Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

الفحص التدفق الخلوي استنادا لمراقبة وظائف الخلايا القاتلة الطبيعية

Published: October 30, 2016 doi: 10.3791/54615
Automatic Translation
*1,2, *3,4, 1,2, 1,2
1Childrens Hospital, Department of Pediatric Stem Cell Transplantation and Immunology, Johann Wolfgang Goethe-University, 2LOEWE Center for Cell and Gene Therapy, Johann Wolfgang Goethe-University, 3Institute for Cancer Research, Department of Cancer Immunology, Oslo University Hospital, Radiumhospital, 4The KG Jebsen Center for Cancer Immunotherapy, Institute of Clinical Medicine, University of Oslo
* These authors contributed equally

Summary

وصفت وهناك طريقة بسيطة وموثوق بها هنا لتحليل مجموعة من وظائف الخلايا القاتلة الطبيعية مثل تحبب، خلوى والإنتاج chemokine ضمن مختلف مجموعات فرعية الخلايا القاتلة الطبيعية.

Introduction

كجزء من القاتل الطبيعي نظام المناعة الفطري (NK) الخلايا تساهم في خط الدفاع الأول ضد الخلايا المصابة بالفيروسات أو تحويلها malignantly. نظام المستقبلات المثبطة وتفعيل تمكنهم من التمييز بين الخلايا السليمة وتحويلها دون فتيلة مستضد مسبق على النقيض من الخلايا التائية. على خلية لقاء الهدف الخلايا القاتلة الطبيعية الافراج عن محتوى حبيبات السامة للخلايا الخاصة بهم (على سبيل المثال، بيرفورين، granzymes) إلى المشبك المناعي لقتل هدفهم. وعلاوة على ذلك، الخلايا القاتلة الطبيعية تنتج وتفرز أنواع مختلفة من السيتوكينات (على سبيل المثال، γ interferon-: IFN-γ، عامل نخر الورم α: TNF-α) و chemokines (على سبيل المثال، بلعم التهابات البروتين 1β: MIP-1β) على الخلية المستهدفة تفاعل أو خلوى التحفيز 1.

كافية وظائف الخلايا القاتلة الطبيعية مثل السمية الخلوية، chemokine وإنتاج السيتوكينات لها تأثير هام على مصير ديس متنوعةيخفف. مرضى سرطان الدم تظهر زيادة معدلات الانتكاس إذا كانوا يظهرون لمحة الخلايا القاتلة الطبيعية خلل في تشخيص تتكون من انخفاض إنتاج الإنترفيرون γ وانخفاض التعبير تفعيل مستقبلات الخلايا القاتلة الطبيعية (2). ويرتبط انتعاش مبكر من أعداد الخلايا القاتلة الطبيعية وظيفة بما في ذلك إنتاج السيتوكينات على التفاعل الخلية المستهدفة مع انخفاض الانتكاس وتحسين معدل البقاء على قيد الحياة في المرضى الذين يتلقون الجذعية خيفي خلية زرع 3. وعلاوة على ذلك، عند بدء علاج مضاد للفيروسات في المرضى المصابين بفيروس التهاب الكبد C القدرة تحبب الخلايا القاتلة الطبيعية الطرفية أقوى في المستجيبين في وقت مبكر مما كانت عليه في غير المستجيبين 4. أعداد الخلايا القاتلة الطبيعية (> 80 / ميكرولتر) في يوم 15 بعد زرع الخلايا الجذعية ذاتي (autoSCT) في المرضى الذين يعانون من سرطان الغدد الليمفاوية أو المايلوما المتعددة والتنبؤية لتحسين تطور الحر والشامل البقاء على قيد الحياة 5. في المرضى الذين يعانون سرطان الجلد التعبير عن خلايا T immunoglobulin- والميوسين المجال، containinز جزيء 3 (TIM-3)، وهو بروتين المناعة التنظيمية على الخلايا القاتلة الطبيعية، يرتبط مرحلة المرض والتشخيص 6.

وقد رصد العلماء ظائف الخلايا القاتلة الطبيعية خلال العقود الماضية. وقد تناول التحليل الأولي للNK الخلية السمسة ضد الخلايا السرطانية دون فتيلة مسبق باستخدام فحص 51 كر الإفراج 7. وفي الآونة الأخيرة، طور العلماء طريقة غير المشعة لتقييم السمية الخلوية للخلايا NK توسيع 8. وكثيرا ما يتم تقييمها من إنتاج السيتوكينات وchemokine باستخدام الفحص المناعي (ELISA) تقنيات انزيم مرتبط 9،10. خلال العقود الماضية واستكملت هذه الأساليب التي تدفق المقايسات مقرها الخلوي. وقد مكنت استخدام مثبطات البروتين النقل (على سبيل المثال، brefeldin ألف ومونينسين) وأساليب خلية permeabilization في تركيبة مع بروتوكولات تلطيخ السطح التقليدي العلماء لدراسة chemokine والإنتاج خلوى في الليمفاوية محددة مختلفةفرعية ocyte (على سبيل المثال، T، B أو الخلايا القاتلة الطبيعية) 11. وعلاوة على ذلك، تم وضع تدفق مختلف المقايسات القائمة على الخلوي لمراقبة تي وNK الخلايا السمية الخلوية. في عام 2004 وصف ألتر آخرون التعبير سطح البروتين المرتبط يحلول CD107a (Lamp1) على الخلايا القاتلة الطبيعية عند لقاء الخلية المستهدفة كعلامة للتحبب من حبيبات السامة للخلايا (12). منذ طائفة واسعة من fluorochromes مختلفة وأجهزة قياس التدفق الخلوي متعدد القنوات تتوفر في أيامنا هذه، أصبح من الممكن رصد في وقت واحد متنوعة وظائف الخلايا القاتلة الطبيعية (السمية الخلوية، خلوى والإنتاج chemokine) في مختلف مجموعات فرعية الخلايا القاتلة الطبيعية. هذا يصبح من المهم وخصوصا في الحالات التي يقتصر حجم العينة، على سبيل المثال، في الخزعات أو عينات الدم من المرضى الذين يعانون من نقص الكريات البيض.

لاختبار وظائف الخلايا القاتلة الطبيعية العالمية، وفحوصات على أساس التدفق الخلوي مختلفة يمكن الجمع بين بكفاءة. Theorell آخرون حفز الخلايا القاتلة الطبيعية من هيئة التعليم العاليالجهات المانحة lthy مع خط الخلايا السرطانية K562 وتحليلها NK تحبب الخلايا، إشارة من الداخل إلى الخارج وchemokine الإنتاج من خلال التدفق الخلوي 13. مؤخرا مجموعات فرعية الخلايا القاتلة الطبيعية، وقد تم تحليل الظواهر وظائف في مرضى الأورام خلال autoSCT باستخدام التدفق المقايسات مقرها الخلوي. وقد تبين أن الخلايا القاتلة الطبيعية استطاعت degranulate وإنتاج السيتوكينات / كيموكينات على الاعتراف الخلايا السرطانية في نقطة زمنية في وقت مبكر جدا بعد autoSCT 11.

