Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Flowcytometrie-gebaseerde test voor het toezicht op NK celfuncties

Published: October 30, 2016 doi: 10.3791/54615
Automatic Translation
*1,2, *3,4, 1,2, 1,2
1Childrens Hospital, Department of Pediatric Stem Cell Transplantation and Immunology, Johann Wolfgang Goethe-University, 2LOEWE Center for Cell and Gene Therapy, Johann Wolfgang Goethe-University, 3Institute for Cancer Research, Department of Cancer Immunology, Oslo University Hospital, Radiumhospital, 4The KG Jebsen Center for Cancer Immunotherapy, Institute of Clinical Medicine, University of Oslo
* These authors contributed equally

Summary

Een eenvoudige en betrouwbare werkwijze is beschreven om een ​​set van NK celfuncties zoals degranulatie cytokine en chemokine productie in verschillende NK cel subsets te analyseren.

Introduction

Als onderdeel van het aangeboren immuunsysteem natural killer (NK) cellen bijdragen tot de eerste verdedigingslinie tegen virus geïnfecteerde of kwaadaardig getransformeerde cellen. Een systeem van remmende en activerende receptoren kunnen zij onderscheiden tussen gezonde en getransformeerde cellen zonder voorafgaande priming antigeen in tegenstelling tot T-cellen. Bij doelcel ontmoeting NK cellen geven de inhoud van hun cytotoxische granules (bijv perforine, granzymen) naar het immuunsysteem synaps om hun doel te doden. Bovendien, NK cellen en scheiden verschillende cytokinen (bijvoorbeeld interferon-γ: IFN-γ, tumornecrosefactor-α: TNF-α) en chemokinen (bijvoorbeeld macrofaag inflammatoir proteïne-1β: MIP-1β) bij doelcel interactie of cytokinestimulatie 1.

Voldoende NK celfuncties zoals cytotoxiciteit, chemokine en cytokine productie hebben een belangrijke impact hebben op het lot van diverse disvergemakkelijkt. Leukemie patiënten vertonen verhoogde recidief als ze een defecte NK-cel profiel vertonen bij diagnose, bestaande uit gereduceerde IFN-γ productie en een verminderde expressie van het activeren van NK-cel-receptoren 2. Een snel herstel van NK-cel aantallen en functie zoals cytokineproductie bij doelcel interactie geassocieerd met een verlaagd recidief en verbeterde overleving bij patiënten die allogene stamceltransplantatie 3. Bovendien, bij aanvang van interferon therapie bij hepatitis C-virus geïnfecteerde patiënten de degranulatie aantal perifere NK cellen sterker begin responders dan bij niet-responders 4. NK-cel aantallen (> 80 / ul) op dag 15 na autologe stamceltransplantatie (autoSCT) bij patiënten met lymfoom en multiple myeloom predictief voor een betere progressievrije en totale overleving 5. Bij melanoompatiënten de expressie van de T-cel immunoglobulin- en mucine-domein met daG-3 molecule (TIM-3), een immuun-regulerende eiwit op NK-cellen, correleert met ziektestadium en prognose 6.

Wetenschappers hebben NK celfuncties gevolgd gedurende de laatste decennia. De eerste analyse van de NK-cel cytotoxiciteit tegen tumorcellen zonder voorafgaande priming werd aangepakt met behulp van een 51 Cr-afgifte test 7. Recenter ontwikkelde wetenschappers een niet-radioactieve methode om de cytotoxiciteit van NK cellen geëxpandeerde 8 evalueren. Cytokine en chemokine productie is herhaaldelijk geëvalueerd middels enzymgekoppelde immunosorbent assay (ELISA) technieken 9,10. Gedurende de laatste decennia deze methoden zijn aangevuld met flowcytometrie-gebaseerde testen. Het gebruik van eiwit transport remmers (bijv Brefeldine A en monensine) en cel permeabilisatie methoden in combinatie met conventionele oppervlak kleuring protocollen konden wetenschappers chemokine en cytokine productie in verschillende specifieke lymfe bestuderenocyte subsets (bijvoorbeeld T, B of NK-cellen) 11. Bovendien zijn verschillende stroomcytometrie gebaseerde bepalingen ontwikkeld om toezicht T- en NK-cel cytotoxiciteit. In 2004 beschreven Alter et al. De oppervlakte-expressie van het lysosoom-geassocieerd eiwit CD107a (Lamp1) op NK cellen na doelwitcel tegenkomen als een marker voor de degranulatie van cytotoxische granules 12. Omdat een groot aantal verschillende fluorochromen en meerkanaals flowcytometers zijn in onze dagen, is het mogelijk om gelijktijdig bewaken NK diverse celfuncties (cytotoxiciteit, cytokine en chemokine productie) in verschillende NK cel subsets. Dit wordt met name belangrijk in situaties waarin steekproefomvang beperkt is, bijvoorbeeld in biopten of bloedmonsters van patiënten met leukopenie.

Wereldwijde NK celfuncties te testen, kunnen de verschillende stromingscytometrie gebaseerde testen efficiënt worden gecombineerd. Theorell et al. Gestimuleerde NK-cellen uit HEAlthy donoren met de tumor-cellijn K562 en geanalyseerd NK celdegranulatie, inside-out signaal en chemokine productie via flowcytometrie 13. Onlangs NK-cel subgroepen fenotypes en functie in tumor patiënten tijdens autoSCT werden geanalyseerd met flowcytometrie-gebaseerde testen. Er werd aangetoond dat NK-cellen konden degranuleren en cytokinen / chemokinen na tumorcel erkenning in zeer vroege tijdstippen na autoSCT 11.

Hier een protocol wordt beschreven NK celfuncties na interactie evalueren tumorcellen waaronder degranulatie capaciteit chemokine en cytokine productie met een flow cytometrie-gebaseerde test die het mogelijk maakt om NK celfuncties bij verschillende subgroepen kan waarnemen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Deze studie werd uitgevoerd in overeenstemming met de aanbevelingen van de lokale ethische commissie van de Universiteit van Frankfurt uitgevoerd.

1. Opkweek K562 cellen

  1. Cultuur K562 cellen in R10 medium (RPMI1640 medium met glutamine, 1% penicilline / streptomycine, 10% foetaal kalfsserum) bij een dichtheid van 0,5-1 x 10 6 cellen per ml in een celkweek kolf bij 37 ° C en 5% CO 2.
  2. Harvest K562 cellen 24 uur voor het begin van een nieuw experiment.
    1. Verwijder de celkweek kolf die de K562 cellen uit de incubator. Re-schorten de K562 cellen in het kweekmedium door zachtjes en neer te pipetteren.
    2. Breng de kweekmedia die de K562-cellen in een 15 of 50 ml buis en pellet de cellen bij 400 g gedurende 8 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 5 ml R10 media en meng goed.
    3. Overdracht 20 ul van de cel oplossing in een putje van een 96-U-well plaat. Voeg 20 pi trypan blauw enMeng goed door en neer te pipetteren minstens 5 keer. Pipetteer 10 ul van de oplossing in een cel telkamer en tel de cellen.
    4. Pellet de cellen bij 400 g gedurende 8 min. Resuspendeer de cellen in R10 media en pas de K562 cel concentratie 0,5-1 x 10 6 cellen per ml.
    5. Incubeer de K562-cellen in een celkweek kolf bij 37 ° C en 5% CO 2 tot gebruik.

2. Isolatie van NK cellen

  1. Volgens de goedkeuring en de richtlijnen van de lokale ethische commissie, het verkrijgen van schriftelijke geïnformeerde toestemming van de gezonde donor of de patiënt vóór de verzameling van 6-10 ml van ofwel EDTA of gehepariniseerd perifeer bloed.
  2. De reagentia voor de NK-cel isolatie bij 4 ° C tot de start van het experiment en vervolgens bij kamertemperatuur (KT) onder steriele omstandigheden. Isoleer NK cellen uit perifeer volbloed met behulp van magnetische microkralen en een specifiek magneet voor celisolatie volgens thij fabrikant.
    1. Los één flacon van de gevriesdroogde NK cel negatieve isolement antilichaam cocktail bij pipetteren 7,5 ml van de geleverde buffer A (inbegrepen in de NK-cel isolatie kit) in de flacon. Meng voorzichtig door en neer te pipetteren 3-4 keer.
      OPMERKING: Zorg ervoor, dat de schorsing homogeen is voor elk gebruik.
    2. Bereid de uiteindelijke cocktail oplossing door het mengen van geschikte volumes van de opgeloste pellet uit stap 2.2.1 en buffer B (inbegrepen in de NK-cel isolatie kit). Om deze hoeveelheden te bepalen, het volume van het monster van compleet bloed definiëren ml het volume = 1,0. Gebruik 0,25 volumes van de opgeloste pellet (uit stap 2.2.1) en 0,25 volumes van buffer B tot 1 volume volbloed verwerken.
    3. Breng het mengsel in een geschikte buis met het monster van compleet bloed. Niet pipet op en neer om het verlies van bloed in de pipet te voorkomen. In plaats daarvan sluit de buis en beweeg het voorzichtig op en neer tot de verlSion is homogeen. Doe niet vortex.
    4. Verdere homogeniseer het monster met behulp van een buis rotator gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    5. Onder steriele omstandigheden, verwijder de dop en plaats de buis in de magnetische separator gedurende 15 min, zoals aanbevolen door de fabrikant. Zorg ervoor dat de buis labels gezicht in de richting van de achterzijde van de magneet om ongestoord de zichtbaarheid van de scheidingslijn mogelijk te maken. Heeft de magneet niet bewegen tijdens de scheiding, omdat deze procedure zou worden verstoord.
    6. Breng voorzichtig de supernatant naar een nieuwe buis van 15 ml en vul met een complete media (CM; hematopoietische cellen media, 1% penicilline / streptomycine, 5% menselijk sera). Pellet de cellen bij 400 g gedurende 8 min.
      1. Optioneel: Als de pellet rood, resuspendeer de cellen in 1 ml erytrocyten lysisbuffer (bijvoorbeeld 1 ml ammonium- chloride-kalium (ACK) lysisbuffer: 155 mM NH4Cl, 0,1 mM EDTA, 10 mM KHCO3 in 1 L gedistilleerd water (DW)) en incubeer gedurende 8 minuten bij kamertemperatuur. U kunt ook gebruik maken van een ERythrocyte uitputting kit.
        LET OP: Houd er rekening mee, dat het gebruik van ACK buffer een negatieve invloed kunnen hebben op NK celfuncties 14.
      2. Snel verdunnen de ACK buffer door het toevoegen van ten minste 1 ml van CM aan de lysis en centrifugeren wordt afgebroken bij 400 xg gedurende 8 minuten om de cellen te pelleteren.
    7. Resuspendeer de cel pellet in 1 ml CM en ga verder met het tellen. Overdracht 20 ul van de NK cel oplossing op een 96-U-well plaat. Voeg 20 ul van methyleenblauw aan elk putje en meng goed door en neer te pipetteren minstens 5 keer. Pipetteer 10 ul van de oplossing in een cel telkamer en tellen cellen. Alternatief gebruik 30 ui onverdunde celsuspensie voor het tellen met een commercieel verkrijgbaar celteller.
    8. Stel de cellen tot een concentratie van ten minste 2 x 10 4 NK cellen per 100 ul CM.
    9. Voer een oppervlak antilichaam kleuring van de geïsoleerde NK celpopulatie om de zuiverheid controleren met een flowcytometer.
      1. Prepare een master mix oplossing door het mengen van de omvang van de aangegeven antilichamen volgens tabel 1.
      2. Resuspendeer de cellen in 88,5 pl wasbuffer (WB; 0,5% runderserumalbumine (BSA), 0,1% NaN3 in PBS) en voeg 11,5 ul van de master mix oplossing. Incubeer de cellen gedurende 20 minuten bij 4 ° C in het donker.
        Let op: NaN3 is giftig en mutagene stof. Handvat dienovereenkomstig om de corresponderende veiligheidsinformatieblad (VIB).
      3. Voeg 1 ml WB en pellet de cellen bij 400 g gedurende 4 min.
      4. Resuspendeer de cellen in 300 ul vlekken buffer plus DAPI. Het verwerven van de cellen met een flow cytometer.
        OPMERKING: Ga verder met het experiment indien de NK-cel zuiverheid ten minste 80% van alle levende lymfocyten.

3. Het oogsten van de K562 Cellen voor NK cel stimulatie

  1. Verwijder de celkweek kolf die de K562-cellen (uit stap 1.2) van h e incubator. Re-schorten de K562 cellen in het kweekmedium door zachtjes en neer te pipetteren.
  2. Breng de gehele kweekmedium in een 15 of 50 ml buis en pellet de cellen bij 400 g gedurende 8 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 5 ml fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en meng.
  3. Overdracht 20 ul van de cel oplossing in een putje van een 96-U-well plaat. Voeg 20 ul trypan blauw en meng goed door en neer te pipetteren minstens 5 keer. Pipetteer 10 ul van de oplossing in een cel telkamer en tel de cellen. Alternatief gebruik 30 ui onverdunde celsuspensie rekenen met een commercieel verkrijgbaar celteller.
  4. Pellet de cellen bij 400 g gedurende 8 min. Resuspendeer cellen in CM in een concentratie van ten minste 2 x 10 4 K562 cellen per 100 pl medium.
    OPMERKING: Gebruik dezelfde K562 en NK cel concentraties om beide incuberen bij een effector: target (E: T) -verhouding van 1: 1 later.
"> 4. Stimulatie van NK cellen met de tumorcellijn K562 en Cytokinen

  1. Meng voorzichtig de cellen door pipetteren ze op en neer ten minste 5 maal. Verdeel 100 ul / putje van de NK-cel-oplossing in de gewenste putjes van een 96-V-well plaat.
    1. Gebruik van ten minste twee putjes per donor, met en zonder prikkel (bijvoorbeeld K562 tumorcellen en cytokines). Waar mogelijk, voeren het experiment ten minste in duplo en voeg een positieve controle (bijvoorbeeld, forbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA) en ionomycine, eindconcentratie 50 nM PMA, 1 uM ionomycine per putje). Bereid bijgewerkt flowcytometrie compensaties voor de datum van het experiment.
      OPMERKING: Titreer de antilichamen voorafgaand gebruik (zie bespreking).
  2. Doe het licht en voeg de anti-CD107a antilichaam (2 pl, eindconcentratie: 1: 100) aan elk putje met NK-cellen op de 96-V-well plaat.
  3. Meng de K562 cellen door pipetteren ze op en neer tenminstens 5 keer.
    1. Van de putjes die de NK cel / anti-CD107a antilichaamoplossing identificeren degenen voorzien voor stimulatie met K562 cellen. Voeg 100 ul / putje van de K562 cel oplossing in deze putten. Meng voorzichtig door en neer te pipetteren minstens 5 keer.
    2. Add interleukine-2 (IL-2; eindconcentratie 100 U / ml) en interleukine-15 (IL-15; eindconcentratie 10 ng / ml) aan de putjes die K562 cellen en NK cellen / anti-CD107a antilichaamoplossing.
      1. Optioneel: Test welke weerslag K562 cellen of cytokinen alleen op de verdeelde NK cellen tumor geïnduceerde versus-cytokine geïnduceerde NK celfuncties ontcijferen.
    3. Identificeer de putjes van de 96-V-well plaat gepland als negatieve controles zonder stimulus. Voeg 100 ul / putje CM deze putjes die alleen de NK cel / anti-CD107a antilichaamoplossing. Meng voorzichtig door en neer te pipetteren minstens 5 keer.
      1. Optioneel: Voor een positieve controle, voeg 100 μ; L CM met PMA en ionomycine (eindconcentratie: 50 nM PMA, 1 uM ionomycine per putje) om een ​​goed aan bij de NK cel / anti-CD107a antilichaam oplossing.
  4. Incubeer de cellen gedurende 3 uur in het donker bij 37 ° C en 5% CO2.
  5. Bereid een eiwittransport remmeroplossing (bijvoorbeeld Brefeldine A en / of monensine) in CM. Na 1 uur incubatie, voeg de oplossing in elk putje van de 96-V-well plaat met het licht uitgeschakeld (eindconcentratie: 0.5-1μM Brefeldine A en monensine 2-3 uM). Meng voorzichtig door en neer te pipetteren minstens 5 keer. Verdere incubatie gedurende de resterende 2 uur.

5. Surface en intracellulaire kleuring

  1. Na 3 uur incubatie periode meng de cellen in de putjes van de 96-V-putjesplaat nauwkeurig door pipetteren en neer minstens 5 maal en overbrengen naar flowcytometrie buizen. Voeg 1 ml / tube WB. Pellet cellen bij 400 g gedurende 4 min.
    1. Optioneel: Voor centrifugeren spoel de putjes met 100 pl / putje PBS, teneinde de celopbrengst optimaliseren door op en neer pipetteren minstens 5 maal Alvorens de cellen in de respectievelijke FACS buis.
  2. Verwijder het supernatant en doorgaan met het oppervlak vlekken.
  3. Omvatten een amine-reactieve fluorescerende kleurstof die niet-permeant aan cellen leven met een emissiemaximum van 423 nm als vastzetbaar dode cel marker (DCM). Voer de kleuring voor (zie hieronder) of parallel aan het oppervlak antilichaamkleuring afhankelijk van het type van de gebruikte DCM.
    1. Resuspendeer cellen in 99 ul / buis PBS en voeg 1 pl / buis van het vastzetbaar DCM (eindconcentratie: 1: 100). Meng cellen en gebruik van een vortex en incubeer ze gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
    2. Bereid een master mix oplossing door de "oppervlakte" antilichamen in tabel 2 met elkaar te mengen (zie kleuring stap column in het blauw). Gebruik de indicated volumes / buis en vermenigvuldig ze met het aantal flowcytometrie buizen te worden gemerkt.
    3. Na incubatie neemt de flowcytometrie buizen met de cellen en voeg 1 ml / tube WB. Pellet de cellen bij 400 g gedurende 4 min.
    4. Verwijder het supernatant, resuspendeer de cellen in 84 ul / tube WB en voeg 16 ul / buis van de master mix oplossing. Meng de cellen goed met behulp van een vortex. Incubeer cellen gedurende 20 minuten bij 4 ° C in het donker.
    5. Na 20 minuten voeg 1 ml / tube WB en pellet cellen op 400 xg gedurende 4 min.
  4. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 100 ul / buis van een fixatie koude oplossing (bv, 2% (eind) paraformaldehyd of formaldehyd). Meng de cellen goed met behulp van een vortex. Incubeer cellen gedurende 10 min bij 4 ° C in het donker.
    1. Vlekken op de cellen voor intracellulaire cytokinen / chemokinen na deze stap en sla overnacht bij 4 ° C in WB.
      NB: Na een nacht incubatie, kan een lagere cel herstel optreden.
  5. Was de cellen in 1 ml / tube WB bij 400 g gedurende 4 min en ga verder met de permeabilisatie stap.
  6. Bereid een permeabilisatie buffer (PB) (bijvoorbeeld 0,2% saponine, 1% BSA oplossing in PBS).
  7. Was de cellen tweemaal in 1 ml / tube PB bij 400 g gedurende 4 min. Doorgaan met het intracellulaire kleuring.
    Let op: Saponine is potentieel irriterend. Handvat dienovereenkomstig om de corresponderende veiligheidsinformatieblad (VIB).
  8. Bereid een master mix oplossing met behulp van de aangegeven "intracellulaire" antilichaam volumes in tabel 2 (in het groen). Vermenigvuldig deze volumes met het aantal buizen te worden gemerkt.
    1. Resuspendeer de cellen in 90 ul / buis PB en breng 10 pl / buis van het antilichaam master mix oplossing. Meng goed met behulp van een vortex en incubeer de cellen voor 30 min bij 4 ° C in het donker.
  9. Was de cellen tweemaal in 1 ml / tube PB bij 400 g gedurende 4 min.
  10. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 400 ul / buis PB. Meng de cellen goed met behulp van een vortex. Plaats cellen op ijs in het donker tot meting.

6. Flowcytometrie Compensation and Acquisition

  1. Selecteer de kanalen voor de verschillende fluorochromen (zie tabel 2) in de flowcytometrie acquisitie software in de parameter setup map. Bovendien kiest de kanalen voor FSC-A en -H en SSC-A en -H.
  2. Laad een vergoeding matrix gemaakt voor de gekozen parameters in de overname-bestand.
    1. Maak een schadevergoeding matrix met behulp van geïsoleerde NK-cellen uit stap 2.2.8 door het uitvoeren van een enkele kleur vlek voor elke gebruikte fluorochroom (zie tabel 2). Gebruik het oppervlak kleuring protocol in stappen 5,1-5,4 beschreven. Onder andere een ongekleurd controle (zonder antilichamen) En isotype controles en / of fluorescentie minus één controles (FMO).
      Opmerking: Als alternatief voor celgebaseerde compensatie gebruik IgG-bindende kralen als compensatie controles.
    2. Plaats elke buis voor enkele vlek monsters en het monster zonder antilichamen in het monster injectiepoort (SIP). Klik op de "record" knop in de flowcytometrie acquisitie software en het verwerven van een aantal cellen van ten minste 5 x 10 3 NK-cellen per monster.
    3. Gebruik de compensatie berekening toepassing van de cytometry acquisitie software om een ​​schadevergoeding matrix te creëren.
  3. Maak Dot Plots voor het vaststellen van de NK cel Bevolking.
    1. Identificeer enkele cellen met behulp van FSC-A / FSC-H en SSC-A / SSC-H puntdiagrammen. Klik op de "veelhoek gate" knop. Teken een hek rondom cellen, die een lineaire distributie patroon in beide puntdiagrammen hebben. Dubbelklik op de poorten om een ​​nieuwe dot plot te openen.
    2. Kies een FSC-A / SSC-A punt complot om de lymfocyten te identificeren/ NK-celpopulatie (zie figuur 1). Teken een veelhoek hek omheen en dubbelklik op de poort.
  4. Plaats elk monster buis van de NK-cel stimulatie-test in het SIP. Klik op de "record" knop en het verwerven van een aantal cellen van ten minste 5 x 10 3 NK-cellen per monster.

7. Analyse en Statistieken

  1. Open de stromingscytometrie analyse software. Klik op de laad- monster knop om de gestimuleerde controle monster te openen.
  2. Een poortsysteem voor verschillende NK cel subpopulaties (zie figuur 1).
    1. Klik op de stip plot knop om een ​​FSC-A / SSC-A plot te maken. Klik op de rechthoek gate knop en trek een rechthoek poort over alle evenementen met een FSC-A waarde> 5 x 10 4 om vuil uit te sluiten. Open de poort door te dubbelklikken op de poort.
    2. Kies opnieuw het FSC-A / SSC-A parameters binnen de nieuwe dot plot en klik op de veelhoek gate knop. Druwe een veelhoek hek rondom de lymfocyt populatie (zie figuur 1). Open de poort.
    3. Selecteer het SSC-A / SSC-H parameter voor de nieuwe dot plot en trek een veelhoek hek rond alle afzonderlijke cellen. Enkele cellen vertonen een lineaire verdeling over de FSC-A / FSC-SSC-H en A / SSC-H parameters (zie figuur 1). Open de poort door te dubbelklikken op het.
    4. Herhaal stap 7.2.3 met behulp van de FSC-A / FSC-H parameters deze tijd.
    5. Gebruik de parameter CD45 en Dump kanaal (CD3, CD14, CD19, DCM) om dode cellen te sluiten. Teken een rechthoek hek rondom alle CD45 positieve en Dump kanaal negatieve cellen. Open de poort door te dubbelklikken op de poort.
    6. Identificeer de gehele NK-celpopulatie met behulp van de CD56 en Dump kanaal parameters. Maak een rechthoek hek rondom de CD56 positieve en Dump kanaliseren negatieve cellen. Open de poort door te dubbelklikken op het.
    7. Teken een rechthoek hek rondom alle drie de NK cel subsets binnen een CD56 / CD16 dot plot. Identify de verschillende subgroepen als CD56 ++ CD16 -, CD56 ++ CD16 + en CD56 + CD16 ++ NK cel subsets.
  3. Analyseer NK celfuncties voor elke individuele NK cel subset.
    1. Klik op één van de drie NK cel subsets poorten te openen. Maak drie verschillende puntdiagrammen voor CD56 / CD107a, CD56 / IFN-γ en CD56 / MIP-1β.
    2. Een rechthoek poort voor CD56 positieve cellen, die respectievelijk positief zijn ook voor CD107a, IFN-γ of MIP-1β (zie figuur 1).
    3. Herhaal stap 7.3.1-7.3.2 voor elke resterende NK-cel subreeks.
  4. Herhaal stap 7.2 en 7.3 voor alle gestimuleerde monsters. Bewaar alle statistische waarden van elk individueel monster door te klikken op de statistiek exporterende knop binnen de analyse software.
  5. Open de bestanden met de statistische waarden van de individuele monsters NK celfuncties te analyseren. Selecteer de waarden voor individuele NK cellsubgroepen (bijvoorbeeld CD56 ++ CD16 - NK-cellen) door ze te kopiëren naar een ander bestand.
    1. Trek het percentage CD107a positieve NK-cellen, die niet zijn behandeld met een prikkel, het percentage CD107a positieve NK-cellen, die behandeld zijn met een stimulus.
      OPMERKING: het resultaat aan de degranulatie capaciteit van dit specifieke NK cel subsets in reactie op de stimulus te tonen.
    2. Herhaal stap 7.5.1 voor IFN-γ en MIP-1ß-positieve NK-cellen het cytokine en chemokine productie tonen in reactie op de stimulus.
    3. Herhaal stap 7.5.1-7.5.2 voor elke resterende NK cel subsets hun degranulatie capaciteit en cytokine / chemokine productie na stimulatie evalueren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De gating strategie voor het analyseren van de degranulatie, cytokine en chemokine productie van de gehele NK celpopulatie en drie verschillende subsets van NK cellen zijn aangegeven in figuur 1.

Representatieve resultaten van een gezonde donor zijn weergegeven in figuur 2. NK-cellen zonder prikkel geproduceerd noch IFN-γ of MIP-1β en niet CD107a expressie op hun oppervlak (Figuur 2A). Daarentegen NK-cellen gestimuleerd met tumorcellen en cytokines veroorzaakte significante hoeveelheden intracellulair IFN-γ en MIP-1β. Bovendien dan 20% van hen degranulated op tumorcellen interactie aangegeven CD107a expressie op hun oppervlak (figuur 2C). PMA en lonomycine stimulatie werden gebruikt als controle (Figuur 2B).

e 1 "src =" / files / ftp_upload / 54615 / 54615fig1.jpg "/>
Figuur 1:. Gating strategie Latere poorten worden uitgezet. Ten eerste, puin zijn uitgesloten in een FSC-A / SSC-A plot. Dan lymfocyten worden geïdentificeerd en doubletten worden uitgesloten met behulp van twee percelen met SSC-A / SSC-H en FSC-A / FSC-H. Daarna wordt een poort met alle CD45 + cellen en exclusief allemaal dood, CD3 +, CD14 + en CD19 + cellen door het uitzetten CD45 / ontladen kanaal. Vervolgens worden NK-cellen geïdentificeerd door gating op CD56 + cellen. Een plot met CD56 / CD16 kan worden gebruikt om de belangrijkste NK cel subsets te identificeren. Tenslotte, in de gehele NK celpopulatie, functionele merkers worden geïdentificeerd door het uitzetten van CD56 versus CD107a, IFN-γ en MIP-1β, respectievelijk. Dit kan ook worden gedaan voor alle verschillende soorten NK cel subsets. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.


Figuur 2:. Representatieve resultaten van een gezonde donor NK cellen gebruiken gating strategie in figuur 1 beschreven, NK cel merkers zoals functionele CD107a (voor degranulatie), IFN-γ en MIP-1β kan worden geïdentificeerd. De linker kolom (A) toont de resultaten met behulp van NK-cellen in de afwezigheid van een stimulus. De middelste kolom (B) toont de resultaten op de aanwezigheid van de positieve controle PMA / ionomycine. De rechter kolom (C) toont resultaten voor NK-cellen gestimuleerd met de tumorcellijn K562 en in aanwezigheid van de cytokinen IL-2 (100 U / ml) en IL-15 (10 ng / ml). Klik hier om te bekijken een grotere versie van deze figuur.

"Tabel Tabel 1: Antilichamen controle op zuiverheid.

tabel 2
Tabel 2: Antilichamen voor extra- en intracellulaire kleuring.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De beschreven werkwijze is een eenvoudige, snelle en betrouwbare benadering NK celfuncties bestuderen monsters volbloed van gezonde donoren of patiënten. Deze werkwijze biedt het grote voordeel om NK-cellen uit bloed rechtstreeks zuiveren, het vermijden van tijdrovende dichtheidsgradiënt centrifugatie, wat verplicht is voor vele andere zuiveringsmethoden 15. Bovendien, het vereist een kleinere steekproef omvang ten opzichte van de "klassieke" NK cel isolatie / verrijking methoden, waardoor het een geschikt alternatief voor monsters van kinderen en / of immuun-deficiënte patiënten maakt. Dit protocol kan worden gebruikt om basiswaarden van NK celfuncties ex vivo te verkrijgen, maar het maakt het ook mogelijk de verdere NK cultuur en expansie, die op deze wijze aanvulling op andere eerder beschreven werkwijzen 8. Niettemin enkele kritische stappen moeten in aanmerking worden genomen. Aangezien de test is gebaseerd op de extra- en intracellulaire antilichaam kleuring, is het cruciaal om de optimale bepalen worken concentratie voor elk antilichaam als eerste. Speciaal voor de intracellulaire kleuring, is een zorgvuldige evaluatie van de gebruikte antilichamen sterk aanbevolen. Een goede benadering is om een verdunningsreeks van het gebruikte antilichaam testen (bijvoorbeeld 1: 100 tot 1: 12,5) in een celsuspensie gestimuleerd met of zonder PMA / ionomycine. Vervolgens wordt de verhouding van positieve gebeurtenissen tussen gestimuleerde en niet-gestimuleerde monsters worden berekend en uitgezet. Het antilichaam verdunning met de hoogste positieve veelvoudverandering ratio (beste signaal-achtergrond-verhouding) worden gebruikt voor verdere experimenten 16. Bovendien kan het gebruik van controles zoals isotype- en FMO controles niet correct bijzonder fundamenteel voor intracellulaire kleuring te zijn om hek aan de positieve celpopulaties.

Er zijn echter belangrijke beperkingen van de beschreven werkwijze. CD107a expressie is een degranulatie marker en daarom slechts indirect aangeeft NK-cel cytotoxiciteit. NK-cel cytotoxiciteit and degranulatie capaciteit kan verschillen. Up-regulatie van autofagie route in tumorcellen resulteert in de afbraak van uitgescheiden granzyme B vermindert celdood op NK-cel interactie 17. Derhalve extra DCM (bijvoorbeeld gesplitst caspase 3) kan zijn voor de kleuring paneel toegevoegd om celdood gebeurtenissen binnen de doelwitcellen 18 volgen. Bovendien wordt NK-cel cytotoxiciteit beïnvloed door de hoeveelheid cytotoxische eiwitten in hun granules (bijv perforine, granzyme b), die kan worden gekwantificeerd door een intracellulaire kleuring 19,20.

Verder zijn er verschillende mogelijkheden om het protocol te wijzigen. In plaats van geïsoleerde NK cellen, perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC's) worden gebruikt. Hoewel men moet zich bewust zijn dat de absolute NK-cel nummer binnen de PBMC populatie verschilt tussen de verschillende donoren en zelfs tussen de monsters afkomstig van dezelfde donor op verschillende tijdstippen. NK-cel degranultie is sterk afhankelijk van de E: T verhouding. Om NK celfuncties te vergelijken tussen verschillende donoren of op verschillende tijdstippen, zouden de absolute NK celaantal in de PBMC populatie worden gebruikt om een ​​constante -E: T verhouding in alle experimenten. Als NK celfuncties op verschillende tijdstippen worden bewaakt van dezelfde donor, kan worden ingevroren PBMC en de analyse kan tegelijkertijd voor verschillende tijdstippen worden gedaan om inter-experimentele variatie 11 verminderen.

Aangezien kleuring panelen met maximaal 18 kleuren mogelijk, kan analyse van NK celfuncties worden uitgebreid tot veel meer detail. Met behulp van extra oppervlakte markers zoals CD57, NKG2A en killer cell immunoglobuline-like receptoren (KIR), kunnen verder NK cel subsets worden geïdentificeerd. Opgeleide NK-cellen die ten minste een self-KIR degranuleren sterker na interactie met K562 cellen dan ongeschoold NK-cellen. Daarentegen meer gedifferentieerde CD57 + CD56 + - CD56 + NK-cellen 21. Bovendien kunnen andere markers van de NK celfunctie gericht. LFA-1 is een belangrijke molecule NK celadhesie en wordt uitgedrukt in de open conformatie op NK-cel activatie. Deze zogenaamde "inside-out signaal" is een vroege NK-cel activatie marker 22.

Tenslotte kunnen de stimuli voor het testen NK celfuncties ook worden gewijzigd. In onze ervaring vers geïsoleerde NK-cellen alleen degranuleren slecht licht werpen op K562 cel interactie als er geen cytokines worden toegevoegd. Met behulp van vers geïsoleerde PBMCs zonder verdere cytokine Daarnaast omzeilen dit probleem, vanwege de invloed van de bystander-cellen. Bovendien cytokineproductie, in het bijzonder IFN-γ en TNF-α kan worden geopend op IL-12 en IL-18 stimulatie 23. IFN-γ productie in de NK-cel subsets kunnen verschillen dependinG op de gebruikte stimulus (cytokine-versus-target geïnduceerde stimulatie) 24. Bovendien, in plaats van K562 cellen als doelcellen, primaire tumorcellen afgeleid van tumorpatiënten kan worden gebruikt om NK celfuncties tegen autologe tumorcellen testen voor of tijdens immunomodulerende therapieën (bijvoorbeeld monoklonaal antilichaam behandeling of immunomodulerende geneesmiddelen (IMiDs)).

In de afgelopen jaren is het gebied van immunotherapie is snel ontwikkelende de klinische goedkeuring van immune ijkpunt remmers (bijvoorbeeld ipilumumab, nivolumumab, pembrolizumab) 25 en succesvolle proeven met genetisch gemodificeerd chimeer antigen receptor (CAR) tot expressie brengen T-cellen en als CAR-NK-cellen (besproken in referentie 26), voor de behandeling van hematologische tumorpatiënten 27. Daarom NK-cellen gebaseerde immunotherapie wordt steeds meer in beeld. Anti-CD20-antilichamen hebben een groot succes in de treatme geweestnt van maligne lymfomen in de laatste twee decennia 28. De overgrote meerderheid van de NK-cellen brengen lage affiniteit Fc receptor CD16 waardoor de cellen herkennen en doden antilichaam gemerkte doelcellen (antilichaamafhankelijke cellulaire cytotoxiciteit - ADCC). Het vermogen van het antilichaam om NK-cel functies triggeren in vitro worden getest met behulp van de beschreven protocol 29. Terszowski et al. ADCC geanalyseerd NK-cellen tegen een B-lymfoblastoïde cellijn met behulp van verschillende klinisch goedgekeurde anti-CD20-antilichamen. Terwijl ADCC geïnduceerd na behandeling met rituximab (eerste klinisch goedgekeurde anti-CD20 antilichaam 30) werd negatief beïnvloed door KIR / HLA interactie Dit effect werd niet waargenomen bij gebruik obinutuzumab (a novel glycoengineered type II CD20 monoklonaal antilichaam) 31, 32. Bovendien worden NK celfuncties beïnvloed door verschillende nieuwe anti-tumor middelen zoals IMID lenalidomide 33 en andere tyrosine-Kinase remmers (TKI) 34. Momenteel NK celspecifieke controlepunt remmers worden getest in klinische studies. Voorbeelden zijn het gebruik van anti-KIR 35,36 of anti-NKG2A antilichamen (NCT02331875) en activeren agonisten als een anti-CD137 antilichaam (NCT01775631; NCT02110082).

Belangrijk is adoptieve NK celoverdracht uitgevoerd bij een verschillende maligne aandoeningen met veelbelovende klinische effecten 37. Met het doel om de beste donor selecteren, zou NK celfuncties tegen tumor van de patiënt worden getest in vitro middels bloedmonsters van potentiële NK cel donors.

Samengevat wordt het beschreven protocol ontworpen om diverse NK celfuncties analyseren van gezonde donoren of patiënten. Die functies kunnen worden gecontroleerd bij diverse NK cel subsets op verschillende stimuli op geselecteerde tijdstippen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 + glutamine Invitrogen 6187-044
penicilin/streptomycin Invitrogen 15140-122
BD Falcon Round Bottom Tube BD 352008
fetal calf serum Invitrogen 10270-106 heat inactivated before use
T-flask Greiner Bio-One 690195
K562 tumor cell line DSMZ GmbH ACC 10
ammonium-chloride-potassium (ACK) lysis buffer made in house / components are listed in the text
Distilled water: Ampuwa Spüllösung 1,000 ml Plastipur Fresenius Kabi 1088813
Megafuge 40R Centrifuge Heraeus /
EDTA blood collector tubes Sarstedt 386453 S-Monovette 7.5 ml, K3EDTA
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Life Technologies 15575-020
Hematopoietic media (XVIVO) Lonza Group Ltd BE04-743Q
human serum DRK Blutspendedienst, Frankfurt/M  / healthy donors with blood type AB; heat inactivated before use
Neubauer-improved counting chamber, bright line Marienfeld superior/ LO-Laboroptik Ltd. 0640030/ 1110000
trypan blue solution (0.4%) Invitrogen 15250-061
3% acetic acid with methylene blue Stemcell Technologies  07060
Corning 96 Well Clear V-Bottom TC-treated Microplates Corning  3894
Falcon 96 Well Round Bottom Not Treated Microplates Corning  351177
DPBS (Ca2+- and Mg2+-free) Gibco Invitrogen 14190-169
BSA Sigma Aldrich A2153-100G
NaN3 Sigma Aldrich 08591-1ML-F
phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)  Merck 524400-1MG
ionomycin  PromoKine PK-CA577-1566-5
interleukin 15 (IL-15) PeproTech 200-15
Proleukin S (IL-2)  Novartis Pharma 730523
Golgi Stop, Protein Transport Inhibitor (containing Monensin) BD Biosciences 554724 This product can be used in combination or instead of Golgi Plug. The best combination for the wished experimental setting has to be tested.
Golgi Plug, Protein Transport Inhibitor (containing Brefeldin A) BD Biosciences 555029
paraformaldehyde AppliChem UN2209
saponin Sigma Aldrich 47036
flow cytometer: Canto10C BD Biosciences /
FlowJo TreeStar Inc. /
Graph Pad Graph Pad Inc. /
MACSxpress Separator Miltenyi Biotec  130-098-308
MACSxpress NK isolation kit Miltenyi Biotec  130-098-185
MACSxpress Erythrocyte Depletion Kit, human Miltenyi Biotec  130-098-196
MACSmix Tube Rotator  Miltenyi Biotec  130-090-753
anti-human CD3 APC Biolegend 300412
anti-human CD3 V450 BD Biosciences 560366
anti-human CD14 PerCP Miltenyi Biotec  130-094-969
anti-human CD14 V450 BD Biosciences 560349
anti-human CD16 PE Biolegend 302008
anti-human CD16 PerCP Biolegend 302029
anti-human CD19 PE-Cy7 Biolegend 302216
anti-human CD19 V450 BD Biosciences 560353
anti-human CD45 BV510 BD Biosciences 563204
anti-human CD56 FITC Biolegend 345811
anti-human CD107a PE Biolegend 328608
anti-human IFN-γ AF-647 BD Biosciences 557729
anti-human MIP-1β APC-H7 BD Biosciences 561280
DAPI Biolegend 422801
Zombie Violet Fixable Viability Kit Biolegend 423113 fixable dead cell marker

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Watzl, C. How to trigger a killer: modulation of natural killer cell reactivity on many levels. Adv Immunol. 124, 137-170 (2014).
  2. Khaznadar, Z., et al. Defective NK Cells in Acute Myeloid Leukemia Patients at Diagnosis Are Associated with Blast Transcriptional Signatures of Immune Evasion. J Immunol. 195 (6), 2580-2590 (2015).
  3. Pical-Izard, C., et al. Reconstitution of natural killer cells in HLA-matched HSCT after reduced-intensity conditioning: impact on clinical outcome. Biol Blood Marrow Transplant. 21 (3), 429-439 (2015).
  4. Ahlenstiel, G., et al. Early changes in natural killer cell function indicate virologic response to interferon therapy for hepatitis C. Gastroenterology. 141 (4), 1231-1239 (2011).
  5. Porrata, L. F., et al. Early lymphocyte recovery predicts superior survival after autologous stem cell transplantation in non-Hodgkin lymphoma: a prospective study. Biol Blood Marrow Transplant. 14 (7), 807-816 (2008).
  6. Silva, I. P., et al. Reversal of NK-cell exhaustion in advanced melanoma by Tim-3 blockade. Cancer Immunol Res. 2 (5), 410-422 (2014).
  7. Kiessling, R., Klein, E., Wigzell, H. "Natural" killer cells in the mouse. I. Cytotoxic cells with specificity for mouse Moloney leukemia cells. Specificity and distribution according to genotype. Eur J Immunol. 5 (2), 112-117 (1975).
  8. Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells. J Vis Exp. (48), (2011).
  9. Mariani, E., et al. Chemokine production by natural killer cells from nonagenarians. Eur J Immunol. 32 (6), 1524-1529 (2002).
  10. Reefman, E., et al. Cytokine secretion is distinct from secretion of cytotoxic granules in NK cells. J Immunol. 184 (9), 4852-4862 (2010).
  11. Jacobs, B., et al. NK Cell Subgroups, Phenotype, and Functions After Autologous Stem Cell Transplantation. Front. Immunol. 6, 583 (2015).
  12. Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. J Immunol Methods. 294 (1-2), 15-22 (2004).
  13. Theorell, J., et al. Sensitive and viable quantification of inside-out signals for LFA-1 activation in human cytotoxic lymphocytes by flow cytometry. J Immunol Methods. 366 (1-2), 106-118 (2011).
  14. Brander, C., et al. Inhibition of human NK cell-mediated cytotoxicity by exposure to ammonium chloride. J Immunol Methods. 252 (1-2), 1-14 (2001).
  15. Beeton, C., Chandy, K. G. Enrichment of NK cells from human blood with the RosetteSep kit from StemCell technologies. J Vis Exp. (8), e326 (2007).
  16. Lamoreaux, L., Roederer, M., Koup, R. Intracellular cytokine optimization and standard operating procedure. Nat. Protoc. 1 (3), 1507-1516 (2006).
  17. Baginska, J., et al. Granzyme B degradation by autophagy decreases tumor cell susceptibility to natural killer-mediated lysis under hypoxia. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (43), 17450-17455 (2013).
  18. He, L., et al. A sensitive flow cytometry-based cytotoxic T-lymphocyte assay through detection of cleaved caspase 3 in target cells. J Immunol Methods. 304 (1-2), 43-59 (2005).
  19. Sutton, V. R., et al. Serglycin determines secretory granule repertoire and regulates NK cell and CTL cytotoxicity. FEBS J. 283 (5), 947-961 (2016).
  20. Schönberg, K., Hejazi, M., Uhrberg, M. Protocol for the clonal analysis of NK cell effector functions by multi-parameter flow cytometry. Methods Mol Biol. 903, 381-392 (2012).
  21. Björkström, N. K., et al. Expression patterns of NKG2A, KIR, and CD57 define a process of CD56dim NK-cell differentiation uncoupled from NK-cell education. Blood. 116 (19), 3853-3864 (2010).
  22. Bryceson, Y. T., Ljunggren, H. G., Long, E. O. Minimal requirement for induction of natural cytotoxicity and intersection of activation signals by inhibitory receptors. Blood. 114 (13), 2657-2666 (2009).
  23. Cooper, M. A., et al. Human natural killer cells: a unique innate immunoregulatory role for the CD56(bright) subset. Blood. 97 (10), 3146-3151 (2001).
  24. Fauriat, C., Long, E. O., Ljunggren, H. G., Bryceson, Y. T. Regulation of human NK-cell cytokine and chemokine production by target cell recognition. Blood. 115 (11), 2167-2176 (2010).
  25. Postow, M. A., Callahan, M. K., Wolchok, J. D. Immune Checkpoint Blockade in Cancer Therapy. J Clin Oncol. 33 (17), 1974-1982 (2015).
  26. Glienke, W., et al. Advantages and applications of CAR-expressing natural killer cells. Front Pharmacol. 6, 21 (2015).
  27. Curran, K. J., Brentjens, R. J. Chimeric antigen receptor T cells for cancer immunotherapy. J Clin Oncol. 33 (15), 1703-1706 (2015).
  28. Zappasodi, R., de Braud, F., Di Nicola, M. Lymphoma Immunotherapy: Current Status. Front. Immunol. 6, 448 (2015).
  29. Laprevotte, E., et al. Endogenous IL-8 acts as a CD16 co-activator for natural killer-mediated anti-CD20 B cell depletion in chronic lymphocytic leukemia. Leuk Res. 37 (4), 440-446 (2013).
  30. Maloney, D. G., et al. IDEC-C2B8 (Rituximab) anti-CD20 monoclonal antibody therapy in patients with relapsed low-grade non-Hodgkin's lymphoma. Blood. 90 (6), 2188-2195 (1997).
  31. Salles, G., et al. Phase 1 study results of the type II glycoengineered humanized anti-CD20 monoclonal antibody obinutuzumab (GA101) in B-cell lymphoma patients. Blood. 119 (22), 5126-5132 (2012).
  32. Terszowski, G., Klein, C., Stern, M. KIR/HLA interactions negatively affect rituximab- but not GA101 (obinutuzumab)-induced antibody-dependent cellular cytotoxicity. J Immunol. 192 (12), 5618-5624 (2014).
  33. Hsu, A. K., et al. The immunostimulatory effect of lenalidomide on NK-cell function is profoundly inhibited by concurrent dexamethasone therapy. Blood. 117 (5), 1605-1613 (2011).
  34. Salih, J., et al. The BCR/ABL-inhibitors imatinib, nilotinib and dasatinib differentially affect NK cell reactivity. Int J Cancer. 127 (9), 2119-2128 (2010).
  35. Benson, D. M., et al. A phase 1 trial of the anti-KIR antibody IPH2101 in patients with relapsed/refractory multiple myeloma. Blood. 120 (22), 4324-4333 (2012).
  36. Vey, N., et al. A phase 1 trial of the anti-inhibitory KIR mAb IPH2101 for AML in complete remission. Blood. 120 (22), 4317-4323 (2012).
  37. Terme, M., Ullrich, E., Delahaye, N. F., Chaput, N., Zitvogel, L. Natural killer cell-directed therapies: moving from unexpected results to successful strategies. Nat Immunol. 9 (5), 486-494 (2008).

Tags

Immunologie NK-cellen CD107a cytotoxiciteit functie IFN-γ MIP-1β K562 cellen
Flowcytometrie-gebaseerde test voor het toezicht op NK celfuncties
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, … More

Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, N., Ullrich, E. Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions. J. Vis. Exp. (116), e54615, doi:10.3791/54615 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter