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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

से फ्लो आधारित एन.के. सेल कार्यों की निगरानी के लिए परख

Published: October 30, 2016 doi: 10.3791/54615
Automatic Translation
*1,2, *3,4, 1,2, 1,2
1Childrens Hospital, Department of Pediatric Stem Cell Transplantation and Immunology, Johann Wolfgang Goethe-University, 2LOEWE Center for Cell and Gene Therapy, Johann Wolfgang Goethe-University, 3Institute for Cancer Research, Department of Cancer Immunology, Oslo University Hospital, Radiumhospital, 4The KG Jebsen Center for Cancer Immunotherapy, Institute of Clinical Medicine, University of Oslo
* These authors contributed equally

Summary

एक सरल और विश्वसनीय विधि यहाँ वर्णित है ऐसे degranulation, साइटोकाइन और विभिन्न एन.के. सेल सबसेट के भीतर केमोकाइन उत्पादन के रूप में एन.के. सेल कार्यों का एक सेट का विश्लेषण करने के लिए।

Introduction

सहज प्रतिरक्षा प्रणाली प्राकृतिक किलर के रूप में हिस्सा कोशिकाओं (एन.के.) वायरस से संक्रमित या malignantly बदल कोशिकाओं के खिलाफ रक्षा की पहली पंक्ति में योगदान। निरोधात्मक और सक्रिय रिसेप्टर्स की एक प्रणाली उन्हें टी कोशिकाओं के विपरीत पूर्व के प्रतिजन भड़काना बिना स्वस्थ और बदल कोशिकाओं के बीच भेद करने के लिए सक्षम बनाता है। पर लक्ष्य सेल मुठभेड़ एन.के. कोशिकाओं को अपने लक्ष्य को मारने के लिए प्रतिरक्षा अन्तर्ग्रथन में उनके साइटोटोक्सिक कणिकाओं (जैसे, perforin, granzymes) की सामग्री जारी। इसके अलावा, एन.के. कोशिकाओं का उत्पादन और साइटोकिन्स के विभिन्न प्रकार (जैसे, interferon- γ: IFN-γ; ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर-α: TNF-α) छिपाना: लक्ष्य सेल पर (एमआईपी-1β जैसे, मैक्रोफेज भड़काऊ प्रोटीन 1β) और chemokines बातचीत या साइटोकाइन उत्तेजना 1।

ऐसे cytotoxicity, केमोकाइन और साइटोकाइन उत्पादन के रूप में पर्याप्त एन.के. सेल कार्यों विविध जिले के भाग्य पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता हैआसान बनाता है। ल्यूकेमिया के रोगियों के पतन दरों में वृद्धि हुई दिखाता है कि वे निदान पर एक दोषपूर्ण एन.के. सेल प्रोफ़ाइल का प्रदर्शन कम हो IFN-γ उत्पादन और एन.के. सेल रिसेप्टर्स 2 को सक्रिय करने की कम अभिव्यक्ति से मिलकर। एन.के. सेल नंबर और लक्ष्य सेल बातचीत पर साइटोकाइन उत्पादन सहित समारोह का एक शीघ्र स्वास्थ्य लाभ के लिए एक कम पलटा और अनुवांशिक रूप से भिन्न स्टेम कोशिका प्रत्यारोपण 3 प्राप्त रोगियों में सुधार जीवित रहने की दर के साथ जुड़ा हुआ है। इसके अलावा, हेपेटाइटिस सी वायरस से संक्रमित रोगियों में इंटरफेरॉन चिकित्सा की दीक्षा पर परिधीय एन.के. कोशिकाओं की क्षमता degranulation गैर responders 4 की तुलना में जल्दी responders में मजबूत है। एन.के. सेल नंबर (> 80 / μl) 15 दिन पर लिंफोमा या मल्टिपल मायलोमा से पीड़ित रोगियों में ऑटोलॉगस स्टेम कोशिका प्रत्यारोपण (autoSCT) के बाद एक बेहतर प्रगति स्वतंत्र और समग्र अस्तित्व 5 के लिए भविष्य कहनेवाला हैं। मेलेनोमा रोगियों में टी सेल की अभिव्यक्ति immunoglobulin- और mucin-डोमेन-containinजी अणु-3 (टिम-3), एन.के. कोशिकाओं पर एक प्रतिरक्षा नियामक प्रोटीन, रोग और रोग का निदान चरण 6 के साथ संबद्ध।

वैज्ञानिकों ने पिछले दशकों के दौरान एन.के. सेल कार्यों पर नजर रखी है। प्रायर भड़काना बिना ट्यूमर कोशिकाओं के खिलाफ एन.के. सेल cytotoxicity के प्रारंभिक विश्लेषण एक 51 करोड़ रिलीज परख 7 का उपयोग कर संबोधित किया। अभी हाल ही में वैज्ञानिकों का विस्तार एन.के. कोशिकाओं 8 की cytotoxicity मूल्यांकन करने के लिए एक गैर रेडियोधर्मी विधि विकसित की है। साइटोकाइन और केमोकाइन उत्पादन अक्सर एंजाइम से जुड़ी immunosorbent परख (एलिसा) तकनीक 9,10 का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया है। पिछले दशक के दौरान इन तरीकों से फ्लो आधारित assays से पूरित कर दिया है। पारंपरिक सतह धुंधला प्रोटोकॉल के साथ संयोजन में प्रोटीन परिवहन अवरोधकों (जैसे, brefeldin ए और monensin) और सेल permeabilization तरीकों का उपयोग विभिन्न विशिष्ट लसीका में केमोकाइन और साइटोकाइन उत्पादन का अध्ययन करने के लिए वैज्ञानिकों के लिए सक्षम हैocyte सबसेट (जैसे, टी, बी या एन.के. कोशिकाओं) 11। इसके अलावा, अलग से फ्लो आधारित assays टी और एन.के. सेल cytotoxicity की निगरानी के लिए विकसित किया गया है। 2004 में ऑल्टर एट अल। साइटोटोक्सिक कणिकाओं 12 के degranulation के लिए एक मार्कर के रूप में लक्ष्य सेल मुठभेड़ पर एन.के. कोशिकाओं पर lysosome जुड़े प्रोटीन CD107a (Lamp1) की सतह अभिव्यक्ति का वर्णन किया। चूंकि अलग fluorochromes और मल्टी चैनल प्रवाह cytometers की एक विस्तृत श्रृंखला हमारे दिनों में उपलब्ध हैं, यह संभव हो गया है साथ ही साथ विभिन्न एन.के. सेल सबसेट में विविध एन.के. सेल कार्यों (cytotoxicity, साइटोकाइन और केमोकाइन उत्पादन) की निगरानी के लिए। यह स्थितियों में, जहां नमूने का आकार सीमित है, जैसे में विशेष रूप से महत्वपूर्ण हो जाता है, बायोप्सी या क्षाररागीश्वेतकोशिकाल्पता से पीड़ित रोगियों के रक्त के नमूनों में।

वैश्विक एन.के. सेल कार्यों का परीक्षण करने के लिए, अलग से फ्लो आधारित assays कुशलता से जोड़ा जा सकता है। Theorell एट अल। Hea से प्रेरित एन.के. कोशिकाओंट्यूमर सेल लाइन K562 के साथ lthy दाताओं और 13 के माध्यम से प्रवाह cytometry एन.के. सेल degranulation, अंदर-बाहर संकेत और केमोकाइन उत्पादन का विश्लेषण किया। हाल ही में एन.के. सेल उपसमूहों, phenotypes और ट्यूमर के रोगियों में कार्यों autoSCT दौरान प्रवाह cytometry आधारित assays का उपयोग कर विश्लेषण किया गया। यह प्रदर्शन किया गया है कि एन.के. कोशिकाओं degranulate और autoSCT 11 के बाद बहुत जल्दी समय बिंदुओं पर ट्यूमर सेल मान्यता पर साइटोकिन्स / chemokines का उत्पादन करने में सक्षम थे।

यहाँ एक प्रोटोकॉल degranulation क्षमता, केमोकाइन और साइटोकाइन उत्पादन सहित ट्यूमर कोशिकाओं को एक से फ्लो आधारित परख के लिए यह संभव विभिन्न सबसेट में एन.के. सेल कार्यों की निगरानी के लिए एक साथ आता है कि प्रयोग के साथ बातचीत पर एन.के. सेल कार्यों का मूल्यांकन करने में वर्णित है।

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Protocol

इस अध्ययन फ्रैंकफर्ट विश्वविद्यालय के स्थानीय आचार समिति की सिफारिशों के अनुसार बाहर किया गया था।

1. K562 कोशिकाओं का संवर्धन

  1. R10 मीडिया में संस्कृति K562 कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ पर एक सेल संस्कृति फ्लास्क में मिलीलीटर प्रति 0.5-1 x 10 6 कोशिकाओं के घनत्व पर (glutamine मध्यम, 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, 10% भ्रूण बछड़ा सीरम के साथ RPMI1640) 2।
  2. हार्वेस्ट K562 कोशिकाओं 24 घंटा एक नया प्रयोग शुरू होने से पहले।
    1. सेल संस्कृति इनक्यूबेटर से K562 कोशिकाओं से युक्त कुप्पी निकालें। धीरे ऊपर और नीचे pipetting द्वारा संस्कृति मीडिया के भीतर K562 कोशिकाओं फिर से निलंबित।
    2. 15 या 50 मिलीलीटर ट्यूब में K562 कोशिकाओं से युक्त संस्कृति मीडिया स्थानांतरण और 8 मिनट के लिए 400 XG पर गोली कोशिकाओं। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 5 मिलीलीटर R10 मीडिया में कोशिकाओं को फिर से निलंबित और अच्छी तरह मिलाएँ।
    3. स्थानांतरण एक 96-यू अच्छी तरह से थाली के एक कुएं में सेल के समाधान के 20 μl। 20 μl trypan नीले जोड़ें औरऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिश्रण अच्छी तरह से कम से कम 5 बार के लिए। पिपेट एक सेल गिनती चैम्बर में समाधान के 10 μl और कोशिकाओं की गिनती।
    4. 8 मिनट के लिए 400 XG पर गोली कोशिकाओं। R10 मीडिया में कोशिकाओं को फिर से निलंबित और मिलीलीटर प्रति 0.5-1 x 10 6 कोशिकाओं को K562 सेल एकाग्रता समायोजित करें।
    5. उपयोग करें जब तक 37 डिग्री सेल्सियस पर एक सेल संस्कृति फ्लास्क में K562 कोशिकाओं सेते हैं और 5% सीओ 2।

2. एन.के. कोशिकाओं के अलगाव

  1. अनुमोदन और स्थानीय आचार समिति के दिशा-निर्देशों के अनुसार, या तो EDTA या heparinized परिधीय रक्त के 6-10 मिलीलीटर के संग्रह से पहले स्वस्थ दाता या रोगी की लिखित सूचित सहमति प्राप्त करते हैं।
  2. प्रयोग के शुरू होने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर एन.के. सेल अलगाव के लिए स्टोर अभिकर्मकों और फिर उन्हें कमरे के तापमान (आरटी) बाँझ शर्तों के तहत कम से उपयोग करें। चुंबकीय microbeads और टी के अनुसार सेल अलगाव के लिए एक विशिष्ट चुंबक का उपयोग परिधीय रक्त से एन.के. कोशिकाओं को अलगवह निर्माता के निर्देशों।
    1. शीशी में प्रदान की बफर (एन.के. सेल अलगाव किट में शामिल) के 7.5 मिलीलीटर pipetting द्वारा lyophilized एन.के. सेल नकारात्मक अलगाव एंटीबॉडी कॉकटेल की एक शीशी Reconstitute। नीचे 3-4 बार ऊपर pipetting और धीरे मिलाएं।
      नोट: सुनिश्चित करें कि निलंबन प्रत्येक उपयोग करने से पहले समरूप है।
    2. कदम 2.2.1 और बफर बी (एन.के. सेल अलगाव किट में शामिल) से पुनर्गठित गोली की उचित मात्रा के मिश्रण से अंतिम कॉकटेल समाधान तैयार है। इन संस्करणों का निर्धारण करने के लिए, = मात्रा के रूप में मिलीलीटर में पूरे रक्त के नमूने की मात्रा को परिभाषित 1.0। पूरे रक्त की मात्रा 1 पर कार्रवाई करने के पुनर्गठन गोली और बफर बी के 0.25 खंडों (कदम 2.2.1 से) के 0.25 की मात्रा का प्रयोग करें।
    3. एक पर्याप्त ट्यूब पूरे रक्त के नमूने से युक्त में मिश्रण स्थानांतरण। पिपेट के भीतर रक्त के नुकसान से बचने के लिए नीचे विंदुक ऊपर और मत करो। इसके बजाय, ट्यूब बंद करने और इसे स्थानांतरित ध्यान से ऊपर और नीचे suspen तकसायन समरूप है। भंवर मत करो।
    4. इसके अलावा आरटी पर 5 मिनट के लिए एक ट्यूब रोटेटर का उपयोग नमूना homogenize।
    5. बाँझ शर्तों के तहत, टोपी को हटा दें और के रूप में निर्माता से सिफारिश की 15 मिनट के लिए चुंबकीय विभाजक में ट्यूब जगह है। सुनिश्चित करें कि ट्यूब लेबलों चुंबक की पीठ की ओर का सामना जुदाई लाइन की अबाधित दृश्यता अनुमति देने के लिए सुनिश्चित करें। जुदाई के दौरान चुंबक कदम नहीं है, के रूप में इस प्रक्रिया को परेशान किया जाएगा।
    6. ध्यान से एक नया 15 मिलीलीटर ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला हस्तांतरण और पूरा मीडिया के साथ भरने (मुख्यमंत्री, hematopoietic सेल मीडिया, 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, 5% मानव सीरा)। 8 मिनट के लिए 400 XG पर गोली कोशिकाओं।
      1. वैकल्पिक: तो गोली लाल है, एरिथ्रोसाइट lysis बफर (के 1ml में कोशिकाओं को फिर से निलंबित जैसे, 1 अमोनियम क्लोराइड पोटेशियम (एसीके) lysing बफर के मिलीलीटर: 155 मिमी एनएच 4 सीएल, 0.1 मिमी EDTA, 10 मिमी KHCO 3 1 एल आसुत जल (DW)) और आरटी पर 8 मिनट के लिए सेते हैं। वैकल्पिक रूप से, एक ईआर का उपयोगythrocyte कमी किट।
        नोट: ध्यान रखें, कि एसीके बफर के उपयोग के नकारात्मक एन.के. सेल कार्यों 14 पर असर पड़ सकता है।
      2. तेजी से 8 मिनट के लिए 400 XG पर सेल और सेंट्रीफ्यूज को रोकने के लिए गोली कोशिकाओं के मुख्यमंत्री के कम से कम 1 मिलीलीटर जोड़कर एसीके बफर पतला।
    7. 1 मिलीलीटर मुख्यमंत्री में सेल गोली पुनः निलंबित और उनकी गिनती के साथ आगे बढ़ना। एक 96-यू अच्छी तरह से थाली पर एन.के. सेल समाधान के 20 μl स्थानांतरण। प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए नीले methylene के 20 μl जोड़ें और कम से कम 5 बार के लिए ऊपर और नीचे pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं। पिपेट एक सेल गिनती चैम्बर में समाधान के 10 μl और कोशिकाओं की गिनती। वैकल्पिक रूप से, एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सेल काउंटर के साथ गिनती के लिए undiluted सेल निलंबन के 30 μl का उपयोग करें।
    8. प्रति 100 μl सेमी में कम से कम 2 एक्स 10 4 एन.के. कोशिकाओं की एकाग्रता के लिए कोशिकाओं को समायोजित करें।
    9. कोशिकामापी एक प्रवाह का उपयोग शुद्धता की जांच करने के लिए पृथक एन.के. सेल की आबादी का एक सतह एंटीबॉडी धुंधला प्रदर्शन करना।
      1. पीआरप्रति 1 टेबल के रूप में संकेत एंटीबॉडी की मात्रा के मिश्रण से एक मास्टर मिश्रण समाधान epare।
      2. 88.5 μl धोने बफर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित (पश्चिम बंगाल; 0.5% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए), 0.1% पीबीएस में NaN 3) और मास्टर मिश्रण समाधान के 11.5 μl जोड़ें। अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते हैं।
        सावधानी: NaN 3 विषैले और उत्परिवर्तजन है। इसी सामग्री सुरक्षा डाटा शीट (MSDS) को तदनुसार इसे संभाल।
      3. पश्चिम बंगाल के 1 मिलीलीटर 4 मिनट के लिए 400 XG पर कोशिकाओं जोड़ें और गोली।
      4. 300 μl बफर धुंधला प्लस DAPI में कोशिकाओं को फिर से निलंबित। एक प्रवाह कोशिकामापी का उपयोग कोशिकाओं मोल।
        नोट: प्रयोग केवल यदि एन.के. सेल पवित्रता सभी जीवित लिम्फोसाइटों के कम से कम 80% है के साथ आगे बढ़ना।

3. एन.के. सेल उत्तेजना के लिए K562 कोशिकाओं की कटाई

  1. सेल संस्कृति वें से (1.2 कदम से) K562 कोशिकाओं से युक्त कुप्पी हटाये ई इनक्यूबेटर। धीरे ऊपर और नीचे pipetting द्वारा संस्कृति मीडिया के भीतर K562 कोशिकाओं फिर से निलंबित।
  2. 15 या 50 मिलीलीटर ट्यूब में पूरी संस्कृति मीडिया हस्तांतरण और 8 मिनट के लिए 400 XG पर गोली कोशिकाओं। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 5 मिलीलीटर फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में कोशिकाओं को फिर से निलंबित और अच्छी तरह मिलाएँ।
  3. स्थानांतरण एक 96-यू अच्छी तरह से थाली के एक कुएं में सेल के समाधान के 20 μl। 20 μl trypan नीले जोड़ें और कम से कम 5 बार के लिए ऊपर और नीचे pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं। पिपेट एक सेल गिनती चैम्बर में समाधान के 10 μl और कोशिकाओं की गिनती। वैकल्पिक रूप से एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सेल काउंटर के साथ गिनती करने के लिए undiluted सेल निलंबन के 30 μl का उपयोग करें।
  4. 8 मिनट के लिए 400 XG पर गोली कोशिकाओं। प्रति 100 μl मीडिया में कम से कम 2 एक्स 10 4 K562 कोशिकाओं की एकाग्रता में मुख्यमंत्री में कोशिकाओं को फिर से निलंबित।
    नोट: बाद में 1: एक प्रेरक पर दोनों सेते क्रम में एक ही K562 और एन.के. सेल सांद्रता का उपयोग करें: लक्ष्य (ई: टी) की 1 अनुपात।
"> 4। ट्यूमर कोशिका लाइन K562 और साइटोकिन्स के साथ एन.के. कोशिकाओं की उत्तेजना

  1. धीरे कम से कम 5 बार के लिए उन्हें ऊपर और नीचे pipetting द्वारा कोशिकाओं मिश्रण। 100 μl की अच्छी तरह / एन.के. सेल समाधान के लिए एक 96-वी अच्छी तरह से थाली की आवश्यकता कुओं में बांटो।
    1. के साथ एक और एक-एक दाता के लिए कम से कम दो कुओं का उपयोग, एक प्रोत्साहन (जैसे, K562 ट्यूमर कोशिकाओं और साइटोकिन्स) के बिना। जब भी संभव हो, कम से कम दो प्रतियों में प्रयोग करने के लिए और एक सकारात्मक नियंत्रण (जैसे, phorbol 12 myristate 13-एसीटेट (पीएमए) और ionomycin; अंतिम एकाग्रता: 50 एनएम पीएमए, अच्छी तरह से प्रति ionomycin 1 माइक्रोन) जोड़ें। प्रयोग की तारीख के लिए मुआवजा cytometry अद्यतन प्रवाह तैयार करें।
      ध्यान दें: एंटीबॉडी से पहले उपयोग (चर्चा देखें) titrate।
  2. प्रकाश बंद स्विच और विरोधी CD107a एंटीबॉडी (2 μl, अंतिम एकाग्रता 100: 1) जोड़ने 96 वी अच्छी तरह से थाली पर एनके कोशिकाओं के साथ एक अच्छी तरह से।
  3. धीरे उन्हें ऊपर pipetting द्वारा और कम करने के लिए नीचे K562 कोशिकाओं मिश्रणकम से कम 5 बार।
    1. एन.के. सेल / विरोधी CD107a एंटीबॉडी समाधान युक्त कुओं से, K562 कोशिकाओं के साथ उत्तेजना के लिए योजना बनाई लोगों की पहचान। 100 μl / इन कुओं में K562 सेल के समाधान के अच्छी तरह से जोड़ें। कम से कम 5 बार के लिए ऊपर और नीचे pipetting द्वारा ध्यान से मिलाएं।
    2. जोड़े इंटरल्यूकिन -2 (IL-2, अंतिम एकाग्रता 100 यू / एमएल) और इंटरल्यूकिन 15 (आईएल 15; अंतिम एकाग्रता 10 एनजी / एमएल) K562 कोशिकाओं और एन.के. सेल / विरोधी CD107a एंटीबॉडी समाधान युक्त कुओं के लिए।
      1. वैकल्पिक: वितरित एन.के. कोशिकाओं पर अकेले या तो K562 कोशिकाओं या साइटोकिन्स के प्रभाव का परीक्षण ट्यूमर प्रेरित बनाम साइटोकाइन प्रेरित एन.के. सेल कार्यों को समझने की।
    3. 96 वी अच्छी तरह से थाली पर कुओं को पहचानें प्रोत्साहन के रूप में बिना नकारात्मक नियंत्रण की योजना बनाई है। इनमें से केवल एन.के. सेल / विरोधी CD107a एंटीबॉडी समाधान युक्त कुओं के लिए 100 μl / अच्छी तरह से मुख्यमंत्री जोड़ें। कम से कम 5 बार के लिए ऊपर और नीचे pipetting द्वारा ध्यान से मिलाएं।
      1. वैकल्पिक: एक सकारात्मक नियंत्रण के लिए, 100 μ जोड़नेएल पीएमए और ionomycin युक्त मुख्यमंत्री (अंतिम एकाग्रता: 50 एनएम पीएमए, अच्छी तरह से प्रति ionomycin 1 माइक्रोन) के एन.के. सेल / विरोधी CD107a एंटीबॉडी समाधान के साथ एक अच्छी तरह से करने के लिए।
  4. 37 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 3 घंटा और 5% सीओ 2 के लिए कोशिकाओं को सेते हैं।
  5. एक प्रोटीन परिवहन अवरोध समाधान तैयार है (जैसे, एक और / या monensin brefeldin) मुख्यमंत्री में। ऊष्मायन के 1 घंटे के बाद, प्रकाश के साथ 96 वी अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से समाधान जोड़ने बंद (अंतिम एकाग्रता: 0.5-1μM brefeldin ए और 2-3 सुक्ष्ममापी monensin)। कम से कम 5 बार के लिए ऊपर और नीचे pipetting द्वारा ध्यान से मिलाएं। शेष 2 घंटे के लिए ऊष्मायन जारी रखें।

5. सतह और intracellular धुंधला

  1. 3 घंटा ऊष्मायन अवधि के बाद, कम से कम 5 बार के लिए ऊपर और नीचे pipetting द्वारा सावधानी से 96 वी अच्छी तरह से थाली के कुओं के भीतर कोशिकाओं का मिश्रण है और उन्हें ट्यूब के प्रवाह cytometry में स्थानांतरित। 1 मिलीग्राम / पश्चिम बंगाल की ट्यूब जोड़ें। 4 मिनट के लिए 400 XG पर गोली कोशिकाओं।
    1. वैकल्पिक: इससे पहले centrifugation 100 μl / अच्छी तरह से पीबीएस के साथ कुओं कुल्ला, आदेश संबंधित FACS ट्यूब में कोशिकाओं को स्थानांतरित करने से पहले कम से कम 5 बार के लिए, सेल वसूली का अनुकूलन करने के लिए ऊपर और नीचे pipetting द्वारा में।
  2. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और सतह धुंधला के साथ जारी रखें।
  3. एक amine प्रतिक्रियाशील फ्लोरोसेंट रंजक है कि गैर permeant है एक फिक्स मृत सेल मार्कर (डीसीएम) के रूप में 423 एनएम के एक उत्सर्जन अधिकतम के साथ कोशिकाओं को रहने के लिए शामिल करें। पहले (देखें नीचे) या एंटीबॉडी सतह धुंधला डीसीएम के प्रकार के आधार पर इस्तेमाल के साथ समानांतर में धुंधला प्रदर्शन करना।
    1. 99 μl / ट्यूब पीबीएस में कोशिकाओं को फिर से निलंबित और 1 μl / फिक्स डीसीएम (अंतिम एकाग्रता: 1: 100) की ट्यूब जोड़ें। अच्छी तरह से एक भंवर का उपयोग कोशिकाओं मिश्रण और अंधेरे में आरटी पर 15 मिनट के लिए उन्हें सेते हैं।
    2. एक साथ मिश्रण 2 तालिका में सूचीबद्ध "सतह" एंटीबॉडी (कदम स्तंभ धुंधला करने को देखने के नीले रंग में प्रकाश डाला) द्वारा एक मास्टर मिश्रण समाधान तैयार है। में प्रयोग करेंdicated संस्करणों / ट्यूब और उन्हें प्रवाह की संख्या के साथ गुणा cytometry ट्यूबों के दाग हो।
    3. ऊष्मायन के बाद कोशिकाओं के साथ ट्यूब प्रवाह cytometry ले और 1 मिलीग्राम / पश्चिम बंगाल की ट्यूब जोड़ें। 4 मिनट के लिए 400 XG पर गोली कोशिकाओं।
    4. सतह पर तैरनेवाला त्यागें, पश्चिम बंगाल के 84 μl / ट्यूब में कोशिकाओं को फिर से निलंबित और 16 μl / मास्टर मिश्रण समाधान की ट्यूब जोड़ें। अच्छी तरह से एक भंवर का उपयोग कोशिकाओं मिक्स। अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते हैं।
    5. 20 मिनट के बाद 4 मिनट के लिए 400 XG पर 1 मिलीग्राम / ट्यूब पश्चिम बंगाल और गोली कोशिकाओं जोड़ें।
  4. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 100 μl / एक ठंड निर्धारण समाधान (जैसे, 2% (अंतिम) paraformaldehyde या formaldehyde) की ट्यूब में कोशिकाओं को फिर से निलंबित। अच्छी तरह से एक भंवर का उपयोग कोशिकाओं मिक्स। अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते हैं।
    1. इस कदम के बाद intracellular साइटोकिन्स / chemokines के लिए कोशिकाओं दाग या उन्हें पश्चिम बंगाल में 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर दुकान।
      ध्यान दें: रात ऊष्मायन के बाद, एक कम सेल वसूली हो सकता है।
  5. 4 मिनट के लिए 400 XG पर 1 मिलीग्राम / ट्यूब पश्चिम बंगाल में कोशिकाओं को धो लें और permeabilization कदम के साथ आगे बढ़ें।
  6. एक permeabilization बफर (पंजाब) (जैसे, 0.2% सैपोनिन, 1% बीएसए पीबीएस में समाधान) तैयार करें।
  7. कोशिकाओं 4 मिनट के लिए 400 XG पर पंजाब के 1 मिलीग्राम / ट्यूब में दो बार धोएं। intracellular धुंधला के साथ आगे बढ़ें।
    सावधानी: Saponin संभावित परेशान है। इसी सामग्री सुरक्षा डाटा शीट (MSDS) को तदनुसार इसे संभाल।
  8. संकेत दिया "intracellular" एंटीबॉडी तालिका 2 में संस्करणों (हरे रंग में प्रकाश डाला) का उपयोग करते हुए एक मास्टर मिश्रण समाधान तैयार है। ट्यूब की संख्या के साथ इन संस्करणों गुणा दाग हो।
    1. 90 μl / ट्यूब पंजाब में कोशिकाओं को फिर से निलंबित और 10 μl / एंटीबॉडी मास्टर मिश्रण समाधान की ट्यूब लागू होते हैं। अच्छी तरह मिक्स एक भंवर का उपयोग और 3 के लिए कोशिकाओं सेतेअंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 0 मिनट।
  9. प्रकोष्ठों 4 मिनट के लिए 400 XG पर पंजाब के 1 मिलीग्राम / ट्यूब में दो बार धोने।
  10. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 400 μl / ट्यूब पंजाब में कोशिकाओं को फिर से निलंबित। अच्छी तरह से एक भंवर का उपयोग कोशिकाओं मिक्स। माप जब तक अंधेरे में बर्फ पर कोशिकाओं रखें।

6. फ्लो का मुआवजा और अधिग्रहण

  1. अलग fluorochromes के लिए चैनलों का चयन करें पैरामीटर सेटअप फ़ोल्डर में अधिग्रहण सॉफ्टवेयर प्रवाह cytometry के भीतर (2 टेबल देखें)। इसके अतिरिक्त, FSC-A के लिए चैनलों के लिए चुनते हैं और एसएससी-ए और एच के साथ ही एच।
  2. अधिग्रहण फ़ाइल में चुना मापदंडों के लिए बनाई गई एक मुआवजा मैट्रिक्स लोड।
    1. कदम 2.2.8 से पृथक एन.के. कोशिकाओं का उपयोग कर एक मुआवजा मैट्रिक्स प्रत्येक इस्तेमाल किया fluorochrome के लिए एक ही रंग के दाग के प्रदर्शन से बनाएँ (2 टेबल देखें)। सतह धुंधला कदम 5.1-5.4 में वर्णित प्रोटोकॉल का प्रयोग करें। एक अस्थिर नियंत्रण (किसी भी एंटीबॉडी के बिना शामिल करें) के रूप में अच्छी तरह से निर्धारण नियंत्रण और / या प्रतिदीप्ति शून्य से एक नियंत्रण (FMO)।
      नोट: सेल आधारित मुआवजा के लिए एक विकल्प के रूप में, आईजीजी बाध्यकारी मुआवजा नियंत्रण के रूप में मोती का उपयोग करें।
    2. एकल दाग नमूने के लिए प्रत्येक ट्यूब और नमूना इंजेक्शन बंदरगाह (एसआईपी) में एंटीबॉडी के बिना नमूना रखें। फ्लो का अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में "रिकॉर्ड" बटन पर क्लिक करें और नमूना प्रति कम से कम 5 एक्स 10 3 एनके कोशिकाओं के एक सेल नंबर हासिल।
    3. एक मुआवजा मैट्रिक्स बनाने के लिए cytometry अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का मुआवजा गणना के आवेदन का प्रयोग करें।
  3. एन.के. सेल की आबादी की पहचान के लिए डॉट भूखंडों बनाएँ।
    1. एफएससी-ए / एफएससी-एच और एसएससी-ए / एसएससी-एच डॉट भूखंडों का उपयोग कर एकल कक्षों को पहचानें। "बहुभुज गेट" बटन पर क्लिक करें। कोशिकाओं है, जो दोनों डॉट भूखंडों में एक रेखीय वितरण पैटर्न है चारों ओर एक फाटक ड्रा। एक नया डॉट साजिश खोलने के लिए द्वार पर डबल क्लिक करें।
    2. एक एफएससी-ए / एसएससी-एक डॉट साजिश लिम्फोसाइट की पहचान करने के लिए चुनें/ एन.के. सेल आबादी (चित्रा 1 देखें)। यह चारों ओर एक बहुभुज गेट ड्रा और गेट पर डबल क्लिक करें।
  4. एन.के. सेल उत्तेजना परख के प्रत्येक नमूना ट्यूब एसआईपी में रखें। "रिकॉर्ड" बटन पर क्लिक करें और नमूना प्रति कम से कम 5 एक्स 10 3 एनके कोशिकाओं के एक सेल नंबर हासिल।

7. विश्लेषण और सांख्यिकी

  1. विश्लेषण सॉफ्टवेयर प्रोग्राम प्रवाह cytometry खोलें। unstimulated नियंत्रण नमूना खोलने के लिए लोडिंग नमूना बटन पर क्लिक करें।
  2. विभिन्न एन.के. सेल उप-जनसंख्या (चित्रा 1 देखें) के लिए एक gating प्रणाली बनाएँ।
    1. एक एफएससी-ए / एसएससी-एक साजिश बनाने के लिए डॉट साजिश बटन पर क्लिक करें। आयत गेट बटन पर क्लिक करें और> 5 एक्स 10 4 मलबे को बाहर करने के लिए एक एफएससी-एक मूल्य के साथ सभी घटनाओं पर एक आयत गेट आकर्षित। गेट पर डबल क्लिक करके गेट खोलें।
    2. फिर एफएससी-ए / एसएससी-एक नया डॉट साजिश के भीतर मानकों को चुनें और बहुभुज गेट बटन पर क्लिक करें। डीकच्चे लिम्फोसाइट आबादी के चारों ओर एक बहुभुज गेट (चित्रा 1 देखें)। गेट खोलने।
    3. नई डॉट साजिश के लिए एसएससी-ए / एसएससी-एच पैरामीटर का चयन करें और आसपास के सभी एकल कक्षों एक बहुभुज गेट आकर्षित। एकल कक्षों एफएससी-ए / एफएससी-एच और एसएससी-ए / एसएससी-एच मानकों को पार एक रेखीय वितरण का प्रदर्शन (चित्रा 1 देखें)। उस पर डबल क्लिक करके गेट खोलें।
    4. दोहराएँ कदम 7.2.3 एफएससी-ए / एफएससी-एच मापदंडों के इस समय का उपयोग कर।
    5. मृत कोशिकाओं को बाहर करने के लिए पैरामीटर CD45 का प्रयोग करें और डंप चैनल (डीसीएम CD3; CD14; CD19)। सभी CD45 सकारात्मक चारों ओर एक आयत गेट ड्रा और चैनल नकारात्मक कोशिकाओं डाल दो। गेट पर डबल क्लिक करके गेट खोलें।
    6. CD56 उपयोग करके पूरी एन.के. सेल आबादी की पहचान और चैनल मानकों को डंप। चारों ओर CD56 सकारात्मक एक आयत गेट बनाएँ और नकारात्मक कोशिकाओं चैनल डंप। उस पर डबल क्लिक करके गेट खोलें।
    7. चारों ओर एक CD56 / CD16 डॉट साजिश के भीतर सभी तीन एन.के. सेल सबसेट एक आयत गेट ड्रा। आईडीई, CD56 ++ CD16 + और CD56 + CD16 ++ एन.के. सेल सबसेट - CD56 ++ CD16 के रूप में विभिन्न सबसेट ntify।
  3. विश्लेषण प्रत्येक व्यक्ति एन.के. सेल सबसेट के लिए एन.के. सेल कार्यों।
    1. इसे खोलने के लिए तीन एन.के. सेल सबसेट फाटकों में से एक पर क्लिक करें। CD56 / CD107a, CD56 / IFN-γ और CD56 / एमआईपी 1β के लिए तीन अलग-अलग डॉट भूखंडों बनाएँ।
    2. CD56 सकारात्मक कोशिकाओं है, जो क्रमश: CD107a, IFN-γ या एमआईपी 1β के लिए भी सकारात्मक रहे हैं के लिए एक आयत गेट ड्रा (चित्रा 1 देखें)।
    3. प्रत्येक शेष एन.के. सेल सबसेट के लिए कदम दोहराएँ 7.3.1-7.3.2।
  4. दोहराएँ कदम 7.2 और सभी को प्रेरित नमूने के लिए 7.3। विश्लेषण सॉफ्टवेयर के भीतर आंकड़ा निर्यात बटन पर क्लिक करके प्रत्येक व्यक्ति के नमूने के सभी सांख्यिकीय मूल्यों को बचाने के।
  5. व्यक्ति के नमूनों के सांख्यिकीय मूल्यों से युक्त एन.के. सेल कार्यों का विश्लेषण करने के लिए फाइल खोलें। व्यक्तिगत एन.के. सेल के लिए मूल्यों का चयन करेंसबसेट (जैसे, CD56 ++ CD16 - एनके कोशिकाओं) उन्हें एक और फाइल में कॉपी करके।
    1. CD107a सकारात्मक एनके कोशिकाओं है, जो CD107a सकारात्मक एन.के. कोशिकाओं का प्रतिशत है, जो एक उत्तेजना के साथ इलाज किया गया है से एक प्रोत्साहन के साथ इलाज नहीं किया गया है, का प्रतिशत घटाएँ।
      नोट: उत्तेजना के जवाब में यह विशेष रूप से एन.के. सेल सबसेट के degranulation क्षमता का प्रदर्शन करने के परिणाम का प्रयोग करें।
    2. IFN-γ और एमआईपी 1SS पॉजिटिव एन.के. कोशिकाओं के लिए दोहराएँ चरण 7.5.1 उत्तेजना के जवाब में साइटोकाइन और केमोकाइन उत्पादन प्रदर्शित करने के लिए।
    3. प्रत्येक शेष एन.के. सेल सबसेट के लिए कदम दोहराएँ 7.5.1-7.5.2 उत्तेजना पर उनकी degranulation क्षमता और साइटोकाइन / केमोकाइन उत्पादन का मूल्यांकन करने के लिए।

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Representative Results

पूरे एन.के. सेल की आबादी और तीन अलग अलग एन.के. सेल सबसेट के degranulation, साइटोकाइन और केमोकाइन उत्पादन विश्लेषण करने के लिए gating रणनीति चित्रा 1 में सचित्र हैं।

एक स्वस्थ दाता के प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 2 में सचित्र हैं। किसी भी प्रोत्साहन के बिना एन.के. कोशिकाओं न IFN-γ और न ही एमआईपी 1β उत्पादन किया है और उनकी सतह पर CD107a (2A चित्रा) का इजहार नहीं किया। इसके विपरीत, एन.के. कोशिकाओं ट्यूमर कोशिकाओं और साइटोकिन्स के साथ प्रेरित intracellular IFN-γ और एमआईपी 1β के महत्वपूर्ण मात्रा में उत्पादन किया। इसके अलावा, उनमें से 20% से अधिक उनकी सतह (चित्रा -2) पर CD107a व्यक्त ने संकेत दिया ट्यूमर सेल बातचीत पर degranulated। पीएमए और Ionomycin उत्तेजना के लिए एक नियंत्रण (चित्रा 2 बी) के रूप में इस्तेमाल किया गया।

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चित्रा 1:। रणनीति Gating बाद फाटक प्लॉट किए जाते हैं। सबसे पहले, मलबे एक एफएससी-ए / एसएससी-एक साजिश में बाहर रखा गया है। तब लिम्फोसाइट पहचान कर रहे हैं और दोहरी एसएससी-ए / एसएससी-एच और FSC-ए / एफएससी-एच के साथ दो भूखंडों का उपयोग कर बाहर रखा गया है। इसके बाद सभी CD45 + कोशिकाओं और सभी मृत, CD3 +, CD14 + और CD19 + कोशिकाओं को छोड़कर सहित एक गेट CD45 / डंप चैनल की साजिश रचने के लिए निर्धारित है। अगले, एन.के. कोशिकाओं CD56 + कोशिकाओं पर gating द्वारा पहचाने जाते हैं। CD56 / CD16 के साथ एक भूखंड मुख्य एन.के. सेल सबसेट की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। अंत में, पूरे एन.के. सेल आबादी के भीतर, कार्यात्मक मार्कर CD107a, IFN-γ और एमआईपी 1β क्रमश: बनाम CD56 साजिश रचने के द्वारा पहचाने जाते हैं। यह रूप में अच्छी तरह एन.के. सेल सबसेट के सभी विभिन्न प्रकार के लिए किया जा सकता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


चित्रा 2:। एक स्वस्थ एन.के. सेल दाता से प्रतिनिधि परिणाम gating रणनीति चित्र 1 में वर्णित का उपयोग करना, CD107a (degranulation के लिए) की तरह एन.के. सेल कार्यात्मक मार्कर, IFN-γ और एमआईपी 1β पहचाना जा सकता है। बाएँ स्तंभ (ए) एक प्रोत्साहन के अभाव में एन.के. कोशिकाओं का उपयोग कर परिणाम से पता चलता है। मध्य स्तम्भ (बी) सकारात्मक नियंत्रण पीएमए / ionomycin की उपस्थिति में परिणाम को दर्शाता है। सही कॉलम (सी) ट्यूमर सेल लाइन K562 के साथ प्रेरित एनके कोशिकाओं के लिए और साइटोकिन्स की उपस्थिति में IL- 2 (100 यू / एमएल) और आईएल -15 (10 एनजी / एमएल)। परिणाम प्रस्तुत कृपया यहाँ क्लिक करें देखने के लिए यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण।

तालिका 1: शुद्धता की जांच के लिए एंटीबॉडी।

सारणी 2
तालिका 2: अतिरिक्त और intracellular धुंधला के लिए एंटीबॉडी।

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Discussion

वर्णित विधि स्वस्थ दाताओं या रोगियों के पूरे रक्त के नमूनों से एन.के. सेल कार्यों का अध्ययन करने के लिए एक आसान, तेज और विश्वसनीय तरीका है। समय लेने वाली घनत्व ढाल centrifugation, जो कई अन्य शुद्धि तरीकों 15 के लिए अनिवार्य है इस विधि महान लाभ सीधे पूरे रक्त से एन.के. कोशिकाओं को शुद्ध करने के लिए प्रदान करता है परहेज। इसके अलावा, यह एक छोटे नमूने का आकार "शास्त्रीय" एन.के. सेल अलगाव / संवर्धन तरीकों की तुलना में, जो यह बाल चिकित्सा और / या प्रतिरक्षा की कमी के रोगियों के नमूने के लिए एक उपयुक्त विकल्प बनाता है की आवश्यकता है। इस प्रोटोकॉल एन.के. सेल कार्यों पूर्व vivo के बेसल मूल्यों को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन यह भी आगे एन.के. संस्कृति और विस्तार की अनुमति देता है, इस तरह से अन्य तरीकों के साथ पूरक पहले 8 वर्णित में किया जा रहा है। फिर भी कुछ महत्वपूर्ण कदम को ध्यान में रखा जाना है। चूंकि परख अतिरिक्त और intracellular एंटीबॉडी धुंधला पर आधारित है, यह wo इष्टतम निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण हैप्रत्येक एंटीबॉडी के लिए एकाग्रता rking पहले। खास तौर पर intracellular धुंधला के लिए, इस्तेमाल किया एंटीबॉडी के एक सावधान मूल्यांकन अत्यधिक की सिफारिश की है। एक अच्छा दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया एंटीबॉडी के कमजोर पड़ने श्रृंखला का परीक्षण करने के लिए है (उदाहरण के लिए, 1: 100 1: 12.5) के साथ या पीएमए / बिना ionomycin प्रेरित एक सेल निलंबन में। इसके बाद उत्तेजित और संयुक्त राष्ट्र को प्रेरित किया नमूनों के बीच सकारात्मक घटनाओं के अनुपात की गणना की और प्लॉट किए जाते हैं। उच्चतम सकारात्मक परिवर्तन गुना अनुपात (सबसे अच्छा संकेत करने वाली पृष्ठभूमि अनुपात) के साथ एंटीबॉडी कमजोर पड़ने आगे के प्रयोगों 16 के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। इसके अलावा, isotype- और FMO नियंत्रण तरह नियंत्रण का उपयोग साबित intracellular धुंधला के लिए विशेष रूप से मौलिक सकारात्मक सेल आबादी पर सही ढंग से फाटक के क्रम में हो सकता है।

हालांकि, वहाँ वर्णित विधि के कुछ महत्वपूर्ण सीमाएं हैं। CD107a अभिव्यक्ति एक degranulation मार्कर है और इसलिए ही परोक्ष रूप से एन.के. सेल cytotoxicity इंगित करता है। एन.के. सेल cytotoxicity एकएन डी degranulation क्षमता अलग-अलग हो सकता है। अप-विनियमन स्रावित granzyme बी की गिरावट में ट्यूमर कोशिकाओं परिणामों में भोजी मार्ग की और एन.के. सेल बातचीत 17 पर कोशिका मृत्यु को कम करता है। इसलिए एक अतिरिक्त डीसीएम (जैसे, cleaved कस्पासे 3) धुंधला पैनल के आदेश लक्ष्य कोशिकाओं के भीतर 18 कोशिका मृत्यु की घटनाओं पर नजर रखने के लिए जोड़ा जा सकता है। इसके अतिरिक्त, एन.के. सेल cytotoxicity उनकी कणिकाओं के भीतर साइटोटोक्सिक प्रोटीन (जैसे, perforin, granzyme ख) की राशि है, जो एक intracellular धुंधला 19,20 द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है से प्रभावित है।

इसके अलावा, वहाँ प्रोटोकॉल को संशोधित करने के लिए अलग अलग संभावनाएं हैं। पृथक एन.के. कोशिकाओं के बजाय, परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMCs) का इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि एक पता है कि PBMC आबादी के भीतर पूर्ण एन.के. सेल संख्या में विभिन्न दानदाताओं के बीच और यहां तक ​​कि अलग अलग समय बिंदुओं पर एक ही दाता से प्राप्त नमूनों के बीच अलग हो गया है। एन.के. सेल degranulटी अनुपात: समझना ई पर अत्यधिक निर्भर है। सभी प्रयोगों के दौरान टी अनुपात: क्रम में विभिन्न दानदाताओं के बीच या विभिन्न बिंदुओं पर समय एन.के. सेल कार्यों की तुलना करने के लिए, PBMC आबादी के भीतर पूर्ण एन.के. सेल नंबर एक निरंतर ई स्थापित करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। एन.के. सेल कार्यों ही दाता के भीतर अलग-अलग समय बिंदुओं पर निगरानी कर रहे हैं, तो PBMCs जमे हुए किया जा सकता है और विश्लेषण के क्रम में अंतर-प्रयोगात्मक रूपों 11 को कम करने में सभी अलग अलग समय बिंदुओं के लिए एक बार में किया जा सकता है।

अप करने के लिए 18 रंगों संभव हो रहे हैं के साथ पैनल धुंधला करने के बाद से, एन.के. सेल कार्यों का विश्लेषण एक बहुत अधिक विस्तार करने के लिए बढ़ाया जा सकता है। CD57, NKG2A और हत्यारा सेल इम्युनोग्लोबुलिन की तरह रिसेप्टर्स (Kirs) सहित अतिरिक्त सतह मार्कर का उपयोग करना, आगे एन.के. सेल सबसेट पहचाना जा सकता है। शिक्षित एन.के. कोशिकाओं को व्यक्त करने में कम से कम एक आत्म-KIR अशिक्षित एन.के. कोशिकाओं की तुलना में K562 कोशिकाओं के साथ बातचीत पर मजबूत degranulate। इसके विपरीत, अधिक विभेदित CD57 + CD56 + + एन.के. कोशिकाओं 21 - sup> एन.के. कोशिकाओं कम विभेदित CD57 की तुलना में आईएल 12 और आईएल 15 उत्तेजना पर कम IFN-γ उत्पादन। इसके अलावा, एन.के. सेल समारोह के अन्य मार्करों संबोधित किया जा सकता। LFA-1 एन.के. सेल आसंजन के लिए एक महत्वपूर्ण अणु है और एन.के. सेल सक्रियण पर अपनी खुली रचना में व्यक्त किया जाता है। इस तथाकथित "अंदर-बाहर संकेत" एक प्रारंभिक एन.के. सेल सक्रियण मार्कर 22 है।

अंत में, परीक्षण एन.के. सेल कार्यों के लिए उत्तेजनाओं के रूप में अच्छी तरह से संशोधित किया जा सकता है। हमारे अनुभव में हौसले K562 सेल बातचीत पर एनके कोशिकाओं को अलग ही degranulate खराब कोई साइटोकिन्स जोड़ रहे हैं यदि। आगे साइटोकाइन अलावा बिना हौसले से पृथक PBMCs का उपयोग दर्शक कोशिकाओं के प्रभाव की वजह से इस मुद्दे को दरकिनार। इसके अलावा, साइटोकाइन उत्पादन, विशेष रूप से IFN-γ और TNF-α, आईएल -12 और आईएल -18 उत्तेजना 23 पर शुरू किया जा सकता है। एन.के. सेल सबसेट के भीतर IFN-γ उत्पादन dependin अलग हो सकती हैइस्तेमाल किया प्रोत्साहन (cytokine- बनाम लक्ष्य प्रेरित उत्तेजना), 24 पर जी। इसके अतिरिक्त, लक्ष्य कोशिकाओं के रूप में K562 कोशिकाओं का उपयोग करने के बजाय, प्राथमिक ट्यूमर ट्यूमर के रोगियों से ली गई कोशिकाओं क्रम में पहले या प्रतिरक्षा का नियमन करने के उपचारों (जैसे, मोनोक्लोनल एंटीबॉडी उपचार या इम्युनो-modulatory दवाओं के दौरान ऑटोलॉगस ट्यूमर कोशिकाओं के खिलाफ एन.के. सेल कार्यों का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (IMiDs))।

पिछले कुछ वर्षों के भीतर, प्रतिरक्षा चिकित्सा के क्षेत्र प्रतिरक्षा चौकी अवरोधकों (जैसे, ipilumumab, nivolumumab, pembrolizumab) के नैदानिक अनुमोदन के साथ तेजी से विकसित किया गया है और 25 सफल परीक्षण आनुवंशिक रूप से संशोधित कैमेरिक प्रतिजन रिसेप्टर (सीएआर) टी कोशिकाओं -expressing के रूप में अच्छी तरह से उपयोग कार-एन.के. कोशिकाओं (संदर्भ 26 में समीक्षा), hematological ट्यूमर के रोगियों के उपचार के लिए 27 के रूप में। इसलिए एन.के. सेल आधारित प्रतिरक्षा चिकित्सा ध्यान में तेजी से और अधिक हो रही है। विरोधी CD20 एंटीबॉडी treatme में एक बड़ी सफलता की गई हैपिछले दो दशकों के भीतर 28 घातक लिम्फोमा के NT। एन.के. कोशिकाओं के विशाल बहुमत कम आत्मीयता एफसी रिसेप्टर कोशिकाओं को सक्रिय करने के CD16 को समझते हैं और एंटीबॉडी लेबल लक्ष्य कोशिकाओं (- ADCC एंटीबॉडी निर्भर सेलुलर cytotoxicity) को मारने के लिए व्यक्त करते हैं। एंटीबॉडी के एन.के. सेल कार्यों को गति प्रदान करने की क्षमता वर्णित प्रोटोकॉल 29 का उपयोग कर इन विट्रो में परीक्षण किया जा सकता है। Terszowski एट अल। विभिन्न चिकित्सकीय अनुमोदित विरोधी CD20 एंटीबॉडी का उपयोग एक बी lymphoblastoid सेल लाइन के खिलाफ विश्लेषण एन.के. कोशिकाओं 'ADCC। ADCC rituximab उपचार पर प्रेरित है (पहले चिकित्सकीय अनुमोदित विरोधी CD20 एंटीबॉडी 30) नकारात्मक KIR / एचएलए बातचीत से प्रभावित था, इस आशय जब obinutuzumab (एक उपन्यास glycoengineered प्रकार द्वितीय CD20 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी), 31, 32 का उपयोग नहीं कर मनाया गया। इसके अलावा, एन.के. सेल कार्यों IMiD lenalidomide 33 और अलग-tyrosine Kinas की तरह अलग अलग उपन्यास विरोधी ट्यूमर दवाओं से प्रभावित हैंई अवरोधकों (TKI) 34। वर्तमान में एन.के. सेल विशिष्ट चौकी अवरोधकों क्लिनिकल परीक्षण में परीक्षण कर रहे हैं। उदाहरण विरोधी KIR 35,36 या विरोधी NKG2A एंटीबॉडी (NCT02331875) के साथ ही एक एंटी-CD137 एंटीबॉडी की तरह सक्रिय एगोनिस्ट (; NCT02110082 NCT01775631) का उपयोग कर रहे हैं।

महत्वपूर्ण बात है, दत्तक एन.के. सेल हस्तांतरण होनहार नैदानिक प्रभाव 37 के साथ विभिन्न घातक रोगों की एक किस्म में प्रदर्शन किया गया है। साथ लक्ष्य के लिए सबसे अच्छा दाता चयन करने के लिए, मरीज के ट्यूमर के खिलाफ एन.के. सेल कार्यों संभावित एन.के. सेल दाताओं से रक्त के नमूनों का उपयोग कर इन विट्रो में परीक्षण किया जा सकता है।

सारांश में, वर्णित प्रोटोकॉल स्वस्थ दाताओं या रोगियों से विविध एन.के. सेल कार्यों का विश्लेषण करने के लिए बनाया गया है। उन कार्यों चयनित समय बिंदुओं पर विभिन्न उत्तेजनाओं पर विविध एन.के. सेल सबसेट में नजर रखी जा सकती है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 + glutamine Invitrogen 6187-044
penicilin/streptomycin Invitrogen 15140-122
BD Falcon Round Bottom Tube BD 352008
fetal calf serum Invitrogen 10270-106 heat inactivated before use
T-flask Greiner Bio-One 690195
K562 tumor cell line DSMZ GmbH ACC 10
ammonium-chloride-potassium (ACK) lysis buffer made in house / components are listed in the text
Distilled water: Ampuwa Spüllösung 1,000 ml Plastipur Fresenius Kabi 1088813
Megafuge 40R Centrifuge Heraeus /
EDTA blood collector tubes Sarstedt 386453 S-Monovette 7.5 ml, K3EDTA
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Life Technologies 15575-020
Hematopoietic media (XVIVO) Lonza Group Ltd BE04-743Q
human serum DRK Blutspendedienst, Frankfurt/M  / healthy donors with blood type AB; heat inactivated before use
Neubauer-improved counting chamber, bright line Marienfeld superior/ LO-Laboroptik Ltd. 0640030/ 1110000
trypan blue solution (0.4%) Invitrogen 15250-061
3% acetic acid with methylene blue Stemcell Technologies  07060
Corning 96 Well Clear V-Bottom TC-treated Microplates Corning  3894
Falcon 96 Well Round Bottom Not Treated Microplates Corning  351177
DPBS (Ca2+- and Mg2+-free) Gibco Invitrogen 14190-169
BSA Sigma Aldrich A2153-100G
NaN3 Sigma Aldrich 08591-1ML-F
phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)  Merck 524400-1MG
ionomycin  PromoKine PK-CA577-1566-5
interleukin 15 (IL-15) PeproTech 200-15
Proleukin S (IL-2)  Novartis Pharma 730523
Golgi Stop, Protein Transport Inhibitor (containing Monensin) BD Biosciences 554724 This product can be used in combination or instead of Golgi Plug. The best combination for the wished experimental setting has to be tested.
Golgi Plug, Protein Transport Inhibitor (containing Brefeldin A) BD Biosciences 555029
paraformaldehyde AppliChem UN2209
saponin Sigma Aldrich 47036
flow cytometer: Canto10C BD Biosciences /
FlowJo TreeStar Inc. /
Graph Pad Graph Pad Inc. /
MACSxpress Separator Miltenyi Biotec  130-098-308
MACSxpress NK isolation kit Miltenyi Biotec  130-098-185
MACSxpress Erythrocyte Depletion Kit, human Miltenyi Biotec  130-098-196
MACSmix Tube Rotator  Miltenyi Biotec  130-090-753
anti-human CD3 APC Biolegend 300412
anti-human CD3 V450 BD Biosciences 560366
anti-human CD14 PerCP Miltenyi Biotec  130-094-969
anti-human CD14 V450 BD Biosciences 560349
anti-human CD16 PE Biolegend 302008
anti-human CD16 PerCP Biolegend 302029
anti-human CD19 PE-Cy7 Biolegend 302216
anti-human CD19 V450 BD Biosciences 560353
anti-human CD45 BV510 BD Biosciences 563204
anti-human CD56 FITC Biolegend 345811
anti-human CD107a PE Biolegend 328608
anti-human IFN-γ AF-647 BD Biosciences 557729
anti-human MIP-1β APC-H7 BD Biosciences 561280
DAPI Biolegend 422801
Zombie Violet Fixable Viability Kit Biolegend 423113 fixable dead cell marker

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References

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Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, N., Ullrich, E. Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions. J. Vis. Exp. (116), e54615, doi:10.3791/54615 (2016).

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