هنا يتم وصف بروتوكول لتقييم وظائف الخلايا القاتلة الطبيعية على التفاعل مع الخلايا السرطانية بما في ذلك القدرة تحبب، chemokine وإنتاج السيتوكينات باستخدام تدفق الفحص القائمة على الخلوي الذي يجعل من الممكن لمراقبة وظائف الخلايا القاتلة الطبيعية في مجموعات فرعية مختلفة في وقت واحد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد أجريت هذه الدراسة وفقا لتوصيات لجنة الاخلاق المحلية من جامعة فرانكفورت.

1. التثقيف من خلايا K562

  1. الخلايا ثقافة K562 في وسائل الإعلام R10 (RPMI1640 المتوسطة مع الجلوتامين، 1٪ البنسلين / الستربتومايسين، 10٪ الجنين مصل العجل) في مناطق ذات كثافة من 0.5-1 × 10 6 خلايا لكل مل في قارورة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
  2. خلايا الحصاد K562 24 ساعة قبل بدء تجربة جديدة.
    1. إزالة قارورة الثقافة الخلية التي تحتوي على خلايا K562 من الحاضنة. إعادة تعليق الخلايا K562 في وسائل الاعلام والثقافة من قبل pipetting بلطف صعودا وهبوطا.
    2. نقل وسائل الإعلام الثقافة التي تحتوي على الخلايا K562 في أنبوب 15 أو 50 مل و بيليه الخلايا في 400 x ج لمدة 8 دقائق. تجاهل طاف واعادة تعليق الخلايا في 5 مل وسائل الاعلام R10 وتخلط جيدا.
    3. نقل 20 ميكرولتر من محلول خلية في بئر من لوحة 96-U-جيدا. إضافة 20 ميكرولتر التريبان الأزرق ومزيج جيد من قبل pipetting صعودا وهبوطا لمدة 5 مرات على الأقل. ماصة 10 ميكرولتر من الحل في غرفة عد الخلايا وعدد الخلايا.
    4. بيليه الخلايا في 400 x ج لمدة 8 دقائق. إعادة تعليق الخلايا في وسائل الإعلام R10 وضبط تركيز خلية K562 إلى 0.5-1 × 10 6 خلايا لكل مل.
    5. احتضان الخلايا K562 في قارورة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 حتى الاستخدام.

2. عزل الخلايا القاتلة الطبيعية

  1. وفقا لموافقة والمبادئ التوجيهية للجنة الأخلاقيات المحلية، الحصول على الموافقة المسبقة عن خطية من متبرع سليم أو المريض قبل مجموعة من 6-10 مل من EDTA إما أو الدم المحيطي heparinized.
  2. متجر الكواشف لعزل الخلايا القاتلة الطبيعية عند 4 درجات مئوية حتى بداية التجربة ومن ثم استخدامها في درجة حرارة الغرفة (RT) تحت ظروف معقمة. عزل الخلايا القاتلة الطبيعية من الدم المحيطي باستخدام ميكروبيدات المغناطيسية والمغناطيس محددة لعزل الخلايا وفقا لرانه تعليمات الشركة الصانعة.
    1. إعادة قنينة واحدة من الخلايا القاتلة الطبيعية مجفف بالتجميد العزلة السلبية الأجسام المضادة كوكتيل بواسطة pipetting 7.5 مل من المقدمة عازلة و(المدرجة ضمن NK عدة العزلة الخلية) في قارورة. المزيج بلطف pipetting صعودا وهبوطا 3-4 مرات.
      ملاحظة: تأكد من أن التعليق غير متجانسة قبل كل استعمال.
    2. إعداد الحل كوكتيل النهائي عن طريق خلط كميات مناسبة من بيليه تشكيلها من الخطوة 2.2.1 وB العازلة (المدرجة داخل الخلية عدة العزلة NK). لتحديد هذه الكميات، وتحديد حجم عينة الدم كلها في مل من حيث حجم التجارة = 1.0. استخدام 0.25 حجم بيليه المعاد (من الخطوة 2.2.1) و 0.25 حجم B العازلة لمعالجة حجم 1 من الدم الكامل.
    3. نقل الخليط في أنبوب المناسب الذي يحتوي على عينة دم كاملة. لا ماصة صعودا وهبوطا لتجنب فقدان الدم داخل ماصة. بدلا من ذلك، أغلق أنبوب وتحريكه بعناية صعودا وهبوطا حتى السقوفسيون غير متجانسة. لا الدوامة.
    4. وعلاوة على ذلك تجانس العينة باستخدام محور دوار أنبوب لمدة 5 دقائق على RT.
    5. تحت ظروف معقمة، وإزالة الغطاء ووضع أنبوب في فاصل المغناطيسي لمدة 15 دقيقة على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة. تأكد من أن التسميات أنبوب تواجه نحو المؤخر من المغناطيس للسماح للرؤية دون عائق من الخط الفاصل. لا تتحرك المغناطيس خلال الفصل، كما سيتم بالانزعاج هذا الإجراء.
    6. نقل بعناية طاف في أنبوب 15 مل جديدة وملء مع وسائل الإعلام كاملة (CM ووسائل الإعلام للدم خلية، 1٪ البنسلين / الستربتومايسين، 5٪ الإنسان الأمصال). بيليه الخلايا في 400 x ج لمدة 8 دقائق.
      1. اختياري: إذا كان بيليه هو أحمر، اعادة تعليق الخلايا في 1ml من العازلة تحلل كرات الدم الحمراء (على سبيل المثال، 1 مل من الأمونيوم كلوريد البوتاسيوم (ACK) الناشر المخزن المؤقت: 155 ملي NH 4 الكلور؛ 0.1 ملي EDTA و 10 ملي KHCO 3 في 1 لتر من الماء المقطر (DW))، واحتضان لمدة 8 دقائق على RT. بدلا من ذلك، استخدم إيهعدة نضوب ythrocyte.
        ملاحظة: نضع في اعتبارنا، أن استخدام العازلة ACK قد يؤثر سلبا على وظائف الخلايا القاتلة الطبيعية (14).
      2. بسرعة تمييع عازلة ACK بإضافة 1 مل على الأقل من سم إلى وقف تحلل وأجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 8 دقائق لخلايا بيليه.
    7. إعادة تعليق بيليه خلية في 1 مل سم والمضي قدما في العد. نقل 20 ميكرولتر من محلول الخلايا القاتلة الطبيعية على طبق من ذهب 96-U-جيدا. إضافة 20 ميكرولتر من الميثيلين الأزرق إلى كل بئر ومزيج جيد من قبل pipetting صعودا وهبوطا لمدة 5 مرات على الأقل. ماصة 10 ميكرولتر من الحل في غرفة عد الخلايا وعدد الخلايا. بدلا من ذلك، استخدم 30 ميكرولتر من تعليق خلية مخفف لحساب مع عداد الخلايا المتاحة تجاريا.
    8. ضبط الخلايا إلى تركيز لا يقل عن 2 × 10 4 الخلايا القاتلة الطبيعية لكل 100 سم ميكرولتر.
    9. إجراء تلوين الأجسام المضادة سطح معزول السكان الخلايا القاتلة الطبيعية للتحقق من نقاء باستخدام قياس التدفق الخلوي.
      1. العلاقات العامةepare حل مزيج الرئيسي عن طريق خلط كميات من الأجسام المضادة وأشار حسب الجدول 1.
      2. إعادة تعليق الخلايا في 88.5 غسل العازلة ميكرولتر (WB؛ 0.5٪ زلال المصل البقري (BSA)، 0.1٪ نان 3 في برنامج تلفزيوني) وإضافة 11.5 ميكرولتر من الحل مزيج الرئيسي. احتضان الخلايا لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية في الظلام.
        تحذير: نان 3 غير سامة والمغير. التعامل معها وفقا لذلك إلى المقابلة ورقة بيانات سلامة المواد (MSDS).
      3. إضافة 1 مل من البنك الدولي وبيليه الخلايا في 400 x ج لمدة 4 دقائق.
      4. إعادة تعليق الخلايا في عازلة تلطيخ 300 ميكرولتر بالإضافة إلى دابي. الحصول على الخلايا باستخدام قياس التدفق الخلوي.
        ملاحظة: المضي قدما مع التجربة فقط إذا كانت الخلية نقاء NK هو لا يقل عن 80٪ من مجموع الخلايا الليمفاوية على قيد الحياة.

3. حصاد خلايا K562 لNK تحفيز الخلية

  1. إزالة قارورة الثقافة الخلية التي تحتوي على خلايا K562 (من الخطوة 1.2) من ال البريد الحاضنة. إعادة تعليق الخلايا K562 في وسائل الاعلام والثقافة من قبل pipetting بلطف صعودا وهبوطا.
  2. نقل وسائل الإعلام ثقافة كله في أنبوب 15 أو 50 مل و بيليه الخلايا في 400 x ج لمدة 8 دقائق. تجاهل طاف واعادة تعليق الخلايا في 5 مخزنة المالحة الفوسفات مل (PBS) وتخلط جيدا.
  3. نقل 20 ميكرولتر من محلول خلية في بئر من لوحة 96-U-جيدا. إضافة 20 ميكرولتر الأزرق التريبان ومزيج جيد من قبل pipetting صعودا وهبوطا لمدة 5 مرات على الأقل. ماصة 10 ميكرولتر من الحل في غرفة عد الخلايا وعدد الخلايا. بدلا من ذلك استخدام 30 ميكرولتر من تعليق خلية مخفف لحساب مع عداد الخلايا المتاحة تجاريا.
  4. بيليه الخلايا في 400 x ج لمدة 8 دقائق. اعادة تعليق الخلايا في CM بتركيز لا يقل عن 2 × 10 4 K562 خلية لكل 100 ميكرولتر وسائل الإعلام.
    ملاحظة: استخدم نفس K562 وتركيز الخلايا القاتلة الطبيعية من أجل احتضان كل من والمستجيب: الهدف (E: T) نسبة 1: 1 في وقت لاحق.
"> 4. تحفيز الخلايا القاتلة الطبيعية مع ورم الخلايا K562 الخط والسيتوكينات

  1. المزيج بلطف الخلايا بواسطة pipetting لهم صعودا وهبوطا لمدة 5 مرات على الأقل. توزيع 100 ميكرولتر جيدا / الحل الخلايا القاتلة الطبيعية في الآبار المطلوبة من لوحة 96-V جيدا.
    1. استخدام اثنين على الأقل من الآبار لكل الجهات المانحة، واحد مع واحد دون التحفيز (على سبيل المثال، K562 الخلايا السرطانية والسيتوكينات). كلما كان ذلك ممكنا، إجراء تجربة على الأقل في مكررة وإضافة عنصر تحكم إيجابية (على سبيل المثال، phorbol 12 ميريستيت 13-خلات (سلطة النقد الفلسطينية) وionomycin، التركيز النهائي: 50 نانومتر سلطة النقد الفلسطينية، 1 ميكرومتر ionomycin لكل بئر). إعداد تدفق تحديث الخلوي التعويضات للتاريخ من التجربة.
      ملاحظة: عاير الأجسام المضادة الاستخدام السابق (انظر المناقشة).
  2. إيقاف ضوء وإضافة إلى CD107a مكافحة الأجسام المضادة (2 ميكرولتر، التركيز النهائي: 1: 100) إلى كل بئر مع الخلايا القاتلة الطبيعية في لوحة 96-V جيدا.
  3. المزيج بلطف الخلايا K562 من قبل pipetting لهم صعودا وهبوطا لفيأقل 5 مرات.
    1. من الآبار التي تحتوي على الخلايا القاتلة الطبيعية / مكافحة CD107a-حل الأجسام المضادة، وتحديد تلك التي خططت لتحفيز الخلايا مع K562. إضافة 100 ميكرولتر / جيد من الحل خلية K562 في هذه الآبار. مزيج بعناية من قبل pipetting صعودا وهبوطا لمدة 5 مرات على الأقل.
    2. إضافة انترلوكين 2 (IL-2، تركيز النهائي 100 U / مل)، وانترلوكين 15 (IL-15؛ النهائي تركيز 10 نانوغرام / مل) إلى الآبار التي تحتوي K562 خلايا والخلايا القاتلة الطبيعية / مكافحة CD107a حل الأجسام المضادة.
      1. اختياري: اختبار تأثير إما خلايا K562 أو السيتوكينات وحده على الخلايا القاتلة الطبيعية وزعت على فك الورم الناجم مقابل وظائف الخلايا القاتلة الطبيعية التي يسببها خلوى.
    3. تحديد الآبار على لوحة 96-V جيدا المخطط الضوابط سلبية دون التحفيز. إضافة 100 ميكرولتر / جيد سم إلى هذه الآبار التي تحتوي فقط على الخلايا القاتلة الطبيعية / مكافحة CD107a حل الأجسام المضادة. مزيج بعناية من قبل pipetting صعودا وهبوطا لمدة 5 مرات على الأقل.
      1. اختياري: للتحكم إيجابية، إضافة 100 μ؛ ل CM تحتوي على سلطة النقد الفلسطينية وionomycin (تركيز النهائي: 50 نانومتر سلطة النقد الفلسطينية، 1 ميكرومتر ionomycin لكل بئر) إلى بئر مع الخلايا القاتلة الطبيعية / مكافحة CD107a حل الأجسام المضادة.
  4. احتضان الخلايا لمدة 3 ساعات في الظلام عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
  5. يعد حل المانع النقل البروتين (على سبيل المثال، brefeldin وو / أو مونينسين) في سم. بعد 1 ساعة من الحضانة، إضافة حل كل بئر من لوحة 96-V جيدا مع ضوء مغلقا (تركيز النهائي: 0.5-1μM brefeldin ألف و2-3 مونينسين ميكرومتر). مزيج بعناية من قبل pipetting صعودا وهبوطا لمدة 5 مرات على الأقل. تستمر حضانة لساعة المتبقية 2.

5. السطح وبين الخلايا تلطيخ

  1. بعد فترة الحضانة 3 ساعات، مزيج من الخلايا داخل الآبار من لوحة 96-V جيدا بعناية من قبل pipetting صعودا وهبوطا لمدة 5 مرات على الأقل ونقلها إلى التدفق الخلوي الأنابيب. إضافة 1 مل / أنبوب من البنك الدولي. بيليه الخلايا في 400 x ج لمدة 4 دقائق.
    1. اختياري: قبل الطرد المركزي شطف الآبار مع 100 ميكرولتر / جيد في برنامج تلفزيوني، من أجل تحسين الانتعاش الخلية، من قبل pipetting صعودا وهبوطا لمدة 5 مرات على الأقل قبل نقل خلايا في أنبوب FACS منها.
  2. تجاهل طاف والاستمرار في تلطيخ السطح.
  3. تشمل صبغ الأمينات رد الفعل الفلورسنت التي هي غير نفيذ للعيش الخلايا مع حد أقصى للانبعاثات من 423 نانومتر كما يمكن حلها علامة الخلية الميتة (DCM). أداء تلطيخ قبل (انظر أدناه) أو بالتوازي مع تلطيخ السطح الأضداد تبعا لنوع من DCM المستخدمة.
    1. اعادة تعليق الخلايا في 99 ميكرولتر / أنبوب برنامج تلفزيوني وإضافة 1 ميكرولتر / أنبوب من قابل للتثبيت • قرار مجلس الوزراء (تركيز النهائي: 1: 100). مزيج خلايا جيدا باستخدام دوامة واحتضان لهم لمدة 15 دقيقة في RT في الظلام.
    2. يعد حل مزيج الرئيسي عن طريق خلط معا الأجسام المضادة "سطح" المدرجة في الجدول 2 (انظر تلطيخ العمود خطوة باللون الأزرق). استخدام فيdicated مجلدات / أنبوب وضرب لهم مع عدد من التدفق الخلوي أنابيب لتكون ملطخة.
    3. بعد مرور فترة الحضانة اتخاذ التدفق الخلوي أنابيب مع الخلايا وإضافة 1 مل / أنبوب من البنك الدولي. بيليه الخلايا في 400 x ج لمدة 4 دقائق.
    4. تجاهل طاف، اعادة تعليق الخلايا في 84 ميكرولتر / أنبوب من البنك الدولي وإضافة 16 ميكرولتر / أنبوب من الحل مزيج الرئيسي. مزيج خلايا جيدا باستخدام دوامة. احتضان الخلايا لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية في الظلام.
    5. بعد 20 دقيقة إضافة 1 مل / أنبوب البنك الدولي والخلايا بيليه في 400 x ج لمدة 4 دقائق.
  4. تجاهل طاف واعادة تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر / أنبوب الحل تثبيت البارد (على سبيل المثال، 2٪ (النهائي) لامتصاص العرق أو الفورمالديهايد). مزيج خلايا جيدا باستخدام دوامة. احتضان الخلايا لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية في الظلام.
    1. وصمة عار على الخلايا للالسيتوكينات داخل الخلايا / كيموكينات بعد هذه الخطوة أو تخزينها بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في الضفة الغربية.
      ملاحظة: بعد مرور فترة الحضانة بين عشية وضحاها، قد تحدث انتعاشا خلية أقل.
  5. غسل الخلايا في 1 مل / أنبوب WB في 400 x ج لمدة 4 دقائق، والمضي قدما في خطوة permeabilization.
  6. إعداد العازلة permeabilization (PB) (على سبيل المثال، 0.2٪ سابونين، 1٪ حل جيش صرب البوسنة في برنامج تلفزيوني).
  7. غسل الخلايا مرتين في 1 مل / أنبوب PB في 400 x ج لمدة 4 دقائق. تواصل مع تلطيخ الخلايا.
    تحذير: سابونين يحتمل أن تكون مزعجة. التعامل معها وفقا لذلك إلى المقابلة ورقة بيانات سلامة المواد (MSDS).
  8. يعد حل مزيج الرئيسي باستخدام أشار "الخلايا" أحجام الأجسام المضادة في الجدول 2 (مظللة باللون الأخضر). مضاعفة هذه الكميات مع عدد من الأنابيب لتكون ملطخة.
    1. إعادة تعليق الخلايا في 90 ميكرولتر / أنبوب PB وتطبيق 10 ميكرولتر / أنبوب من الحل مزيج الرئيسي الأجسام المضادة. تخلط جيدا باستخدام الدوامة واحتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية في الظلام.
  9. غسل الخلايا مرتين في 1 مل / أنبوب PB في 400 x ج لمدة 4 دقائق.
  10. تجاهل طاف واعادة تعليق الخلايا في 400 ميكرولتر / أنبوب PB. مزيج خلايا جيدا باستخدام دوامة. وضع الخلايا على الجليد في الظلام حتى قياس.

6. التدفق الخلوي التعويض واكتساب

  1. حدد قنوات لfluorochromes مختلفة (انظر الجدول 2) داخل التدفق الخلوي اقتناء البرمجيات في مجلد إعداد المعلمة. بالإضافة إلى ذلك، واختيار قنوات FSC-A و-H فضلا عن SSC-A و-H.
  2. تحميل مصفوفة التعويضات التي تم إنشاؤها للمعلمات المختارة في ملف الاستحواذ.
    1. إنشاء مصفوفة التعويض باستخدام الخلايا القاتلة الطبيعية المعزولة من الخطوة 2.2.8 عن طريق أداء وصمة عار لون واحد لكل تألقي المستخدمة (انظر الجدول 2). استخدام بروتوكول تلطيخ السطح هو موضح في الخطوات 5،1-5،4. تشمل عنصر تحكم غير ملوثين (بدون أي الأجسام المضادة) وكذلك الضوابط نمط إسوي و / أو مضان ناقص الضوابط واحد (FMO).
      ملاحظة: كبديل لتعويض خلية القاعدة، استخدام الخرز والضوابط تعويض مفتش ملزم.
    2. وضع كل أنبوب للعينات وصمة عار واحدة وعينة من دون الأجسام المضادة في ميناء حقن العينة (SIP). انقر على زر "السجل" في برنامج الحصول على التدفق الخلوي والحصول على عدد الخلايا لا يقل عن 5 × 10 3 الخلايا القاتلة الطبيعية لكل عينة.
    3. استخدام التطبيق تعويض حساب البرنامج الحصول على الخلوي لإنشاء مصفوفة التعويض.
  3. إنشاء مؤامرات نقطة لتحديد السكان الخلايا القاتلة الطبيعية.
    1. تحديد الخلايا واحدة باستخدام FSC-A / FSC-H وSSC-A / SSC-H المؤامرات نقطة. انقر على زر "بوابة المضلع". رسم بوابة حول الخلايا، والتي لها نمط التوزيع الخطي في كل المؤامرات نقطة. انقر نقرا مزدوجا على أبواب فتح نقطة مؤامرة جديدة.
    2. اختيار FSC-A / SSC-A مؤامرة نقطة للتعرف على الخلايا اللمفاوية/ NK السكان الخلية (انظر الشكل 1). رسم مضلع بوابة حوله وانقر نقرا مزدوجا على البوابة.
  4. وضع كل أنبوب عينة من NK تحفيز الخلايا فحص في SIP. انقر على زر "سجل" والحصول على عدد الخلايا لا يقل عن 5 × 10 3 الخلايا القاتلة الطبيعية لكل عينة.

7. تحليل والإحصاء

  1. فتح التدفق الخلوي برنامج برامج التحليل. انقر على زر تحميل عينة لفتح العينة الضابطة unstimulated.
  2. إنشاء نظام المحاصرة لمجموعات سكانية فرعية NK مختلفة من الخلايا (انظر الشكل 1).
    1. انقر على زر نقطة مؤامرة لخلق FSC-A / SSC-A المؤامرة. انقر على زر بوابة المستطيل ورسم بوابة المستطيل على كل الأحداث مع FSC-A قيمة> 5 × 10 4 إلى استبعاد الحطام. فتح البوابة عن طريق النقر المزدوج على البوابة.
    2. اختيار مرة أخرى / SSC-A المعلمات FSC-A ضمن مؤامرة نقطة جديدة وانقر على زر بوابة المضلع. دالخام بوابة المضلع حول السكان لمفاوية (انظر الشكل 1). افتح البوابة.
    3. حدد SSC-A المعلمة / SSC-H لمؤامرة نقطة جديدة ورسم بوابة المضلع حول كل الخلايا وحيدة. الخلايا واحد يبرهن على وجود توزيع خطي عبر المعلمات FSC-A / FSC-H وSSC-A / SSC-H (انظر الشكل 1). فتح البوابة عن طريق النقر المزدوج على ذلك.
    4. كرر الخطوة 7.2.3 باستخدام المعلمات FSC-A / FSC-H هذا الوقت.
    5. استخدام CD45 المعلمة وتفريغ قناة (CD3، CD14، CD19، DCM) لاستبعاد الخلايا الميتة. رسم باب مستطيل حول كل CD45 إيجابية وتفريغ الخلايا السلبية القناة. فتح البوابة عن طريق النقر المزدوج على البوابة.
    6. تحديد كامل السكان الخلايا القاتلة الطبيعية باستخدام CD56 وتفريغ المعلمات قناة. إنشاء بوابة مستطيل حول CD56 إيجابية وتفريغ توجيه الخلايا السلبية. فتح البوابة عن طريق النقر المزدوج على ذلك.
    7. رسم باب مستطيل حول كل المجموعات الفرعية الثلاث الخلايا القاتلة الطبيعية ضمن CD56 / CD16 نقطة مؤامرة. بيئة تطوير متكاملةntify مجموعات فرعية مختلفة كما CD56 + CD16 - CD56 + CD16 + ومجموعات فرعية خلية CD56 + CD16 + NK.
  3. تحليل NK وظائف الخليوي لكل المجموعة الثانوية خلية فردية NK.
    1. انقر على واحدة من NK بوابات خلية فرعية ثلاثة لفتحه. إنشاء ثلاث قطع نقطة مختلفة لCD56 / CD107a، CD56 / IFN-γ وCD56 / MIP-1β.
    2. رسم بوابة المستطيل لCD56 الخلايا الإيجابية، التي هي ايجابية فضلا عن CD107a، IFN-γ أو MIP-1β على التوالي (انظر الشكل 1).
    3. كرر الخطوة 7.3.1-7.3.2 لكل فرعية الخلايا القاتلة الطبيعية المتبقية.
  4. كرر الخطوة 7.2 و 7.3 لجميع العينات حفز. احفظ كل القيم الإحصائية من كل عينة على حدة عن طريق النقر على زر المصدرة للإحصاء ضمن برامج التحليل.
  5. فتح الملفات التي تحتوي على القيم الإحصائية العينات الفردية لتحليل وظائف الخلايا القاتلة الطبيعية. حدد قيم الخلايا القاتلة الطبيعية الفرديةفرعية (على سبيل المثال، CD56 + CD16 - الخلايا القاتلة الطبيعية) عن طريق نسخها إلى ملف آخر.
    1. طرح نسبة من CD107a الخلايا القاتلة الطبيعية إيجابي، والتي لم يتم التعامل معها حافزا، من نسبة CD107a الخلايا القاتلة الطبيعية الإيجابية التي تم التعامل مع حافز.
      ملاحظة: استخدم نتيجة للتدليل على قدرة تحبب هذا خاصة خلية فرعية NK ردا على التحفيز.
    2. كرر الخطوة 7.5.1 لIFN-γ والخلايا القاتلة الطبيعية الإيجابية MIP-1ß للتدليل على خلوى وchemokine الإنتاج استجابة لحافز.
    3. كرر الخطوة 7.5.1-7.5.2 لكل فرعية الخلايا القاتلة الطبيعية المتبقية لتقييم قدرة تحبب وإنتاج السيتوكينات / chemokine على التحفيز.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويتضح استراتيجية النابضة لتحليل تحبب، خلوى وchemokine إنتاج كامل السكان الخلايا القاتلة الطبيعية وثلاث مجموعات فرعية الخلايا القاتلة الطبيعية المختلفة في الشكل 1.

موضحة نتائج ممثلة من الجهات المانحة صحي واحد في الشكل 2. الخلايا القاتلة الطبيعية دون أي حافز أنتجت لا IFN-γ ولا MIP-1β ولا تعبر عن CD107a على سطحها (الشكل 2A). في المقابل، الخلايا القاتلة الطبيعية مع حفز الخلايا السرطانية والسيتوكينات أنتجت كميات كبيرة من الخلايا الإنترفيرون γ وMIP-1β. وعلاوة على ذلك، أكثر من 20٪ منهم degranulated على تفاعل الخلايا السرطانية أشار بالإعراب عن CD107a على سطحها (الشكل 2C). واستخدمت سلطة النقد الفلسطينية والتحفيز Ionomycin كعنصر تحكم (الشكل 2B).

ه 1 "SRC =" / ملفات / ftp_upload / 54615 / 54615fig1.jpg "/>
يتم رسم المحاصرة الاستراتيجية اللاحقة بوابات: الشكل 1. أولا، يتم استبعاد الحطام في FSC-A / SSC-A المؤامرة. ثم يتم تحديد الخلايا الليمفاوية، وتستبعد الحلل باستخدام قطعتي مع SSC-A / SSC-H وFSC-A / FSC-H. بعد ذلك، يتم تعيين بوابة بما في ذلك جميع CD45 + الخلايا واستبعاد كل شيء، CD3 +، CD14 + CD19 + والخلايا الميتة التي كتبها بالتآمر CD45 قناة / تفريغ. بعد ذلك، يتم تحديد الخلايا القاتلة الطبيعية التي تبوب على خلايا CD56 +. مؤامرة مع CD56 / CD16 يمكن استخدامها لتحديد أهم مجموعات فرعية الخلايا القاتلة الطبيعية. وأخيرا، ضمن كله السكان الخلايا القاتلة الطبيعية، ويتم تحديد علامات الوظيفية التي بالتآمر CD56 مقابل CD107a، IFN-γ وMIP-1β، على التوالي. ويمكن أن يتم هذا فضلا عن جميع أنواع مختلفة من مجموعات فرعية الخلايا القاتلة الطبيعية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الصورة = "jove_content" FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1"> الشكل 2
الشكل 2: ممثل النتائج من واحد صحي الخلية المانحة NK باستخدام استراتيجية النابضة هو موضح في الشكل 1، علامات الوظيفية الخلايا القاتلة الطبيعية مثل CD107a (للتحبب)، ويمكن تحديد IFN-γ وMIP-1β. العمود الأيسر (A) يبين النتائج باستخدام الخلايا القاتلة الطبيعية في غياب التحفيز. العمود الأوسط (ب) يوضح النتائج في وجود إيجابي سيطرة سلطة النقد الفلسطينية / ionomycin. العمود الأيمن (C) ويعرض النتائج للخلايا NK حفز مع خط الخلايا السرطانية K562 وفي وجود السيتوكينات ايل 2 (100 U / مل) و IL-15 (10 نانوغرام / مل). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: الأجسام المضادة لفحص نقاء.

الجدول 2
الجدول 2: الأجسام المضادة لتلطيخ من خارج وداخل الخلايا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وصف الأسلوب هو نهج سهل وسريع وموثوق بها لدراسة وظائف الخلايا القاتلة الطبيعية من عينات دم كاملة من المتبرعين الأصحاء أو المرضى. هذا الأسلوب يوفر ميزة كبيرة لتنقية الخلايا القاتلة الطبيعية مباشرة من الدم الكامل، وتجنب الطرد المركزي التدرج الكثافة، وهو إلزامي لكثير من أساليب تنقية أخرى 15 تستغرق وقتا طويلا. وعلاوة على ذلك، فإنه يتطلب حجم العينة أصغر بالمقارنة مع الطرق "الكلاسيكية" الخلايا القاتلة الطبيعية العزل / تخصيب اليورانيوم، مما يجعله بديلا مناسبا لعينات من المرضى من الأطفال و / أو في مأمن من نقص. هذا البروتوكول يمكن استخدامها للحصول على القيم القاعدية من NK ظائف الخلية السابقين فيفو، لكنه أيضا يسمح للثقافة NK أخرى، والتوسع، ويجري في هذه الطريقة مكملة مع غيرها من الأساليب التي سبق وصفها 8. ومع ذلك يجب أن تؤخذ بعين الاعتبار بعض الخطوات الحاسمة. منذ يستند الفحص على الموارد الخارجة والخلايا تلوين الأجسام المضادة، من الأهمية بمكان لتحديد الأمثل التعليم الجامعيrking تركيز لكل الأجسام المضادة لأول مرة. خاصة بالنسبة للتلطيخ الخلايا، وإجراء تقييم دقيق للالأجسام المضادة المستخدمة ينصح بشدة. نهج جيد هو لاختبار سلسلة التخفيف من الأجسام المضادة المستخدمة (على سبيل المثال، 1: 100 إلى 1: 12.5) في تعليق خلية وحفز مع أو بدون سلطة النقد الفلسطينية / ionomycin. بعد ذلك يتم احتساب نسبة من الأحداث الإيجابية بين عينات حفز والامم المتحدة وحفز وتآمر. التخفيف الضد مع أعلى نسبة إيجابية تغيير أضعاف (أفضل نسبة إشارة إلى الخلفية) وينبغي أن تستخدم لمزيد من التجارب 16. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام ضوابط مثل الضوابط isotype- وFMO يثبت أنه أساسي وخاصة لتلطيخ الخلايا من أجل بوابة بشكل صحيح على السكان الخلية إيجابي.

ومع ذلك، هناك بعض القيود الهامة من طريقة وصفها. CD107a التعبير هو علامة تحبب ويشير بالتالي بشكل غير مباشر فقط NK الخلايا السمية الخلوية. NK الخلايا السمية الخلوية لالثانية قدرة تحبب يمكن أن تكون مختلفة. يصل تنظيم مسار الالتهام الذاتي في نتائج الخلايا السرطانية في تدهور يفرز جرانزيم ب ويقلل من موت الخلايا على NK خلية التفاعل 17. لذلك على DCM إضافية (على سبيل المثال، المشقوق كاسباس 3) يمكن أن تضاف إلى لوحة تلطيخ من أجل رصد أحداث موت الخلايا داخل الخلايا المستهدفة 18. بالإضافة إلى ذلك، يتأثر NK السمية لخلايا بمقدار البروتينات السامة للخلايا داخل حبيبات الخاصة بهم (على سبيل المثال، بيرفورين، جرانزيم ب)، والتي يمكن قياسها عن طريق تلطيخ الخلايا 19،20.

وعلاوة على ذلك، هناك احتمالات مختلفة لتعديل البروتوكول. بدلا من الخلايا القاتلة الطبيعية المعزولة، الطرفية خلايا الدم وحيدات النوى (PBMCs) يمكن استخدامها. على الرغم من المرء أن يكون على علم بأن مطلق عدد الخلايا القاتلة الطبيعية في السكان PBMC يختلف بين مختلف الجهات المانحة وحتى بين عينات مستمدة من نفس الجهات المانحة في نقاط زمنية مختلفة. NK degranul خليةأوجه تعتمد بشكل كبير على E: نسبة T. من أجل مقارنة وظائف الخلايا القاتلة الطبيعية بين مختلف الجهات المانحة أو عند نقاط زمنية مختلفة، ينبغي أن تستخدم المطلق عدد الخلايا القاتلة الطبيعية في السكان PBMC لإقامة E ثابت: نسبة T في جميع التجارب. إذا تم رصدها وظائف الخلايا القاتلة الطبيعية عند نقاط زمنية مختلفة داخل نفس الجهات المانحة، PBMCs يمكن تجميدها ويمكن أن يتم التحليل في وقت واحد لجميع نقاط زمنية مختلفة من أجل الحد من الاختلافات بين التجريبية 11.

منذ تلطيخ لوحات مع ما يصل إلى 18 ألوان ممكنة، ويمكن تمديد تحليل وظائف الخلايا القاتلة الطبيعية إلى تفصيل أكبر من ذلك بكثير. استخدام علامات سطح إضافية بما في ذلك CD57، NKG2A والخلايا القاتلة مثل المناعي مستقبلات (كيرس)، ويمكن تحديد المزيد من مجموعات فرعية الخلايا القاتلة الطبيعية. الخلايا القاتلة الطبيعية المتعلمين التعبير عن واحد على الأقل الذاتي كيريباتي degranulate أقوى على التفاعل مع الخلايا K562 من الخلايا القاتلة الطبيعية غير المتعلمات. في المقابل، CD57 أكثر تمايزا + CD56 + - خلايا CD56 + NK 21. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن معالجة علامات أخرى من وظيفة الخلايا القاتلة الطبيعية. LFA-1 هو جزيء مهم لNK التصاق الخلية، ويعبر في التشكل العلني على تنشيط الخلايا القاتلة الطبيعية. هذا ما يسمى ب "إشارة من الداخل إلى الخارج" هي الأولى الخلايا القاتلة الطبيعية تنشيط علامة 22.

وأخيرا، فإن المحفزات لاختبار وظائف الخلايا القاتلة الطبيعية يمكن تعديلها كذلك. في تجربتنا المعزولة حديثا الخلايا القاتلة الطبيعية فقط degranulate سيئة على K562 تفاعل الخلايا إذا تم إضافة أي السيتوكينات. استخدام PBMCs المعزولة حديثا دون مزيد من إضافة خلوى الالتفاف على هذه المشكلة بسبب تأثير الخلايا المارة. وعلاوة على ذلك، إنتاج السيتوكينات، خصوصا IFN-γ وTNF-α، يمكن أن تبدأ على IL-12 و IL-18 التحفيز 23. إنتاج الإنترفيرون γ ضمن مجموعات فرعية الخلايا القاتلة الطبيعية قد تختلف dependinز على التحفيز المستخدمة (cytokine- مقابل التحفيز التي يسببها الهدف) 24. بالإضافة إلى ذلك، بدلا من استخدام K562 الخلايا كما الخلايا المستهدفة، الخلايا السرطانية الأولية المستمدة من مرضى الأورام يمكن أن تستخدم من أجل اختبار وظائف الخلايا القاتلة الطبيعية ضد الخلايا السرطانية ذاتي قبل أو أثناء العلاج تنظيم الجهاز المناعي، (على سبيل المثال، وحيدة النسيلة العلاج الأضداد أو المناعية تغييري المخدرات (IMiDs)).

خلال السنوات القليلة الماضية، مجال العلاج المناعي قد تتطور بسرعة بموافقة السريرية للمثبطات المناعة نقطة تفتيش (على سبيل المثال، ipilumumab، nivolumumab، pembrolizumab) 25 و تجارب ناجحة باستخدام المعدلة وراثيا مستقبلات المستضد خيالية (CAR) -expressing خلايا T وكذلك كخلايا CAR-NK (إعادة النظر في المرجع 26)، لعلاج مرضى الأورام الدموية 27. لذلك NK المناعي خلية القاعدة يزداد على نحو متزايد إلى التركيز. وقد أضداد CD20 نجاحا كبيرا في محطات الصرف الصحيالإقليم الشمالي من الأورام اللمفاوية الخبيثة في العقدين الماضيين 28. الغالبية العظمى من الخلايا القاتلة الطبيعية تعبر عن تقارب منخفضة التيسير CD16 مستقبلات تمكين الخلايا على التعرف وقتل الخلايا المستهدفة المسمى الأجسام المضادة (التي تعتمد على الأجسام المضادة السمسة الخلوية - ADCC). قدرة الأجسام المضادة لتحريك وظائف الخلايا القاتلة الطبيعية يمكن اختبارها في المختبر باستخدام بروتوكول صفها 29. Terszowski وآخرون. ADCC تحليل الخلايا القاتلة الطبيعية ضد خط B الخلايا lymphoblastoid باستخدام مختلف وافق سريريا أضداد CD20. في حين ADCC يسببها على العلاج ريتوكسيماب (أولا سريريا مكافحة CD20 الأجسام المضادة 30) تأثر سلبا كيريباتي التفاعل / HLA، لم يكن لوحظ هذا التأثير عند استخدام أوبينوتوزوماب (رواية glycoengineered النوع الثاني CD20 الأجسام المضادة وحيدة النسيلة) 31، 32. وعلاوة على ذلك، تتأثر وظائف الخلايا القاتلة الطبيعية من قبل مختلف الأدوية المضادة للأورام جديدة مثل IMiD يناليدوميد 33 و مختلفة التيروزين kinasمثبطات ه (TKI) 34. حاليا يتم اختبار الخلايا القاتلة الطبيعية مثبطات تفتيش محددة في التجارب السريرية. ومن الأمثلة على ذلك استخدام الألغام المضادة للكيريباتي 35،36 أو أضداد NKG2A (NCT02331875) وكذلك تفعيل منبهات مثل-CD137 مكافحة الأجسام المضادة (NCT01775631، NCT02110082).

الأهم من ذلك، وقد تم تنفيذ بالتبني نقل الخلايا القاتلة الطبيعية في مجموعة متنوعة من الأمراض الخبيثة مختلفة مع الآثار السريرية واعدة 37. وذلك بهدف اختيار أفضل الجهات المانحة، قد يتم اختبار وظائف الخلايا القاتلة الطبيعية ضد ورم المريض في المختبر باستخدام عينات دم من المتبرعين المحتملين الخلايا القاتلة الطبيعية.

وباختصار، فقد تم تصميم بروتوكول صفها لتحليل مختلف وظائف الخلايا القاتلة الطبيعية من المتبرعين الأصحاء أو المرضى. يمكن رصد تلك الوظائف في مختلف مجموعات فرعية الخلايا القاتلة الطبيعية على مختلف المحفزات في نقطة زمنية محددة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 + glutamine Invitrogen 6187-044
penicilin/streptomycin Invitrogen 15140-122
BD Falcon Round Bottom Tube BD 352008
fetal calf serum Invitrogen 10270-106 heat inactivated before use
T-flask Greiner Bio-One 690195
K562 tumor cell line DSMZ GmbH ACC 10
ammonium-chloride-potassium (ACK) lysis buffer made in house / components are listed in the text
Distilled water: Ampuwa Spüllösung 1,000 ml Plastipur Fresenius Kabi 1088813
Megafuge 40R Centrifuge Heraeus /
EDTA blood collector tubes Sarstedt 386453 S-Monovette 7.5 ml, K3EDTA
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Life Technologies 15575-020
Hematopoietic media (XVIVO) Lonza Group Ltd BE04-743Q
human serum DRK Blutspendedienst, Frankfurt/M  / healthy donors with blood type AB; heat inactivated before use
Neubauer-improved counting chamber, bright line Marienfeld superior/ LO-Laboroptik Ltd. 0640030/ 1110000
trypan blue solution (0.4%) Invitrogen 15250-061
3% acetic acid with methylene blue Stemcell Technologies  07060
Corning 96 Well Clear V-Bottom TC-treated Microplates Corning  3894
Falcon 96 Well Round Bottom Not Treated Microplates Corning  351177
DPBS (Ca2+- and Mg2+-free) Gibco Invitrogen 14190-169
BSA Sigma Aldrich A2153-100G
NaN3 Sigma Aldrich 08591-1ML-F
phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)  Merck 524400-1MG
ionomycin  PromoKine PK-CA577-1566-5
interleukin 15 (IL-15) PeproTech 200-15
Proleukin S (IL-2)  Novartis Pharma 730523
Golgi Stop, Protein Transport Inhibitor (containing Monensin) BD Biosciences 554724 This product can be used in combination or instead of Golgi Plug. The best combination for the wished experimental setting has to be tested.
Golgi Plug, Protein Transport Inhibitor (containing Brefeldin A) BD Biosciences 555029
paraformaldehyde AppliChem UN2209
saponin Sigma Aldrich 47036
flow cytometer: Canto10C BD Biosciences /
FlowJo TreeStar Inc. /
Graph Pad Graph Pad Inc. /
MACSxpress Separator Miltenyi Biotec  130-098-308
MACSxpress NK isolation kit Miltenyi Biotec  130-098-185
MACSxpress Erythrocyte Depletion Kit, human Miltenyi Biotec  130-098-196
MACSmix Tube Rotator  Miltenyi Biotec  130-090-753
anti-human CD3 APC Biolegend 300412
anti-human CD3 V450 BD Biosciences 560366
anti-human CD14 PerCP Miltenyi Biotec  130-094-969
anti-human CD14 V450 BD Biosciences 560349
anti-human CD16 PE Biolegend 302008
anti-human CD16 PerCP Biolegend 302029
anti-human CD19 PE-Cy7 Biolegend 302216
anti-human CD19 V450 BD Biosciences 560353
anti-human CD45 BV510 BD Biosciences 563204
anti-human CD56 FITC Biolegend 345811
anti-human CD107a PE Biolegend 328608
anti-human IFN-γ AF-647 BD Biosciences 557729
anti-human MIP-1β APC-H7 BD Biosciences 561280
DAPI Biolegend 422801
Zombie Violet Fixable Viability Kit Biolegend 423113 fixable dead cell marker

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Watzl, C. How to trigger a killer: modulation of natural killer cell reactivity on many levels. Adv Immunol. 124, 137-170 (2014).
  2. Khaznadar, Z., et al. Defective NK Cells in Acute Myeloid Leukemia Patients at Diagnosis Are Associated with Blast Transcriptional Signatures of Immune Evasion. J Immunol. 195 (6), 2580-2590 (2015).
  3. Pical-Izard, C., et al. Reconstitution of natural killer cells in HLA-matched HSCT after reduced-intensity conditioning: impact on clinical outcome. Biol Blood Marrow Transplant. 21 (3), 429-439 (2015).
  4. Ahlenstiel, G., et al. Early changes in natural killer cell function indicate virologic response to interferon therapy for hepatitis C. Gastroenterology. 141 (4), 1231-1239 (2011).
  5. Porrata, L. F., et al. Early lymphocyte recovery predicts superior survival after autologous stem cell transplantation in non-Hodgkin lymphoma: a prospective study. Biol Blood Marrow Transplant. 14 (7), 807-816 (2008).
  6. Silva, I. P., et al. Reversal of NK-cell exhaustion in advanced melanoma by Tim-3 blockade. Cancer Immunol Res. 2 (5), 410-422 (2014).
  7. Kiessling, R., Klein, E., Wigzell, H. "Natural" killer cells in the mouse. I. Cytotoxic cells with specificity for mouse Moloney leukemia cells. Specificity and distribution according to genotype. Eur J Immunol. 5 (2), 112-117 (1975).
  8. Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells. J Vis Exp. (48), (2011).
  9. Mariani, E., et al. Chemokine production by natural killer cells from nonagenarians. Eur J Immunol. 32 (6), 1524-1529 (2002).
  10. Reefman, E., et al. Cytokine secretion is distinct from secretion of cytotoxic granules in NK cells. J Immunol. 184 (9), 4852-4862 (2010).
  11. Jacobs, B., et al. NK Cell Subgroups, Phenotype, and Functions After Autologous Stem Cell Transplantation. Front. Immunol. 6, 583 (2015).
  12. Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. J Immunol Methods. 294 (1-2), 15-22 (2004).
  13. Theorell, J., et al. Sensitive and viable quantification of inside-out signals for LFA-1 activation in human cytotoxic lymphocytes by flow cytometry. J Immunol Methods. 366 (1-2), 106-118 (2011).
  14. Brander, C., et al. Inhibition of human NK cell-mediated cytotoxicity by exposure to ammonium chloride. J Immunol Methods. 252 (1-2), 1-14 (2001).
  15. Beeton, C., Chandy, K. G. Enrichment of NK cells from human blood with the RosetteSep kit from StemCell technologies. J Vis Exp. (8), e326 (2007).
  16. Lamoreaux, L., Roederer, M., Koup, R. Intracellular cytokine optimization and standard operating procedure. Nat. Protoc. 1 (3), 1507-1516 (2006).
  17. Baginska, J., et al. Granzyme B degradation by autophagy decreases tumor cell susceptibility to natural killer-mediated lysis under hypoxia. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (43), 17450-17455 (2013).
  18. He, L., et al. A sensitive flow cytometry-based cytotoxic T-lymphocyte assay through detection of cleaved caspase 3 in target cells. J Immunol Methods. 304 (1-2), 43-59 (2005).
  19. Sutton, V. R., et al. Serglycin determines secretory granule repertoire and regulates NK cell and CTL cytotoxicity. FEBS J. 283 (5), 947-961 (2016).
  20. Schönberg, K., Hejazi, M., Uhrberg, M. Protocol for the clonal analysis of NK cell effector functions by multi-parameter flow cytometry. Methods Mol Biol. 903, 381-392 (2012).
  21. Björkström, N. K., et al. Expression patterns of NKG2A, KIR, and CD57 define a process of CD56dim NK-cell differentiation uncoupled from NK-cell education. Blood. 116 (19), 3853-3864 (2010).
  22. Bryceson, Y. T., Ljunggren, H. G., Long, E. O. Minimal requirement for induction of natural cytotoxicity and intersection of activation signals by inhibitory receptors. Blood. 114 (13), 2657-2666 (2009).
  23. Cooper, M. A., et al. Human natural killer cells: a unique innate immunoregulatory role for the CD56(bright) subset. Blood. 97 (10), 3146-3151 (2001).
  24. Fauriat, C., Long, E. O., Ljunggren, H. G., Bryceson, Y. T. Regulation of human NK-cell cytokine and chemokine production by target cell recognition. Blood. 115 (11), 2167-2176 (2010).
  25. Postow, M. A., Callahan, M. K., Wolchok, J. D. Immune Checkpoint Blockade in Cancer Therapy. J Clin Oncol. 33 (17), 1974-1982 (2015).
  26. Glienke, W., et al. Advantages and applications of CAR-expressing natural killer cells. Front Pharmacol. 6, 21 (2015).
  27. Curran, K. J., Brentjens, R. J. Chimeric antigen receptor T cells for cancer immunotherapy. J Clin Oncol. 33 (15), 1703-1706 (2015).
  28. Zappasodi, R., de Braud, F., Di Nicola, M. Lymphoma Immunotherapy: Current Status. Front. Immunol. 6, 448 (2015).
  29. Laprevotte, E., et al. Endogenous IL-8 acts as a CD16 co-activator for natural killer-mediated anti-CD20 B cell depletion in chronic lymphocytic leukemia. Leuk Res. 37 (4), 440-446 (2013).
  30. Maloney, D. G., et al. IDEC-C2B8 (Rituximab) anti-CD20 monoclonal antibody therapy in patients with relapsed low-grade non-Hodgkin's lymphoma. Blood. 90 (6), 2188-2195 (1997).
  31. Salles, G., et al. Phase 1 study results of the type II glycoengineered humanized anti-CD20 monoclonal antibody obinutuzumab (GA101) in B-cell lymphoma patients. Blood. 119 (22), 5126-5132 (2012).
  32. Terszowski, G., Klein, C., Stern, M. KIR/HLA interactions negatively affect rituximab- but not GA101 (obinutuzumab)-induced antibody-dependent cellular cytotoxicity. J Immunol. 192 (12), 5618-5624 (2014).
  33. Hsu, A. K., et al. The immunostimulatory effect of lenalidomide on NK-cell function is profoundly inhibited by concurrent dexamethasone therapy. Blood. 117 (5), 1605-1613 (2011).
  34. Salih, J., et al. The BCR/ABL-inhibitors imatinib, nilotinib and dasatinib differentially affect NK cell reactivity. Int J Cancer. 127 (9), 2119-2128 (2010).
  35. Benson, D. M., et al. A phase 1 trial of the anti-KIR antibody IPH2101 in patients with relapsed/refractory multiple myeloma. Blood. 120 (22), 4324-4333 (2012).
  36. Vey, N., et al. A phase 1 trial of the anti-inhibitory KIR mAb IPH2101 for AML in complete remission. Blood. 120 (22), 4317-4323 (2012).
  37. Terme, M., Ullrich, E., Delahaye, N. F., Chaput, N., Zitvogel, L. Natural killer cell-directed therapies: moving from unexpected results to successful strategies. Nat Immunol. 9 (5), 486-494 (2008).

Tags

علم المناعة، العدد 116، الخلايا القاتلة الطبيعية، CD107a، سمية الخلايا، وظيفة، IFN-γ، MIP-1β، خلايا K562
الفحص التدفق الخلوي استنادا لمراقبة وظائف الخلايا القاتلة الطبيعية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, … More

Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, N., Ullrich, E. Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions. J. Vis. Exp. (116), e54615, doi:10.3791/54615 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter