Biofilmen kolonier dyrket i nærvær af D-leucin var mindre og rynker var mindre udtalt. De D-leucin-behandlede celler blev forlænget, en fænotype, som er observed i celler behandlet med molekyler 33 cellevæg-målretning. Derudover blev cellerne klart mindre dækket med EPS og ikke tæt forbundet med deres naboceller via EPS som set i de ubehandlede biofilm kolonier. De præsenterede resultater viser, at de to metoder til biofilm koloni dehydrering, lufttørret fra ethanol eller CP-tørret ved anvendelse af carbondioxid som overgangen fluidum giver værdifuld indsigt i virkningen af små molekyler på enkelt celle morfologi, samt på EPS overflod og arkitektur.
Figur 6. Små molekyler kan ændre store og små af biofilmen koloni arkitektur. Biofilm kolonier af B. subtilis NCIB 3610 dyrket (A og D) i fravær eller (B og D) i nærvær af 0,5 mM D-leucin i 72 timer ved 30 ° Cpå fast MSgg medium blev fikseret som beskrevet i protokollen og tørret fra ethanol som følgende: (A og B) lufttørret og (C og D) CP-tørret ved anvendelse af carbondioxid som overgangen fluid. Vist er top down kikkerter billeder af biofilm kolonier (venstre, øvre paneler), top down fotografier af de tørrede biofilm kolonier monteret på elektronmikroskopi stubbe før guld-palladium-belægning (venstre, nederste paneler), lav og høj forstørrelse billeder erhvervet af SEM til at vise 3D-arkitektur af biofilm koloni rynker eller enkelt celle morfologi / EPS organisation. Scale barer fra venstre til højre:. 5 mm, 100 um, 2 um Klik her for at se en større version af dette tal.
| 1.925 mM | grydeassium monobasisk |
| 3.075 mM | dibasisk kaliumphosphat |
| 100 mM | 3- (N -morpholino) propansulfonsyre, pH 7,1 |
| 2 mM | magnesiumchloridhexahydrat |
| 700 uM | calciumchlorid vandfri |
| 50 pM en | jern (III) chlorid-hexahydrat |
| 125 uM B | |
| 1 uM | zinkchlorid vandfri |
| 2 uM | thiamin-hydrochlorid |
| 50 ug / ml | tryptophan |
| 50 ug / ml | phenylalanin |
| 50 ug / ml | threonin |
| 0,5% (v / v) | glycerol vandfri |
| 0,5% (vægt / volumen) | L-glutaminsyre mononatrium- salte hydrat |
| en for hinde assay; b for biofilm assay | |
Tabel 1. Afsluttende 1x MSgg præparat anvendt i denne undersøgelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bacillus subtilis formularer robuste og meget strukturerede biofilm både i flydende (pellikeler) og på fast medium (kolonier). Derfor tjener det som en ideel model organisme at karakterisere virkningsmåden af specifikke biofilm inhibitorer. På faste medier, celler danner flercellede strukturer med særlige kendetegn, som ikke er tydelig i pellikeler, ligesom rynker udstråler fra midten til kanten. Således pellikeler og kolonier er supplerende systemer til at studere B. subtilis multicellularity.
Målet med denne undersøgelse er at udvikle en B. subtilis-system model for biofilm (pellikeler og kolonier) hæmning. Flere trin er afgørende for reproducerbarheden af biofilmen forstyrrelse essay. Et første kritiske trin er at bekræfte, at virkningen på biofilmdannelse ikke skyldes en generel toksicitet for bakterier dyrket i planktoniske livsstil. Dette kan betragtes ved at sammenligne virkningen af en given koncentration af såmall molekyle inhibitor på den relative biofilm inhibering af virkningen af dette molekyle på planktoniske vækst. En dramatisk stærkere effekt på biofilm udvikling kan sikre identifikation af mål mekanismer, der er specielt vigtige for udviklingen af biofilm. Endvidere heri beskrevne undersøgelse viser betydningen af de præ-dyrkningsbetingelser til udvikling af pellikeler og deres følsomhed over for små molekyler. Før karakterisere effekten af små molekyler, reproducerbare og robuste eksperimentelle betingelser (f.eks hinde vækst temperatur og mangel på følsomhed over for medierne sammensætning) for at teste deres virkninger bør defineres. For at finde sådanne forhold, medierne i den præ-kultur tilstand, bør overvejes vækstfase af de præ-kultur, præ-kultur fjernelse medier, vækst temperatur og vækstmedier.
En stor udfordring, når en specifik inhibitor for biofilmdannelse er fundet, er at finde kvantitativog kvalitative metoder, som kendetegner virkningerne af disse lavmolekylære inhibitorer på biofilm udvikling og modstand. Her er to vigtige metoder beskrevet i detaljer, der kan bruges til at vurdere virkningerne af sådanne inhibitorer. Først introducerer vi en simpel kvantitativ metode, der reproducerbart kan sonde modstanden af behandlede versus ubehandlede koloni biofilm til baktericider, såsom ethanol. Repræsentative resultater er vist for følsomheden af D-leucin-behandlede biofilm kolonier til 50% ethanol. Imidlertid kan dette essay let modificeres ved hjælp af forskellige steriliserende midler eller antibiotika. For det andet er en SEM metode beskrevet i detaljer, der giver høj opløsning undersøgelse af ændringerne i biofilmen koloni forårsaget af den lille molekyle inhibitor i flere supplerer niveauer: den overordnede struktur, organisering og overflod af EPS matrix og dens komponenter, og encellede morfologier hele biofilmen. Vi bemærker, at to metoder til dehydratipå (lufttørring af 100% ethanol eller CP-tørring under anvendelse af carbondioxid som overgangen væske) kan anvendes lige under SEM prøveforberedelse af en biofilm koloni. Vigtigere den vellykkede fiksering af biofilm prøven afhænger i høj grad af hydrofobicitet af biofilmen koloni. Denne hydrofobicitet er en iboende egenskab ved B. subtilis-biofilm på grund af den hydrofobe overfladelag 10,34.
Adskillige metoder blev brugt tidligere til at studere biofilm samling og udvikling med B. subtilis som en model organisme 35. En række uafhængige undersøgelser vist effekterne af mediernes sammensætning på biofilm udvikling 36-38. Indtil videre dog en systematisk evaluering af effekterne af mediernes sammensætning på biofilm hæmning var, at vores bedste viden, mangler. Denne undersøgelse viser, at mens hinde inhibering af B. subtilis af små molekyler er følsom over for pre-dyrkningsbetingelser, er det unapåvirkes dog af virkningerne af temperatur og medier sammensætning, og således egnede til systematiske skærme af småmolekylære inhibitorer. Også, vi etableret en enkel, reproducerbar og kvantitativ metode til at vurdere modstanden af ubehandlet eller lille molekyle inhibitor-behandlede biofilm kolonier til antibakterielle midler, som i øjeblikket mangler i biofilm model organisme B. subtilis.
B. subtilis biofilm i kombination med fluorescerende reportere kan tages yderligere at kigge efter småmolekyleinhibitorer, der er målrettet enten en bestemt udviklingsmodel trin biofilmdannelse eller en bestemt sub-population af celler i biofilmen. De heri beskrevne fremgangsmåder tilvejebringer ikke enkelt celle beslutning med hensyn til genekspression i biofilmen. Metoder til EPS matrix genekspression analyse inden B. subtilis biofilm på enkelt celle niveau blev etableret med succes 39.
Bakterielle biofilm er af crucial betydning i landbrugs-, industri- og kliniske omgivelser. I et landbrugsområde sammenhæng evnen til at danne biofilm øger planteværten kolonisering af talrige plantepatogener 40, og i en klinisk sammenhæng biofilm er naturligt resistente over for antimikrobielle stoffer 21 og er kernen af mange persistente og kroniske bakterielle infektioner. Desuden er det nu erkendt, at biofilm har enorme økonomiske konsekvenser for industrien, da de er yderst vanskeligt at fjerne og kontrollere 41. Således vil udvikle en eksperimentel ramme for studiet af mikrobielle biofilm hæmmere give betydelige landbrugs- 42,43, kliniske 21,44, og teknologiske 45-47 fremskridt.
De nuværende metoder er begrænset til B. subtilis. Vi opfordrer følge fremgangsmåden beskrevet kvantitative og kvalitative begreber at studere biofilm-specifikke inhibitorer med små molekyler i andre arter. Desuden Denne undersøgelse vedrører en konkret eksempel for biofilm hæmning af D-leucin, ud af flere specifikke biofilm hæmmere tidligere 17 offentliggjort. Vigtigere, blev D-leucin allerede karakteriseret som et anti-biofilm molekyle i afgroedesygdomme Xanthomonas citri 48, præsentere mulige ligheder mellem plante kolonisering og biofilmdannelse. Biofilmdannelse (hinde og rynket kolonidannelse) er også almindelig i humane patogener (f.eks Pseudomonas aeruginosa 49-51 og uropatogen Escherichia coli 52,53). De beskrevne metoder kan udvikles yderligere for at søge efter specifikke lægemidler, der hæmmer biofilm dannelse og reducerer biofilm-medieret resistens over for antimikrobielle stoffer i klinisk forskning. Samlet set kan de her beskrevne fremgangsmåder anvendes som grundlag for at udvikle kvantitative og kvalitative begreber at studere biofilm-specifikke inhibitorer med små molekyler i andre arter.
nt "> Sammenfattende giver vi en enkel og nyttigt værktøj-boks, der viser de potentielle styrker og faldgruber i at bruge B. subtilis til at studere biofilm hæmmere.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Luria Broth, Lennox | Difco | 240230 | |
| Bacto Agar | Difco | 214010 | |
| potassium phosphate monobasic | Sigma, 136.09 g/mol | P0662-500G | |
| potassium phosphate dibasic | Fisher Scientific, 174.18 g/mol | BP363-1 | |
| 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid | Fisher Scientific, 209.27 g/mol | BP308-500 | |
| magnesium chloride hexahydrate | Merck, 203.30 g/mol | 1.05833.0250 | |
| calcium chloride anhydrous | J.T. Baker, 110.98 g/mol | 1311-01 | |
| manganese(II) chloride tetrahydrate | Sigma, 197.91 g/mol | 31422-250G-R | |
| iron(III) chloride hexahydrate | Sigma, 270.30 g/mo) | F2877-500G | |
| zinc chloride anhydrous | Acros Organics, 136.29 g/mol | 424592500 | |
| thiamine hydrochloride | Sigma, 337.27 g/mol | T1270-100G | |
| L-tryptophan | Fisher Scientific, 204.1 g/mol | BP395-100 | |
| L-phenylalanine | Sigma, 165.19 g/mol | P5482-100G | |
| L-threonine | Sigma, 119.12 g/mol | T8625-100G | |
| glycerol anhydrous | Bio-Lab Itd | 712022300 | |
| L-glutamic acid monosodium salts hydrate | Sigma, 169.11 g/mol | G1626-1KG | |
| D-leucine | Sigma, 169.11 g/mol | 855448-10G | |
| ethanol anhydrous | Gadot | 830000054 | |
| razor blade | Eddison | NA | |
| circular cellulose filter papers | Whatman, 90 mm | 1001-090 | |
| glutaraldehyde | EMS (Electron Micoscopy Science), 25% in water | 16220 | |
| paraformaldehyde | EMS, 16% in water | 15710 | |
| sodium cacodylate | Merck, 214.05 g/mol | 8.2067 | |
| calcium chloride 2-hydrate | Merck, 147.02 g/mol | 1172113 | |
| stub-aluminium mount | EMS, sloted head | 75230 | |
| carbon adhesive tape | EMS | 77825-12 | |
| Shaker 37 °C | New Brunswick Scientific Innowa42 | NA | |
| Centrifuge | Eppendorf table top centrifuge 5424 | NA | |
| Digital Sonifier, Model 250, used with Double Step Microtip | Branson | NA | |
| Incubator 30 °C | Binder | NA | |
| Incubator 23 °C | Binder | NA | |
| Filter System, 500 ml, polystyrene | Cornig Incorporated | NA | |
| Rotary Shaker - Orbitron Rotatory II | Boekel | NA | |
| S150 Sputter Coater | Edwards | NA | |
| CPD 030 Critical Point Dryer | BAL-TEC | NA | |
| Environmental Scanning Electron Microscope | XL30 ESEM FEG Philips (FEI) | NA |
References
- Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. Biofilms: the matrix revisited. Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).
- Stoodley, P., Sauer, K., Davies, D. G., Costerton, J. W. Biofilms as complex differentiated communities. Annu Rev Microbiol. 56, 187-209 (2002).
- Miller, M. B., Bassler, B. L. Quorum sensing in bacteria. Annu Rev Microbiol. 55, 165-199 (2001).
- Aguilar, C., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. Thinking about Bacillus subtilis as a multicellular organism. Curr Opin Microbiol. 10, 638-643 (2007).
- Kolter, R., Greenberg, E. P. Microbial sciences: the superficial life of microbes. Nature. 441, 300-302 (2006).
