Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Flow Cytometry מבוסס Assay עבור הניטור של פונקציות תא NK

Published: October 30, 2016 doi: 10.3791/54615
Automatic Translation
*1,2, *3,4, 1,2, 1,2
1Childrens Hospital, Department of Pediatric Stem Cell Transplantation and Immunology, Johann Wolfgang Goethe-University, 2LOEWE Center for Cell and Gene Therapy, Johann Wolfgang Goethe-University, 3Institute for Cancer Research, Department of Cancer Immunology, Oslo University Hospital, Radiumhospital, 4The KG Jebsen Center for Cancer Immunotherapy, Institute of Clinical Medicine, University of Oslo
* These authors contributed equally

Summary

שיטה פשוטה ואמינה מתוארת כאן כדי לנתח קבוצה של פונקציות תא NK כגון degranulation, ציטוקינים וייצור chemokine בתוך תת תא NK שונה.

Introduction

במסגרת ההרג הטבעי מערכת חיסון המולדת (NK) תאים לתרום קו ההגנה הראשון נגד שנדבק בנגיף או רע ומר טרנספורמציה תאים. מערכת של קולטנים מעכב והפעלה מאפשרת להם להבחין בין תאים בריאים טרנספורמציה ללא תחול אנטיגן לפני בניגוד לתאי T. לאחר מפגש תא המטרה תא NK לשחרר את התוכן של הגרגרים שלהם ציטוטוקסיות (למשל, perforin, granzymes) לתוך הסינפסה החיסונית להרוג היעד שלהם. יתר על כן, תאי NK מייצרים ומפרישים סוגים שונים של ציטוקינים (למשל, γ interferon-: IFN-γ; הגידול נמק-α גורם: TNF-α) וכמוקינים (למשל,-1β חלבון דלקתי מקרופאג: MIP-1β) על תא המטרה אינטראקציה או ציטוקינים גירוי 1.

מספיק פונקציות תא NK כגון רעילות, chemokine וייצור ציטוקינים יש השפעה חשובה על גורל דיס מגווןמקל. חולי לוקמיה להראות גדל בשיעור ההתקפים אם הם מפגינים פרופיל תא NK פגום בעת האבחנה המורכב של ייצור IFN-γ מופחת התבטאות מופחתת של הפעלת 2 לקולטנים המצויים בתאי NK. התאוששות מוקדמת של מספרים הסלולריים NK ותפקוד כולל ייצור ציטוקינים על אינטראקצית תא המטרה קשורה להרע מופחת שיעור הישרדות משופר בחולים מקבל השתלת תאי גזע אלוגנאית 3. יתר על כן, על התחלת טיפול אינטרפרון בחולים שנדבקו בנגיף הפטיטיס C קיבולת degranulation של תאים היקפיים NK הוא חזק המגיבים מוקדם מאשר שלא הגיבו לטיפול 4. מספרי תא NK (> 80 / μl) ביום 15 לאחר השתלת מח עצם אוטולוגית (autoSCT) בחולים הסובלים מלימפומה או מיאלומה נפוצה הם המנבאים התקדמות משופרת חופשית הכוללת הישרדות 5. בחולים מלנומה הביטוי של T-cell immunoglobulin- ו mucin-מושלם-containinמולקולת -3 G (TIM-3), חלבון חיסוני רגולציה על תאי NK, עולה בקנה אחד עם שלב מחלה והפרוגנוזה 6.

מדעני פיקוח פונקציות תא NK לאורך העשורים האחרונים. הניתוח הראשוני של cytotoxicity תא NK כנגד תאים סרטניים ללא תחול לפני טופל באמצעות assay 51 Cr-שחרור 7. לאחרונה, מדענים פתחו שיטה שאינה רדיואקטיבי כדי להעריך את הרעילות של תאי NK המורחבים 8. ייצור ציטוקינים ו chemokine נבדק לעתים קרובות באמצעות assay immunosorbent enzyme-linked (ELISA) טכניקות 9,10. במהלך העשורים האחרונים שיטות אלה כבר כהשלמת מבחני זרימה מבוססת cytometry. השימוש מעכבי תחבורת חלבון (לדוגמא, brefeldin ו monensin) ושיטות התא permeabilization בשילוב עם פרוטוקולים מכתימים קונבנציונלי שטח אפשר למדענים לחקור chemokine וייצור ציטוקינים ב הלימפה ספציפית שונהתת ocyte (למשל, T, B או תאי NK) 11. יתר על כן, מבחני cytometry מבוסס זרימה שונה פותחו כדי לפקח T ו- NK cytotoxicity תא. בשנת 2004 אלתר ואח. תאר את ביטוי השטח של החלבון ליזוזום הקשורים CD107a (Lamp1) על תאי NK על מפגש תא המטרה כסמן עבור degranulation של גרגרי ציטוטוקסיות 12. מאז מגוון רחב של fluorochromes השונה cytometers זרימת רב ​​ערוצית זמין בימינו, זה הפך להיות אפשרי לפקח בו זמנית פונקציות תא NK מגוונות (cytotoxicity, ציטוקינים וייצור chemokine) תת תאים שונים NK. זה הופך להיות חשוב במיוחד במצבים בהם גודל המדגם מוגבל, למשל, ב ביופסיות או דגימות דם של חולים הסובלים לויקופניה.

כדי לבדוק פונקציות תא NK העולמיות, מבחני הזרימה השונה מבוסס cytometry ניתן לשלב ביעילות. Theorell et al. תאי NK מגורה מ heaתורמי lthy עם קו התאים הסרטניים K562 ונותח degranulation תא NK, ייצור אות ו chemokine מבפנים החוצה באמצעות זרימת cytometry 13. לאחרונה תת-קבוצות תא NK, פנוטיפים ופונקציות בחולי גידול בזמן autoSCT נותחו באמצעות לזרום מבחני cytometry מבוססים. זה הודגם כי תאי NK הצליחו degranulate ולייצר ציטוקינים / כמוקינים בעת ההכרה תאים סרטניים בנקודות מוקדם מאוד זמן אחרי autoSCT 11.

הנה פרוטוקול מתואר להעריך פונקציות תא NK על אינטראקציה עם תאים סרטניים כוללים קיבולת degranulation, chemokine וייצור ציטוקינים באמצעות זרימה cytometry המבוסס assay זה עושה את זה ניתן לבצע מעקב אחר פונקציות תא NK תת שונים בו זמנית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

מחקר זה בוצע בהתאם להמלצות של ועדת האתיקה המקומית מאוניברסיטת פרנקפורט.

1. Culturing של תאי K562

  1. K562 תאים תרבות בתקשורת R10 (RPMI1640 עם המדיום גלוטמין, 1% פניצילין / סטרפטומיצין, 10% נסיוב עגל עוברית) בצפיפות של 0.5-1 x 10 6 תאים לכל מ"ל בבקבוק תרבית תאים על 37 מעלות צלזיוס ו- CO 5% 2.
  2. תאי הקציר K562 24 שעות לפני תחילת ניסוי חדש.
    1. הסר את בקבוק תרבית תאים המכיל את תאי K562 מן החממה. Re- להשעות את תאי K562 בתוך התקשורת והתרבות על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה.
    2. מעביר את התקשורת והתרבות המכילה את תאי K562 לתוך צינור 15 או 50 מיליליטר ו גלולת התאים ב 400 XG במשך 8 דקות. בטל supernatant מחדש להשעות את התאים 5 מ"ל התקשורת R10 ומערבבים היטב.
    3. העברת 20 μl של פתרון התא לתוך באר של צלחת 96-U-היטב. הוסף 20 μl trypan כחול וומערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה במשך 5 פעמים לפחות. פיפטה 10 μl של פתרון לתוך תא ספירת תאים לספור את התאים.
    4. גלולת התאים ב 400 XG במשך 8 דקות. Re- להשעות את תאי תקשורת R10 ולהתאים את ריכוז תאי K562 כדי 0.5-1 x 10 6 תאים לכל מיליליטר.
    5. דגירת תאי K562 בבקבוק תרבית תאים על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עד שימוש.

בידוד 2. של תאי NK

  1. על פי אישור והנחיות של ועדת האתיקה המקומית, קבלת הסכמה מדעת בכתב של התורם או המטופל בריא לפני גביית 6-10 מ"ל של או EDTA או דם היקפי heparinized.
  2. ריאגנטים חנות עבור בידוד תא NK ב 4 מעלות צלזיוס עד תחילת הניסוי ולאחר מכן להשתמש בהם בטמפרטורת החדר (RT) בתנאים סטריליים. לבודד תאי NK מדם היקפי באמצעות microbeads מגנטי מגנט ספציפי בידוד תא פי tהוא הוראות היצרן.
    1. לשקם בקבוקון אחד של הקוקטייל של נוגדני בידוד שלילי תא NK lyophilized על ידי pipetting 7.5 מיליליטר של החיץ ספק (הכלול בתוך ערכת בידוד תא NK) לתוך הבקבוקון. מערבבים בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה 3-4 פעמים.
      הערה: ודא, כי ההשעיה היא הומוגנית לפני כל שימוש.
    2. הכן את הפתרון קוקטייל הסופי על ידי ערבוב כמויות מתאימות של גלולה מחדש משלב 2.2.1 ו חיץ B (כלול בתוך ערכת בידוד תא NK). כדי לקבוע כרכים אלה, להגדיר את עוצמת הקול של כל דגימת דם ב מ"ל כמו נפח = 1.0. השתמש 0.25 כרכים של גלולה מחדש (משלב 2.2.1) ו -0.25 כרכים של חיץ B לעבד 1 נפח של דם מלא.
    3. מעבירים את התערובת לתוך צינור הולם המכיל את כל דגימת דם. אל פיפטה למעלה ולמטה כדי להימנע מאובדן דם בתוך פיפטה. במקום זאת, לסגור את הצינור והעבר אותו בזהירות מעלה ומטה עד suspenשיאון הוא הומוגני. לא מערבולת.
    4. בהמשך homogenize המדגם באמצעות Rotator צינור במשך 5 דקות ב RT.
    5. בתנאים סטריליים, להסיר את הכובע במקום הצינור לתוך המפריד המגנטי במשך 15 דקות כפי מומלץ על ידי היצרן. ודא כי תוויות צינור הפנים כלפי הישבן של המגנט כדי לאפשר שקיפות מופרעת של קו ההפרדה. אל תזיז את המגנט במהלך ההפרדה, משום שהליך רפואי זה לא יוזז.
    6. להעביר בזהירות את supernatant לתוך צינור חדש 15 מ"ל ו להתמלא מדיה מלאה (CM; מדיה תא hematopoietic, 1% פניצילין / סטרפטומיצין, 5% האנושי סרה). גלולת התאים ב 400 XG במשך 8 דקות.
      1. אופציונלי: אם גלולה הוא אדום, מחדש להשעות את התאים 1ml של חיץ תמוגה כדורית אדומה (למשל, 1 מ"ל של אמוניום כלוריד-אשלגן (ACK) lysing חיץ: 155 מ"מ NH 4 Cl; 0.1 מ"מ EDTA; 10 מ"מ KHCO 3 ב 1 מים מזוקקים L (DW)) דגירה במשך 8 דקות ב RT. לחלופין, להשתמש erערכת דלדול ythrocyte.
        הערה: זכור, כי השימוש חיץ ACK כאמור עלול להשפיע לרעה על תפקודי התא NK 14.
      2. במהירות לדלל למאגר ACK על ידי הוספת לפחות 1 מ"ל של CM לעצור את תמוגה צנטריפוגות ב 400 XG במשך 8 דקות עד גלולה התאים.
    7. Re- להשעות את התא גלולה ב 1 ס"מ מ"ל ולהמשיך עם היד נטויה. עבר 20 μl של פתרון תא NK לצלחת 96-U-היטב. הוסף 20 μl של מתילן כחול היטב כל ומערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה במשך 5 פעמים לפחות. פיפטה 10 μl של פתרון לתוך תא ספירת תאים ותאי לספור. לחלופין, להשתמש 30 μl של השעית תא חייה לספירה עם דלפק תא זמין מסחרי.
    8. התאם את תאי ריכוז של לפחות 2 x 10 4 תאי NK לכל 100 μl CM.
    9. בצע מכתים נוגדן השטח של אוכלוסיית התאים המבודדת NK לבדוק את הטוהר באמצעות cytometer זרימה.
      1. יחסי ציבורepare פתרון תערובת אמן על ידי ערבוב הכרכים של נוגדנים הצביעו לפי טבלה 1.
      2. Re- להשעות את התאים 88.5 כביסה חיץ μl (WB; 0.5% בסרום שור אלבומין (BSA), 0.1% NaN 3 ב PBS) ולהוסיף 11.5 μl של פתרון שילוב הורים. דגירת התאים במשך 20 דקות ב 4 ° C בחושך.
        זהירות: NaN 3 רעילים mutagen. טפל בו בהתאם לגיליון הבטיחות של החומר המתאים (MSDS).
      3. הוסף 1 מ"ל של WB ו גלולה התאים ב 400 XG למשך 4 דקות.
      4. Re- להשעות התאים חיץ מכתים 300 μl בתוספת DAPI. רוכש את התאים באמצעות cytometer זרימה.
        הערה: להמשיך הלאה עם הניסוי רק אם טוהר תא NK הוא לפחות 80% מכלל לימפוציטים בחיים.

קציר 3. של תאי K562 עבור גירוי תא NK

  1. הסר את בקבוק תרבית תאים המכיל את תאי K562 (משלב 1.2) מ ה חממת דואר. Re- להשעות את תאי K562 בתוך התקשורת והתרבות על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה.
  2. מעבירים את התקשורת והתרבות כולה לתוך צינור 15 או 50 מ"ל ו גלולה התאים ב 400 XG במשך 8 דקות. בטל supernatant מחדש להשעות את התאים מלוחים מ"ל 5 פוספט שנאגרו (PBS) ומערבבים היטב.
  3. העברת 20 μl של פתרון התא לתוך באר של צלחת 96-U-היטב. הוסף 20 μl trypan כחול ומערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה במשך 5 פעמים לפחות. פיפטה 10 μl של פתרון לתוך תא ספירת תאים לספור את התאים. לחלופין להשתמש 30 μl של השעית תא חייה לספור עם דלפק תא זמין מסחרי.
  4. גלולת התאים ב 400 XG במשך 8 דקות. Re להשעות תאים CM בריכוז של לפחות 2 x 10 4 תאים לכל K562 100 מדיה μl.
    הערה: משתמש באותה K562 וריכוז תא NK כדי לדגור הוא לעבר מפעיל: היעד (E: T) יחס של 1: 1 בהמשך.
"> 4. גירוי של תאי NK עם K562 בשורת תאים סרטניים וציטוקינים

  1. לערבב בעדינות את התאים על ידי pipetting אותם מעלה ומטה במשך 5 פעמים לפחות. הפץ 100 μl / טוב של פתרון התא NK לתוך הבארות הנדרשות של צלחת 96-V-היטב.
    1. השתמש לפחות שתי בארות עבור כל תורם, אחד עם ואחד בלי גירוי (למשל, תאים סרטניים K562 וציטוקינים). במידת האפשר, לבצע את הניסוי לפחות בשני עותקים ולהוסיף כביקורת חיובית (למשל, phorbol 12-myristate 13-אצטט (PMA) ו ionomycin; לריכוז סופי: 50 ננומטר PMA, 1 מיקרומטר ionomycin לכל טוב). כן תזרים עודכן cytometry בהליך משפט פיצויים בשל מועד הניסוי.
      הערה: לכיל הנוגדנים שימוש קודם (ראה דיון).
  2. כבו את האור ולהוסיף את נוגדן אנטי CD107a (2 μl, ריכוז סופי: 1: 100) זה טוב עם תאי NK על צלחת 96-V-היטב.
  3. לערבב בעדינות את תאי K562 ידי pipetting אותם מעלה ומטה במשך5 פעמים לפחות.
    1. מן הבארות המכיל את פתרון נוגדן NK תא / אנטי CD107a, לזהות את אלה המתוכננים גירוי עם תאי K562. הוספת 100 μl / טוב של פתרון התא K562 לתוך בארות אלה. מערבבים בזהירות על ידי pipetting למעלה ולמטה במשך 5 פעמים לפחות.
    2. להוסיף אינטרלויקין -2 (IL-2; ריכוז סופי 100 U / ml) ו- interleukin-15 (IL-15; ng 10 לריכוז סופי / מיליליטר) כדי הבארות המכילות K562 תאים ותא NK / אנטי CD107a פתרון הנוגדנים.
      1. אופציונלי: לבדוק את ההשפעה של תאים או K562 או ציטוקינים לבד על תאי NK מופץ לפענח הנגרמת הגידול לעומת פונקציות תא NK-induced ציטוקינים.
    3. זהה את הבארות על הצלחת 96-V-מתוכנן היטב כפי שולט שלילי ללא גירוי. הוספת 100 μl / טוב CM לבארות אלה המכיל רק את תא NK / פתרון נוגדן אנטי CD107a. מערבבים בזהירות על ידי pipetting למעלה ולמטה במשך 5 פעמים לפחות.
      1. אופציונאלי: עבור פקד חיובי, להוסיף 100 μ; CM l המכיל PMA ו ionomycin (הריכוז הסופי: 50 ננומטר PMA, 1 מיקרומטר ionomycin לכל טוב) אל באר עם תא NK / פתרון נוגדן אנטי CD107a.
  4. דגירת התאים עבור 3 שעות בחושך ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  5. כן פתרון מעכב תחבורת חלבון (למשל, brefeldin A ו- / או monensin) ב CM. אחרי שעה 1 של דגירה, להוסיף את הפתרון היטב בכל צלחת 96-V-היטב עם אור כבוי (ריכוז סופי: 0.5-1μM brefeldin A ו- 2-3 monensin מיקרומטר). מערבבים בזהירות על ידי pipetting למעלה ולמטה במשך 5 פעמים לפחות. המשך הדגירה של השעה 2 הנותרים.

Surface 5. תאיים מכתימים

  1. לאחר תקופת דגירה 3 שעות, לערבב את התאים בתוך בארות הצלחת 96-V-טוב בקפידה על ידי pipetting למעלה ולמטה במשך לפחות 5 פעמים ולהעביר אותם לתוך זרימת cytometry צינורות. הוסף 1 מ"ל / שפופרת של WB. תאים גלולים ב 400 XG למשך 4 דקות.
    1. אופציונאלי: לפני צנטריפוגה ולשטוף את הבארות עם 100 μl / גם PBS, על מנת לייעל את התאוששות התא, על ידי pipetting למעלה ולמטה במשך 5 פעמים לפחות לפני העברת התאים לתוך צינור FACS בהתאמה.
  2. בטל supernatant והמשך עם משטח מכתים.
  3. כלול צבע פלואורסצנטי-reactive אמין כי הוא בלתי permeant לחיות תאים עם מקסימום פליטה של ​​423 ננומטר כסמן תאים מתים fixable (DCM). בצע את המכתים לפני (ראה להלן) או במקביל עם מכתים משטח נוגדן בהתאם לסוג של DCM בשימוש.
    1. Re- להשעות התאים 99 μl / צינור PBS ולהוסיף 1 μl / צינור של (הריכוז הסופי: 1: 100) DCM ניתן לתקן. מערבבים היטב תאים בעזרת מערבולת דגירה אותם במשך 15 דקות ב RT בחושך.
    2. כן פתרון תערובת אמן על ידי ערבוב יחד נוגדני "המשטח" המפורטים בטבלה 2 (ראה מכתים טור צעד מודגש בכחול). השתמש בכרכים / צינור dicated ולהתרבות אותם עם מספר זרימת cytometry צינורות להיצבע.
    3. לאחר דגירה לקחת את זרימת cytometry צינורות עם תאים ולהוסיף 1 מ"ל / שפופרת של WB. גלולת התאים ב 400 XG למשך 4 דקות.
    4. בטל supernatant, מחדש להשעות את התאים 84 μl / שפופרת של WB ולהוסיף 16 μl / שפופרת של הפתרון תערובת מאסטר. מערבבים היטב תאים בעזרת מערבולת. דגירה תאים עבור 20 דקות ב 4 ° C בחושך.
    5. לאחר 20 דקות להוסיף 1 מ"ל / WB צינור ותאי גלולה ב 400 XG למשך 4 דקות.
  4. בטל supernatant מחדש להשעות את התאים 100 μl / שפופרת של פתרון קיבעון קר (למשל, 2% (סופי) paraformaldehyde או פורמלין). מערבבים היטב תאים בעזרת מערבולת. דגירה תאים עבור 10 דקות ב 4 ° C בחושך.
    1. כתם תאי ציטוקינים תאיים / כמוקינים לאחר שלב זה או לאחסן אותם הלילה ב 4 מעלות צלזיוס WB.
      הערה: לאחר דגירת הלילה, התאוששות תא תחתונה עלולה להתרחש.
  5. שטפו תאים ב WB 1 מ"ל / צינור ב 400 XG למשך 4 דקות ו להמשיך לשלב permeabilization.
  6. הכן חיץ permeabilization (PB) (למשל, 0.2% saponin, 1% פתרון BSA ב PBS).
  7. שוטפים את התאים פעמיים 1 מ"ל / שפופרת של PB ב 400 XG למשך 4 דקות. המשך עם המכתים התאי.
    זהירות: Saponin הוא פוטנציאל מעצבן. טפל בו בהתאם לגיליון הבטיחות של החומר המתאים (MSDS).
  8. כן פתרון תערובת מאסטר באמצעות כרכי נוגדן "התאיים" המצוינים בטבלת 2 (מסומנים בירוק). כפל כרכים אלה עם מספר הצינורות להיצבע.
    1. Re- להשעות את התאים 90 μl / צינור PB ולהחיל 10 μl / שפופרת של הפתרון תערובת אמן נוגדן. מערבבים היטב בעזרת מערבולת דגירה התאים עבור 30 דקות ב 4 ° C בחושך.
  9. לשטוף תאים פעמיים ב 1 מ"ל / שפופרת של PB ב 400 XG למשך 4 דקות.
  10. בטל supernatant מחדש להשעות את התאים 400 μl / צינורית PB. מערבבים היטב תאים בעזרת מערבולת. מניחים את התאים על הקרח בחושך עד המדידה.

6. פיצוי Cytometry זרימת רכישה

  1. בחר את הערוצים עבור fluorochromes השונה (ראה טבלה 2) בתוך הזרימה cytometry תוכנת רכישה בתיקיית התקנת פרמטר. בנוסף, לבחור את הערוצים עבור FSC-A ו- -h כמו גם עבור SSC-A ו- -H.
  2. טען מטריקס פיצוי נוצר לפרמטרים שנבחרו לקובץ הרכישה.
    1. צור מטריצת פיצויים באמצעות תאי NK מבודדים משלב 2.2.8 ידי ביצוע כתם צבע אחד עבור כל fluorochrome בשימוש (ראה טבלה 2). השתמש בפרוטוקול מכתים משטח כמתואר צעדים 5.1-5.4. כלול פקד בלא כתם (ללא נוגדנים) וכן בקרות אלוטיפ ו / או קרינה מינוס אחד שולט (FMO).
      הערה: כחלופה לפיצוי מבוסס תאים, השתמש IgG מחייב חרוזים שולטים פיצוי.
    2. מניחים כל צינור עבור דגימות כתם יחיד המדגם ללא נוגדנים ליציאת הזרקת מדגם (SIP). הקש על הכפתור "הקלט" בתוכנת רכישת cytometry הזרימה ולרכוש את מספר נייד של לפחות 5 x 10 3 NK תאים לדגימה.
    3. השתמש ביישום חישוב פיצויים של תוכנת רכישת cytometry ליצור מטריצת פיצויים.
  3. צור מגרשים דוט עבור זיהוי אוכלוסיית תא NK.
    1. לזהות תאים בודדים באמצעות FSC-A / FSC-H ומגרשים נקודה SSC-A / SSC-H. לחץ על הכפתור "שער פוליגון". צייר שער סביב תאים, אשר יש דפוס והפצה ליניארי בחלקות הנקודה שניהם. לחץ פעמים על שעיר לפתוח עלילת נקודה חדשה.
    2. בחר עלילת FSC-A / SSC-נקודה כדי לזהות את הלימפוציטים/ אוכלוסיית תא NK (ראה איור 1). צייר שער מצולע סביבו ללחוץ לחיצה כפולה על השער.
  4. מניחים כל צינור דגימה של assay גירוי תא NK לתוך SIP. הקישו על כפתור "הקלט" ולרכוש את מספר הנייד של לפחות 5 x 10 3 NK תאים לדגימה.

7. ניתוח וסטטיסטיקה

  1. פתח את זרימת cytometry תוכנה לניתוח. לחץ על כפתור הטעינה מדגם לפתוח מדגם השליטה unstimulated.
  2. ליצור מערכת Gating עבור subpopulations תא NK השונה (ראה איור 1).
    1. לחץ על כפתור עלילת הנקודה ליצור FSC-A / SSC-עלילה. לחץ על כפתור השער המלבן ולהסיק שער מלבן מעל כל האירועים עם FSC-ערך> 5 x 10 4 להוציא פסולת. פתח את השער על ידי לחיצה כפולה על השער.
    2. בחר שוב את פרמטרי FSC-A / SSC-A בתוך עלילת הנקודה החדשה ולחץ על כפתור השער מצולע. Dגלם שער פוליגון סביב אוכלוסיית הלימפוציטים (ראה איור 1). פתח את השער.
    3. בחר את פרמטר SSC-A / SSC-H עבור מגרש הנקודה החדש לצייר שער מצולע כל התאים הבודדים סביב. תאים בודדים להפגין חלוקה ליניארית על פני פרמטרים FSC-A / FSC-H ו SSC-A / SSC-H (ראה איור 1). פתח את השער על ידי לחיצה כפולה על זה.
    4. חזור על שלב 7.2.3 באמצעות הפרמטרים FSC-A / FSC-H הפעם.
    5. השתמש CD45 פרמטר דאמפ ערוץ (CD3; CD14; CD19; DCM) להוציא תאים מתים. צייר שער מלבן סביב כל חיובית CD45 ו- dump תאי ערוץ שליליים. פתח את השער על ידי לחיצה כפולה על השער.
    6. זהה את אוכלוסיית התא כולו NK באמצעות CD56 ו- dump פרמטרי ערוץ. צור שער מלבן סביב החיובי CD56 ו- dump לתעל תאים שליליים. פתח את השער על ידי לחיצה כפולה על זה.
    7. צייר שער מלבן סביב כל השלושה תת תא NK בתוך עלילת נקודת CD56 / CD16. אידהntify תת שונים כמו CD56 ++ CD16 -, CD56 ++ CD16 + ו- CD56 + CD16 ++ תת תא NK.
  3. לנתח פונקציות תא NK עבור כל תת תא יחיד NK.
    1. לחץ על אחד משערי משנה התא שלוש NK כדי לפתוח אותו. צור שלוש חלקות נקודה שונה עבור CD56 / CD107a, CD56 / IFN-γ ו CD56 / MIP-1β.
    2. צייר שער מלבן עבור תאים חיוביים CD56, שהן חיוביות כמו גם עבור CD107a, IFN-γ או MIP-1β בהתאמה (ראה איור 1).
    3. חזור על שלב 7.3.1-7.3.2 עבור כל תת תא NK הנותרים.
  4. חזור על שלב 7.2 ו -7.3 עבור כל הדגימות המגורות. שמור את כל הערכים הסטטיסטיים של כל דגימה על ידי לחיצה על כפתור מייצאות הנתונה בתוך תוכנת הניתוח.
  5. פתח את הקבצים המכילים את הערכים הסטטיסטיים של הדגימות הבודדות לנתח פונקציות תא NK. בחר את הערכים עבור תא NK פרטתת (למשל, CD16 ++ CD56 - תאי NK) על ידי העתקת אותם בתוך קובץ אחר.
    1. הפחת את אחוז תאי NK החיובית CD107a, אשר לא טופלו עם גירוי, משיעור של תאי NK החיוביים CD107a, אשר טופל עם גירוי.
      הערה: השתמש התוצאה להפגין את יכולת degranulation של מערך ספציפי NK תא זה בתגובה לגירוי.
    2. חזור על שלב 7.5.1 עבור-γ IFN ו- MIP-1SS חיוב תאי NK כדי להדגים את ייצור ציטוקינים ו chemokine בתגובה לגירוי.
    3. חזור על שלב 7.5.1-7.5.2 עבור כל תת תא NK הנותרים להעריך קיבולת degranulation שלהם ייצור ציטוקינים / chemokine על גירוי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

האסטרטגיה gating לניתוח degranulation, ציטוקינים ו chemokine הייצור של האוכלוסייה התא כולו NK ושלושה תת תא NK שונים הם באיור 1.

תוצאות נציג התורם אחד בריא הם באיור 2. תאי NK ללא כל גירוי הפיק לא IFN-γ ולא MIP-1β ולא הביע CD107a על פני השטח שלהם (איור 2 א). בניגוד לכך, תאי NK מגורים עם תאים סרטניים וציטוקינים מיוצרים כמויות משמעותיות של-γ IFN התאי-1β MIP. יתר על כן, למעלה מ -20% מהם degranulated על אינטראקצית תאים סרטניים שמציינת להביע CD107a על פני השטח שלהם (איור 2 ג). PMA וגירוי ionomycin שימשו כביקורת (איור 2 ב).

e 1 "src =" / files / ftp_upload / 54,615 / 54615fig1.jpg "/>
איור 1:. Gating אסטרטגיה שערים לאחר הם זממו. ראשית, פסולת מודרים בתוך FSC-A / SSC-עלילה. ואז לימפוציטים מזוהים כפילויות מודרים באמצעות שני מגרשים עם SSC-A / SSC-H ו- FSC-A / FSC-H. לאחר מכן, שער לרבות כל CD45 + תאים ולמעט כל המתים, CD3 +, CD14 + ו- CD19 + תאים מוגדר על ידי התוויית ערוץ CD45 / דאמפ. לאחר מכן, תאי NK מזוהים על ידי gating על תאי CD56 +. עלילה עם CD56 / CD16 יכול לשמש כדי לזהות את תת תא NK הראשי. לבסוף, בקרב אוכלוסיית התא כולו NK, סמנים פונקציונליים מזוהים על ידי התוויית CD56 לעומת CD107a, IFN-γ ו MIP-1β, בהתאמה. ניתן לעשות זאת גם עבור כל סוגים שונים של תת תא NK. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

s = "jove_content" FO: keep-together.within-page = "1"> איור 2
איור 2:. תוצאות נציגה אחד תורם תא בריא NK באמצעות אסטרטגית gating המתוארת בתרשים 1, סמנים תפקודיים תא NK כמו CD107a (עבור degranulation), IFN-γ ו MIP-1β ניתן לזהות. העמודה השמאלית (א) מראה את התוצאות באמצעות תאי NK בהיעדר גירוי. העמודה האמצעית (ב) מדגימה את התוצאות בנוכחות של ionomycin PMA / בקרה החיובית. העמודה הימנית (C) מציגה תוצאות עבור תאי NK מגורים עם קו התאים הסרטניים K562 ובנוכחות של ציטוקינים אִי- 2 (100 U / ml) ו- IL-15 (10 ng / ml). אנא לחצו כאן לצפייה גרסה גדולה יותר של דמות זו.

טבלה 1: נוגדנים לבדיקה טוהר.

טבלה 2
טבלה 2: נוגדנים מכתימים חוּץ ו תאי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השיטה המתוארת היא גישה קלה, מהירה ואמינה ללמוד פונקציות תא NK מדגימה דם שלם של תורמים או מטופלים בריאים. שיטה זו מציעה את היתרון הגדול לטהר תאי NK ישירות מדם כולו, הימנעות צנטריפוגה שיפוע צפיפות זמן רבה, שהיא חובה עבור שיטות טיהור רבות אחרות 15. יתר על כן, זה דורש גודל מדגם קטן יותר בהשוואה "קלסי" בידוד תא NK / שיטות עשר, מה שהופך אותו חלופה מתאימה עבור דגימות של מטופלי ילדים ו / או חיסון לקוי. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי להשיג ערכי בסיס של-vivo לשעבר פונקציות תא NK, אבל זה גם מאפשר תרבות NK נוספת ורחבה, להיות בדרך זו משלימה עם שיטות אחרות המתוארות 8 בעבר. אף על פי כן כמה צעדים קריטיים צריכים להילקח בחשבון. מאז assay מבוסס על חוּץ מכתים נוגדן תאי, חשוב לקבוע את אופטימלית ווrking ריכוז עבור כל נוגדן הראשון. במיוחד עבור המכתים התאי, הערכה זהירה של נוגדנים המשמשים מומלצת מאוד. גישה טובה היא לבדוק סדרת דילול של הנוגדן משמש (למשל, 1: 100 עד 1: 12.5) ב השעית תא מגורה עם או בלי PMA / ionomycin. החלתי מאותו מועד, היחס של אירועים חיוביים בין דגימות מגורות ובטל מגורה מחושב זמם. דילול הנוגדן עם יחס שינוי לקפל החיובי הגבוה ביותר (אות הרקע הטוב ביותר היחס) אמור לשמש עבור ניסויים נוספים 16. יתר על כן, השימוש של בקרות כמו פקדי isotype- ו FMO יכול להוכיח להיות יסודי במיוחד עבור מכתים תאי על מנת שער כראוי על אוכלוסיות תאים החיוביות.

עם זאת, ישנן מספר מגבלות חשובות של השיטה המתוארת. הביטוי CD107a הוא סמן degranulation ולכן בעקיפין רק מצביע cytotoxicity תא NK. cytotoxicity תא NKnd קיבולת degranulation יכול להיות שונה. Up-רגולציה של מסלול autophagy בתוצאות תאים סרטניים השפלת ב granzyme מופרש ומפחית מוות של תאים על האינטראקציה תא NK 17. אפוא DCM נוסף (למשל, בקע caspase 3) עשוי להתווסף ללוח המכתים כדי לעקוב אחר המתרחש בתא הנידון למוות בתוך תאי היעד 18. בנוסף, cytotoxicity תא NK מושפע כמות חלבונים ציטוטוקסיות בתוך הגרגרים שלהם (למשל, perforin, ב granzyme), אשר ניתן לכמת ידי מכתים תאי 19,20.

יתר על כן, ישנן אפשרויות שונות כדי לשנות את הפרוטוקול. במקום תאי NK מבודד, תאי דם היקפיים mononuclear (PBMCs) יכול לשמש. למרות שאחד מהם חייב להיות מודע לכך את המספר הסלולרי NK המוחלט בקרב אוכלוסיית PBMC שונה בין תורמים שונים ואף בין דגימות הנגזרות מאותו התורם בנקודות זמן שונה. תא NK degranulation תלויה מאוד על E: היחס T. על מנת להשוות פונקציות תא NK בין תורמים שונים או בנקודות זמן שונות, מספר תא NK המוחלט בקרב אוכלוסיית PBMC אמור לשמש להקים E קבוע: יחס T בכל הניסויים. אם פונקציות תא NK מנוטרים בנקודות זמן שונות בתוך אותו התורם, PBMCs אפשר להקפיא הניתוח יכול להיעשות בבת אחת ולתמיד בנקודות זמן שונות על מנת להפחית וריאציות בין-ניסיוני 11.

מאז מכתים לוחות עם עד 18 צבעים אפשריים, ניתוח של פונקציות תא NK ניתן להרחיב פרט הרבה יותר. באמצעות סמנים משטח נוספים לרבות CD57, NKG2A ואת הקולטנים הרוצח דמוי תא אימונוגלובולינים (KIRs), תת תא NK נוספים ניתן לזהות. משכילי תאי NK להביע לפחות-KIR העצמי אחד degranulate חזקים על אינטראקציה עם תאי K562 מאשר תאי NK חסר השכלה. לעומת זאת, CD57 הבדיל יותר + CD56 + - CD56 + NK 21 תאים. בנוסף, סמנים אחרים של תפקוד התא NK ניתן לפנות. LFA-1 הוא מולקולה חשובה הידבקות תא NK ובאו לידי ביטוי הקונפורמציה שלו פתוח על הפעלת תא NK. זה מה שנקרא "מבפנים החוצה אות" מהווה סמן הפעיל תא NK מוקדם 22.

לבסוף, הגירויים עבור פונקציות תא בדיקות NK ניתן לשנות גם כן. מניסיוננו טרי מבודדים תאי NK רק degranulate גרוע על האינטראקציה תא K562 אם לא ציטוקינים מתווספים. באמצעות PBMCs טרי מבודד ללא תוספת ציטוקינים נוספת לעקוף את הבעיה, בגלל ההשפעה של תאי עובר אורח. יתר על כן, ייצור ציטוקינים, במיוחד IFN-γ ו- TNF-α, יכול להיות יזם על IL-12 ו- IL-18 גירוי 23. ייצור IFN-γ בתוך תת תא NK עשוי להשתנות תלוי,g על הגירוי בשימוש (cytokine- לעומת גירוי נגרמת יעד) 24. בנוסף, במקום להשתמש K562 תאים כמו תאי יעד, תאי גידול ראשוניים נגזרו חולי גידול יכולים לשמש כדי לבדוק פונקציות תא NK כנגד תאים סרטניים עצמיים לפני או במהלך טיפולים חיסוניים-ויסות (למשל, טיפול נוגדן חד שבטיות או תרופות-modulatory החיסונית (IMiDs)).

בתוך בשנים האחרונות, בתחום האימונותרפיה כבר המתפתח במהירות באישור הקליני של מעכבי מחסום חיסוניים (למשל, ipilumumab, nivolumumab, pembrolizumab) 25 וניסויים מוצלחים באמצעות קולטן אנטיגן chimeric מהונדס גנטי (CAR) -expressing תאי T וכן כתאי CAR-NK (הנסקרת תוך התייחסות 26), לטיפול בחולי גידול המטולוגיות 27. לכן חיסוני NK מבוססי תאים הוא מקבל יותר ויותר אל המוקד. נוגדנים נגד CD20 היו הצלחה גדולה מתכNT לימפומות ממאירות בתוך שני העשורים האחרונים 28. הרוב המכריע של תאי NK לבטא את CD16 קולטן Fc נמוך זיקה המאפשר לתאים לזהות ולהרוג תאים היעד שכותרתו נוגדנים (נוגדנים תלויי cytotoxicity הסלולר - ADCC). היכולת של הנוגדן להפעיל פונקציות תא NK ניתן לבדוק במבחנה באמצעות הפרוטוקול המתואר 29. Terszowski et al. 'ADCC תאי NK ניתח נגד קו תא B lymphoblastoid באמצעות נוגדנים נגד CD20 שונים שאושרו קלינית. בעוד ADCC המושרה על טיפול Rituximab (הראשונה שאושרה קלינית אנטי CD20 נוגדן 30) הושפע לרעה אינטראקציה KIR / HLA, השפעה זו לא נצפתה בעת שימוש obinutuzumab (נוגדן חד-שבטי CD20 glycoengineered סוג II רומן) 31, 32. יתר על כן, פונקציות תא NK מושפעות תרופות אנטי סרטניות רומן שונה כמו IMiD lenalidomide 33 ו-kinas טירוזין השונהמעכבי דואר (TKI) 34. כרגע מעכבי מחסום NK תאים ספציפיים נבדקים בניסויים קליניים. דוגמאות לכך הן השימוש בתרופות אנטי-KIR 35,36 או הנוגדנים נגד NKG2A (NCT02331875) וכן אגוניסטים הפעילו כמו נוגדן אנטי CD137 (NCT01775631; NCT02110082).

חשוב לציין, העברת תא המאמצת NK שבוצעה במגוון מחלות ממאירות שונות עם תופעות קליניות מבטיח 37. במטרה לבחור את התורם הטוב ביותר, פונקציות תא NK כנגד הגידול של החולה עלולות להיבדק במבחנה באמצעות דגימות דם מתורמים תא פוטנציאל NK.

לסיכום, הפרוטוקול המתואר נועד לנתח פונקציות תא NK מגוונות מתורמים או מטופלים בריאים. ניתן לנטר את התפקידים אמורים תת תא NK מגוון על גירויים שונים בנקודות זמן שנבחרו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 + glutamine Invitrogen 6187-044
penicilin/streptomycin Invitrogen 15140-122
BD Falcon Round Bottom Tube BD 352008
fetal calf serum Invitrogen 10270-106 heat inactivated before use
T-flask Greiner Bio-One 690195
K562 tumor cell line DSMZ GmbH ACC 10
ammonium-chloride-potassium (ACK) lysis buffer made in house / components are listed in the text
Distilled water: Ampuwa Spüllösung 1,000 ml Plastipur Fresenius Kabi 1088813
Megafuge 40R Centrifuge Heraeus /
EDTA blood collector tubes Sarstedt 386453 S-Monovette 7.5 ml, K3EDTA
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Life Technologies 15575-020
Hematopoietic media (XVIVO) Lonza Group Ltd BE04-743Q
human serum DRK Blutspendedienst, Frankfurt/M  / healthy donors with blood type AB; heat inactivated before use
Neubauer-improved counting chamber, bright line Marienfeld superior/ LO-Laboroptik Ltd. 0640030/ 1110000
trypan blue solution (0.4%) Invitrogen 15250-061
3% acetic acid with methylene blue Stemcell Technologies  07060
Corning 96 Well Clear V-Bottom TC-treated Microplates Corning  3894
Falcon 96 Well Round Bottom Not Treated Microplates Corning  351177
DPBS (Ca2+- and Mg2+-free) Gibco Invitrogen 14190-169
BSA Sigma Aldrich A2153-100G
NaN3 Sigma Aldrich 08591-1ML-F
phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)  Merck 524400-1MG
ionomycin  PromoKine PK-CA577-1566-5
interleukin 15 (IL-15) PeproTech 200-15
Proleukin S (IL-2)  Novartis Pharma 730523
Golgi Stop, Protein Transport Inhibitor (containing Monensin) BD Biosciences 554724 This product can be used in combination or instead of Golgi Plug. The best combination for the wished experimental setting has to be tested.
Golgi Plug, Protein Transport Inhibitor (containing Brefeldin A) BD Biosciences 555029
paraformaldehyde AppliChem UN2209
saponin Sigma Aldrich 47036
flow cytometer: Canto10C BD Biosciences /
FlowJo TreeStar Inc. /
Graph Pad Graph Pad Inc. /
MACSxpress Separator Miltenyi Biotec  130-098-308
MACSxpress NK isolation kit Miltenyi Biotec  130-098-185
MACSxpress Erythrocyte Depletion Kit, human Miltenyi Biotec  130-098-196
MACSmix Tube Rotator  Miltenyi Biotec  130-090-753
anti-human CD3 APC Biolegend 300412
anti-human CD3 V450 BD Biosciences 560366
anti-human CD14 PerCP Miltenyi Biotec  130-094-969
anti-human CD14 V450 BD Biosciences 560349
anti-human CD16 PE Biolegend 302008
anti-human CD16 PerCP Biolegend 302029
anti-human CD19 PE-Cy7 Biolegend 302216
anti-human CD19 V450 BD Biosciences 560353
anti-human CD45 BV510 BD Biosciences 563204
anti-human CD56 FITC Biolegend 345811
anti-human CD107a PE Biolegend 328608
anti-human IFN-γ AF-647 BD Biosciences 557729
anti-human MIP-1β APC-H7 BD Biosciences 561280
DAPI Biolegend 422801
Zombie Violet Fixable Viability Kit Biolegend 423113 fixable dead cell marker

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Watzl, C. How to trigger a killer: modulation of natural killer cell reactivity on many levels. Adv Immunol. 124, 137-170 (2014).
  2. Khaznadar, Z., et al. Defective NK Cells in Acute Myeloid Leukemia Patients at Diagnosis Are Associated with Blast Transcriptional Signatures of Immune Evasion. J Immunol. 195 (6), 2580-2590 (2015).
  3. Pical-Izard, C., et al. Reconstitution of natural killer cells in HLA-matched HSCT after reduced-intensity conditioning: impact on clinical outcome. Biol Blood Marrow Transplant. 21 (3), 429-439 (2015).
  4. Ahlenstiel, G., et al. Early changes in natural killer cell function indicate virologic response to interferon therapy for hepatitis C. Gastroenterology. 141 (4), 1231-1239 (2011).
  5. Porrata, L. F., et al. Early lymphocyte recovery predicts superior survival after autologous stem cell transplantation in non-Hodgkin lymphoma: a prospective study. Biol Blood Marrow Transplant. 14 (7), 807-816 (2008).
  6. Silva, I. P., et al. Reversal of NK-cell exhaustion in advanced melanoma by Tim-3 blockade. Cancer Immunol Res. 2 (5), 410-422 (2014).
  7. Kiessling, R., Klein, E., Wigzell, H. "Natural" killer cells in the mouse. I. Cytotoxic cells with specificity for mouse Moloney leukemia cells. Specificity and distribution according to genotype. Eur J Immunol. 5 (2), 112-117 (1975).
  8. Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells. J Vis Exp. (48), (2011).
  9. Mariani, E., et al. Chemokine production by natural killer cells from nonagenarians. Eur J Immunol. 32 (6), 1524-1529 (2002).
  10. Reefman, E., et al. Cytokine secretion is distinct from secretion of cytotoxic granules in NK cells. J Immunol. 184 (9), 4852-4862 (2010).
  11. Jacobs, B., et al. NK Cell Subgroups, Phenotype, and Functions After Autologous Stem Cell Transplantation. Front. Immunol. 6, 583 (2015).
  12. Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. J Immunol Methods. 294 (1-2), 15-22 (2004).
  13. Theorell, J., et al. Sensitive and viable quantification of inside-out signals for LFA-1 activation in human cytotoxic lymphocytes by flow cytometry. J Immunol Methods. 366 (1-2), 106-118 (2011).
  14. Brander, C., et al. Inhibition of human NK cell-mediated cytotoxicity by exposure to ammonium chloride. J Immunol Methods. 252 (1-2), 1-14 (2001).
  15. Beeton, C., Chandy, K. G. Enrichment of NK cells from human blood with the RosetteSep kit from StemCell technologies. J Vis Exp. (8), e326 (2007).
  16. Lamoreaux, L., Roederer, M., Koup, R. Intracellular cytokine optimization and standard operating procedure. Nat. Protoc. 1 (3), 1507-1516 (2006).
  17. Baginska, J., et al. Granzyme B degradation by autophagy decreases tumor cell susceptibility to natural killer-mediated lysis under hypoxia. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (43), 17450-17455 (2013).
  18. He, L., et al. A sensitive flow cytometry-based cytotoxic T-lymphocyte assay through detection of cleaved caspase 3 in target cells. J Immunol Methods. 304 (1-2), 43-59 (2005).
  19. Sutton, V. R., et al. Serglycin determines secretory granule repertoire and regulates NK cell and CTL cytotoxicity. FEBS J. 283 (5), 947-961 (2016).
  20. Schönberg, K., Hejazi, M., Uhrberg, M. Protocol for the clonal analysis of NK cell effector functions by multi-parameter flow cytometry. Methods Mol Biol. 903, 381-392 (2012).
  21. Björkström, N. K., et al. Expression patterns of NKG2A, KIR, and CD57 define a process of CD56dim NK-cell differentiation uncoupled from NK-cell education. Blood. 116 (19), 3853-3864 (2010).
  22. Bryceson, Y. T., Ljunggren, H. G., Long, E. O. Minimal requirement for induction of natural cytotoxicity and intersection of activation signals by inhibitory receptors. Blood. 114 (13), 2657-2666 (2009).
  23. Cooper, M. A., et al. Human natural killer cells: a unique innate immunoregulatory role for the CD56(bright) subset. Blood. 97 (10), 3146-3151 (2001).
  24. Fauriat, C., Long, E. O., Ljunggren, H. G., Bryceson, Y. T. Regulation of human NK-cell cytokine and chemokine production by target cell recognition. Blood. 115 (11), 2167-2176 (2010).
  25. Postow, M. A., Callahan, M. K., Wolchok, J. D. Immune Checkpoint Blockade in Cancer Therapy. J Clin Oncol. 33 (17), 1974-1982 (2015).
  26. Glienke, W., et al. Advantages and applications of CAR-expressing natural killer cells. Front Pharmacol. 6, 21 (2015).
  27. Curran, K. J., Brentjens, R. J. Chimeric antigen receptor T cells for cancer immunotherapy. J Clin Oncol. 33 (15), 1703-1706 (2015).
  28. Zappasodi, R., de Braud, F., Di Nicola, M. Lymphoma Immunotherapy: Current Status. Front. Immunol. 6, 448 (2015).
  29. Laprevotte, E., et al. Endogenous IL-8 acts as a CD16 co-activator for natural killer-mediated anti-CD20 B cell depletion in chronic lymphocytic leukemia. Leuk Res. 37 (4), 440-446 (2013).
  30. Maloney, D. G., et al. IDEC-C2B8 (Rituximab) anti-CD20 monoclonal antibody therapy in patients with relapsed low-grade non-Hodgkin's lymphoma. Blood. 90 (6), 2188-2195 (1997).
  31. Salles, G., et al. Phase 1 study results of the type II glycoengineered humanized anti-CD20 monoclonal antibody obinutuzumab (GA101) in B-cell lymphoma patients. Blood. 119 (22), 5126-5132 (2012).
  32. Terszowski, G., Klein, C., Stern, M. KIR/HLA interactions negatively affect rituximab- but not GA101 (obinutuzumab)-induced antibody-dependent cellular cytotoxicity. J Immunol. 192 (12), 5618-5624 (2014).
  33. Hsu, A. K., et al. The immunostimulatory effect of lenalidomide on NK-cell function is profoundly inhibited by concurrent dexamethasone therapy. Blood. 117 (5), 1605-1613 (2011).
  34. Salih, J., et al. The BCR/ABL-inhibitors imatinib, nilotinib and dasatinib differentially affect NK cell reactivity. Int J Cancer. 127 (9), 2119-2128 (2010).
  35. Benson, D. M., et al. A phase 1 trial of the anti-KIR antibody IPH2101 in patients with relapsed/refractory multiple myeloma. Blood. 120 (22), 4324-4333 (2012).
  36. Vey, N., et al. A phase 1 trial of the anti-inhibitory KIR mAb IPH2101 for AML in complete remission. Blood. 120 (22), 4317-4323 (2012).
  37. Terme, M., Ullrich, E., Delahaye, N. F., Chaput, N., Zitvogel, L. Natural killer cell-directed therapies: moving from unexpected results to successful strategies. Nat Immunol. 9 (5), 486-494 (2008).

Tags

אימונולוגיה גיליון 116 תאי NK CD107a cytotoxicity פונקציה IFN-γ MIP-1β תאי K562
Flow Cytometry מבוסס Assay עבור הניטור של פונקציות תא NK
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, … More

Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, N., Ullrich, E. Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions. J. Vis. Exp. (116), e54615, doi:10.3791/54615 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter