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Immunology and Infection

Ensayo de citometría de flujo de base para la supervisión de funciones de las células NK

Published: October 30, 2016 doi: 10.3791/54615
Automatic Translation
*1,2, *3,4, 1,2, 1,2
1Childrens Hospital, Department of Pediatric Stem Cell Transplantation and Immunology, Johann Wolfgang Goethe-University, 2LOEWE Center for Cell and Gene Therapy, Johann Wolfgang Goethe-University, 3Institute for Cancer Research, Department of Cancer Immunology, Oslo University Hospital, Radiumhospital, 4The KG Jebsen Center for Cancer Immunotherapy, Institute of Clinical Medicine, University of Oslo
* These authors contributed equally

Summary

Un método sencillo y fiable se describe aquí para analizar un conjunto de funciones de las células NK, tales como la desgranulación, de citoquinas y la producción de quimioquinas dentro de los diferentes subconjuntos de células NK.

Introduction

Como parte del sistema inmune innato células asesinas naturales (NK) contribuyen a la primera línea de defensa contra las células infectadas por virus o malignamente transformadas. Un sistema de receptores inhibidores y activadores les permite distinguir entre las células sanas y transformadas sin cebado antígeno antes en contraste con las células T. Al encuentro célula diana células NK liberan el contenido de sus gránulos citotóxicos (por ejemplo, perforina, granzimas) en la sinapsis inmune para matar a su objetivo. Por otra parte, las células NK producen y secretan diferentes tipos de citoquinas (por ejemplo, gamma interferón: IFN-γ; factor de necrosis tumoral-α: TNF-α) y quimiocinas (por ejemplo, proteína inflamatoria de macrófagos-1β: MIP-1 beta) sobre la célula diana interacción o citoquina estimulación 1.

suficientes funciones de las células NK, tales como citotoxicidad, quimioquinas y la producción de citoquinas tienen un impacto importante en el destino de diversas disalivia. Los pacientes con leucemia muestran un aumento de las tasas de recaída si presentan un perfil de las células NK defectuosa al momento del diagnóstico que consiste en reducción de la producción de IFN-γ y la reducción de la expresión de la activación de los receptores de células NK 2. Una recuperación temprana del número de células NK y la función, incluyendo la producción de citocinas tras la interacción célula diana está asociada con una recaída reducida y una mejor tasa de supervivencia en pacientes que reciben un trasplante de células madre alogénicas 3. Por otra parte, al iniciar la terapia con interferón en pacientes infectados por el virus de la hepatitis C la capacidad de la desgranulación de las células NK periféricas es más fuerte en los primeros respondedores que en los no respondedores 4. El número de células NK (> 80 / l) en el día 15 después del trasplante autólogo de células madre (autoSCT) en pacientes que padecen linfoma o mieloma múltiple son predictivos de la progresión de una mejora de la supervivencia global y libre de 5. En pacientes con melanoma la expresión de la célula T immunoglobulin- y mucina-dominio-containing molécula-3 (TIM-3), una proteína inmunorreguladora en las células NK, se correlaciona con la etapa de la enfermedad y el pronóstico 6.

Los científicos han monitoreado funciones de las células NK en las últimas décadas. El análisis inicial de la citotoxicidad de las células NK contra las células tumorales sin imprimación previa se abordó usando un ensayo de liberación de 51Cr 7. Más recientemente, los científicos desarrollaron un método no radiactivo para evaluar la citotoxicidad de las células NK expandido 8. La producción de citocinas y quimiocinas se ha evaluado con frecuencia usando el ensayo de inmunoabsorción (ELISA) técnicas ligados a enzimas 9,10. Durante las últimas décadas estos métodos han sido complementados por ensayos basados ​​en citometría de flujo. El uso de inhibidores de la proteína de transporte (por ejemplo, brefeldina A y la monensina) y los métodos de permeabilización de células en combinación con protocolos de tinción de superficie convencionales han permitido a los científicos estudiar de quimioquinas y la producción de citoquinas en diferentes linfático específicosubconjuntos ocyte (por ejemplo, T, B o células NK) 11. Por otra parte, los ensayos basados ​​en citometría de flujo diferente se han desarrollado para monitorizar T y NK citotoxicidad de las células. En 2004 Alter et al. Describe la expresión en la superficie de la proteína asociada a lisosoma CD107a (Lamp1) en las células NK en encuentro célula diana como un marcador para la desgranulación de gránulos citotóxicos 12. Dado que una amplia gama de diferentes fluorocromos y citómetros de flujo de múltiples canales están disponibles en nuestros días, se ha hecho posible para monitorear simultáneamente diversas funciones de las células NK (citotoxicidad, producción de citoquinas y quimioquinas) en diferentes subconjuntos de células NK. Esto es especialmente importante en situaciones donde el tamaño de la muestra es limitado, por ejemplo, en las biopsias o muestras de sangre de pacientes que sufren de leucopenia.

Para probar las funciones globales de células NK, los ensayos basados ​​en citometría de flujo diferente se pueden combinar de manera eficiente. Theorell et al. Las células NK estimuladas de headonantes lthy con la línea de células tumorales K562 y analizada la producción desgranulación de las células, y la señal de quimiocina de dentro a fuera NK a través de citometría de flujo 13. Recientemente subgrupos de células NK, fenotipos y funciones en pacientes con tumor durante autoSCT se analizaron mediante citometría de flujo ensayos basados. Se demostró que las células NK fueron capaces de degranulación y producir citocinas / quimiocinas sobre el reconocimiento de células tumorales en puntos de tiempo muy tempranos después de autoSCT 11.

Aquí se describe un protocolo para evaluar las funciones de células NK tras la interacción con las células tumorales, incluyendo la capacidad de la desgranulación, quimioquinas y la producción de citoquinas utilizando un flujo ensayo basado en citometría-que hace que sea posible controlar las funciones de las células NK en diferentes subconjuntos de forma simultánea.

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Protocol

Este estudio se llevó a cabo de acuerdo con las recomendaciones del comité de ética local de la Universidad de Frankfurt.

1. El cultivo de células K562

  1. Células de cultivo K562 en medios R10 (RPMI 1640 con medio de glutamina, 1% de penicilina / estreptomicina, 10% de suero de ternera fetal) a una densidad de 0,5-1 x 10 6 células por ml en un matraz de cultivo celular a 37 ° C y 5% de CO 2.
  2. Las células K562 cosecha de las 24 horas antes del inicio de un nuevo experimento.
    1. Retirar el matraz de cultivo celular que contiene las células K562 de la incubadora. Vuelva a suspender las células K562 dentro de los medios de cultivo pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo.
    2. Transferir el medio de cultivo que contiene las células K562 en un tubo de 15 o 50 ml y sedimentar las células a 400 xg durante 8 min. Desechar el sobrenadante y resuspender las células en 5 ml de medio R10 y mezclar bien.
    3. Transferencia de 20 l de la solución de células en un pocillo de una placa de 96-U-bien. Añadir 20 l de azul de tripano ymezclar bien pipeteando arriba y abajo durante al menos 5 veces. Pipeta de 10 l de la solución en una cámara de recuento celular y el recuento de las células.
    4. Sedimentar las células a 400 xg durante 8 min. Vuelva a suspender las células en medios R10 y ajustar la concentración celular K562 de 0,5-1 x 10 6 células por ml.
    5. Se incuban las células K562 en un matraz de cultivo celular a 37 ° C y 5% de CO 2 hasta su uso.

2. Aislamiento de células NK

  1. De acuerdo con la aprobación y directrices del comité de ética local, obtener el consentimiento informado por escrito del paciente o donante sano antes de la colección de 6-10 ml de EDTA o sangre periférica heparinizada.
  2. Almacenar los reactivos para el aislamiento de células NK a 4 ° C hasta el momento del inicio del experimento y luego usarlos a temperatura ambiente (TA) en condiciones estériles. Aislar las células NK de sangre periférica usando microperlas magnéticas y un imán específico para el aislamiento de células de acuerdo con tél instrucciones del fabricante.
    1. Reconstituir un vial del cóctel de anticuerpos aislamiento negativo liofilizado de células NK pipeteando 7,5 ml del tampón A proporcionado (incluidos en el kit de aislamiento de células NK) en el vial. Mezclar suavemente pipeteando arriba y abajo 3-4 veces.
      Nota: Asegúrese de que la suspensión es homogénea antes de cada uso.
    2. Preparar la solución final cóctel mezclando volúmenes apropiados de la pastilla reconstituido desde el paso 2.2.1 y tampón B (incluidos en el kit de aislamiento de células NK). Para determinar estos volúmenes, definir el volumen de la muestra de sangre en ml como volumen = 1,0. Utilice 0,25 volúmenes de la pastilla reconstituida (de la etapa 2.2.1) y 0,25 volúmenes de tampón B para procesar 1 volumen de sangre entera.
    3. Transferir la mezcla en un tubo adecuado que contiene la muestra de sangre. No pipetear arriba y hacia abajo para evitar la pérdida de sangre dentro de la pipeta. En su lugar, cerrar el tubo y mover con cuidado hacia arriba y abajo hasta que la suspensión es homogénea. No hacer vórtice.
    4. homogeneizar aún más la muestra usando un rotador tubo durante 5 min a RT.
    5. En condiciones estériles, retire la tapa y colocar el tubo en el separador magnético durante 15 minutos según lo recomendado por el fabricante. Asegúrese de que las etiquetas de las mangueras apunten hacia la parte trasera del imán para permitir la visibilidad sin perturbaciones de la línea de separación. No mueva el imán durante la separación, como se vería perturbado este procedimiento.
    6. transferir cuidadosamente el sobrenadante en un nuevo tubo de 15 ml y se llenan con completa los medios de comunicación (CM; medios de células hematopoyéticas, 1% de penicilina / estreptomicina, 5% de suero humano). Sedimentar las células a 400 xg durante 8 min.
      1. Opcional: Si el sedimento es rojo, volver a suspender las células en 1 ml de tampón de lisis de eritrocitos (por ejemplo, 1 ml de amonio-cloruro de potasio (ACK) lisar tampón: 155 mM NH 4 Cl; EDTA 0,1 mM; 10 mM KHCO3 en 1 L de agua destilada (DW)) y se incuba durante 8 minutos a TA. Como alternativa, utilizar un amplikit de agotamiento ythrocyte.
        NOTA: Tenga en cuenta, que el uso de tampón ACK podría impactar negativamente en las funciones celulares NK 14.
      2. Rápidamente diluir el tampón ACK mediante la adición de al menos 1 ml de CM para detener la lisis y se centrifuga a 400 xg durante 8 minutos para sedimentar las células.
    7. Vuelva a suspender el sedimento celular en 1 ml de CM y proceder con el conteo. Transferencia de 20 l de la solución de células NK en una placa de 96-U-bien. Añadir 20 l de azul de metileno a cada pocillo y mezclar bien pipeteando arriba y abajo durante al menos 5 veces. Pipetear 10 l de la solución en una cámara de recuento de células y células de contar. Alternativamente, utilizar 30 l de suspensión de células sin diluir para contar con un contador de células disponible en el mercado.
    8. Ajustar las células a una concentración de al menos 2 x 10 4 células NK por 100 CM l.
    9. Realizar una tinción de anticuerpos superficie de la población de células NK aisladas para comprobar la pureza usando un citómetro de flujo.
      1. Prepare una solución mezcla maestra mediante mezcla de los volúmenes de los anticuerpos indicados según la Tabla 1.
      2. Vuelva a suspender las células en tampón de lavado 88,5 l (WB; 0,5% de albúmina de suero bovino (BSA), 0,1% NaN 3 en PBS) y añadir 11,5 l de la solución de mezcla maestra. Se incuban las células durante 20 min a 4 ° C en la oscuridad.
        Precaución: NaN 3 es tóxico y mutágeno. Manejarlo de acuerdo a la correspondiente hoja de datos de seguridad del material (MSDS).
      3. Añadir 1 ml de WB y sedimentar las células a 400 xg durante 4 minutos.
      4. Vuelva a suspender las células en tampón de tinción de 300 l, más DAPI. Adquirir las células utilizando un citómetro de flujo.
        NOTA: seguir adelante con el experimento sólo si la pureza de las células NK es de al menos 80% de todos los linfocitos vivos.

3. La recolección de las células K562 para la estimulación de células NK

  1. Retirar el matraz de cultivo celular que contiene las células K562 (de la etapa 1.2) de TH e incubadora. Vuelva a suspender las células K562 dentro de los medios de cultivo pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo.
  2. Transferir todo el medio de cultivo en un tubo de 15 o 50 ml y sedimentar las células a 400 xg durante 8 min. Desechar el sobrenadante y resuspender las células en 5 solución salina tamponada con fosfato ml (PBS) y mezclar bien.
  3. Transferencia de 20 l de la solución de células en un pocillo de una placa de 96-U-bien. Añadir 20 l de tripano azul y mezclar bien pipeteando arriba y abajo durante al menos 5 veces. Pipeta de 10 l de la solución en una cámara de recuento celular y el recuento de las células. Alternativamente utilizar 30 l de suspensión celular sin diluir para contar con un contador de células disponibles comercialmente.
  4. Sedimentar las células a 400 xg durante 8 min. Células en CM Vuelva a suspender a una concentración de al menos 2 x 10 4 K562 células por 100 l de medios.
    NOTA: Utilice el mismo K562 y las concentraciones de células NK con el fin de incubar tanto a una relación de efector:: (TE) de 1: 1 de destino más adelante.
"> 4. La estimulación de las células NK con el tumor Línea Celular K562 y citoquinas

  1. Mezclar suavemente las células pipeteando arriba y abajo durante al menos 5 veces. Distribuir 100 l / pocillo de la solución de células NK en los pocillos requeridos de una placa de 96-V pocillos.
    1. Use al menos dos pocillos para cada donante, una con y otra sin un estímulo (por ejemplo, células tumorales K562 y citoquinas). Siempre que sea posible, realizar el experimento, al menos por duplicado y añadir un control positivo (por ejemplo, miristato de forbol 12-13-acetato (PMA) y ionomicina; concentración final: 50 nM de PMA, 1 M de ionomicina por pocillo). Preparar el flujo actualizado citometría de compensaciones para la fecha del experimento.
      NOTA: Valorar los anticuerpos uso anterior (véase el debate).
  2. Apagar la luz y añadir el anticuerpo anti-CD107a (2 l, concentración final: 1: 100) a cada pocillo con células NK en la placa 96-V-así.
  3. Mezclar suavemente las células K562 con la pipeta hacia arriba y abajo por loPor lo menos 5 veces.
    1. A partir de los pocillos que contienen la solución de anticuerpos de las células NK / anti-CD107a, identificar a los previstos para la estimulación con células K562. Añadir 100 l / pocillo de la solución de células K562 en estos pozos. Mezclar con cuidado la pipeta hacia arriba y hacia abajo durante al menos 5 veces.
    2. Añadir la interleucina-2 (IL-2; concentración final 100 U / ml) y la interleucina-15 (IL-15; concentración final de 10 ng / ml) a los pocillos que contienen células K562 y la solución de anticuerpo de células NK / anti-CD107a.
      1. Opcional: probar el impacto de cualquiera de las células K562 o citocinas solo en las células NK distribuidos de descifrar comparadas con las funciones de las células NK inducida por citoquinas inducida por el tumor.
    3. Identificar los pozos de la placa de 96 V-bien planificada como controles negativos sin estímulo. Añadir 100 l / pocillo CM a estos pozos que contienen sólo la solución de anticuerpos de las células NK / anti-CD107a. Mezclar con cuidado la pipeta hacia arriba y hacia abajo durante al menos 5 veces.
      1. Opcional: Para un control positivo, añadir 100 μ; L CM que contiene PMA y ionomicina (concentración final: 50 nM PMA, 1 mM ionomicina por pocillo) a un pozo con la solución de anticuerpos de células NK / anti-CD107a.
  4. Se incuban las células durante 3 horas en la oscuridad a 37 ° C y 5% de CO2.
  5. Preparar una solución de inhibidor de la proteína de transporte (por ejemplo, brefeldina A y / o monensina) en CM. Después de 1 h de incubación, añadir la solución a cada pocillo de la placa de 96-V-bien con la luz apagada (concentración final: 0.5-1μM brefeldin A y 2-3 monensina M). Mezclar con cuidado la pipeta hacia arriba y hacia abajo durante al menos 5 veces. Continuar la incubación durante 2 horas el restante.

5. La superficie e intracelulares tinción

  1. Después de que el período de incubación de 3 h, la mezcla de las células dentro de los pocillos de la placa de 96-V-así cuidadosamente pipeteando arriba y abajo por al menos 5 veces y transferirlos a citometría de flujo tubos. Añadir 1 ml / tubo de WB. Precipitar las células a 400 xg durante 4 minutos.
    1. Opcional: antes de la centrifugación Lavar los pocillos con 100 l / pocillo de PBS, con el fin de optimizar la recuperación de células, pipeteando arriba y abajo por al menos 5 veces antes de la transferencia de las células en el respectivo tubo de FACS.
  2. Descartar el sobrenadante y continuar con la tinción de la superficie.
  3. Incluir un colorante fluorescente reactivo con amina que no es permeable a las células vivas con un máximo de emisión de 423 nm como un marcador de células muertas puede arreglar (DCM). Realizar la tinción antes (ver a continuación) o en paralelo con la tinción de la superficie de anticuerpos en función del tipo de la DCM utiliza.
    1. Vuelva a suspender las células en 99 l / tubo de PBS y añadir 1 l / tubo del DCM corregible (concentración final: 1: 100). Mezclar bien las células utilizando un vórtice y se incuba durante 15 min a TA en la oscuridad.
    2. Preparar una solución de mezcla maestra mediante la mezcla de los anticuerpos "superficie" que se enumeran en la Tabla 2 (ver columna etapa de tinción resaltado en azul). En utilizar eldicated volúmenes / tubo y se multiplica con el número de tubos de citometría de flujo para ser teñidos.
    3. Después de la incubación tomar la citometría de flujo tubos con las células y añadir 1 ml / tubo de WB. Sedimentar las células a 400 xg durante 4 min.
    4. Descartar el sobrenadante, resuspender las células en 84 l / tubo de WB y añadir 16 l / tubo de la solución de mezcla maestra. Mezclar bien usando células de un vórtice. Se incuban las células durante 20 min a 4 ° C en la oscuridad.
    5. Después de 20 minutos añadir 1 ml / tubo de WB y células de pellets a 400 xg durante 4 minutos.
  4. Desechar el sobrenadante y resuspender las células en 100 l / tubo de una solución de fijación fría (por ejemplo, 2% () de paraformaldehído al final o formaldehído). Mezclar bien usando células de un vórtice. Se incuban las células durante 10 min a 4 ° C en la oscuridad.
    1. Teñir las células de citoquinas intracelulares / quimiocinas después de este paso o almacenarlos durante la noche a 4 ° C en WB.
      NOTA: Después de la incubación durante la noche, se puede producir una recuperación celda inferior.
  5. Lavar las células en 1 ml de WB / tubo a 400 xg durante 4 minutos y proceder con el paso de permeabilización.
  6. Preparar un tampón de permeabilización (PB) (por ejemplo, 0,2% de saponina, 1% de solución de BSA en PBS).
  7. Lavar las células dos veces en 1 ml / tubo de PB a 400 xg durante 4 min. Continuar con la tinción intracelular.
    Precaución: La saponina es potencialmente irritantes. Manejarlo de acuerdo a la correspondiente hoja de datos de seguridad del material (MSDS).
  8. Preparar una solución de mezcla maestra utilizando los volúmenes indicados "intracelulares" de anticuerpos en la Tabla 2 (resaltados en verde). Multiplicar estos volúmenes con el número de tubos que se tiñe.
    1. Vuelva a suspender las células en 90 l de PB / tubo y aplicar 10 l / tubo de la solución de anticuerpos mezcla maestra. Mezclar bien usando un vórtice y se incuban las células durante 30 min a 4 ° C en la oscuridad.
  9. Lavar las células dos veces en 1 ml / tubo de PB a 400 xg durante 4 minutos.
  10. Desechar el sobrenadante y resuspender las células en 400 PB l / tubo. Mezclar bien usando células de un vórtice. Coloque células en hielo en la oscuridad hasta la medición.

6. Citometría de Flujo de Compensación y Adquisición

  1. Seleccione los canales para los diferentes fluorocromos (ver Tabla 2) dentro de la citometría de flujo software de adquisición en la carpeta de configuración de parámetros. Además, elegir los canales para FSC-A y -H, así como para SSC-A y -H.
  2. Cargar una matriz de compensación creada para los parámetros elegidos en el archivo de adquisición.
    1. Crear una matriz de compensación utilizando células NK aisladas de la etapa 2.2.8 mediante la realización de una sola mancha de color para cada fluorocromo utilizado (véase la Tabla 2). Utilizar el protocolo de tinción de la superficie descrita en los pasos 5.1-5.4. Incluir un control sin teñir (sin ningún tipo de anticuerpos), así como controles de isotipo y / o fluorescencia menos uno controles (FMO).
      NOTA: Como alternativa a la compensación basada en células, usar perlas como controles de compensación de unión a IgG.
    2. Colocar cada tubo para muestras de manchas individuales y la muestra sin anticuerpos en el puerto de inyección de muestra (SIP). Haga clic en el botón "Grabar" en el software de adquisición de citometría de flujo y adquirir un número de células de al menos 5 x 10 3 células NK por muestra.
    3. Utilice la aplicación de cálculo de la compensación del software de adquisición de citometría de crear una matriz de compensación.
  3. Crear gráficas de puntos para la identificación de la población de células NK.
    1. Identificar las células individuales utilizando FSC-A / FSC-H y / SSC-H gráficos de puntos de SSC-A. Haga clic en el botón "puerta polígono". Dibuje una puerta alrededor de las células, que tienen un patrón de distribución lineal en ambos gráficos de puntos. Haga doble clic en las puertas para abrir un nuevo gráfico de puntos.
    2. Elija una parcela FSC-A / SSC-Un punto para identificar el linfocito/ Población de células NK (ver Figura 1). Dibuje una puerta polígono alrededor de ella y haga doble clic en la puerta.
  4. Colocar cada tubo de muestra del ensayo de estimulación de células NK en el SIP. Haga clic en el botón "Grabar" y adquirir un número de células de al menos 5 x 10 3 células NK por muestra.

7. Análisis y Estadísticas

  1. Abrir el flujo del programa software de análisis de citometría. Haga clic en el botón de carga de muestra para abrir la muestra de control no estimulado.
  2. Crear un sistema de llenado de las diferentes subpoblaciones de células NK (ver Figura 1).
    1. Haga clic en el botón gráfico de puntos para crear una EVE-A / SSC-Una trama. Haga clic en el botón de la puerta rectángulo y dibujar un rectángulo sobre la puerta todos los eventos con un FSC-Un valor> 5 x 10 4 para excluir los desechos. Abra la puerta, haciendo doble clic en la puerta.
    2. Elegir de nuevo los parámetros FSC-A / SSC-A dentro del nuevo gráfico de puntos y hacer clic en el botón de la puerta polígono. reen bruto de una puerta polígono alrededor de la población de linfocitos (véase la Figura 1). Abre la puerta.
    3. Seleccionar el parámetro / SSC-H SSC-A para el nuevo diagrama de puntos y dibujar una puerta polígono alrededor de todas las células individuales. Las células individuales muestran una distribución lineal a través de los parámetros de FSC-A / FSC-H y SSC-A / SSC-H (véase la Figura 1). Abra la puerta, haciendo doble clic sobre él.
    4. Repita el paso 7.2.3 con los parámetros de FSC-A / FSC-H en esta ocasión.
    5. Utilizar el parámetro de CD45 y volcado canal (CD3, CD14, CD19; DCM) para excluir las células muertas. Dibuje un rectángulo alrededor de la puerta todo CD45 positivas y negativas de vaciado células del canal. Abra la puerta, haciendo doble clic en la puerta.
    6. Identificar toda la población de células NK mediante el CD56 y volcado parámetros de canal. Crear una puerta rectángulo alrededor del CD56 positivo y volcado canalizar las células negativas. Abra la puerta, haciendo doble clic sobre él.
    7. Dibuje una puerta rectángulo alrededor de los tres subgrupos de células NK en un CD56 / CD16 gráfico de puntos. Identify los diferentes subconjuntos como CD56 ++ CD16 -, CD56 ++ CD16 + y subconjuntos de células CD56 + CD16 ++ NK.
  3. Analizar funciones de las células NK para cada subconjunto de células NK individual.
    1. Haga clic en una de las tres puertas de subconjuntos de células NK para abrirlo. Crear tres gráficos de puntos diferentes para CD56 / CD107a, CD56 / IFN-γ y CD56 / MIP-1β.
    2. Dibujar una puerta rectángulo de células positivas CD56, que son positivas también para CD107a, IFN-γ o MIP-1β, respectivamente (véase la Figura 1).
    3. Repita el paso 7.3.1-7.3.2 para cada subconjunto de células NK restante.
  4. Repita el paso 7.2 y 7.3 para todas las muestras estimuladas. Guardar todos los valores estadísticos de cada muestra individual haciendo clic en el botón de Estadística-exportación en el software de análisis.
  5. Abrir los archivos que contienen los valores estadísticos de las muestras individuales para analizar funciones de las células NK. Seleccionar los valores de las células NK individuosubconjuntos (por ejemplo, CD56 ++ CD16 - células NK) copiándolos en otro archivo.
    1. Restar el porcentaje de células NK positivo CD107a, que no han sido tratados con un estímulo, a partir del porcentaje de células positivas CD107a NK, que han sido tratados con un estímulo.
      NOTA: Utilice el resultado para demostrar la capacidad de la desgranulación de este subconjunto particular de células NK en respuesta al estímulo.
    2. Repita el paso 7.5.1 para IFN-γ y células NK MIP-1ß-positivos para demostrar la producción de citoquinas y quimioquinas en respuesta al estímulo.
    3. Repita el paso 7.5.1-7.5.2 para cada subconjunto de células NK restante para evaluar su capacidad desgranulación y la producción de citoquinas / quimioquinas tras la estimulación.

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Representative Results

La estrategia gating para analizar la desgranulación, citoquinas y quimioquinas producción de toda la población de células NK y tres subconjuntos de células NK diferentes se ilustran en la Figura 1.

Los resultados representativos de un donante sano se ilustran en la Figura 2. Las células NK sin ningún estímulo ni producen IFN-γ ni MIP-1β y no expresaron CD107a en su superficie (Figura 2A). En contraste, las células NK estimuladas con células tumorales y las citoquinas producidas cantidades significativas de IFN-γ intracelular y MIP-1β. Por otra parte, más de 20% de ellos desgranulados tras la interacción de las células tumorales se indica mediante la expresión de CD107a en su superficie (Figura 2C). PMA y ionomicina estimulación se utilizaron como control (Figura 2B).

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Figura 1:. Compuertas a la estrategia posterior puertas se representan. En primer lugar, los desechos se excluyen en una FSC-A / SSC-Una trama. A continuación, se identifican los linfocitos y los dobletes se excluyen el uso de dos parcelas con el SSC-A / SSC-H y FSC-A / FSC-H. A partir de entonces, una puerta que incluye todas las células CD45 + y excluyendo todas, las células CD3 +, CD14 + y CD19 + muertas se establece mediante el trazado del canal CD45 / descarga. A continuación, las células NK se identifican por gating en las células CD56 +. Una parcela con CD56 / CD16 se puede utilizar para identificar los principales subconjuntos de células NK. Por último, dentro de toda la población de células NK, marcadores funcionales se identifican mediante el trazado de CD56 frente CD107a, IFN-γ y MIP-1β, respectivamente. Esto se puede hacer, así como para todos los diferentes tipos de subconjuntos de células NK. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.


Figura 2:. Los resultados representativos de un donante de células NK saludable mediante la estrategia de gating describe en la Figura 1, los marcadores funcionales de células NK como CD107a (por degranulación), IFN-γ y MIP-1β se pueden identificar. La columna de la izquierda (A) muestra los resultados utilizando células NK en ausencia de un estímulo. La columna de en medio (B) demuestra los resultados en la presencia del control PMA / ionomicina positivo. La columna derecha (C) se presentan los resultados para las células NK estimuladas con la línea de células tumorales K562 y en presencia de las citoquinas IL-2 (100 U / ml) e IL-15 (10 ng / ml). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

"Tabla Tabla 1: Los anticuerpos para comprobar la pureza.

Tabla 2
Tabla 2: Los anticuerpos para la tinción extracelular e intracelular.

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Discussion

El método descrito es un método fácil, rápido y fiable para estudiar las funciones de las células NK a partir de muestras de sangre entera de donantes sanos o pacientes. Este método ofrece la gran ventaja de purificar directamente a las células NK de la sangre entera, evitando el tiempo de centrifugación en gradiente de densidad, que es obligatorio para muchos otros métodos de purificación 15. Por otra parte, se requiere un tamaño de muestra más pequeño en comparación con métodos de enriquecimiento / "clásico" de aislamiento de células NK, que hace que sea una alternativa adecuada para las muestras de los pacientes pediátricos y / o inmunodeficientes. Este protocolo se puede utilizar para obtener valores basales de NK funciones de las células ex vivo, sino que también permite la cultura NK más y expansión, siendo de esta manera complementaria con otros métodos descritos anteriormente 8. Sin embargo, algunos pasos críticos tienen que ser tomadas en cuenta. Dado que el ensayo se basa en la tinción de anticuerpos extra e intracelular, es crucial para determinar la óptima wojo concentración de cada anticuerpo en primer lugar. Especialmente para la tinción intracelular, una cuidadosa evaluación de los anticuerpos utilizados es muy recomendable. Un buen método es poner a prueba una serie de diluciones del anticuerpo utilizado (por ejemplo, 1: 100 a 1: 12,5) en una suspensión de células estimuladas con o sin PMA / ionomicina. Posteriormente, la relación de los acontecimientos positivos entre las muestras estimuladas y un-estimulado se calculan y se representa. La dilución de anticuerpo con la relación de cambio veces positivo más alto (mejor relación señal-fondo) se debe utilizar para experimentos adicionales 16. Por otra parte, el uso de controles, como controles de isotipo y FMO puede llegar a ser fundamental especialmente para la tinción intracelular con el fin de puerta correctamente en las poblaciones de células positivas.

Sin embargo, hay algunas limitaciones importantes del método descrito. expresión CD107a es un marcador desgranulación y por lo tanto sólo indirectamente indica la citotoxicidad de células NK. NK citotoxicidad de las células unand capacidad desgranulación puede ser diferente. Sobre regulación de la vía de la autofagia en células tumorales da como resultado la degradación de secretada granzima B y reduce la muerte celular tras la interacción de células NK 17. Por lo tanto un DCM adicional (por ejemplo, se escindió de la caspasa 3) podría añadirse al panel de tinción con el fin de supervisar los eventos de muerte celular en las células diana 18. Además, la citotoxicidad de células NK se ve influida por la cantidad de proteínas citotóxicas dentro de sus gránulos (por ejemplo, perforina, granzima B), que puede ser cuantificado por una tinción intracelular 19,20.

Además, hay diferentes posibilidades para modificar el protocolo. En lugar de las células NK aisladas, las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) se pueden utilizar. Aunque hay que tener en cuenta que el número absoluto de células NK en la población de PBMC difiere entre los distintos donantes e incluso entre las muestras procedentes del mismo donante en diferentes puntos temporales. degranul de células NKación depende de la E altamente: relación de T. Con el fin de comparar las funciones de las células NK entre los diferentes donantes o en varios puntos de tiempo, el número absoluto de células NK en la población de PBMC debería utilizarse para establecer una constante de proporción de E: T a lo largo de todos los experimentos. Si las funciones de las células NK son monitoreados en diferentes puntos de tiempo dentro de un mismo donante, PBMCs se pueden congelar y el análisis se puede hacer de una sola vez para todos los diferentes puntos de tiempo con el fin de reducir las variaciones entre experimentos 11.

Desde la tinción paneles con hasta 18 colores son posibles, el análisis de las funciones de las células NK se puede extender a una mucho mayor detalle. El uso de marcadores de superficie adicionales, incluyendo CD57, NKG2A y los receptores similares a inmunoglobulina de células killer (KIR), más subconjuntos de células NK pueden ser identificados. células NK educadas que expresan al menos una auto-KIR desgranulan más fuerte tras la interacción con células K562 que las células NK sin educación. Por el contrario, CD57 más diferenciado + CD56 + - células CD56 + NK 21. Además, otros marcadores de la función de las células NK pueden ser dirigidas. LFA-1 es una molécula importante para la adhesión de las células NK y se expresa en su conformación abierta a la activación de células NK. Esta denominada "señal de adentro hacia afuera" es un marcador de activación de las células NK temprana 22.

Por último, los estímulos de prueba para las funciones de las células NK se pueden modificar también. En nuestra experiencia recién aisladas células NK única degranulate mal tras la interacción celular K562 si no se añaden citocinas. Utilizando PBMCs recién aisladas sin más adición de citoquinas eludir este problema, debido a la influencia de células espectadoras. Por otra parte, la producción de citoquinas, especialmente IFN-γ y TNF-α, se puede iniciar a IL-12 y IL-18 estimulación 23. la producción de IFN-γ dentro de los subconjuntos de células NK puede diferir depending en el estímulo utilizado (citoquinas frente a la estimulación inducida diana) 24. Además, en vez de usar células K562 como células diana, células tumorales primarias derivadas de pacientes tumorales podrían ser utilizados con el fin de probar las funciones de las células NK contra las células tumorales autólogas antes o durante terapias inmunomoduladoras (por ejemplo, monoclonales de tratamiento de anticuerpo o inmuno-moduladores drogas (IMiDs)).

En los últimos años, el campo de la inmunoterapia ha evolucionado rápidamente con la aprobación clínica de los inhibidores de punto de control inmunitario (por ejemplo, ipilumumab, nivolumumab, pembrolizumab) 25 y exitosos ensayos que utilizaron receptor de antígeno quimérico modificado genéticamente (CAR) que expresan las células T, así como células CAR-NK (revisado en referencia 26), para el tratamiento de pacientes con tumores hematológicos 27. Por lo tanto NK inmunoterapia basada en células es cada vez más en el foco. Los anticuerpos anti-CD20 han sido un gran éxito en el limpnt de los linfomas malignos en las últimas dos décadas 28. La gran mayoría de las células NK expresan la afinidad Fc CD16 bajo receptor que permite a las células para reconocer y matar células diana de anticuerpos marcados (citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo - ADCC). La capacidad del anticuerpo para activar las funciones de las células NK se puede probar in vitro utilizando el protocolo descrito 29. Terszowski et al. ADCC células NK analizados 'contra una línea celular linfoblastoide B usando diferentes anticuerpos anti-CD20 clínicamente aprobados. Mientras ADCC inducida por tratamiento rituximab (primero aprobado clínicamente anticuerpo anti-CD20 30) fue influenciado negativamente por la interacción / HLA KIR, este efecto no se observó cuando se utiliza obinutuzumab (un nuevo tipo II glucomanipulado anticuerpo monoclonal CD20) 31, 32. Por otra parte, las funciones de las células NK son influenciados por diferentes nuevos fármacos antitumorales como la lenalidomida ImiD 33 y diferentes tirosina-kinasinhibidores de e (TKI) 34. Actualmente inhibidores de puntos de control específicos de células NK se prueban en ensayos clínicos. Ejemplos son el uso de anti-KIR 35,36 o anticuerpos anti-NKG2A (NCT02331875), así como agonistas que activan como un anticuerpo anti-CD137 (NCT01775631; NCT02110082).

Es importante destacar que la transferencia de células NK adoptiva se ha realizado en una variedad de diferentes enfermedades malignas con efectos clínicos prometedores 37. Con el objetivo de seleccionar el mejor de los donantes, las funciones de las células NK contra el tumor del paciente pueden ser probados in vitro usando muestras de sangre de potenciales donantes de células NK.

En resumen, el protocolo descrito está diseñado para analizar diversas funciones de las células NK de donantes sanos o pacientes. Esas funciones pueden ser monitoreados en diversos subconjuntos de células NK de diversos estímulos en puntos de tiempo seleccionados.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 + glutamine Invitrogen 6187-044
penicilin/streptomycin Invitrogen 15140-122
BD Falcon Round Bottom Tube BD 352008
fetal calf serum Invitrogen 10270-106 heat inactivated before use
T-flask Greiner Bio-One 690195
K562 tumor cell line DSMZ GmbH ACC 10
ammonium-chloride-potassium (ACK) lysis buffer made in house / components are listed in the text
Distilled water: Ampuwa Spüllösung 1,000 ml Plastipur Fresenius Kabi 1088813
Megafuge 40R Centrifuge Heraeus /
EDTA blood collector tubes Sarstedt 386453 S-Monovette 7.5 ml, K3EDTA
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Life Technologies 15575-020
Hematopoietic media (XVIVO) Lonza Group Ltd BE04-743Q
human serum DRK Blutspendedienst, Frankfurt/M  / healthy donors with blood type AB; heat inactivated before use
Neubauer-improved counting chamber, bright line Marienfeld superior/ LO-Laboroptik Ltd. 0640030/ 1110000
trypan blue solution (0.4%) Invitrogen 15250-061
3% acetic acid with methylene blue Stemcell Technologies  07060
Corning 96 Well Clear V-Bottom TC-treated Microplates Corning  3894
Falcon 96 Well Round Bottom Not Treated Microplates Corning  351177
DPBS (Ca2+- and Mg2+-free) Gibco Invitrogen 14190-169
BSA Sigma Aldrich A2153-100G
NaN3 Sigma Aldrich 08591-1ML-F
phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)  Merck 524400-1MG
ionomycin  PromoKine PK-CA577-1566-5
interleukin 15 (IL-15) PeproTech 200-15
Proleukin S (IL-2)  Novartis Pharma 730523
Golgi Stop, Protein Transport Inhibitor (containing Monensin) BD Biosciences 554724 This product can be used in combination or instead of Golgi Plug. The best combination for the wished experimental setting has to be tested.
Golgi Plug, Protein Transport Inhibitor (containing Brefeldin A) BD Biosciences 555029
paraformaldehyde AppliChem UN2209
saponin Sigma Aldrich 47036
flow cytometer: Canto10C BD Biosciences /
FlowJo TreeStar Inc. /
Graph Pad Graph Pad Inc. /
MACSxpress Separator Miltenyi Biotec  130-098-308
MACSxpress NK isolation kit Miltenyi Biotec  130-098-185
MACSxpress Erythrocyte Depletion Kit, human Miltenyi Biotec  130-098-196
MACSmix Tube Rotator  Miltenyi Biotec  130-090-753
anti-human CD3 APC Biolegend 300412
anti-human CD3 V450 BD Biosciences 560366
anti-human CD14 PerCP Miltenyi Biotec  130-094-969
anti-human CD14 V450 BD Biosciences 560349
anti-human CD16 PE Biolegend 302008
anti-human CD16 PerCP Biolegend 302029
anti-human CD19 PE-Cy7 Biolegend 302216
anti-human CD19 V450 BD Biosciences 560353
anti-human CD45 BV510 BD Biosciences 563204
anti-human CD56 FITC Biolegend 345811
anti-human CD107a PE Biolegend 328608
anti-human IFN-γ AF-647 BD Biosciences 557729
anti-human MIP-1β APC-H7 BD Biosciences 561280
DAPI Biolegend 422801
Zombie Violet Fixable Viability Kit Biolegend 423113 fixable dead cell marker

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References

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Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, N., Ullrich, E. Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions. J. Vis. Exp. (116), e54615, doi:10.3791/54615 (2016).

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