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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Cytométrie de flux à base de test pour la surveillance des cellules NK Fonctions

Published: October 30, 2016 doi: 10.3791/54615
Automatic Translation
*1,2, *3,4, 1,2, 1,2
1Childrens Hospital, Department of Pediatric Stem Cell Transplantation and Immunology, Johann Wolfgang Goethe-University, 2LOEWE Center for Cell and Gene Therapy, Johann Wolfgang Goethe-University, 3Institute for Cancer Research, Department of Cancer Immunology, Oslo University Hospital, Radiumhospital, 4The KG Jebsen Center for Cancer Immunotherapy, Institute of Clinical Medicine, University of Oslo
* These authors contributed equally

Summary

Une méthode simple et fiable est décrit ici pour analyser un ensemble de fonctions des cellules NK telles que la dégranulation, la cytokine et la production de chimiokines dans les différents sous-ensembles de cellules NK.

Introduction

Dans le cadre du système immunitaire inné tueuses naturelles (cellules NK) contribuent à la première ligne de défense contre les cellules infectées par le virus ou malignement transformées. Un système de récepteurs inhibiteurs et activateurs qui leur permet de distinguer entre les cellules saines et transformées sans apprêt préalable de l'antigène, contrairement aux lymphocytes T. Lors de la rencontre de la cellule cible les cellules NK libèrent le contenu de leurs granules cytotoxiques (par exemple, perforine, granzymes) dans la synapse immunitaire de tuer leur cible. En outre, les cellules NK produisent et sécrètent différents types de cytokines (par exemple, gamma interferon: IFN-γ, facteur de nécrose tumorale α: le TNF-α) et de chimiokines (par exemple, macrophage inflammatoire protéine-1β: MIP-1 ß) sur la cellule cible l' interaction ou la stimulation des cytokines 1.

les fonctions des cellules NK suffisantes telles que la cytotoxicité, la chimiokine et la production de cytokines ont un impact important sur le sort des diverses dissoulage. Les patients leucémiques montrent une augmentation des taux de rechute si elles présentent un profil défectueux des cellules NK au moment du diagnostic consistant en une production réduite de l' IFN-γ et une expression réduite d'activation des cellules NK 2 récepteurs. Un redressement rapide du nombre de cellules NK et la fonction , y compris la production de cytokines lors de l' interaction de la cellule cible est associée à une rechute réduite et l' amélioration de taux de survie chez les patients recevant souches allogéniques transplantation de cellules 3. En outre, lors de l' initiation de la thérapie par interféron chez les patients infectés par le virus de l' hépatite C dont la capacité de dégranulation des cellules NK périphériques est plus forte dans les premiers répondeurs que chez les non-répondeurs 4. Le nombre de cellules NK (> 80 / ul) au jour 15 après la transplantation de cellules souches autologues (autoSCT) chez les patients souffrant d' un lymphome ou un myélome multiple sont prédictifs d'une amélioration sans progression et la survie globale 5. Chez les patients souffrant de mélanome l'expression de la cellule T et immunoglobulin- mucine domaine containing molécule-3 (TIM-3), une protéine de régulation immunitaire sur les cellules NK, est en corrélation avec stade de la maladie et le pronostic 6.

Les scientifiques ont suivi les fonctions des cellules NK au cours des dernières décennies. L'analyse initiale de cytotoxicité des cellules NK contre les cellules tumorales sans amorçage préalable a été traitée en utilisant un dosage 51 Cr-release 7. Plus récemment, des chercheurs ont développé un procédé non radioactif pour évaluer la cytotoxicité des cellules NK expansées 8. Cytokine et chimiokine production a souvent été évaluée en utilisant un dosage immuno (ELISA) techniques liés aux enzymes 9,10. Au cours des dernières décennies, ces méthodes ont été complétés par des essais à base de cytométrie en flux. L'utilisation d'inhibiteurs de la protéine de transport (par exemple, la monensine et la brefeldine A) et des procédés de perméabilisation cellulaire en combinaison avec des protocoles de coloration de surface classiques ont permis aux chercheurs d'étudier la chimiokine et la production de cytokines dans différents ganglions spécifiquesous - ensembles de ocyte (par exemple, T, cellules NK B ou) 11. En outre, des dosages à base de cytométrie de flux ont été développés pour surveiller T et la cytotoxicité des cellules NK. En 2004 , Alter et al. , Décrit l'expression de surface de la protéine associée au lysosome CD107a (Lampe 1) sur les cellules NK à la rencontre de la cellule cible en tant que marqueur pour la dégranulation des granules 12 cytotoxiques. Etant donné qu'une large gamme de différents fluorochromes et les cytomètres de flux à canaux multiples sont disponibles de nos jours, il est devenu possible de surveiller simultanément les différentes fonctions cellulaires (NK cytotoxicité, de cytokines et de production de chimiokine) dans différents sous-ensembles de cellules NK. Cela devient particulièrement important dans les situations où la taille de l' échantillon est limitée, par exemple, dans des biopsies ou des échantillons de sang de patients atteints de leucopénie.

Pour tester les fonctions globales de cellules NK, les essais à base de cytométrie de flux différents peuvent être efficacement combinés. Theorell et al. Les cellules NK stimulées de headonateurs lthy avec la lignée cellulaire tumorale K562 et analysé NK dégranulation cellulaire, signal à l' intérieur-out et chimiokine production via cytométrie en flux 13. Récemment des sous-groupes de cellules NK, phénotypes et fonctions chez les patients de tumeur pendant autoSCT ont été analysées à l'aide de flux tests basés sur la cytométrie. Il a été démontré que les cellules NK ont été capables de produire des cytokines et dégranulent / chimiokines sur la reconnaissance des cellules tumorales à des moments très tôt après 11 autoSCT.

Ici, un protocole est décrit pour évaluer les fonctions des cellules NK lors de l'interaction avec des cellules tumorales y compris la capacité de la dégranulation, la chimiokine et la production de cytokines à l'aide d'un flux de dosage basé sur une cytométrie qui permet de contrôler les fonctions des cellules NK dans les différents sous-ensembles simultanément.

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Protocol

Cette étude a été réalisée en conformité avec les recommandations du comité d'éthique local de l'Université de Francfort.

1. Culture de cellules K562

  1. La culture de cellules K562 en R10 (Media RPMI1640 avec du milieu de glutamine, 1% de pénicilline / streptomycine, 10% de sérum de veau foetal) à une densité de 0,5-1 x 10 6 cellules par ml dans un flacon de culture cellulaire à 37 ° C et 5% de CO 2.
  2. Récolte des cellules K562 24 h Avant le début d'une nouvelle expérience.
    1. Retirer le flacon de culture cellulaire contenant les cellules K562 à partir de l'incubateur. Remettre en suspension les cellules K562 au sein des milieux de culture en pipettant doucement vers le haut et vers le bas.
    2. Transférer le milieu de culture contenant les cellules K562 dans un tube de 15 ou 50 ml et un culot cellulaire à 400 g pendant 8 min. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 5 ml de milieu R10 et bien mélanger.
    3. Transférer 20 ul de la solution de cellules dans un puits d'une plaque à 96 puits en U. Ajouter 20 ul bleu trypan etbien mélanger par pipetage de haut en bas pendant au moins 5 fois. Introduire à la pipette 10 ul de la solution dans une chambre de comptage de cellules et compter les cellules.
    4. Pellet les cellules à 400 g pendant 8 min. Re-suspendre les cellules dans R10 médias et ajuster la concentration de cellules K562 à 0,5-1 x 10 6 cellules par ml.
    5. Incuber les cellules K562 dans un flacon de culture cellulaire à 37 ° C et 5% de CO 2 jusqu'à son utilisation.

2. Isolement des cellules NK

  1. Selon l'approbation et les directives du comité d'éthique local, obtenir le consentement éclairé du donneur ou d'un patient en bonne santé avant la collecte de 6-10 ml de l'EDTA ou du sang périphérique hépariné.
  2. Conserver les réactifs pour l'isolement des cellules NK à 4 ° C jusqu'à ce que le début de l'expérience, puis les utiliser à la température ambiante (RT) dans des conditions stériles. Isoler les cellules NK de sang périphérique en utilisant des microbilles magnétiques et un aimant pour l'isolement spécifique des cellules T selon lail les instructions du fabricant.
    1. Reconstituer un flacon de la cellule NK lyophilisée isolement négative cocktail d'anticorps par pipetage 7,5 ml du tampon fourni A (inclus dans le kit d'isolement des cellules NK) dans le flacon. Mélanger doucement par pipetage de haut en bas 3-4 fois.
      REMARQUE: Assurez-vous que la suspension est homogène avant chaque utilisation.
    2. Préparer la solution finale de cocktail en mélangeant des volumes appropriés de la pastille reconstitué à partir de l'étape 2.2.1 et le tampon B (inclus dans le kit d'isolement des cellules NK). Pour déterminer ces volumes, de définir le volume de l'échantillon de sang total en ml le volume = 1,0. Utiliser 0,25 volume de la pastille reconstitué (étape 2.2.1) et 0,25 volume de tampon B à traiter 1 volume de sang total.
    3. Transférer le mélange dans un tube adéquat contenant l'échantillon de sang entier. Ne pas pipeter de haut en bas pour éviter la perte de sang au sein de la pipette. Au lieu de cela, fermer le tube et le déplacer avec précaution de haut en bas jusqu'à ce que la suspension est homogène. Ne pas vortex.
    4. homogénéiser davantage l'échantillon en utilisant un dispositif de rotation du tube pendant 5 min à température ambiante.
    5. Dans des conditions stériles, enlever le bouchon et placer le tube dans le séparateur magnétique pendant 15 min tel que recommandé par le fabricant. Assurez-vous que les étiquettes de tube soient orientés vers l'arrière de l'aimant pour permettre une visibilité tranquille de la ligne de séparation. Ne pas déplacer l'aimant lors de la séparation, que cette procédure serait perturbé.
    6. Soigneusement transférer le surnageant dans un nouveau tube de 15 ml et remplir avec un milieu complet (CM, les médias hématopoïétique cellulaire, 1% de pénicilline / streptomycine, 5% des sérums humains). Pellet les cellules à 400 g pendant 8 min.
      1. Facultatif: Si la pastille est rouge, remettre en suspension les cellules dans 1 ml de tampon de lyse des erythrocytes (par exemple, 1 ml d'ammoniaque-chlorure de potassium (ACK) tampon de lyse: 155 mM de NH4CI, 0,1 mM d' EDTA, 10 mM KHCO3 dans 1 litre d'eau distillée (DW)) et laisser incuber pendant 8 minutes à température ambiante. Vous pouvez également utiliser un erkit de déplétion ythrocyte.
        NOTE: Gardez à l' esprit, que l'utilisation d' un tampon ACK pourrait avoir un impact négatif sur les fonctions des cellules NK 14.
      2. Diluer rapidement le tampon ACK en ajoutant au moins 1 ml de CM pour arrêter la lyse et centrifuger à 400 g pendant 8 min pour sédimenter les cellules.
    7. Re-suspendre le culot cellulaire dans 1 ml CM et procéder au dépouillement. Transférer 20 ul de la solution de cellules NK sur une plaque à 96 puits en U. Ajouter 20 pi de bleu de méthylène dans chaque puits et bien mélanger par pipetage de haut en bas pendant au moins 5 fois. Introduire à la pipette 10 ul de la solution dans une chambre de comptage de cellules et de cellules compter. Vous pouvez également utiliser 30 pl de suspension cellulaire non dilué pour le comptage avec un compteur de cellules disponibles dans le commerce.
    8. Ajuster les cellules à une concentration d'au moins 2 x 10 4 cellules NK par 100 ul de CM.
    9. Effectuer une coloration d'anticorps de surface de la population isolée de cellules NK pour vérifier la pureté en utilisant un cytomètre de flux.
      1. Prepare une solution maître de mélange en mélangeant les volumes des anticorps indiqués selon le tableau 1.
      2. Remettre en suspension les cellules dans 88,5 ul de tampon de lavage (WB; 0,5% de sérum albumine bovine (BSA), 0,1% de NaN3 dans du PBS) et ajouter 11,5 ul de la solution maître de mixage. Incuber les cellules pendant 20 min à 4 ° C dans l'obscurité.
        Attention: NaN 3 est toxique et mutagène. Poignée en conséquence à la fiche de données de sécurité correspondantes (MSDS).
      3. Ajouter 1 ml de WB et sédimenter les cellules à 400 g pendant 4 min.
      4. Re-suspendre les cellules dans un tampon de coloration 300 pi, plus DAPI. Acquérir les cellules en utilisant un cytomètre de flux.
        REMARQUE: poursuivre l'essai que si la pureté des cellules NK est d'au moins 80% de tous les lymphocytes vivants.

3. La récolte des cellules K562 pour cellules NK Stimulation

  1. Retirer le flacon de culture cellulaire contenant les cellules K562 (étape 1.2) du ième e incubateur. Remettre en suspension les cellules K562 au sein des milieux de culture en pipettant doucement vers le haut et vers le bas.
  2. Transférer l'ensemble des milieux de culture dans un tube 15 ou 50 ml et sédimenter les cellules à 400 g pendant 8 min. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 5 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et bien mélanger.
  3. Transférer 20 ul de la solution de cellules dans un puits d'une plaque à 96 puits en U. Ajouter 20 ul bleu trypan et bien mélanger par pipetage de haut en bas pendant au moins 5 fois. Introduire à la pipette 10 ul de la solution dans une chambre de comptage de cellules et compter les cellules. Sinon, utiliser 30 pl de suspension cellulaire non dilué compter avec un compteur de cellules disponibles dans le commerce.
  4. Pellet les cellules à 400 g pendant 8 min. Remettre en suspension les cellules CM à une concentration d'au moins 2 x 10 4 cellules K562 par 100 ul de milieu de.
    REMARQUE: Utilisez le même K562 et les concentrations de cellules NK pour incuber les deux à un effecteur: cible (E: T) rapport de 1: 1 plus tard.
"> 4. Stimulation des cellules NK avec la tumeur cellulaire K562 Line et Cytokines

  1. Mélanger délicatement les cellules en les pipetant pendant au moins 5 fois. Distribuer 100 pl / puits de la solution des cellules NK dans les puits nécessaires d'une plaque à 96 puits V.
    1. Utilisez au moins deux puits pour chaque donneur, une avec et l' autre sans un stimulus (par exemple, des cellules tumorales K562 et cytokines). Chaque fois que possible, réaliser l'expérience au moins en double et ajouter un contrôle positif (par exemple, phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) et ionomycine; concentration finale: 50 nM PMA, 1 uM ionomycine par puits). Préparer le flux mis à jour cytométrie compensations pour la date de l'expérience.
      NOTE: Titrer les anticorps avant utilisation (voir la discussion).
  2. Eteignez la lumière et ajouter l'anticorps anti-CD107a (2 pl, concentration finale: 1: 100) à chaque puits avec des cellules NK sur la plaque 96-V-bien.
  3. Mélanger délicatement les cellules K562 en les pipetant auau moins 5 fois.
    1. Des puits contenant le / anti-CD107a solution d'anticorps des cellules NK, identifier celles prévues pour la stimulation avec des cellules K562. Ajouter 100 ul / puits de la solution de cellules K562 dans ces puits. Mélanger soigneusement par pipetage de haut en bas pendant au moins 5 fois.
    2. Ajouter l'interleukine-2 (IL-2, la concentration finale de 100 U / ml) et l'interleukine-15 (IL-15; concentration finale de 10 ng / ml) dans les puits contenant des cellules K562 et la solution d'anticorps des cellules NK / anti-CD107a.
      1. Facultatif: Testez l'impact de soit des cellules K562 ou cytokines seul sur les cellules NK distribués à déchiffrer contre les fonctions des cellules NK induite par des cytokines induite par une tumeur.
    3. Identifier les puits sur la plaque 96-V-bien planifié contrôles négatifs sans stimulus. Ajouter 100 pl / puits CM à ces puits ne contenant que la solution d'anticorps des cellules NK / anti-CD107a. Mélanger soigneusement par pipetage de haut en bas pendant au moins 5 fois.
      1. Facultatif: Pour un contrôle positif, ajouter 100 μ; L cm contenant du PMA et de l'ionomycine (concentration finale: 50 nM de PMA, ionomycine 1 pM par puits) dans un puits avec la solution d'anticorps des cellules NK / anti-CD107a.
  4. Incuber les cellules pendant 3 heures dans l'obscurité à 37 ° C et 5% de CO 2.
  5. Préparer une solution d'inhibiteur de transport des protéines (par exemple, la bréfeldine A et / ou la monensine) CM. Après 1 heure d'incubation, ajouter la solution à chaque puits de la plaque 96-V-bien avec la lumière éteinte (concentration finale: 0.5-1μM brefeldine A et 2-3 uM monensin). Mélanger soigneusement par pipetage de haut en bas pendant au moins 5 fois. Continuer l'incubation pour les 2 heures restantes.

5. Surface et intracellulaires Coloration

  1. Après la période d'incubation de 3 heures, mélanger les cellules dans les puits de la plaque 96-V-bien soigneusement par pipetage de haut en bas pendant au moins 5 fois et de les transférer dans des tubes de cytométrie de flux. Ajouter 1 ml / tube WB. cellules de granule à 400 xg pendant 4 min.
    1. Facultatif: Avant centrifugation rincer les puits avec 100 pl / puits de PBS, afin d'optimiser la récupération des cellules, par pipetage de haut en bas pendant au moins 5 fois avant de transférer les cellules dans le tube FACS respective.
  2. Jeter le surnageant et continuer avec le Coloration de surface.
  3. Inclure un colorant fluorescent amine réactif qui est non infiltrant de cellules vivantes avec un maximum d'émission de 423 nm comme morts marqueur de cellules fixable (DCM). Effectuer la coloration avant (voir ci-dessous) ou en parallèle avec la coloration de la surface de l'anticorps en fonction du type du DCM utilisé.
    1. Remettre en suspension les cellules dans 99 ul / tube de PBS et ajouter 1 pl / tube du DCM (concentration finale: 1: 100) peut être fixé. Mélanger les cellules et en utilisant un vortex et incuber pendant 15 min à température ambiante dans l'obscurité.
    2. Préparer une solution maître de mélange en mélangeant ensemble les anticorps «surface» figurant au tableau 2 (voir colonne de coloration étape surligné en bleu). Utilisez le endicated volumes / tube et les multiplier par le nombre de cytométrie de flux des tubes à être colorés.
    3. Après incubation prendre la cytométrie en flux tubes avec les cellules et ajouter 1 ml / tube WB. Pellet les cellules à 400 g pendant 4 min.
    4. Jeter le surnageant, remettre en suspension les cellules dans 84 ul / tube WB et ajouter 16 ul / tube de la solution maître de mélange. Mélanger les cellules puits en utilisant un vortex. Incuber les cellules pendant 20 min à 4 ° C dans l'obscurité.
    5. Après 20 minutes ajouter 1 ml / tube de WB et un culot de cellules à 400 g pendant 4 min.
  4. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 100 ul / tube d'une solution de fixation à froid (par exemple, 2% ( en ) finale paraformaldéhyde ou le formaldéhyde). Mélanger les cellules puits en utilisant un vortex. Incuber les cellules pendant 10 min à 4 ° C dans l'obscurité.
    1. Colorer les cellules pour intracellulaires cytokines / chimiokines après cette étape ou de les stocker pendant une nuit à 4 ° C dans WB.
      NOTE: Après une nuit d'incubation, une reprise de la cellule inférieure peut se produire.
  5. Laver les cellules dans 1 ml / tube de WB à 400 g pendant 4 min et passez à l'étape de perméabilisation.
  6. Préparer un tampon de perméabilisation (PB) (par exemple, 0,2% de saponine, une solution de BSA à 1% dans du PBS).
  7. Laver les cellules deux fois dans 1 ml / tube PB à 400 g pendant 4 min. Continuer avec la coloration intracellulaire.
    Attention: saponine est potentiellement irritant. Poignée en conséquence à la fiche de données de sécurité correspondantes (MSDS).
  8. Préparer une solution maître de mélange en utilisant les volumes indiqués «intracellulaires» d'anticorps dans le tableau 2 (mis en évidence en vert). Multipliez ces volumes avec le nombre de tubes à colorer.
    1. Re-suspendre les cellules dans 90 ul / tube de PB et d'appliquer 10 pl / tube de la solution d'anticorps maître de mélange. Bien mélanger à l'aide d'un vortex et incuber les cellules pendant 30 min à 4 ° C dans l'obscurité.
  9. Laver les cellules deux fois dans 1 ml / tube PB à 400 g pendant 4 min.
  10. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 400 ul / tube de PB. Mélanger les cellules puits en utilisant un vortex. Placez les cellules sur la glace dans l'obscurité jusqu'à la mesure.

6. cytométrie de flux d'indemnisation et d'acquisition

  1. Sélectionnez les canaux pour les différents fluorochromes (voir le tableau 2) dans le flux de cytométrie logiciel d'acquisition dans le dossier de configuration des paramètres. En outre, pour choisir les canaux pour le FSC-A et -H, ainsi que pour la SSC-A et -H.
  2. Chargez une matrice de compensation créé pour les paramètres choisis dans le fichier d'acquisition.
    1. Créer une matrice de compensation en utilisant des cellules NK isolées de l' étape 2.2.8 en effectuant une seule tache de couleur pour chaque fluorochrome utilisé (voir le tableau 2). Utilisez le protocole de coloration de surface décrit dans les étapes 5.1-5.4. Inclure un témoin non coloré (sans anticorps) ainsi que des contrôles d'isotype et / ou fluorescence moins un contrôle (FMO).
      NOTE: Comme une alternative à la rémunération à base de cellules, utiliser des billes en tant que témoins de compensation IgG contraignant.
    2. Placer chaque tube pour les échantillons individuels de teinture, et l'échantillon sans anticorps dans le port d'injection d'échantillon (SIP). Cliquez sur le bouton "enregistrement" dans le logiciel d'acquisition de cytométrie de flux et d' acquérir un certain nombre de cellules d'au moins 5 x 10 3 cellules NK par échantillon.
    3. Utilisez l'application de calcul de la rémunération du logiciel d'acquisition cytométrie pour créer une matrice de compensation.
  3. Créer Parcelles Dot pour identifier la cellule NK Population.
    1. Identifier des cellules individuelles à l'aide de FSC-A / FSC-H et SSC-A / SSC-H tracés de points. Cliquez sur le bouton "porte de polygone". Dessiner une grille autour des cellules, qui ont un modèle de distribution linéaire dans les deux tracés de points. Double-cliquez sur les portes pour ouvrir un nouveau tracé de points.
    2. Choisissez un terrain FSC-A / SSC-Un point pour identifier le lymphocyte/ Population de cellules NK (voir Figure 1). Dessiner une grille polygonale autour d'elle et double-cliquez sur la porte.
  4. Placer chaque tube de l'essai de stimulation des cellules NK de l'échantillon dans le protocole SIP. Cliquez sur le bouton "enregistrement" et d' acquérir un certain nombre de cellules d'au moins 5 x 10 3 cellules NK par échantillon.

7. Analyse et statistiques

  1. Ouvrir la cytométrie de flux logiciel d'analyse. Cliquez sur le bouton de chargement d'échantillon pour ouvrir l'échantillon témoin non stimulé.
  2. Créer un système Gating pour les différentes sous - populations de cellules NK (voir Figure 1).
    1. Cliquez sur le bouton de tracé de points pour créer une FSC-A / SSC-Un terrain. Cliquez sur le bouton de porte de rectangle et dessiner une porte rectangle sur tous les événements avec un-A FSC valeur> 5 x 10 4 à exclure les débris. Ouvrez la porte en double-cliquant sur la porte.
    2. Choisissez à nouveau les / SSC-A paramètres FSC-A au sein de la nouvelle parcelle point et cliquez sur le bouton de porte de polygone. répremière une porte de polygone autour de la population de lymphocytes (voir Figure 1). Ouvre la porte.
    3. Sélectionnez le SSC-A / SSC-H paramètre pour le nouveau tracé de points et dessiner une grille polygonale autour de toutes les cellules individuelles. Les cellules individuelles montrent une distribution linéaire sur les paramètres FSC-A / FSC-H et SSC-A / SSC-H (voir la figure 1). Ouvrez la porte en double-cliquant dessus.
    4. Répétez l'étape 7.2.3 en utilisant les paramètres FSC-A / FSC-H cette fois.
    5. Utilisez le paramètre CD45 and Dump canal (CD3, CD14, CD19; DCM) pour exclure les cellules mortes. Dessinez une porte rectangle autour de tous CD45 positif et Dump cellules de canal négatives. Ouvrez la porte en double-cliquant sur la porte.
    6. Identifier l'ensemble de la population de cellules NK en utilisant le CD56 et de vidage des paramètres de canal. Créer une grille de rectangle autour du CD56 positif et Dump canaliser les cellules négatives. Ouvrez la porte en double-cliquant dessus.
    7. Dessiner une grille rectangle autour de tous les trois sous-ensembles de cellules NK dans un CD56 / CD16 dot plot. Identifier les différents sous - ensembles comme CD56 ++ CD16 -, CD56 ++ CD16 + et des sous - ensembles de cellules CD56 + CD16 ++ NK.
  3. Analyser NK fonctions cellulaires pour chaque cellule individuelle Subset NK.
    1. Cliquez sur l'un des trois sous-ensembles de cellules NK portes pour l'ouvrir. Créer trois tracés de points différents pour CD56 / CD107a, CD56 / IFN-γ et CD56 / MIP-1β.
    2. Dessiner une grille rectangulaire pour les cellules positives CD56, qui sont positifs aussi bien pour CD107a, IFN-γ ou MIP-1β respectivement (voir Figure 1).
    3. Répétez l'étape 7.3.1-7.3.2 pour chaque sous-ensemble restant des cellules NK.
  4. Répétez l'étape 7.2 et 7.3 pour tous les échantillons stimulés. Enregistrer toutes les valeurs statistiques de chaque échantillon individuel en cliquant sur le bouton de statistique exportateurs dans le logiciel d'analyse.
  5. Ouvrez les fichiers contenant les valeurs statistiques des échantillons individuels pour analyser les fonctions des cellules NK. Sélectionnez les valeurs de cellules NK individuellesous - ensembles (par exemple, CD56 de la CD16 - les cellules NK) en les copiant dans un autre fichier.
    1. Soustraire le pourcentage de cellules NK CD107a positive, ce qui n'a pas été traité avec un stimulus, par rapport au pourcentage de cellules NK positives CD107a, qui ont été traités avec un stimulus.
      REMARQUE: Utilisez le résultat pour démontrer la capacité de dégranulation de cette cellule sous-ensemble NK particulier en réponse au stimulus.
    2. Répétez l'étape 7.5.1 pour l'IFN-γ et les cellules NK MIP-1ß-positifs pour démontrer la production de cytokines et de chimiokines, en réponse au stimulus.
    3. Répétez l'étape 7.5.1-7.5.2 pour chaque sous-ensemble restant de cellules NK pour évaluer leur capacité de dégranulation et la production cytokine / chimiokine lors de la stimulation.

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Representative Results

La stratégie d'ouverture de porte pour analyser la dégranulation, la production de cytokines et chimiokines de l' ensemble de la population de cellules NK et de trois sous - ensembles de cellules NK différentes sont illustrés sur la figure 1.

Des résultats représentatifs d'un donneur sain sont illustrés sur la figure 2. Les cellules NK sans stimulation produites ni IFN-γ , ni MIP-1β et n'a pas exprimé sur leur surface CD107a (figure 2A). En revanche, les cellules NK stimulées avec des cellules tumorales et des cytokines produites des quantités significatives de IFN-γ intracellulaire et MIP-1β. En outre, plus de 20% d'entre eux dégranulés lors de l' interaction des cellules tumorales exprimant indiquée par CD107a sur leur surface (figure 2C). La stimulation PMA et ionomycine ont été utilisées comme témoin (figure 2B).

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Figure 1:. Gating stratégie ultérieure portes sont tracées. Tout d'abord, les débris sont exclus dans une FSC-A / SSC-Un terrain. Ensuite, les lymphocytes sont identifiés et doublets sont exclus en utilisant deux parcelles avec SSC-A / SSC-H et FSC-A / FSC-H. Par la suite, une porte , y compris tous les CD45 + cellules et à l' exclusion de toutes les cellules mortes, CD3 +, CD14 + et CD19 + est réglé en traçant canal / Dump CD45. Ensuite, les cellules NK sont identifiés par gating sur les cellules CD56 +. Une parcelle avec CD56 / CD16 peut être utilisé pour identifier les principaux sous-ensembles de cellules NK. Enfin, dans toute la population des cellules NK, des marqueurs fonctionnels sont identifiés en traçant CD56 par rapport CD107a, l'IFN-γ et MIP-1β, respectivement. Cela peut se faire aussi bien pour tous les différents types de sous - ensembles de cellules NK. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.


Figure 2:. Les résultats représentatifs d'une cellule NK donneur en bonne santé en utilisant la stratégie de portillonnage décrit à la figure 1, les marqueurs fonctionnels tels que des cellules NK CD107a (pour la dégranulation), l' IFN-γ et MIP-1β peuvent être identifiés. La colonne de gauche (A) montre les résultats obtenus en utilisant des cellules NK en l'absence d'un stimulus. La colonne du milieu (B) montre les résultats en présence du contrôle positif PMA / ionomycine. La colonne de droite (C) présente les résultats pour les cellules NK stimulées par la lignée cellulaire tumorale K562 et en présence des cytokines IL - 2 (100 U / ml) et de l' IL-15 (10 ng / ml). S'il vous plaît , cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Tableau 1: Anticorps pour vérification de la pureté.

Tableau 2
Tableau 2: Anticorps pour coloration extra- et intracellulaire.

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Discussion

La méthode décrite est une approche facile, rapide et fiable pour étudier les fonctions des cellules NK à partir d'échantillons de sang total de donneurs sains ou de patients. Ce procédé offre le grand avantage de purifier directement les cellules NK dans le sang total, en évitant le temps centrifugation en gradient de densité, qui est obligatoire pour de nombreux autres procédés de purification 15. En outre, il nécessite une plus petite taille de l'échantillon par rapport à des procédés d'enrichissement / d'isolement des cellules NK "classique", ce qui en fait une solution appropriée pour des échantillons de patients pédiatriques et / ou immunodéficientes. Ce protocole peut être utilisé pour obtenir des valeurs de base des fonctions cellulaires NK ex vivo, mais il permet également la poursuite de la culture des cellules NK et d' expansion, étant de cette manière complémentaire avec les autres procédés précédemment décrits 8. Néanmoins, certaines étapes critiques doivent être prises en compte. Étant donné que le dosage est basé sur extra- et la coloration de l'anticorps intracellulaire, il est essentiel de déterminer la valeur optimale working concentration pour chaque premier anticorps. Surtout pour la coloration intracellulaire, une évaluation minutieuse des anticorps utilisés est fortement recommandé. Une bonne méthode consiste à tester une série de dilutions de l'anticorps utilisé (par exemple, 1: 100 à 1: 12,5) d'une suspension de cellules stimulées avec ou sans PMA / ionomycine. Par la suite le rapport des événements positifs entre les échantillons stimulés et non-stimulées sont calculées et tracées. La dilution d'anticorps la plus élevée avec le taux de variation positif de pliage (meilleur rapport signal sur bruit de fond) devrait être utilisé pour d' autres expériences 16. En outre, l'utilisation des commandes comme des commandes isotype- et FMO peut se révéler fondamentale en particulier pour la coloration intracellulaire afin de porte correctement sur les populations de cellules positives.

Cependant, il existe des limites importantes du procédé décrit. CD107a expression est un marqueur de la dégranulation et indique donc que de manière indirecte cytotoxicité des cellules NK. NK cytotoxicité cellulaire ae capacité de dégranulation peut être différent. Up-régulation de la voie de l' autophagie dans les cellules tumorales entraîne la dégradation des sécrétée granzyme b et réduit la mort cellulaire sur des cellules NK interaction 17. Par conséquent , un DCM supplémentaire (par exemple, la caspase clivé 3) pourrait être ajoutée au panneau de coloration afin de surveiller les événements de la mort cellulaire dans les cellules cibles 18. En outre, la cytotoxicité des cellules NK est influencée par la quantité de protéines cytotoxiques dans leurs granules (par exemple, la perforine, granzyme B), qui peut être quantifiée par une coloration intracellulaire 19,20.

En outre, il existe différentes possibilités de modifier le protocole. À la place des cellules NK isolées, des cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) peuvent être utilisés. Bien que l'on doit être conscient que le nombre de cellules NK absolue au sein de la population PBMC diffère entre les différents bailleurs de fonds et même entre les échantillons provenant du même donneur à différents points de temps. Cellules NK degranulation est fortement dépendante du rapport E: T. Afin de comparer les fonctions des cellules NK entre les différents bailleurs de fonds ou à divers points de temps, le nombre de cellules NK absolue au sein de la population PBMC doit être utilisé pour établir une constante E: rapport T à travers toutes les expériences. Si les fonctions des cellules NK sont surveillées à différents points de temps dans le même donneur, PBMC peuvent être congelés et l'analyse peut être fait à la fois pour tous les points de temps différents, afin de réduire les variations inter-expérimentales 11.

Etant donné que la coloration des panneaux avec jusqu'à 18 couleurs sont possibles, l'analyse des fonctions des cellules NK peut être étendu à un plus grand détail. En utilisant des marqueurs de surface supplémentaires, y compris CD57, NKG2A et cellules tueuses récepteurs de type immunoglobuline (KIR), d'autres sous-ensembles de cellules NK peuvent être identifiés. Les cellules NK formés exprimant au moins une auto-KIR dégranulent plus fort lors de l'interaction avec les cellules K562 que les cellules NK sans instruction. En revanche, CD57 plus différenciée + CD56 + - Les cellules NK CD56 + 21. En outre, d'autres marqueurs de la fonction des cellules NK peuvent être pris en compte. LFA-1 est une molécule importante pour l'adhésion des cellules NK et elle est exprimée dans sa conformation ouverte lors de l'activation des cellules NK. Ce soi-disant «signal inside-out" est une cellule NK marqueur d'activation précoce 22.

Enfin, les stimuli pour les fonctions des cellules NK de test peuvent être modifiés aussi bien. Dans notre expérience fraîchement isolées les cellules NK ne dégranulent mal sur K562 interaction cellulaire si aucune cytokines sont ajoutés. Utilisation de PBMC fraîchement isolés sans autre addition de cytokine contourner ce problème, en raison de l'influence des cellules de voisinage. Par ailleurs, la production de cytokines, en particulier l' IFN-γ et TNF-α, peut être initiée à l' IL-12 et IL-18 23 stimulation. La production d'IFN-γ dans les sous-ensembles de cellules NK peut différer depending sur le stimulus utilisé (cytokine par rapport à la stimulation induite par la cible) 24. En outre, au lieu d'utiliser des cellules K562 en tant que cellules cibles, des cellules tumorales primaires dérivées de patients atteints de tumeurs peuvent être utilisés pour tester les fonctions des cellules NK contre les cellules tumorales autologues avant ou pendant les traitements immunomodulateurs (par exemple, traitement de l' anticorps ou immunomodulatrices médicaments monoclonaux (IMiDs)).

Au cours des dernières années, le domaine de l' immunothérapie a évolué rapidement avec l'approbation clinique des inhibiteurs de point de contrôle immunitaire (par exemple, ipilumumab, nivolumumab, lambrolizumab) 25 et avec succès les essais en utilisant le récepteur de l' antigène chimère génétiquement modifié (CAR) exprimant des cellules T ainsi en tant que cellules NK (CAR-évalués en référence 26), pour le traitement des patients atteints de tumeurs hématologiques 27. Par conséquent NK immunothérapie à base de cellules devient de plus en plus dans le foyer. Les anticorps anti-CD20 ont été un grand succès dans le Treatment de lymphomes malins au cours des deux dernières décennies 28. La grande majorité des cellules NK expriment le récepteur Fc faible affinité CD16 permettant aux cellules de se reconnaître et de tuer des cellules cibles d'anticorps marqué (cytotoxicité cellulaire dépendant d'anticorps - ADCC). La capacité de l'anticorps à déclencher les fonctions des cellules NK peuvent être testés in vitro en utilisant le protocole décrit 29. Terszowski et al. , L'ADCC des cellules NK analysées par contre une lignée de cellules B lymphoblastoïdes en utilisant des anticorps anti-CD20 différents cliniquement approuvés. Alors que l' ADCC induite lors d'un traitement par rituximab (première approuvé cliniquement anticorps anti-CD20 30) a été influencé négativement par KIR / HLA interaction, cet effet n'a pas été observé lors de l' utilisation obinutuzumab (un roman glycosylation modifiée type II CD20 anticorps monoclonal) 31, 32. En outre, les fonctions des cellules NK sont influencées par divers médicaments anti-tumoraux tels que la lénalidomide IMiD 33 et les différentes tyrosine kinasinhibiteurs de e (TKI) 34. Actuellement des inhibiteurs de point de contrôle spécifiques des cellules NK ont été testés dans des essais cliniques. Des exemples sont l'utilisation d'anticorps anti-KIR ou 35,36 anticorps anti-NKG2A (NCT02331875), ainsi que des agonistes d' activation , comme un anticorps anti-CD137 (NCT01775631; NCT02110082).

Surtout, le transfert adoptif des cellules NK a été réalisée dans une variété de différentes pathologies malignes avec des effets cliniques prometteurs 37. Dans le but de sélectionner le meilleur donneur, les fonctions des cellules NK contre la tumeur du patient peuvent être testés in vitro en utilisant des échantillons de sang provenant de donneurs potentiels de cellules NK.

En résumé, le protocole décrit est conçu pour analyser les diverses fonctions des cellules NK provenant de donneurs sains ou de patients. Ces fonctions peuvent être contrôlées dans divers sous-ensembles de cellules NK sur divers stimuli aux points de temps choisis.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 + glutamine Invitrogen 6187-044
penicilin/streptomycin Invitrogen 15140-122
BD Falcon Round Bottom Tube BD 352008
fetal calf serum Invitrogen 10270-106 heat inactivated before use
T-flask Greiner Bio-One 690195
K562 tumor cell line DSMZ GmbH ACC 10
ammonium-chloride-potassium (ACK) lysis buffer made in house / components are listed in the text
Distilled water: Ampuwa Spüllösung 1,000 ml Plastipur Fresenius Kabi 1088813
Megafuge 40R Centrifuge Heraeus /
EDTA blood collector tubes Sarstedt 386453 S-Monovette 7.5 ml, K3EDTA
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Life Technologies 15575-020
Hematopoietic media (XVIVO) Lonza Group Ltd BE04-743Q
human serum DRK Blutspendedienst, Frankfurt/M  / healthy donors with blood type AB; heat inactivated before use
Neubauer-improved counting chamber, bright line Marienfeld superior/ LO-Laboroptik Ltd. 0640030/ 1110000
trypan blue solution (0.4%) Invitrogen 15250-061
3% acetic acid with methylene blue Stemcell Technologies  07060
Corning 96 Well Clear V-Bottom TC-treated Microplates Corning  3894
Falcon 96 Well Round Bottom Not Treated Microplates Corning  351177
DPBS (Ca2+- and Mg2+-free) Gibco Invitrogen 14190-169
BSA Sigma Aldrich A2153-100G
NaN3 Sigma Aldrich 08591-1ML-F
phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)  Merck 524400-1MG
ionomycin  PromoKine PK-CA577-1566-5
interleukin 15 (IL-15) PeproTech 200-15
Proleukin S (IL-2)  Novartis Pharma 730523
Golgi Stop, Protein Transport Inhibitor (containing Monensin) BD Biosciences 554724 This product can be used in combination or instead of Golgi Plug. The best combination for the wished experimental setting has to be tested.
Golgi Plug, Protein Transport Inhibitor (containing Brefeldin A) BD Biosciences 555029
paraformaldehyde AppliChem UN2209
saponin Sigma Aldrich 47036
flow cytometer: Canto10C BD Biosciences /
FlowJo TreeStar Inc. /
Graph Pad Graph Pad Inc. /
MACSxpress Separator Miltenyi Biotec  130-098-308
MACSxpress NK isolation kit Miltenyi Biotec  130-098-185
MACSxpress Erythrocyte Depletion Kit, human Miltenyi Biotec  130-098-196
MACSmix Tube Rotator  Miltenyi Biotec  130-090-753
anti-human CD3 APC Biolegend 300412
anti-human CD3 V450 BD Biosciences 560366
anti-human CD14 PerCP Miltenyi Biotec  130-094-969
anti-human CD14 V450 BD Biosciences 560349
anti-human CD16 PE Biolegend 302008
anti-human CD16 PerCP Biolegend 302029
anti-human CD19 PE-Cy7 Biolegend 302216
anti-human CD19 V450 BD Biosciences 560353
anti-human CD45 BV510 BD Biosciences 563204
anti-human CD56 FITC Biolegend 345811
anti-human CD107a PE Biolegend 328608
anti-human IFN-γ AF-647 BD Biosciences 557729
anti-human MIP-1β APC-H7 BD Biosciences 561280
DAPI Biolegend 422801
Zombie Violet Fixable Viability Kit Biolegend 423113 fixable dead cell marker

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References

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Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, N., Ullrich, E. Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions. J. Vis. Exp. (116), e54615, doi:10.3791/54615 (2016).

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