Summary
Un metodo semplice ed affidabile è descritto qui di analizzare un insieme di funzioni delle cellule NK come degranulazione, citochine e chemochine ai differenti sottopopolazioni di cellule NK.
Introduction
Come parte del natural killer del sistema immunitario innato (NK), le cellule contribuiscono alla prima linea di difesa contro le cellule infettate da virus o malignamente trasformati. Un sistema di recettori inibitori e attivatori consente loro di distinguere tra cellule sane e trasformate senza alcun priming antigene rispetto alle cellule T. Al momento dell'incontro delle cellule bersaglio cellule NK rilasciare il contenuto dei loro granuli citotossici (ad esempio, perforina, il granzimi) nella sinapsi immunitario per uccidere il loro obiettivo. Inoltre, le cellule NK producono e secernono diversi tipi di citochine (ad esempio, gamma interferone: IFN-γ; fattore di necrosi tumorale-α: TNF-α) e chemochine (ad esempio, macrofagi infiammatori proteina-1β: MIP-1b) su cellule bersaglio interazione o citochina stimolazione 1.
funzioni delle cellule NK sufficienti come la citotossicità, chemochine e la produzione di citochine hanno un impatto importante sulla sorte di diversi disfacilita. Pazienti affetti da leucemia mostrano un aumento tassi di recidiva se presentano un profilo delle cellule NK difettose al momento della diagnosi consiste di produzione di IFN-γ ridotta e ridotta espressione di attivare i recettori delle cellule NK 2. Un recupero precoce del numero di cellule NK e le funzioni, tra cui la produzione di citochine in seguito all'interazione cellula bersaglio è associato ad una ricaduta ridotta e il tasso di sopravvivenza migliore nei pazienti trattati con trapianto di cellule staminali allogeniche 3. Inoltre, dopo l'inizio della terapia con interferone nei pazienti con infezione da virus dell'epatite C la capacità degranulazione delle cellule NK periferiche è più forte nei primi responder rispetto ai non-responder 4. Il numero di cellule NK (> 80 / ml) al giorno 15 dopo il trapianto autologo di cellule staminali (trapianto autologo) in pazienti affetti da linfoma o mieloma multiplo sono predittivi per una migliore libera da progressione e la sopravvivenza globale 5. Nei pazienti affetti da melanoma l'espressione della cellule T immunoglobuline e mucina-domain-contenentg molecola-3 (TIM-3), una proteina immuno-normativo sulle cellule NK, correla con stadio di malattia e la prognosi 6.
Gli scienziati hanno monitorato le funzioni delle cellule NK nel corso degli ultimi decenni. L'analisi iniziale di citotossicità delle cellule NK contro le cellule tumorali senza obbligo di adescamento è stato affrontato con un saggio di 51 Cr-release 7. Più recentemente, gli scienziati hanno sviluppato un metodo non radioattivo per valutare la citotossicità delle cellule NK espanse 8. Citochine e chemochine è stato spesso valutata utilizzando test immunoenzimatico (ELISA) tecniche enzyme-linked 9,10. Nel corso degli ultimi decenni, questi metodi sono stati integrati da analisi di flusso citometria-based. L'uso di inibitori della proteina di trasporto (ad esempio, brefeldina A e monensin) e metodi di permeabilizzazione delle cellule in combinazione con protocolli di colorazione della superficie convenzionale ha permesso agli scienziati di studiare chemochine e la produzione di citochine in diversi linfa specificosottoinsiemi ocyte (ad esempio, T, B o cellule NK) 11. Inoltre, le analisi di citometria a base di diversi flussi sono stati sviluppati per monitorare T e NK citotossicità delle cellule. Nel 2004 Alter et al. Descrive l'espressione di superficie della proteina lisosomi associata CD107a (Lamp1) sulle cellule NK su incontro cellula bersaglio come marker per la degranulazione dei granuli citotossici 12. Dal momento che una vasta gamma di differenti fluorocromi e multicanale citometri a flusso sono disponibili ai nostri giorni, è diventato possibile monitorare contemporaneamente diverse funzioni delle cellule NK (citotossicità, citochine e chemochine produzione) in diverse sottopopolazioni di cellule NK. Questo diventa particolarmente importante in situazioni in cui la dimensione del campione è limitato, ad esempio, in biopsie o campioni di sangue di pazienti affetti da leucopenia.
Per provare le funzioni delle cellule NK globali, i saggi di citometria a base di diversa portata può essere efficacemente combinati. Theorell et al. Cellule NK stimolate da headonatori lthy con la linea di cellule tumorali K562 e analizzato la produzione di degranulazione, segnale dentro-fuori e chemochine NK tramite citometria di flusso 13. Recentemente sottogruppi di cellule NK, fenotipi e funzioni in pazienti con tumore durante trapianto autologo sono stati analizzati utilizzando flusso saggi citometria-based. E 'stato dimostrato che le cellule NK sono stati in grado di degranulano e produrre citochine / chemochine su riconoscimento delle cellule tumorali in momenti molto precoce dopo trapianto autologo 11.
Qui un protocollo è descritto per valutare le funzioni delle cellule NK mediante interazione con le cellule tumorali compresa la capacità di degranulazione, chemochine e produzione di citochine mediante un flusso assay citometria-based che consente di controllare le funzioni delle cellule NK in diversi sottoinsiemi simultaneamente.
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Protocol
Questo studio è stato condotto in conformità con le raccomandazioni del comitato etico locale dell'Università di Francoforte.
1. coltura di cellule K562
- Cellule K562 Culture in R10 supporti (RPMI1640 con mezzo glutammina, 1% di penicillina / streptomicina, 10% siero di vitello fetale) ad una densità di 0,5-1 x 10 6 cellule per ml in un pallone di coltura cellulare a 37 ° C e 5% CO 2.
- Celle di raccolta K562 24 hr prima dell'inizio di un nuovo esperimento.
- Rimuovere il pallone di coltura cellulare contenente le cellule K562 dal termostato. Risospendere le cellule K562 all'interno del terreno di coltura pipettando gentilmente su e giù.
- Trasferire il terreno di coltura contenente le cellule K562 in un tubo da 15 o 50 ml e agglomerare le cellule a 400 xg per 8 min. Eliminare il surnatante e risospendere le cellule in 5 ml di mezzi R10 e mescolare bene.
- Trasferire 20 microlitri della soluzione di cellule in un pozzetto di una piastra a 96 U-well. Aggiungere 20 ml trypan blu emescolare bene pipettando su e giù per almeno 5 volte. Pipettare 10 ml di soluzione in una camera di conteggio delle cellule e contare le cellule.
- Agglomerare le cellule a 400 xg per 8 min. Risospendere le cellule in R10 media e regolare la concentrazione cellulare K562 a 0,5-1 x 10 6 cellule per ml.
- Incubare le cellule K562 in un pallone di coltura cellulare a 37 ° C e 5% CO 2 fino al momento dell'uso.
2. Isolamento di cellule NK
- Secondo l'approvazione e le linee guida del comitato etico locale, ottenere il consenso informato scritto del donatore sano o malato prima della raccolta di 6-10 ml di una EDTA o sangue periferico eparinizzato.
- Conservare i reagenti per l'isolamento delle cellule NK a 4 ° C fino all'inizio dell'esperimento e poi li usano a temperatura ambiente (RT) in condizioni sterili. Isolare le cellule NK del sangue periferico utilizzando microsfere magnetiche e un magnete specifico per l'isolamento delle cellule in base alla tegli le istruzioni del produttore.
- Ricostituire un flacone del liofilizzato cellule NK isolamento negativo anticorpi cocktail pipettando 7,5 ml di tampone A in dotazione (incluso nel kit di isolamento delle cellule NK) nel flaconcino. Mescolare delicatamente pipettando su e giù per 3-4 volte.
Nota: Assicurarsi che la sospensione è omogenea prima di ogni utilizzo. - Preparare la soluzione finale cocktail mescolando volumi adeguati del pellet ricostituito dal punto 2.2.1 e tampone B (incluso nel kit di isolamento delle cellule NK). Per determinare questi volumi, definire il volume del campione di sangue intero in ml come volume = 1.0. Utilizzare 0,25 volumi del pellet ricostituito (dal punto 2.2.1) e 0,25 volumi di tampone B per elaborare 1 volume di sangue intero.
- Trasferire il composto in un tubo di adeguato contenente il campione di sangue intero. Non pipettare su e giù per evitare la perdita di sangue all'interno della pipetta. Al contrario, chiudere il tubo e muoversi con cautela su e giù fino al suspensione è omogenea. Non farlo vortice.
- Ulteriori omogeneizzare il campione utilizzando un rotatore tubo per 5 minuti a RT.
- In condizioni sterili, togliere il cappuccio e inserire il tubo nel separatore magnetico per 15 min come raccomandato dal produttore. Assicurarsi che le etichette tubo siano rivolti verso la parte posteriore del magnete per consentire visibilità indisturbata della linea di separazione. Non spostare il magnete durante la separazione, in quanto questo procedimento sarebbe stato disturbato.
- trasferire con attenzione il surnatante in un nuovo tubo da 15 ml e riempire con completo supporto (CM; supporti ematopoietiche cellule, 1% di penicillina / streptomicina, 5% sieri umani). Agglomerare le cellule a 400 xg per 8 min.
- Opzionale: Se il pellet è rosso, risospendere le cellule in 1 ml di tampone di lisi eritrocitaria (ad esempio, 1 ml di ammonio-cloruro di potassio (ACK) lisi buffer: 155 mM NH 4 Cl; 0,1 mM EDTA, 10 mM KHCO 3 in 1 L acqua distillata (DW)) e incubare per 8 minuti a temperatura ambiente. In alternativa, utilizzare un erKit esaurimento ythrocyte.
NOTA: Tenete a mente, che l'uso di tampone ACK potrebbe avere un impatto negativo le funzioni delle cellule NK 14. - Rapidamente diluire il tampone ACK aggiungendo almeno 1 ml di CM per fermare la lisi e centrifugare a 400 xg per 8 minuti per sedimentare le cellule.
- Opzionale: Se il pellet è rosso, risospendere le cellule in 1 ml di tampone di lisi eritrocitaria (ad esempio, 1 ml di ammonio-cloruro di potassio (ACK) lisi buffer: 155 mM NH 4 Cl; 0,1 mM EDTA, 10 mM KHCO 3 in 1 L acqua distillata (DW)) e incubare per 8 minuti a temperatura ambiente. In alternativa, utilizzare un erKit esaurimento ythrocyte.
- Risospendere il pellet cellulare in 1 ml CM e procedere con il conteggio. Trasferire 20 microlitri della soluzione di cellule NK su una piastra 96-U-well. Aggiungere 20 ml di metilene blu per ogni pozzetto e mescolare bene pipettando su e giù per almeno 5 volte. Pipettare 10 ml di soluzione in una camera di conteggio delle cellule e contare le cellule. In alternativa, utilizzare 30 ml di sospensione cellulare non diluito per il conteggio con un contatore di cellule disponibili in commercio.
- Regolare le cellule ad una concentrazione di almeno 2 x 10 4 cellule NK per 100 microlitri CM.
- Eseguire una colorazione di anticorpi superficie della popolazione di cellule NK isolate per verificare la purezza utilizzando un citofluorimetro.
- Prepare una soluzione Master Mix mescolando i volumi degli anticorpi indicati come da Tabella 1.
- Risospendere le cellule in tampone di lavaggio 88,5 microlitri (WB; 0,5% di siero albumina bovina (BSA), 0,1% NaN 3 in PBS) e aggiungere 11,5 ml di soluzione di master mix. Incubare le cellule per 20 minuti a 4 ° C al buio.
Attenzione: NaN 3 è tossico e mutageno. Maneggiare di conseguenza alla corrispondente scheda di sicurezza (SDS). - Aggiungere 1 ml di WB e agglomerare le cellule a 400 xg per 4 minuti.
- Risospendere le cellule nel buffer di colorazione 300 ml più DAPI. Acquisire le cellule utilizzando un citofluorimetro.
NOTA: Procedere ulteriormente con l'esperimento solo se la purezza delle cellule NK è almeno l'80% di tutti i linfociti vivi.
- Ricostituire un flacone del liofilizzato cellule NK isolamento negativo anticorpi cocktail pipettando 7,5 ml di tampone A in dotazione (incluso nel kit di isolamento delle cellule NK) nel flaconcino. Mescolare delicatamente pipettando su e giù per 3-4 volte.
3. La raccolta delle cellule K562 per NK cellulare Stimolazione
- Rimuovere il pallone di coltura cellulare contenente le cellule K562 (dal punto 1.2) da th e incubatore. Risospendere le cellule K562 all'interno del terreno di coltura pipettando gentilmente su e giù.
- Trasferire la terreni di coltura in una provetta da 15 o 50 ml e agglomerare le cellule a 400 xg per 8 min. Eliminare il surnatante e risospendere le cellule in 5 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e mescolare bene.
- Trasferire 20 microlitri della soluzione di cellule in un pozzetto di una piastra a 96 U-well. Aggiungere 20 ml trypan blu e mescolare bene pipettando su e giù per almeno 5 volte. Pipettare 10 ml di soluzione in una camera di conteggio delle cellule e contare le cellule. In alternativa, utilizzare 30 ml di sospensione cellulare non diluito a contare con un contatore di cellule disponibili in commercio.
- Agglomerare le cellule a 400 xg per 8 min. Risospendere le cellule in CM ad una concentrazione di almeno 2 x 10 4 cellule K562 per 100 microlitri mezzi.
NOTA: utilizzare la stessa K562 e le concentrazioni di cellule NK, al fine di incubare sia a effettore: bersaglio (E: T) rapporto di 1: 1 in seguito.
- Mescolare delicatamente le cellule da essi pipettando su e giù per almeno 5 volte. Distribuire 100 pl / pozzetto della soluzione di cellule NK nei pozzetti richieste di una piastra a 96 V-well.
- Utilizzare almeno due pozzetti per ciascun donatore, uno con e uno senza uno stimolo (ad esempio, le cellule tumorali K562 e citochine). Quando possibile, eseguire l'esperimento, almeno in duplice copia e aggiungere un controllo positivo (ad esempio, forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA) e ionomicina; concentrazione finale: 50 Nm PMA, 1 micron ionomicina per pozzetto). Preparare flusso aggiornato citometria a compensazioni per la data dell'esperimento.
NOTA: Titolare gli anticorpi uso prima (vedi la discussione).
- Utilizzare almeno due pozzetti per ciascun donatore, uno con e uno senza uno stimolo (ad esempio, le cellule tumorali K562 e citochine). Quando possibile, eseguire l'esperimento, almeno in duplice copia e aggiungere un controllo positivo (ad esempio, forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA) e ionomicina; concentrazione finale: 50 Nm PMA, 1 micron ionomicina per pozzetto). Preparare flusso aggiornato citometria a compensazioni per la data dell'esperimento.
- Spegnere la luce e aggiungere l'anticorpo anti-CD107a (2 ml, concentrazione finale: 1: 100) ad ogni pozzetto con cellule NK sul piatto 96-V-bene.
- Mescolare delicatamente le cellule K562 da loro pipettando su e giù per aalmeno 5 volte.
- Dai pozzi che contengono il / anti-CD107a soluzione di anticorpi delle cellule NK, individuare quelli previsti per la stimolazione con le cellule K562. Aggiungere 100 pl / pozzetto della soluzione di cellule K562 in questi pozzetti. Miscelare accuratamente pipettando su e giù per almeno 5 volte.
- Aggiungere interleuchina-2 (IL-2; concentrazione finale 100 U / ml) e interleuchina-15 (IL-15; concentrazione finale di 10 ng / ml) ai pozzetti contenenti cellule K562 e / soluzione di anticorpi delle cellule NK anti-CD107a.
- Opzionale: testare l'impatto di una cellule K562 o citochine solo sulle cellule NK distribuiti per decifrare neoplastica rispetto a funzioni delle cellule NK citochine indotta.
- Identificare i pozzetti sulla piastra 96-V-ben pianificata come controlli negativi, senza stimolo. Aggiungere 100 ml / pozzetto CM di questi pozzi che contengono solo il / soluzione di anticorpi delle cellule NK anti-CD107a. Miscelare accuratamente pipettando su e giù per almeno 5 volte.
- Opzionale: Per un controllo positivo, aggiungere 100 μ; L cm contenente PMA e ionomicina (concentrazione finale: 50 Nm PMA, 1 micron ionomicina per pozzetto) per un bene con il / soluzione di anticorpi delle cellule NK anti-CD107a.
- Incubare le cellule per 3 ore al buio a 37 ° C e 5% di CO 2.
- Preparare una soluzione inibitore proteine di trasporto (ad esempio, brefeldin A e / o monensin) in CM. Dopo 1 h di incubazione, aggiungere la soluzione a ciascun pozzetto della piastra a 96 V-bene con la luce spenta (concentrazione finale: 0.5-1μM brefeldina A e 2-3 mM monensin). Miscelare accuratamente pipettando su e giù per almeno 5 volte. Continuare l'incubazione per il restante 2 hr.
5. superficie ed intracellulari colorazione
- Dopo il periodo di incubazione 3 ore, mescolare le cellule all'interno dei pozzetti della piastra a 96 V-ben attentamente pipettando su e giù per almeno 5 volte e trasferirli in citometria a flusso tubi. Aggiungere 1 ml / tubo di WB. Cellule pellet a 400 xg per 4 min.
- Opzionale: Prima centrifugazione sciacquare i pozzetti con 100 microlitri / pozzetto PBS, al fine di ottimizzare il recupero delle cellule, pipettando su e giù per almeno 5 volte prima di trasferire le cellule nel rispettivo tubo FACS.
- Scartare il surnatante e continuare con la colorazione della superficie.
- Includere un colorante fluorescente ammina-reattivo che non è permeante di vivere le cellule con un massimo di emissione di 423 nm come marcatore cellula morta risolvibile (DCM). Eseguire la colorazione prima (vedi sotto) o in parallelo con la colorazione della superficie anticorpi a seconda del tipo di DCM utilizzato.
- Risospendere le cellule in 99 ml / tubo PBS e aggiungere 1 ml / tubo della risolvibile DCM (concentrazione finale: 1: 100). Mescolare bene cellule utilizzando un vortex e incubare per 15 min a RT al buio.
- Preparare una soluzione Master Mix mescolando insieme gli anticorpi "Surface" elencati nella tabella 2 (vedi colorazione colonna passo evidenziato in blu). Utilizzare l'indicato volumi / tubo e moltiplicarle con il numero di citometria a flusso tubi per essere colorati.
- Dopo l'incubazione prendere la citometria a flusso tubi con le cellule e aggiungere 1 ml / tubo di WB. Agglomerare le cellule a 400 xg per 4 min.
- Eliminare il surnatante, risospendere le cellule in 84 ml / tubo di WB e aggiungere 16 ml / tubo della soluzione master mix. Mescolare bene con le cellule di un vortice. Incubare le cellule per 20 minuti a 4 ° C al buio.
- Dopo 20 minuti aggiungere 1 ml / tubo WB e le cellule pellet a 400 xg per 4 minuti.
- Eliminare il surnatante e risospendere le cellule in 100 l / tubo di una soluzione di fissaggio a freddo (per esempio, 2% (finale paraformaldeide o formaldeide)). Mescolare bene con le cellule di un vortice. Incubare le cellule per 10 minuti a 4 ° C al buio.
- Macchiare le cellule per citochine intracellulari / chemochine dopo questo passo o memorizzarli notte a 4 ° C in WB.
NOTA: Dopo incubazione durante la notte, potrebbe verificarsi un recupero delle cellule inferiore.
- Macchiare le cellule per citochine intracellulari / chemochine dopo questo passo o memorizzarli notte a 4 ° C in WB.
- Lavare le cellule in 1 ml / tubo WB a 400 xg per 4 minuti e procedere con il passo permeabilizzazione.
- Preparare un buffer permeabilizzazione (PB) (ad esempio, 0,2% saponina, 1% di soluzione di BSA in PBS).
- Lavare le cellule due volte in 1 ml / tubo di PB a 400 xg per 4 minuti. Continuare con la colorazione intracellulare.
Attenzione: Saponina è potenzialmente irritante. Maneggiare di conseguenza alla corrispondente scheda di sicurezza (SDS). - Preparare una soluzione master mix utilizzando i volumi indicati anticorpi "intracellulari" nella tabella 2 (evidenziato in verde). Moltiplicare questi volumi con il numero di tubi da colorare.
- Risospendere le cellule in 90 ml / tubo di PB e applicare 10 ml / tubo della soluzione di anticorpi master mix. Mescolare bene con un vortice e incubare le cellule per 30 min a 4 ° C al buio.
- Lavare le cellule due volte in 1 ml / tubo di PB a 400 xg per 4 minuti.
- Eliminare il surnatante e risospendere le cellule in 400 ml / tubo di PB. Mescolare bene con le cellule di un vortice. Posizionare cellule su ghiaccio al buio fino a quando la misura.
6. Citometria a Flusso di compensazione e di acquisizione
- Selezionare i canali per i diversi fluorocromi (vedi Tabella 2) all'interno della citometria a flusso software di acquisizione nella cartella di impostazione dei parametri. Inoltre, scegliere i canali per FSC-A e -H nonché per SSC-A e -H.
- Caricare una matrice di compensazione creato per i parametri scelti nel file di acquisizione.
- Creare una matrice di compensazione con isolate cellule NK dal punto 2.2.8 eseguendo una singola macchia di colore per ogni fluorocromo utilizzato (vedi tabella 2). Utilizzare il protocollo di superficie colorazione descritto ai punti 5.1-5.4. Includere un controllo senza macchia (senza anticorpi), così come i controlli isotipo e / o fluorescenza meno uno dei controlli (FMO).
NOTA: in alternativa al risarcimento cell-based, utilizzare perle come i controlli di compensazione IgG-binding. - Collocare ciascuna provetta per campioni singoli macchia e il campione senza anticorpi nella porta di iniezione del campione (SIP). Fare clic sul pulsante "record" nel software di acquisizione citometria a flusso e acquisire un numero di cellule di almeno 5 x 10 3 cellule NK per campione.
- Utilizzare l'applicazione di calcolo di compensazione del software di acquisizione citometria di creare una matrice di compensazione.
- Creare una matrice di compensazione con isolate cellule NK dal punto 2.2.8 eseguendo una singola macchia di colore per ogni fluorocromo utilizzato (vedi tabella 2). Utilizzare il protocollo di superficie colorazione descritto ai punti 5.1-5.4. Includere un controllo senza macchia (senza anticorpi), così come i controlli isotipo e / o fluorescenza meno uno dei controlli (FMO).
- Creare Terreni Dot per l'individuazione delle cellule NK popolazione.
- Identificare singole cellule utilizzando FSC-A / FSC-H e SSC-A / SSC-H trame punti. Fare clic sul pulsante "porta poligono". Disegnare un cancello intorno alle cellule, che hanno un modello di distribuzione lineare in entrambe dot plots. Fare doppio clic sui cancelli per aprire un nuovo diagramma a punti.
- Scegli una trama FSC-A / SSC-Un punto per identificare il linfocita/ Popolazione di cellule NK (vedi Figura 1). Disegnare un cancello poligono attorno ad esso e fare doppio clic sul cancello.
- Posizionare ogni provetta del test di stimolazione delle cellule NK nel SIP. Fare clic sul pulsante "record" e acquisire un numero di cellule di almeno 5 x 10 3 cellule NK per campione.
7. Analisi e Statistiche
- Aprire la citometria a flusso programma di software di analisi. Fare clic sul pulsante caricamento del campione per aprire il campione di controllo non stimolato.
- Creare un sistema di colata per le diverse sottopopolazioni delle cellule NK (vedi Figura 1).
- Fare clic sul pulsante dot plot per creare un FSC-A / SSC-Una trama. Fare clic sul pulsante porta rettangolo e disegnare un rettangolo sul cancello di tutti gli eventi con una FSC Un valore> 5 x 10 4 per escludere detriti. Aprite il cancello con un doppio clic sul cancello.
- Scegliere nuovamente i parametri FSC-A / SSC-A all'interno del nuovo diagramma a punti e fare clic sul pulsante porta poligono. DRAW un cancello poligono attorno la popolazione dei linfociti (vedi Figura 1). Apri il cancello.
- Selezionare la SSC-Un parametro / SSC-H per il nuovo dot plot e disegnare un cancello poligono intorno a tutte le singole cellule. Singole cellule mostrano una distribuzione lineare di tutti i parametri FSC-A / FSC-H e SSC-A / SSC-H (vedi Figura 1). Aprite il cancello con un doppio clic su di esso.
- Ripetere il passaggio 7.2.3 utilizzando i parametri FSC-A / FSC-H questa volta.
- Utilizzare il parametro CD45 e Dump canale (CD3, CD14, CD19, DCM) di escludere le cellule morte. Disegnare un cancello rettangolo intorno tutto CD45 positivi e negativi Dump cellule di canale. Aprite il cancello con un doppio clic sul cancello.
- Identificare l'intera popolazione di cellule NK utilizzando il CD56 e Dump parametri del canale. Creare un cancello rettangolo intorno al CD56 positivo e Dump canale cellule negative. Aprite il cancello con un doppio clic su di esso.
- Disegnare un cancello rettangolo intorno tutti i tre sottoinsiemi di cellule NK all'interno di un CD56 / CD16 dot plot. Identify i diversi sottoinsiemi come CD56 ++ CD16 -, CD56 ++ CD16 + e sottoinsiemi di cellule CD56 + CD16 ++ NK.
- Analizzare le funzioni delle cellule NK per ogni singolo NK cellulare sottoinsieme.
- Fare clic su una delle tre porte NK sottoinsieme di cellule per aprirlo. Creare tre diversi appezzamenti di punti per CD56 / CD107a, CD56 / IFN-γ e CD56 / MIP-1β.
- Disegnare un cancello rettangolo cellule positive CD56, che sono positivi anche per CD107a, IFN-γ o MIP-1β rispettivamente (vedi Figura 1).
- Ripetere il passaggio 7.3.1-7.3.2 per ogni rimanente sottoinsieme delle cellule NK.
- Ripetere il passaggio 7.2 e 7.3 per tutti i campioni stimolati. Salva tutti i valori statistici di ogni singolo campione facendo clic sul pulsante di statistica esportazione all'interno del software di analisi.
- Aprire i file contenenti i valori statistici dei singoli campioni per analizzare le funzioni delle cellule NK. Selezionare i valori per singola cella NKsottoinsiemi (ad esempio, CD56 ++ CD16 - cellule NK) copiandoli in un altro file.
- Sottrarre la percentuale di cellule NK positive CD107a, che non sono state trattate con uno stimolo, dalla percentuale di cellule NK positive CD107a, che sono stati trattati con uno stimolo.
NOTA: utilizzare il risultato di dimostrare la capacità degranulazione di questo particolare sottogruppo di cellule NK in risposta allo stimolo. - Ripetere il passaggio 7.5.1 per IFN-γ e cellule NK MIP-1ß-positivi per dimostrare la produzione di citochine e chemochine in risposta allo stimolo.
- Ripetere il passaggio 7.5.1-7.5.2 per ogni rimanente sottoinsieme delle cellule NK per valutare la loro capacità di degranulazione e la produzione di citochine / chemochine dopo stimolazione.
- Sottrarre la percentuale di cellule NK positive CD107a, che non sono state trattate con uno stimolo, dalla percentuale di cellule NK positive CD107a, che sono stati trattati con uno stimolo.
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Representative Results
La strategia di gating per analizzare la degranulazione, citochine e chemochine di tutta la popolazione di cellule NK e tre differenti sottopopolazioni di cellule NK sono illustrati in Figura 1.
Risultati rappresentativi di un donatore sano sono illustrati nella Figura 2. Cellule NK senza alcuno stimolo prodotte né IFN-γ né MIP-1β e non hanno espresso CD107a sulla loro superficie (Figura 2A). Al contrario, le cellule NK stimolate con cellule tumorali e citochine prodotte notevoli quantità di IFN-γ intracellulare e MIP-1β. Inoltre, oltre il 20% di essi degranulati seguito all'interazione delle cellule tumorali indicato esprimendo CD107a sulla loro superficie (Figura 2C). PMA e stimolazione Ionomicina stati usati come controllo (Figura 2B).
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Figura 1:. Soppressione strategia successiva cancelli vengono tracciati. In primo luogo, i detriti sono esclusi in un FSC-A / SSC-Una trama. Poi linfociti sono identificati e doppiette sono esclusi utilizzando due lotti con SSC-A / SSC-H e FSC-A / FSC-H. Da allora in poi, un cancello compresi tutti CD45 + cellule ed escludendo tutte, le cellule morte CD3 +, CD14 + e CD19 + è impostato tracciando canale / Dump CD45. Successivamente, le cellule NK sono identificati con gating sulle cellule CD56 +. Una trama con CD56 / CD16 può essere utilizzato per identificare le principali sottopopolazioni di cellule NK. Infine, all'interno della intera popolazione di cellule NK, marcatori funzionali sono identificati da tracciando CD56 contro CD107a, IFN-γ e MIP-1β, rispettivamente. Questo può essere fatto anche per tutti i diversi tipi di sottoinsiemi di cellule NK. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2:. I risultati rappresentativi da una sana donatore di cellule NK utilizzando la strategia di gating descritto nella figura 1, cellule NK marcatori funzionali come CD107a (per degranulazione), IFN-γ e MIP-1β possono essere identificati. La colonna di sinistra (A) mostra i risultati utilizzando cellule NK in assenza di uno stimolo. La colonna centrale (B) dimostra i risultati in presenza del positivo di controllo PMA / ionomicina. La colonna di destra (C) presenta i risultati di cellule NK stimolate con la linea di cellule tumorali K562 e in presenza di citochine IL-2 (100 U / ml) e IL-15 (10 ng / ml). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: Anticorpi per il controllo della purezza.
Tabella 2: Anticorpi per la colorazione extra e intracellulare.
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Discussion
Il metodo descritto è un metodo facile, veloce e affidabile per studiare le funzioni delle cellule NK da campioni di sangue intero di donatori sani o pazienti. Questo metodo offre il grande vantaggio di purificare direttamente le cellule NK da sangue intero, evitando il tempo centrifugazione in gradiente di densità, che è obbligatorio per molti altri metodi di purificazione 15. Inoltre, si richiede una dimensione campione più piccolo rispetto ai metodi "classici" di isolamento delle cellule NK / arricchimento, il che lo rende una valida alternativa per i campioni di pazienti pediatrici e / o immuno-deficienti. Questo protocollo può essere utilizzato per ottenere valori basali di NK funzioni cellulari ex-vivo, ma permette anche l'ulteriore coltura NK ed espansione, essendo in questo modo complementare con altri metodi precedentemente descritti 8. Tuttavia alcuni passaggi critici devono essere prese in considerazione. Dal momento che il test si basa su extra e intracellulare colorazione anticorpi, è fondamentale per determinare l'ottimale working concentrazione per ogni anticorpo prima. Soprattutto per la colorazione intracellulare, un'attenta valutazione degli anticorpi utilizzati è altamente raccomandato. Un buon approccio è quello di testare una serie di diluizioni di anticorpo utilizzato (ad esempio, 1: 100 a 1: 12.5) in una sospensione cellulare stimolata con o senza PMA / ionomicina. In seguito il rapporto di eventi positivi tra i campioni stimolati e non-stimolata vengono calcolati e tracciati. La diluizione anticorpo con il più alto rapporto di variazione piega positiva (miglior rapporto segnale-background) dovrebbe essere utilizzato per ulteriori esperimenti 16. Inoltre, l'impiego di controlli come controlli isotype- e FMO può rivelarsi fondamentale soprattutto per la colorazione intracellulare per cancello correttamente sui popolazioni cellulari positive.
Tuttavia, ci sono alcune importanti limitazioni del metodo descritto. espressione CD107a è un marcatore degranulazione e quindi solo indirettamente indica citotossicità delle cellule NK. NK citotossicità cellulare unND capacità degranulazione può essere diversa. Up-regolazione della via autofagia nelle cellule tumorali risultati nella degradazione del secreto granzima B e riduce la morte delle cellule in seguito all'interazione delle cellule NK 17. Pertanto un ulteriore DCM (ad esempio, caspasi spaccati 3) può essere aggiunta al pannello di colorazione per monitorare gli eventi di morte cellulare nelle cellule bersaglio 18. Inoltre, citotossicità delle cellule NK è influenzata dalla quantità di proteine citotossici nei loro granuli (ad esempio, perforina, granzyme b), che può essere quantificato da una colorazione intracellulare 19,20.
Inoltre, vi sono diverse possibilità per modificare il protocollo. Invece di cellule NK isolate, le cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) possono essere utilizzati. Anche se si deve essere consapevoli del fatto che il numero delle cellule NK assoluto all'interno della popolazione PBMC differisce tra i vari donatori e anche tra i campioni provenienti dallo stesso donatore in diversi momenti. degranul cellule NKzione è fortemente dipendente sulla E: rapporto T. Al fine di confrontare le funzioni delle cellule NK tra i diversi donatori o in vari momenti, il numero delle cellule NK assoluto all'interno della popolazione PBMC deve essere utilizzato per stabilire una costante E: rapporto T in tutti gli esperimenti. Se funzioni delle cellule NK sono monitorate in diversi momenti all'interno dello stesso donatore, PBMC possono essere congelati e l'analisi può essere fatto in una sola volta per tutti i diversi punti di tempo al fine di ridurre le variazioni inter-sperimentali 11.
Poiché colorazione pannelli con fino a 18 colori sono possibili, analisi delle funzioni delle cellule NK può essere estesa ad un dettaglio molto maggiore. Utilizzando marcatori di superficie CD57 aggiuntive, tra cui, NKG2A e recettori immunoglobuline-like cellule killer (KIRs), ulteriori sottoinsiemi di cellule NK possono essere identificati. Le cellule NK istruite che esprimono almeno un auto-KIR degranulano più forte su di interazione con le cellule K562 rispetto alle cellule NK ignoranti. Al contrario, CD57 più differenziato + CD56 + - cellule CD56 + NK 21. Inoltre, altri marcatori della funzione delle cellule NK possono essere indirizzate. LFA-1 è una molecola importante per l'adesione delle cellule NK e si esprime nella sua conformazione aperta al momento dell'attivazione delle cellule NK. Questo cosiddetto "segnale all'interno-out" è un indicatore di attivazione delle cellule NK primi 22.
Infine, gli stimoli per le funzioni delle cellule NK di test possono essere modificati come bene. Nella nostra esperienza di fresco isolato le cellule NK solo degranulano male su di interazione cellulare K562 Se non vengono aggiunti citochine. Utilizzando PBMC appena isolate, senza ulteriore aggiunta di citochine aggirare questo problema, a causa dell'influenza delle cellule astanti. Inoltre, la produzione di citochine, in particolare IFN-γ e TNF-α, può essere avviata su IL-12 e IL-18 stimolazione 23. produzione di IFN-γ entro i sottoinsiemi di cellule NK può variare in depending dallo stimolo utilizzato (citochine contro stimolazione bersaglio indotta) 24. Inoltre, invece di utilizzare K562 cellule come cellule bersaglio, le cellule tumorali primarie derivate da pazienti con tumori possono essere usati per testare le funzioni delle cellule NK contro le cellule tumorali autologhe prima o durante terapie immunomodulanti (es monoclonali trattamento anticorpo o immuno-modulatori farmaci (IMiDs)).
All'interno di questi ultimi anni, il campo dell'immunoterapia è stata in rapida evoluzione con l'approvazione clinica degli inibitori checkpoint del sistema immunitario (ad esempio, ipilumumab, nivolumumab, pembrolizumab) 25 e di successo le prove utilizzando geneticamente modificati recettore per l'antigene chimerico (CAR) esprimente cellule T come pure come cellule NK-CAR (recensiti riferimento 26), per il trattamento di pazienti con tumori ematologici 27. Pertanto immunoterapia a base di cellule NK sta diventando sempre più a fuoco. Gli anticorpi anti-CD20 sono stati un grande successo in lavornt di linfomi maligni negli ultimi due decenni 28. La stragrande maggioranza delle cellule NK esprimono il recettore a bassa affinità Fc CD16 consentendo alle cellule di riconoscere e uccidere le cellule bersaglio anticorpi marcato (anticorpo-dipendente cellulare citotossicità - ADCC). La capacità del anticorpi per attivare le funzioni delle cellule NK può essere testato in vitro utilizzando il protocollo descritto 29. Terszowski et al. ADCC cellule NK analizzate 'contro una linea B linfoblastoidi utilizzando diversi clinicamente approvati anticorpi anti-CD20. Mentre ADCC indotta in seguito al trattamento con Rituximab (primo clinicamente approvato anti-CD20 anticorpo 30) è stato negativamente influenzato dall'interazione / HLA KIR, questo effetto non è stato osservato quando si utilizza afutuzumab (un romanzo glycoengineered tipo II CD20 anticorpo monoclonale) 31, 32. Inoltre, le funzioni delle cellule NK sono influenzati da diversi farmaci antitumorali innovativi come il IMiD lenalidomide 33 e diversi tirosin-Kinase inibitori (TKI) 34. Attualmente inibitori checkpoint specifici di cellule NK sono testati in studi clinici. Esempi sono l'uso di anti-KIR 35,36 o anti-NKG2A (NCT02331875) così come agonisti attivazione come un anticorpo anti-CD137 (NCT01775631; NCT02110082).
È importante sottolineare che, adottivo trasferimento di cellule NK è stato effettuato in una varietà di diverse malattie maligne con effetti clinici promettenti 37. Con l'obiettivo di selezionare il miglior donatore, le funzioni delle cellule NK contro tumore del paziente possono essere testate in vitro usando campioni di sangue di donatori potenziali cellule NK.
In sintesi, il protocollo descritto è progettato per analizzare diverse funzioni delle cellule NK da donatori sani o pazienti. Queste funzioni possono essere monitorate in diversi sottogruppi di cellule NK da vari stimoli in punti di tempo selezionato.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 + glutamine | Invitrogen | 6187-044 | |
| penicilin/streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| BD Falcon Round Bottom Tube | BD | 352008 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10270-106 | heat inactivated before use |
| T-flask | Greiner Bio-One | 690195 | |
| K562 tumor cell line | DSMZ GmbH | ACC 10 | |
| ammonium-chloride-potassium (ACK) lysis buffer | made in house | / | components are listed in the text |
| Distilled water: Ampuwa Spüllösung 1,000 ml Plastipur | Fresenius Kabi | 1088813 | |
| Megafuge 40R Centrifuge | Heraeus | / | |
| EDTA blood collector tubes | Sarstedt | 386453 | S-Monovette 7.5 ml, K3EDTA |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies | 15575-020 | |
| Hematopoietic media (XVIVO) | Lonza Group Ltd | BE04-743Q | |
| human serum | DRK Blutspendedienst, Frankfurt/M | / | healthy donors with blood type AB; heat inactivated before use |
| Neubauer-improved counting chamber, bright line | Marienfeld superior/ LO-Laboroptik Ltd. | 0640030/ 1110000 | |
| trypan blue solution (0.4%) | Invitrogen | 15250-061 | |
| 3% acetic acid with methylene blue | Stemcell Technologies | 07060 | |
| Corning 96 Well Clear V-Bottom TC-treated Microplates | Corning | 3894 | |
| Falcon 96 Well Round Bottom Not Treated Microplates | Corning | 351177 | |
| DPBS (Ca2+- and Mg2+-free) | Gibco Invitrogen | 14190-169 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A2153-100G | |
| NaN3 | Sigma Aldrich | 08591-1ML-F | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Merck | 524400-1MG | |
| ionomycin | PromoKine | PK-CA577-1566-5 | |
| interleukin 15 (IL-15) | PeproTech | 200-15 | |
| Proleukin S (IL-2) | Novartis Pharma | 730523 | |
| Golgi Stop, Protein Transport Inhibitor (containing Monensin) | BD Biosciences | 554724 | This product can be used in combination or instead of Golgi Plug. The best combination for the wished experimental setting has to be tested. |
| Golgi Plug, Protein Transport Inhibitor (containing Brefeldin A) | BD Biosciences | 555029 | |
| paraformaldehyde | AppliChem | UN2209 | |
| saponin | Sigma Aldrich | 47036 | |
| flow cytometer: Canto10C | BD Biosciences | / | |
| FlowJo | TreeStar Inc. | / | |
| Graph Pad | Graph Pad Inc. | / | |
| MACSxpress Separator | Miltenyi Biotec | 130-098-308 | |
| MACSxpress NK isolation kit | Miltenyi Biotec | 130-098-185 | |
| MACSxpress Erythrocyte Depletion Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-098-196 | |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
| anti-human CD3 APC | Biolegend | 300412 | |
| anti-human CD3 V450 | BD Biosciences | 560366 | |
| anti-human CD14 PerCP | Miltenyi Biotec | 130-094-969 | |
| anti-human CD14 V450 | BD Biosciences | 560349 | |
| anti-human CD16 PE | Biolegend | 302008 | |
| anti-human CD16 PerCP | Biolegend | 302029 | |
| anti-human CD19 PE-Cy7 | Biolegend | 302216 | |
| anti-human CD19 V450 | BD Biosciences | 560353 | |
| anti-human CD45 BV510 | BD Biosciences | 563204 | |
| anti-human CD56 FITC | Biolegend | 345811 | |
| anti-human CD107a PE | Biolegend | 328608 | |
| anti-human IFN-γ AF-647 | BD Biosciences | 557729 | |
| anti-human MIP-1β APC-H7 | BD Biosciences | 561280 | |
| DAPI | Biolegend | 422801 | |
| Zombie Violet Fixable Viability Kit | Biolegend | 423113 | fixable dead cell marker |
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