Summary
간단하고 신뢰할 수있는 방법은 상이한 NK 세포의 서브 세트 내의 탈과립, 사이토 카인 및 케모카인 생산 등의 NK 세포의 기능 세트를 분석하기 위해 여기에 설명된다.
Introduction
선천성 면역 시스템 자연 살해의 일환으로 (NK) 세포는 바이러스에 감염된 또는이 악 형질 전환 된 세포에 대한 방어의 첫 번째 줄에 기여한다. 억제 및 활성화 수용체 시스템은 T 세포와 대조적으로 종래 항원 프라이밍없이 건강하고 형질 전환 된 세포를 구별하도록 할 수있다. 대상 셀의 만남에 NK 세포는 자신의 목표를 죽이는 면역 시냅스에 자신의 세포 독성 과립 (예를 들면, 퍼포, granzymes)의 내용을 놓습니다. 타겟 셀시 (MIP-1β 예, 대 식세포 염증 단백질 1β) 및 케모카인 :; 또한, NK 세포는 다른 사이토 카인의 종류 (TNF-α, 종양 괴사 인자 α IFN-γ 예, 인터페론 γ)를 생성 및 분비 상호 작용 또는 사이토 카인 자극 한.
이러한 세포 독성, 케모카인 및 사이토 카인 생성 충분한 NK 세포의 기능은 다양한 DIS의 운명에 중요한 영향을 미칠용이하게합니다. 그들은 감소 IFN-γ 생산과 NK 세포 수용체 2를 활성화 감소 식으로 구성된 진단에서 결함이 NK 세포 프로파일을 나타내는 경우 백혈병 환자는 재발 속도를 증가 보여줍니다. 표적 세포의 상호 작용에 따라 사이토 카인 생성을 포함하여 NK 세포의 수 및 기능의 조기 회복 조혈 모세포 이식 3을받은 환자에서 재발 감소 향상된 생존율과 연관된다. 또한, C 형 간염 바이러스에 감염된 환자에게 인터페론 요법의 개시시 주변 NK 세포의 탈과립 용량 비 반응자 (4)보다 조기에 대응 강하다. NK 세포 수는 (> 80 / μL) 임파종 또는 다발성 골수종을 앓고있는 환자에서는자가 줄기 세포 이식 (autoSCT) 후 15 일이 향상된 무 진행하고 생존율 5 예측된다. 흑색 종 환자에서 T 세포의 발현 및 immunoglobulin- 뮤신 - 도메인 containing 분자-3 (TIM-3), NK 세포에 대한 면역 조절 단백질은 병기와 예후 (6)와 상관 관계.
과학자들은 지난 수십 년에 걸쳐 NK 세포의 기능을 관찰 하였다. 앞서 프라이밍없이 종양 세포에 NK 세포 세포 독성의 초기 분석은 51 크롬 방출 분석을 사용하여 7 해결 하였다. 최근에 과학자들은 확장 된 NK 세포 (8)의 세포 독성을 평가하기위한 비 방사능 방법을 개발 하였다. 사이토 카인 및 케모카인 생산은 흔히 효소 면역 분석법 (ELISA) 방법을 사용하여 평가 9,10되었다. 지난 수십 년 동안 이러한 방법은 유동 세포 계측법 기반 분석에 의해 보완되고있다. 종래의면 염색 프로토콜과 함께 수송 단백질 억제제 (예 brefeldin A 및 넨신) 세포 permeabilization 방법의 사용은 다른 특정 림프에서 케모카인 및 사이토 카인 생성을 연구 과학자 활성화ocyte 서브 세트 (예를 들어, T, B 또는 NK 세포) 11. 또한, 다른 유동 세포 계측법 기반 분석법은 T 및 NK 세포의 세포 독성을 모니터링하도록 개발되었다. 2004 년 알터는 외. 독성 입자 (12)의 탈과립을위한 마커로서 표적 세포의 발생에 NK 세포의 리소좀 - 관련 단백질 CD107a (램프 1)의 표면 발현을 설명했다. 상이한 형광 색소 및 멀티 채널 유동 세포 계측기 다양한 우리 일에서 유효하기 때문에, 동시에 다른 NK 세포 서브 세트의 다양한 NK 세포의 기능 (세포 독성, 사이토 카인 및 케모카인 생산)를 모니터링 할 수있게되었다. 이 생검 또는 백혈구 감소증을 앓고있는 환자의 혈액 샘플에서 예를 들면 샘플 크기를 제한하는 상황에서 특히 중요해진다.
글로벌 NK 세포의 기능을 테스트하기 위해, 상이한 유동 세포 계측법 기반 분석을 효율적으로 결합 될 수있다. 테오 등. 난방에서 자극 NK 세포lthy의 종양 세포주 K562와 도너 13 유세포 통해 NK 세포 탈과립, 인사이드 - 아웃 신호 및 케모카인 생산을 분석 하였다. 최근 NK 세포의 하위 집단은 표현형 autoSCT 동안 종양 환자 기능 계측법 기반 분석법 흐름으로 분석 하였다. 또한 NK 세포 및 degranulate autoSCT 11 후 초기 시점에서 종양 세포를 인식시 사이토킨 / 케모카인을 생성 할 수 있다고 입증되었다.
여기 프로토콜 탈과립 용량, 케모카인 및 사이토 카인 생성을 포함하여 종양 세포가 가능한 동시에 상이한 서브 세트에서 NK 세포의 기능을 모니터 할 수 유동 세포 계측법 기반 분석법을 이용하여 상호 작용시 NK 세포의 기능을 평가하기 위해 설명된다.
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Protocol
본 연구는 프랑크푸르트 대학의 지역 윤리위원회의 권고에 따라 실시 하였다.
K562 세포의 배양 (1)
- R10 배지에서 배양 K562 세포를 37 ℃, 5 % CO에서의 세포 배양 플라스크의 용액 당 0.5 × 106 세포의 밀도 (글루타민 매체, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, 10 % 소 태아 혈청 RPMI1640) 2.
- 수확 K562 세포의 새로운 실험의 시작하기 전에 24 시간.
- 인큐베이터에서 K562 세포를 포함하는 세포 배양 플라스크를 제거한다. 부드럽게 피펫 팅 아래로 배양 배지 내에서 K562 세포를 다시 일시 중지합니다.
- 15 또는 50 ㎖ 튜브에 K562 세포를 함유하는 배양 배지를 전송하고 8 분 동안 400 XG에서 세포 펠렛. 뜨는을 취소하고 5 ml의 R10 미디어의 세포를 다시 일시 중지하고 잘 섞는다.
- 이전 96 U - 웰 플레이트의 웰에 세포 용액 20 μL. 20 μL를 트리 판 블루를 추가하고적어도 5 회까지 피펫 팅에 의해 아래로 잘 섞는다. 피펫 세포 계수 챔버 내로 용액 10 μL 및 세포 수를 계산.
- 8 분 동안 400 XG에서 세포 펠렛. R10 미디어의 세포를 다시 일시 중단 ml의 당 0.5 × 10 6 세포에 K562 세포 농도를 조정합니다.
- 사용할 때까지 CO 2, 37 ℃에서 세포 배양 플라스크 내의 K562 세포를 인큐베이션하고, 5 %.
NK 세포의 2. 분리
- 지역 윤리위원회의 승인 및 가이드 라인에 따르면, EDTA 또는 헤파린 말초 혈액 중의 6 ~ 10 ml를 수집하기 전에 건강한 기증자 또는 환자의 서면 동의서를 얻을 수 있습니다.
- 다음 스토어 실험 시작 전까지 39 ° C에서 NK 세포 분리 용 시약 및 멸균 조건 하에서, 실온 (RT)에서 사용할. 자성 마이크로 비드 및 t에 따른 세포 분리를위한 특정 자석을 이용하여 말초 혈액 NK 세포를 분리제조업체의 지침에 그는.
- 바이알로합니다 (NK 세포 분리 키트 내에 포함) 제공된 완충액 A 7.5 ㎖의 피펫 팅하여 동결 건조 된 NK 세포 음극 격리 항체 칵테일 한 바이알을 재구성한다. 아래로 3-4 시간을 피펫 팅에 의해 부드럽게 섞는다.
참고 : 서스펜션이 각 사용하기 전에 균일 한 것을, 확인하십시오. - 단계 2.2.1 및합니다 (NK 세포 분리 키트에 포함) 버퍼 B에서 재구성 된 펠릿의 적절한 볼륨을 혼합하여 최종 칵테일 솔루션을 준비합니다. 이러한 볼륨을 결정 = 부피로 1.0 ml의 전혈을 시료의 부피를 정의한다. 전체 혈액의 1 볼륨을 처리하고 버퍼 B 0.25 볼륨 (단계 2.2.1)에서 재구성 된 펠릿의 0.25 볼륨을 사용합니다.
- 전체 혈액 샘플을 포함하는 적절한 튜브로 혼합물을 전송합니다. 피펫 내에서 혈액의 손실을 방지하기 위해 아래 피펫하지 마십시오. 대신, 튜브를 닫고 suspen 때까지 조심스럽게 아래로 이동시온은 균일하다. 소용돌이하지 마십시오.
- 또한 RT에서 5 분 동안 튜브 회전기를 사용하여 샘플을 균질화.
- 무균 조건에서, 캡을 제거하고 제조업체에서 권장하는 15 분 동안 자기 분리기에 튜브를 배치합니다. 튜브 라벨 분리 라인의 방해받지 가시성을 할 수 있도록 자석의 뒷면을 향해 얼굴을 확인합니다. 이 절차가 방해되는 바와 같이, 분리하는 동안 자석을 이동하지 마십시오.
- 조심스럽게 새로운 15ml의 튜브로 상청액을 이전하고 완전한 미디어 채우기 (CM 조혈 세포 매체, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 5 % 인간 혈청). 8 분 동안 400 XG에서 세포 펠렛.
- 선택적 : 펠렛이 적색 인 경우, 적혈구 용해 완충 용액 (1ml를 상기 세포를 다시 일시 예 1 암모늄, 염화 칼륨 (ACK) 용균 완충액 ml의 155 mM의 NH 4 CL 0.1 mM의 EDTA, 10 mM의 KHCO 3 1 L의 증류수 (DW))과의 실온에서 8 분 동안 품어. 또는, 어를 사용ythrocyte 고갈 키트.
참고 : ACK 버퍼의 사용에 부정적인 NK 세포의 기능 (14)에 영향을 미칠 수 있음을 명심하십시오. - 빠르게 세포 펠렛 8 분 동안 400 XG에 용해 및 원심 분리를 중지 CM 적어도 1 mL를 첨가하여 ACK 버퍼 희석.
- 선택적 : 펠렛이 적색 인 경우, 적혈구 용해 완충 용액 (1ml를 상기 세포를 다시 일시 예 1 암모늄, 염화 칼륨 (ACK) 용균 완충액 ml의 155 mM의 NH 4 CL 0.1 mM의 EDTA, 10 mM의 KHCO 3 1 L의 증류수 (DW))과의 실온에서 8 분 동안 품어. 또는, 어를 사용ythrocyte 고갈 키트.
- 1 ML의 CM에서 세포 펠렛을 다시 중단하고 계수를 진행합니다. 96 U-웰 플레이트 상에 NK 세포 용액 20 μl를 전송합니다. 물론 각 메틸렌 블루의 20 μl를 추가하고 최소 5 회까지 피펫 팅에 의해 아래로 잘 섞는다. 피펫 (10) 셀 카운팅 챔버로 솔루션의 μL 및 계산 세포. 대안 적으로, 시판되는 휴대 카운터 카운트 희석 세포 현탁액 30 μL를 사용한다.
- 100 μL의 CM 당 적어도 2 × 104 NK 세포의 농도로 세포를 조정한다.
- 플로우 사이토 미터를 이용하여 순도를 확인하기 위해 절연 NK 세포군의 표면 항체 염색을 수행한다.
- 홍보표 1에 따라 지시 된 항체의 양을 혼합하여 마스터 믹스 용액 epare.
- 88.5 ㎕의 세척 완충액으로 세포를 다시 일시 정지 (WB를 0.5 % 소 혈청 알부민 (BSA), 0.1 % PBS에서 NaN이 3)가 마스터 혼합 용액 11.5 μL를 추가한다. 어둠 속에서 4 ° C에서 20 분 동안 세포를 품어.
주의 : NaN의 3 독성 및 돌연변이입니다. 해당 물질 안전 보건 자료 (MSDS)에 따라이를 처리합니다. - 4 분 동안 400 XG에서 세포를 WB의 1 ML을 추가하고 펠렛.
- 300 ㎕의 염색 버퍼 플러스 DAPI에서 세포를 다시하면 일시 중지합니다. 플로우 사이토 미터를 사용하여 셀을 획득.
주 : NK 세포의 순도는 모두 살아 림프구의 적어도 80 % 인 경우에만 상기 실험 진행.
- 바이알로합니다 (NK 세포 분리 키트 내에 포함) 제공된 완충액 A 7.5 ㎖의 피펫 팅하여 동결 건조 된 NK 세포 음극 격리 항체 칵테일 한 바이알을 재구성한다. 아래로 3-4 시간을 피펫 팅에 의해 부드럽게 섞는다.
NK 세포 자극에 대한 K562 세포의 3 수확
- 일 발 (단계 1.2)이 K562 세포를 포함하는 세포 배양 플라스크를 제거 전자 인큐베이터. 부드럽게 피펫 팅 아래로 배양 배지 내에서 K562 세포를 다시 일시 중지합니다.
- 15 또는 50 ㎖ 튜브에 전체 문화 매체를 전송하고 8 분 동안 400 XG에서 세포 펠렛. 뜨는을 취소하고 5 ml의 인산염 완충 식염수 (PBS)에있는 세포를 다시 일시 중지하고 잘 섞는다.
- 이전 96 U - 웰 플레이트의 웰에 세포 용액 20 μL. 블루 20 μL 트리 판 추가하고 최소 5 회까지 피펫 팅에 의해 아래로 잘 섞는다. 피펫 세포 계수 챔버 내로 용액 10 μL 및 세포 수를 계산. 또는 시판 셀 카운터 카운트 희석 세포 현탁액의 30 μl를 사용합니다.
- 8 분 동안 400 XG에서 세포 펠렛. 100 ㎕의 배지 당 적어도 2 × 104 K562 세포의 농도로 세포를 CM에서 다시 대기.
참고 : 이펙터에 모두 부화하기 위해 같은 K562과 NK 세포의 농도를 사용 대상 : 1 (E T) 비율 : 1을 나중에.
- 부드럽게 적어도 5 번 그들을 피펫 팅에 의해 아래로 세포를 혼합한다. 100 μL / 웰의 NK 세포 용액 96 V 웰 플레이트의 요구 우물에 배포합니다.
- 자극 (예를 들면, K562 종양 세포 및 사이토 카인)없이 각 기증자와, 하나는 적어도 두 개의 웰을 사용한다. 가능하다면, 적어도 이중으로 실험을 수행하고, 양성 대조군 (예를 들면, 포르 볼 12- 미리 스테이트 13- 아세테이트 (PMA) 및 이오 노마 이신; 최종 농도 50 nM의 PMA, 이오 노마 이신 웰당 1 μM)을 첨가. 실험의 날짜에 대한 보상 세포 계측법 업데이트 흐름을 준비합니다.
참고 : 항체를 이전에 사용 (설명 참조) 적정한다.
- 자극 (예를 들면, K562 종양 세포 및 사이토 카인)없이 각 기증자와, 하나는 적어도 두 개의 웰을 사용한다. 가능하다면, 적어도 이중으로 실험을 수행하고, 양성 대조군 (예를 들면, 포르 볼 12- 미리 스테이트 13- 아세테이트 (PMA) 및 이오 노마 이신; 최종 농도 50 nM의 PMA, 이오 노마 이신 웰당 1 μM)을 첨가. 실험의 날짜에 대한 보상 세포 계측법 업데이트 흐름을 준비합니다.
- 빛을 끄고 방지 CD107a 항체 (2 μL, 최종 농도 100 : 1)를 추가 96-V 웰 플레이트에 NK 세포를 각 웰에.
- 조심스럽게 그들을 피펫 팅에 의해에 대한 아래 K562 세포를 혼합5 회 이상.
- 자연 살해 세포 / 항 CD107a 항체 용액을 함유하는 웰에서 K562 세포 자극 계획 것들을 식별한다. 100 μL /이 우물에 K562 셀 솔루션의 잘을 추가합니다. 적어도 5 회까지 피펫 팅에 의해 아래로 조심스럽게 섞는다.
- 추가 인터루킨 -2 (IL-2, 최종 농도 100 U / ㎖) 및 인터루킨 15 (IL-15; 최종 농도 10 ng / ml) K562 세포와 NK 세포 / 항 CD107a 항체 용액을 함유하는 웰에.
- 선택 사항 : 종양 유발 사이토 카인 유도 된 NK 세포의 기능에 비해 해독 분산 NK 세포에 혼자 K562 세포 또는 사이토 카인 중 하나의 영향을 테스트합니다.
- 96-V 웰 플레이트에 우물을 확인하고 자극없이 부정적인 컨트롤을 계획했다. 만 NK 세포 / 안티 - CD107a 항체 솔루션을 포함하는이 우물에 100 μL / 잘 CM을 추가합니다. 적어도 5 회까지 피펫 팅에 의해 아래로 조심스럽게 섞는다.
- 옵션 : 양성 대조군의 경우, 100 μ를 추가, PMA와 이오 노마 이신을 포함 리터의 CM (최종 농도 : 50 nm의 PMA, 잘 당 이오 노마 이신 1 μM)에 NK 세포 / 안티 - CD107a 항체 솔루션을 잘합니다.
- 37 ° C에서 어둠 속에서 3 시간 5 % CO 2의 세포를 품어.
- 수송 단백질 억제제 용액을 제조한다 (예를 들면, 및 / 또는 모 넨신을 brefeldin) CM이다. 배양 1 시간 후에, 빛을 96 V 웰 플레이트의 각 웰의 용액을 추가하는 것은 스위치 오프 (최종 농도 0.5-1μM brefeldin A 및 2-3 μM의 넨신). 적어도 5 회까지 피펫 팅에 의해 아래로 조심스럽게 섞는다. 나머지 2 시간 동안 배양을 계속합니다.
5. 표면 및 세포 내 염색
- 3 시간의 잠복기 후, 최소 5 회까지 피펫 팅에 의해 아래로 조심스럽게 96-V 웰 플레이트에서 세포를 혼합 및 튜브 유동 세포 계측법로 전송합니다. 1 ㎖ / WB의 튜브를 추가합니다. 4 분 동안 400 XG에 펠렛 세포.
- 선택적 : 원심 분리 각 FACS 튜브에 세포를 전송하기 전에 적어도 5 회 피펫 팅하여 최대 상하 세포 회복을 최적화하기 위해, 100 μL / 웰 PBS로 웰 린스 전에.
- 상층 액을 제거하고 표면 염색 계속합니다.
- 고칠 수 죽은 세포 마커 (DCM)로 423 나노 미터의 발광 최대 세포를 사는 비 투과 인 아민 반응성 형광 염료를 포함합니다. 전 (아래 참조) 또는 항체 표면 얼룩 사용한 DCM의 종류에 따라 병렬로 염색을 수행한다.
- 99 μL / 튜브 PBS에 세포를 일시 중지 다시 1 μL /를 고칠 DCM (최종 농도 : 1 : 100)의 튜브를 추가 할 수 있습니다. 잘 소용돌이를 사용하여 세포를 혼합하고 어둠 속에서 실온에서 15 분 동안 그들을 품어.
- (단계 열을 염색 볼 파란색으로 표시) 표 2에 나와있는 "면"항체를 함께 혼합하여 마스터 믹스 솔루션을 준비합니다. 에서를 사용하여볼륨 / 튜브 및 튜브 dicated 염색 할 유세포의 개수로 곱.
- 배양 후 세포와 튜브 유동 세포 계측법을 1 ㎖ / WB의 튜브를 추가합니다. 4 분 동안 400 XG에서 세포 펠렛.
- WB의 84 μL / 튜브에 세포를 다시 일시 중지하고 16 μL / 마스터 믹스 솔루션의 튜브를 추가, 상층 액을 버린다. 잘 소용돌이를 사용하여 세포를 섞는다. 어둠 속에서 4 ° C에서 20 분 동안 세포를 품어.
- 20 분 후 4 분 동안 400 XG에 1 ㎖ / 튜브 WB 및 펠릿 세포를 추가합니다.
- 뜨는을 취소하고 100 μL / 차가운 고정 솔루션 (예를 들어, 2 % (최종) 파라 포름 알데히드 또는 포름 알데히드)의 튜브에 세포를 다시 일시 중지합니다. 잘 소용돌이를 사용하여 세포를 섞는다. 어둠 속에서 4 ° C에서 10 분 동안 세포를 품어.
- 이 단계 후 세포 내 사이토 카인 / 케모카인의 세포를 얼룩 또는 WB 4 ℃에서 하룻밤을 저장합니다.
참고 : 하룻밤 배양 후, 낮은 세포 복구가 발생할 수 있습니다.
- 이 단계 후 세포 내 사이토 카인 / 케모카인의 세포를 얼룩 또는 WB 4 ℃에서 하룻밤을 저장합니다.
- 4 분 동안 400 XG에 1 ㎖ / 튜브 WB에서 세포를 씻으과 permeabilization 단계를 진행합니다.
- permeabilization 완충액 (PB) (PBS에서 예를 들면 0.2 % 사포닌, 1 % BSA 용액)을 준비한다.
- 4 분 동안 400 XG에 PB 1 ㎖ / 튜브에 두 번 세포를 씻으십시오. 세포 내 염색 계속합니다.
주의 : 사포닌은 잠재적으로 자극적입니다. 해당 물질 안전 보건 자료 (MSDS)에 따라이를 처리합니다. - (녹색으로 강조 표시) 표 2에 표시된 "세포"항체 볼륨을 사용하여 마스터 믹스 솔루션을 준비합니다. 튜브의 수와 이러한 볼륨을 곱하는 스테인드합니다.
- 90 μL / 튜브 PB의 세포를 다시 일시 중지하고 10 μL / 항체 마스터 믹스 솔루션의 튜브를 적용합니다. 소용돌이를 사용하여 잘 혼합하고 3 세포를 배양어둠 속에서 4 ° C에서 0 분.
- 4 분 동안 400 XG에 PB 1 ㎖ / 튜브에 두 번 세포를 씻으십시오.
- 뜨는을 취소하고 400 μL / 튜브 PB의 세포를 다시 일시 중지합니다. 잘 소용돌이를 사용하여 세포를 섞는다. 측정 할 때까지 어둠 속에서 얼음에 세포를 놓습니다.
6. 유동 세포 계측법 보상 및 취득
- 상이한 형광 색소에 대한 채널 선택 파라미터 설정 폴더 수집 소프트웨어 유세포 내 (표 2 참조). 또한, FSC-A의 채널을 선택하고 SSC-A 및 -H뿐만 아니라 -H.
- 인수 파일로 선택한 매개 변수에 대해 생성 된 보상 행렬을로드합니다.
- 각 형광 색소 사용에 대한 단일 색 얼룩을 수행하여 단계 2.2.8에서 격리 NK 세포를 이용한 보정 행렬을 생성 (표 2 참조). 단계 5.1-5.4에 기재된 표면 염색 프로토콜을 사용한다. 어떤 항체가없는 흠없는 제어를 (포함)과 아이소 타입 컨트롤 및 / 또는 형광 뺀 컨트롤 (FMO).
참고 : 셀 기반 보상에 대한 대안으로, 보상 컨트롤과 같은 구슬의 IgG가 결합 사용합니다. - 단일 염색 표본 각 튜브 시료 주입구 (SIP)에 항체가없는 샘플을 놓는다. 유동 세포 계측법 수집 소프트웨어의 "기록"버튼을 클릭하고 샘플 당 적어도 5 × 10 3 NK 세포의 세포 수를 확보.
- 보상 매트릭스를 생성하기 위해 계측법 수집 소프트웨어의 보정 계산 프로그램을 사용한다.
- 각 형광 색소 사용에 대한 단일 색 얼룩을 수행하여 단계 2.2.8에서 격리 NK 세포를 이용한 보정 행렬을 생성 (표 2 참조). 단계 5.1-5.4에 기재된 표면 염색 프로토콜을 사용한다. 어떤 항체가없는 흠없는 제어를 (포함)과 아이소 타입 컨트롤 및 / 또는 형광 뺀 컨트롤 (FMO).
- 북한군 세포 인구를 식별하기위한 도트 플롯을 작성합니다.
- FSC-A / FSC-H와 SSC-A / SSC-H 도트 플롯을 사용하여 단일 세포를 식별합니다. 은 "다각형 게이트"버튼을 클릭합니다. 모두 도트 플롯의 선형 분포 패턴이 세포 주위에 게이트를 그립니다. 새로운 도트 플롯을 열고 문을 두 번 클릭합니다.
- 림프구를 식별하기 FSC-A / SSC-A 도트 플롯을 선택/ NK 세포군 (도 1 참조). 주위 다각형 게이트를 그리고 게이트를 두 번 클릭합니다.
- 는 SIP에 NK 세포 자극 분석의 각 샘플 튜브를 놓습니다. 은 "기록"버튼을 클릭하고 샘플 당 적어도 5 × 10 3 NK 세포의 세포 수를 확보.
7. 분석 및 통계
- 분석 소프트웨어 프로그램 세포 계측법 흐름을 엽니 다. 자극되지 제어 샘플을 열고로드 샘플 버튼을 클릭합니다.
- 다르게 지정 NK 세포 부분 집단 (그림 1 참조)에 대한 게이팅 시스템을 만듭니다.
- FSC-A / SSC-A 플롯을 만들 도트 플롯 버튼을 클릭합니다. 사각형 게이트 버튼을 클릭> 5 × 10 (4)가 파편을 제외하는 FSC-A 값으로 모든 이벤트를 통해 사각형 게이트를 그립니다. 게이트 더블 클릭하여 문을 엽니 다.
- 다시 새로운 점 플롯 내에서 FSC-A / SSC-A 매개 변수를 선택하고 다각형 게이트 버튼을 클릭합니다. 디림프구 집단 주위 다각형 게이트 원 (도 1 참조). 문을 엽니 다.
- 새로운 도트 플롯에 대한 SSC-A / SSC-H 매개 변수를 선택하고 주위의 모든 단일 세포를 다각형 게이트를 그립니다. 단셀은 FSC-A / FSC-H 및 SSC-A / SSC-H 파라미터 걸쳐 선형 분포를 보여주는 (도 1 참조). 더블 클릭으로 문을 엽니 다.
- 금융위원회-A / FSC-H 매개 변수이 시간을 사용하여 단계를 반복 7.2.3.
- 매개 변수 CD45을 사용하여 채널 덤프 (CD3를, CD14, CD19, DCM)를 죽은 세포를 제외 할 수 있습니다. 모든 CD45 양성 주위에 사각형 게이트를 그리고 채널 음성 세포를 덤프합니다. 게이트 더블 클릭하여 문을 엽니 다.
- CD56을 사용하여 전체 NK 세포군을 식별 및 채널 파라미터 덤프. CD56 양성 주위에 사각형 게이트를 만들고 음성 세포 채널 덤프합니다. 더블 클릭으로 문을 엽니 다.
- 주위에 CD56 / CD16 점 플롯 내의 모든 세 NK 세포 하위 집합을 사각형 게이트를 그립니다. 이데, CD56 + CD16 +와 CD56 + CD16 + NK 세포 하위 집합 - CD56 + CD16과 다른 부분 집합을 ntify.
- 각 개별 NK 세포 부분에 대한 NK 세포의 기능을 분석 할 수 있습니다.
- 엽니 세 NK 세포 하위 집합 게이트 중 하나를 클릭합니다. CD56 / CD107a, CD56 / IFN-γ와 CD56 / MIP-1β에 대한 세 가지 다른 점 플롯을 작성합니다.
- 각각 CD107a, IFN-γ 또는 MIP-1β에 대한뿐만 아니라 긍정적 인 CD56 양성 세포에 대한 사각형 게이트를 그리기 (그림 1 참조).
- 나머지 각 NK 세포 하위 단계를 반복 7.3.1-7.3.2.
- 단계를 반복 7.2 및 모든 자극 샘플 7.3. 분석 소프트웨어 내 통계 - 내보내기 버튼을 클릭하여 각 시료의 모든 통계 값을 저장합니다.
- NK 세포의 기능을 분석하기 위해 각각의 샘플의 통계 값을 포함하는 파일을 연다. 각각의 NK 세포에 대한 값을 선택서브 세트 (예를 들어, CD56 CD16 ++ - NK 세포)를 다른 파일로 복사하여.
- 자극 처리 된 CD107a 양성 NK 세포의 비율에서 자극으로 처리되지 않은 CD107a 양성 NK 세포의 비율을 뺀다.
참고 : 자극에 대한 반응이 특히 NK 세포 하위 집합의 탈과립 능력을 입증하는 결과를 사용합니다. - IFN-γ와 MIP-1ß 양성 NK 세포 단계를 반복 7.5.1은 자극에 반응하여 사이토 카인과 케모카인 생산을 설명합니다.
- 나머지 각 NK 세포 하위 단계를 반복 7.5.1-7.5.2 자극에 따라 자신의 탈과립 용량 및 사이토 카인 / 케모카인 생산을 평가합니다.
- 자극 처리 된 CD107a 양성 NK 세포의 비율에서 자극으로 처리되지 않은 CD107a 양성 NK 세포의 비율을 뺀다.
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Representative Results
전체 NK 세포군 세 가지 NK 세포 서브 세트의 탈과립, 사이토 카인 및 케모카인 생산을 분석하는 게이팅 전략은도 1에 도시되어있다.
하나의 건강한 기증자의 대표적인 결과는도 2에 도시되어있다. 어떤 자극없이 NK 세포는 모두 IFN-γ도 MIP-1β을 생산하고 그 표면에 CD107a (그림 2A)을 표현하지 않았다. 대조적으로, 종양 세포 및 사이토 카인 자극 NK 세포는 세포 내 IFN-γ와 MIP-1β의 상당한 양의 생산. 또한, 그들 중 20 %는 그 표면 (도 2c)에 CD107a 표현으로 표시된 종양 세포의 상호 작용에 degranulated. PMA 및 이오 노마 이신 자극은 제어 (도 2B)을 사용 하였다.
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그림 1 :. 전략을 게이팅 후속 게이트 플롯됩니다. 첫째, 파편은 FSC-A / SSC-A 플롯에서 제외됩니다. 그런 다음 림프구가 식별되고 이중선은 SSC-A / SSC-H 및 FSC-A / FSC-H 두 개의 플롯을 사용하여 제외됩니다. 그 후, 모든 CD45 + 세포와 모든 죽은, CD3 +, CD14 + 및 CD19 + 세포를 제외한 포함하는 게이트는 CD45 / 덤프 채널을 음모에 의해 설정된다. 다음으로, NK 세포는 CD56 + 세포에 게이팅로 식별됩니다. CD56 / CD16와 플롯 메인 NK 세포의 부분 집합을 식별하기 위해 사용될 수있다. 마지막으로, 전체 NK 세포 인구 내에서 기능 마커는 CD107a 각각 IFN-γ와 MIP-1β, 대 CD56 음모를 꾸미고로 식별됩니다. 이 NK 세포 하위 집합의 모든 다른 종류도 수행 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2.도 1에 기재된 게이트 전략을 사용하는 한 건강 NK 세포 공여자 대표 결과 (탈과립 용) CD107a 등 NK 세포 기능 마커는 IFN-γ와 MIP-1β가 식별 될 수있다. 왼쪽 열 (A)는 자극의 부재에서 NK 세포를 이용한 결과를 나타낸다. 가운데 열 (B)는 양성 대조군 PMA / 이오 노마 이신의 존재의 결과를 보여준다. 우측 컬럼 (C)은 IL-2 (100에게 U가 / ml) 및 IL-15 (10 ng의 / ㎖). 종양 세포주 K562 자극 NK 세포 및 사이토 카인의 존재 하에서 결과 제시 여기 링크를 클릭하면 보는을 이 그림의 더 큰 버전.
표 2 : 역외 및 세포 내 염색에 대한 항체.
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Discussion
설명 된 방법은 건강한 기증자 또는 환자의 전혈 시료로부터 NK 세포의 기능을 연구하기 쉽고, 빠르고 신뢰성있는 방법이다. 이 방법은 피 직접 전혈로부터 NK 세포를 정제 할 수있는 큰 이점을 제공하는 시간 소모적 인 많은 다른 정제 방법 15 필수 밀도 구배 원심 분리. 또한, 그것은 소아 및 / 또는 면역 결핍 환자의 샘플에 대한 적절한 대체한다 "클래식"NK 세포 분리 / 농축 방법에 비해 더 작은 샘플 크기를 필요로한다. 이 프로토콜은 NK 세포의 기능의 생체 외에서의 기저 값을 취득 할 수 있지만, 다른 방법에 상보 이전 8 기재된 이러한 방법으로 되, 상기 추가 NK 배양 및 확장 할 수있다. 그럼에도 불구하고 몇 가지 중요한 단계를 고려해야한다. 상기 분석은 역외 세포 내 항체 염색에 기초하기 때문에, 우와 최적를 결정하는 중요먼저 각 항체 농도를 rking. 특히 세포 내 염색을 위해, 사용 된 항체의주의 깊은 평가가 좋습니다. 좋은 방법이 사용 된 항체의 희석 계열을 테스트하는 것이다 (예를 들면, 1 : 12.5 : 100 (1)) 또는 이오 노마 이신 PMA /없이 자극 세포 현탁액이다. 이어서 자극되지 않은 샘플 간의 자극 포지티브 이벤트의 비율을 산출하고 플롯. 높은 양의 배 변화율 (최고 신호 대 백그라운드 비율)을 항체 희석 추가 실험 16을 위해 사용되어야한다. 또한, isotype- 및 FMO 컨트롤 같은 컨트롤의 사용은 긍정적 인 세포 집단에서 제대로 게이트 위해 세포 내 염색 특히 기본적인 것을 입증 할 수있다.
그러나, 설명 방법의 몇 가지 중요한 제한이 있습니다. CD107a 표현은 탈과립 마커이며, 따라서 간접적으로 NK 세포의 세포 독성을 나타냅니다. NK 세포 독성ND 탈과립 용량은 상이 할 수있다. 분비 그랜 자임 B의 열화 암세포 결과에서 자식 작용 경로 규제 접속 및 NK 세포 상호 작용 (17) 할 때 세포 사멸을 감소시킨다. 따라서 추가 DCM (예, 카스파 제 절단 3) 표적 세포 (18) 내에서 세포사 사건을 모니터링하기 위해 염색 패널에 첨가 될 수있다. 또한, NK 세포의 세포 독성은 세포 내 염색 (19, 20)에 의해 정량화 될 수있는 그들의 과립 내 독성 단백질 (예를 들면, 퍼포, 그랜 자임 B)의 양에 의해 영향을 받는다.
또한, 프로토콜을 변경하는 다른 가능성이있다. 대신 절연 NK 세포들, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 사용할 수있다. 하나는 PBMC 집단 내의 NK 세포의 절대 수는 다양한 도너 사이에도 서로 다른 시점에서 동일 공여체 유래의 시료 사이에서 상이 알고 있어야한다하더라도. NK 세포 degranulT 비율 : ATION는 E에 크게 의존한다. 모든 실험 내내 T 비율 : 다른 기증자 간 또는 다양한 시점에서 NK 세포의 기능을 비교하기 위해, PBMC 인구 내의 절대 NK 세포 수는 상수 E를 설정하는 데 사용되어야한다. NK 세포의 기능이 동일한 도너 내의 상이한 시점에서 관찰되는 경우, PBMC를 동결 될 수 있고, 분석 간 실험 변동 (11)을 감소시키기 위해 한 번에 모든 상이한 시점에 대해 수행 될 수있다.
최대 18 색이 가능한 패널로 염색 때문에, NK 세포의 기능 분석은 훨씬 더 구체적으로 확장 될 수있다. CD57, NKG2A 킬러 세포의 면역 글로불린 형 수용체 (KIRs) 등의 추가 표면 마커를 이용하여, 상기 NK 세포의 서브 세트가 식별 될 수있다. 적어도 하나의 자기 KIR 표현 교육 NK 세포는 NK 세포 교양보다 K562 세포와의 상호 작용에 강한 degranulate. 반대로,보다 분화 된 CD57 + CD56 + + NK 세포 (21) - SUP> NK 세포는 덜 차별화 된 CD57에 비해 IL-12 및 IL-15의 자극에 따라 적은 IFN-γ를 생산하고 있습니다. 또한, NK 세포의 기능의 다른 마커는 해결 될 수있다. LFA-1이 NK 세포 유착에 중요한 분자 및 NK 세포 활성화시 개방 형태로 표현된다. 이것은 소위 "내부 아웃 신호는"초기 NK 세포 활성화 마커 (22)이다.
마지막 테스트 NK 세포의 기능에 대한 자극도 변형 될 수있다. 더 사이토 카인이 추가되지 않은 경우 우리의 경험에서 갓 K562 세포의 상호 작용에 만 degranulate 제대로 NK 세포입니다. 상기 사이토 카인을 첨가하지 않은 갓 절연 PBMC를 사용하기 때문에 와키 세포의 영향이 문제를 회피. 또한, 사이토 카인 생산, 특히 IFN-γ 및 TNF-α가 IL-12 및 IL-18의 자극 (23)에 개시 될 수있다. 북한군 셀 하위 집합 내에서 IFN-γ 생산은 dependin 다를 수사용 된 자극 (사이토 카인 대 목표에 의한 자극) 24 g. 대신 표적 세포로서 K562 세포를 사용 또한 종양 환자로부터 유도 된 일차 종양 세포는 전 또는 면역 조절 요법 (예를 들어, 모노클로 날 항체의 치료 또는 면역 조절 성 약제 중에자가 종양 세포에 NK 세포의 기능을 테스트하기 위해 사용될 수있다 (IMiDs)).
지난 몇 년 동안, 면역 요법의 분야는 면역 검사 억제제 (예 ipilumumab, nivolumumab, pembrolizumab)의 임상 승인 급변 한 아니라 T 세포의 발현 유전자 재조합 키메라 항원 수용체 (CAR)을 사용하여 25 성공적인 실험 혈액 암 환자 (27)의 치료 (참조 (26)에 검토) CAR-NK 세포 등. 따라서 NK 세포 면역 요법의 초점에 점점 더 많이 받고있다. 항 CD20 항체는 자원 처리에 큰 성공을 거두었습니다지난 20 년간 (28) 내에서 악성 림프종의 NT를. NK 세포의 대부분은 인식 항체를 표지 한 표적 세포 (- ADCC 항체 의존성 세포 독성)을 죽 세포를 활성화 낮은 친 화성 Fc 수용체의 CD16를 발현. NK 세포의 기능을 유발하는 항체의 능력은 기술 된 프로토콜을 사용하여 29 시험 관내에서 시험 할 수있다. Terszowski 등. 다른 임상 적으로 승인 된 항 CD20 항체를 이용하여 B의 임파 세포주에 대해 분석 NK 세포 "ADCC. ADCC는 리툭시 맵 치료시 유발하지만 (신규 glycoengineered 타입 II CD20 모노클로 날 항체) 31 32 obinutuzumab 사용하는 경우, 이러한 효과가 관찰되지 않았 음 KIR / HLA 상호 작용에 의해 영향을 받았다 (제 임상 항 CD20 항체 (30)를 승인). 또한, NK 세포의 기능은 IMID 레 날리도 33과 다른 티로신 kinas 같은 다른 신규 한 항암 약물의 영향을 받는다전자 억제제 (TKI) 34. 현재 NK 세포의 특정 체크 포인트 억제제는 임상 시험에서 시험한다. 예 안티 KIR 35, 36 또는 항 NKG2A 항체 (NCT02331875)뿐만 아니라 항 CD137 항체 등 활성화 작용제 (; NCT02110082 NCT01775631)의 사용이다.
중요한 것은, 대체 NK 세포 전달은 전도 유망한 임상 효과 (37)와 다른 악성 질환의 다양한 수행되었다. 목적은 가장 도너를 선택하면, 환자의 종양에 대해 NK 세포의 기능 잠재적 NK 세포 공여자의 혈액 샘플을 사용하여 시험 관내에서 시험 될 수있다.
결론적으로, 설명 된 프로토콜은 건강한 기증자 또는 환자의 다양한 NK 세포의 기능을 분석하기 위해 설계된다. 이러한 기능은 선택된 시간 지점에서 다양한 자극에 따라 다양한 NK 세포의 서브 세트를 모니터링 할 수있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 + glutamine | Invitrogen | 6187-044 | |
| penicilin/streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| BD Falcon Round Bottom Tube | BD | 352008 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10270-106 | heat inactivated before use |
| T-flask | Greiner Bio-One | 690195 | |
| K562 tumor cell line | DSMZ GmbH | ACC 10 | |
| ammonium-chloride-potassium (ACK) lysis buffer | made in house | / | components are listed in the text |
| Distilled water: Ampuwa Spüllösung 1,000 ml Plastipur | Fresenius Kabi | 1088813 | |
| Megafuge 40R Centrifuge | Heraeus | / | |
| EDTA blood collector tubes | Sarstedt | 386453 | S-Monovette 7.5 ml, K3EDTA |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies | 15575-020 | |
| Hematopoietic media (XVIVO) | Lonza Group Ltd | BE04-743Q | |
| human serum | DRK Blutspendedienst, Frankfurt/M | / | healthy donors with blood type AB; heat inactivated before use |
| Neubauer-improved counting chamber, bright line | Marienfeld superior/ LO-Laboroptik Ltd. | 0640030/ 1110000 | |
| trypan blue solution (0.4%) | Invitrogen | 15250-061 | |
| 3% acetic acid with methylene blue | Stemcell Technologies | 07060 | |
| Corning 96 Well Clear V-Bottom TC-treated Microplates | Corning | 3894 | |
| Falcon 96 Well Round Bottom Not Treated Microplates | Corning | 351177 | |
| DPBS (Ca2+- and Mg2+-free) | Gibco Invitrogen | 14190-169 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A2153-100G | |
| NaN3 | Sigma Aldrich | 08591-1ML-F | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Merck | 524400-1MG | |
| ionomycin | PromoKine | PK-CA577-1566-5 | |
| interleukin 15 (IL-15) | PeproTech | 200-15 | |
| Proleukin S (IL-2) | Novartis Pharma | 730523 | |
| Golgi Stop, Protein Transport Inhibitor (containing Monensin) | BD Biosciences | 554724 | This product can be used in combination or instead of Golgi Plug. The best combination for the wished experimental setting has to be tested. |
| Golgi Plug, Protein Transport Inhibitor (containing Brefeldin A) | BD Biosciences | 555029 | |
| paraformaldehyde | AppliChem | UN2209 | |
| saponin | Sigma Aldrich | 47036 | |
| flow cytometer: Canto10C | BD Biosciences | / | |
| FlowJo | TreeStar Inc. | / | |
| Graph Pad | Graph Pad Inc. | / | |
| MACSxpress Separator | Miltenyi Biotec | 130-098-308 | |
| MACSxpress NK isolation kit | Miltenyi Biotec | 130-098-185 | |
| MACSxpress Erythrocyte Depletion Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-098-196 | |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
| anti-human CD3 APC | Biolegend | 300412 | |
| anti-human CD3 V450 | BD Biosciences | 560366 | |
| anti-human CD14 PerCP | Miltenyi Biotec | 130-094-969 | |
| anti-human CD14 V450 | BD Biosciences | 560349 | |
| anti-human CD16 PE | Biolegend | 302008 | |
| anti-human CD16 PerCP | Biolegend | 302029 | |
| anti-human CD19 PE-Cy7 | Biolegend | 302216 | |
| anti-human CD19 V450 | BD Biosciences | 560353 | |
| anti-human CD45 BV510 | BD Biosciences | 563204 | |
| anti-human CD56 FITC | Biolegend | 345811 | |
| anti-human CD107a PE | Biolegend | 328608 | |
| anti-human IFN-γ AF-647 | BD Biosciences | 557729 | |
| anti-human MIP-1β APC-H7 | BD Biosciences | 561280 | |
| DAPI | Biolegend | 422801 | |
| Zombie Violet Fixable Viability Kit | Biolegend | 423113 | fixable dead cell marker |
References
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