- Kearns, D. B., Chu, F., Branda, S. S., Kolter, R., Losick, R. A master regulator for biofilm formation by Bacillus subtilis. Mol Microbiol. 55, 739-749 (2005).
- Branda, S. S., Chu, F., Kearns, D. B., Losick, R., Kolter, R. A major protein component of the Bacillus subtilis biofilm matrix. Mol Microbiol. 59, 1229-1238 (2006).
- Romero, D., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. Amyloid fibers provide structural integrity to Bacillus subtilis biofilms. Proc Natl Acad Sci USA. 107, 2230-2234 (2010).
- Kobayashi, K., Iwano, M. BslA(YuaB) forms a hydrophobic layer on the surface of Bacillus subtilis biofilms. Mol Microbiol. 85, 51-66 (2012).
- Hobley, L., et al. BslA is a self-assembling bacterial hydrophobin that coats the Bacillus subtilis biofilm. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 13600-13605 (2013).
- Romero, D., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. An accessory protein required for anchoring and assembly of amyloid fibres in B. subtilis biofilms. Mol Microbiol. 80, 1155-1168 (2011).
- Kolodkin-Gal, I., et al. D-amino acids trigger biofilm disassembly. Science. 328, 627-629 (2010).
- Chan, Y. G., Kim, H. K., Schneewind, O., Missiakas, D. The capsular polysaccharide of Staphylococcus aureus is attached to peptidoglycan by the LytR-CpsA-Psr (LCP) family of enzymes. J Biol Chem. 289, 15680-15690 (2014).
- Mielich-Suss, B., Lopez, D. Molecular mechanisms involved in Bacillus subtilis biofilm formation. Environ Microbiol. 17, 555-565 (2014).
- Cairns, L. S., Hobley, L., Stanley-Wall, N. R. Biofilm formation by Bacillus subtilis: new insights into regulatory strategies and assembly mechanisms. Mol Microbiol. 93, 587-598 (2014).
- Chen, M., Yu, Q., Sun, H. Novel strategies for the prevention and treatment of biofilm related infections. Int J Mol Sci. 14, 18488-18501 (2013).
- Bucher, T., Oppenheimer-Shaanan, Y., Savidor, A., Bloom-Ackermann, Z., Kolodkin-Gal, I. Disturbance of the bacterial cell wall specifically interferes with biofilm formation. Environ Microbiol Rep. 7, 990-1004 (2015).
- Sarkar, S., Pires, M. M. D-Amino acids do not inhibit biofilm formation in Staphylococcus aureus. PLoS One. 10, e0117613 (2015).
- Wei, W., Bing, W., Ren, J., Qu, X. Near infrared-caged D-amino acids multifunctional assembly for simultaneously eradicating biofilms and bacteria. Chem Commun (Camb). 51, 12677-12679 (2015).
- Leiman, S. A., et al. D-amino acids indirectly inhibit biofilm formation in Bacillus subtilis by interfering with protein synthesis. J Bacteriol. 195, 5391-5395 (2013).
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Davies, D. Understanding biofilm resistance to antibacterial agents. Nat Rev Drug Discov. 2, 114-122 (2003).
- Olsen, I. Biofilm-specific antibiotic tolerance and resistance. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 34, 877-886 (2015).
- Tseng, B. S., et al. The extracellular matrix protects Pseudomonas aeruginosa biofilms by limiting the penetration of tobramycin. Environ Microbiol. 15, 2865-2878 (2013).
- Branda, S. S., Gonzalez-Pastor, J. E., Ben-Yehuda, S., Losick, R., Kolter, R. Fruiting body formation by Bacillus subtilis. Proc Natl Acad Sci USA. 98, 11621-11626 (2001).
- Holscher, T., et al. Motility, Chemotaxis and Aerotaxis Contribute to Competitiveness during Bacterial Pellicle Biofilm Development. J Mol Biol. 427, 3695-3708 (2015).
- Bray, D. Methods in Biotechnology. 13, Humana Press Inc. 235-243 (2000).
- Ensikat, H. J., Ditsche-Kuru, P., Barthlott, W. Scanning electron microscopy of plant surfaces: simple but sophisticated methods for preparation and examination. 1, Formatex Research Center. 248-255 (2010).
- Hayat, M. A. Principles and techniques of scanning electron microscopy: Biological applications. 2, Van Nostrand Reinhold Company. (1976).
- Schatten, H. Scanning Electron Microscopy for the Life Sciences. , Cambridge University Press. (2013).
- Bridier, A., Meylheuc, T., Briandet, R. Realistic representation of Bacillus subtilis biofilms architecture using combined microscopy (CLSM, ESEM and FESEM). Micron. 48, 65-69 (2013).
- Boyde, A., MacOnnachie, E. Volume changes during preparation of mouse embryonic tissue for scanning electron microscopy. SCANNING. 2, 149-163 (1979).
- Yao, Z., Kahne, D., Kishony, R. Distinct single-cell morphological dynamics under beta-lactam antibiotics. Mol Cell. 48, 705-712 (2012).
- Epstein, A. K., Pokroy, B., Seminara, A., Aizenberg, J. Bacterial biofilm shows persistent resistance to liquid wetting and gas penetration. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 995-1000 (2011).
- Vlamakis, H., Chai, Y., Beauregard, P., Losick, R., Kolter, R. Sticking together: building a biofilm the Bacillus subtilis way. Nat Rev Microbiol. 11, 157-168 (2013).
- Shemesh, M., Chai, Y. A combination of glycerol and manganese promotes biofilm formation in Bacillus subtilis via histidine kinase KinD signaling. J Bacteriol. 195, 2747-2754 (2013).
- Kolodkin-Gal, I., et al. Respiration control of multicellularity in Bacillus subtilis by a complex of the cytochrome chain with a membrane-embedded histidine kinase. Genes Dev. 27, 887-899 (2013).
- Oppenheimer-Shaanan, Y., et al. Spatio-temporal assembly of functional mineral scaffolds within microbial biofilms. npj Biofilms and Microbiomes. 2, 15031 (2016).
- Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry. J Vis Exp. , e3796 (2012).
- Bogino, P. C., Oliva Mde, L., Sorroche, F. G., Giordano, W. The role of bacterial biofilms and surface components in plant-bacterial associations. Int J Mol Sci. 14, 15838-15859 (2013).
- Fratamico, P. M., Annous, B. A., Guenther, N. W. Biofilms in the Food and Beverage Industires. 1, Woodhead Publishing. (2009).
- Gao, G., et al. Effect of biocontrol agent Pseudomonas fluorescens 2P24 on soil fungal community in cucumber rhizosphere using T-RFLP and DGGE. PLoS One. 7, e31806 (2012).
- Chen, Y., et al. Biocontrol of tomato wilt disease by Bacillus subtilis isolates from natural environments depends on conserved genes mediating biofilm formation. Environ Microbiol. 15, 848-864 (2013).
- Bryers, J. D. Medical biofilms. Biotechnol Bioeng. 100, 1-18 (2008).
- Logan, B. E. Exoelectrogenic bacteria that power microbial fuel cells. Nat Rev Microbiol. 7, 375-381 (2009).
- Nevin, K. P., Woodard, T. L., Franks, A. E., Summers, Z. M., Lovley, D. R. Microbial electrosynthesis: feeding microbes electricity to convert carbon dioxide and water to multicarbon extracellular organic compounds. MBio. 1, (2010).
- Torres, C. I., et al. A kinetic perspective on extracellular electron transfer by anode-respiring bacteria. FEMS Microbiol Rev. 34, 3-17 (2010).
- Li, J., Wang, N. Foliar application of biofilm formation-inhibiting compounds enhances control of citrus canker caused by Xanthomonas citri subsp. citri. Phytopathology. 104, 134-142 (2014).
- Okegbe, C., Price-Whelan, A., Dietrich, L. E. Redox-driven regulation of microbial community morphogenesis. Curr Opin Microbiol. 18, 39-45 (2014).
- Mann, E. E., Wozniak, D. J. Pseudomonas biofilm matrix composition and niche biology. FEMS Microbiol Rev. 36, 893-916 (2012).
- Bouffartigues, E., et al. Sucrose favors Pseudomonas aeruginosa pellicle production through the extracytoplasmic function sigma factor SigX. FEMS Microbiol Lett. 356, 193-200 (2014).
- Wu, C., Lim, J. Y., Fuller, G. G., Cegelski, L. Quantitative analysis of amyloid-integrated biofilms formed by uropathogenic Escherichia coli at the air-liquid interface. Biophys J. 103, 464-471 (2012).
- Serra, D. O., Richter, A. M., Hengge, R. Cellulose as an Architectural Element in Spatially Structured Escherichia coli Biofilms. J Bacteriol. 195, 5540-5554 (2013).
