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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Ensaio de citometria de fluxo baseada para a monitorização das funções das células NK

Published: October 30, 2016 doi: 10.3791/54615
Automatic Translation
*1,2, *3,4, 1,2, 1,2
1Childrens Hospital, Department of Pediatric Stem Cell Transplantation and Immunology, Johann Wolfgang Goethe-University, 2LOEWE Center for Cell and Gene Therapy, Johann Wolfgang Goethe-University, 3Institute for Cancer Research, Department of Cancer Immunology, Oslo University Hospital, Radiumhospital, 4The KG Jebsen Center for Cancer Immunotherapy, Institute of Clinical Medicine, University of Oslo
* These authors contributed equally

Summary

Um método simples e de confiança é descrito aqui para analisar um conjunto de funções das células NK, tais como desgranulação, produção de citocina e quimiocina dentro de diferentes subconjuntos de células NK.

Introduction

Como parte do sistema natural killer imune inata (NK) contribuir para a primeira linha de defesa contra as células infectadas com vírus ou transformadas de forma maligna. Um sistema de receptores inibidores e activadores lhes permite distinguir entre células transformadas e saudáveis ​​sem escorva antigénio antes em contraste com as células T. No momento do encontro célula alvo células NK liberar o conteúdo de seus grânulos citotóxicos (por exemplo, perforina, Granzimas) na sinapse imunológico para matar seu alvo. Além disso, as células NK produzem e segregam diferentes tipos de citocinas (por exemplo, interferão-y: IFN-γ; Factor de Necrose Tumoral-α: TNF-α) e quimiocinas (por exemplo, proteína inflamatória de macrófagos-1β: MIP-1b) sobre células alvo interacção citocina ou uma estimulação.

Suficientes funções das células NK, tais como citotoxicidade, quimiocinas e produção de citocinas têm um impacto importante sobre o destino de diversas disfacilita. Pacientes com leucemia mostram taxas de recaída aumenta se eles apresentam um perfil de célula NK com defeito no momento do diagnóstico consiste em produção de IFN-γ reduzida e redução da expressão de ativação de receptores 2 células NK. Uma recuperação rápida do número de células NK e do funcionamento, incluindo a produção de citoquinas após interacção célula alvo está associada com uma recaída reduzida e uma melhor taxa de sobrevivência em doentes que receberam transplante de células estaminais alogénicas 3. Além disso, no início da terapêutica interferon em pacientes infectados pelo vírus da hepatite C a capacidade desgranulação das células NK periféricas é mais forte nos primeiros respondedores do que em não-respondedores 4. O número de células NK (> 80 / l) no dia 15 após o transplante de células-tronco autólogas (autoSCT) em pacientes que sofrem de linfoma ou mieloma múltiplo são preditivos de uma melhor progressão livre e de sobrevida global 5. Em pacientes com melanoma, a expressão de a-célula T immunoglobulin- e mucina-domínio-contendg molécula-3 (TIM-3), uma proteína imuno-reguladora das células NK, correlaciona-se com a fase da doença e o prognóstico 6.

Os cientistas têm monitorado as funções das células NK ao longo das últimas décadas. A análise inicial da citotoxicidade das células NK contra células tumorais sem escorva antes foi abordada utilizando um ensaio de libertação de 51Cr-7. Mais recentemente, os cientistas desenvolveram um método não-radioactivos para avaliar a citotoxicidade das células NK expandidos 8. Citocina e quimiocina produção tem sido frequentemente avaliado utilizando um ensaio de imunossorvente ligado técnicas a enzima (ELISA) 9,10. Durante as últimas décadas, estes métodos têm sido completada pelo fluxo de ensaios baseados em citometria. A utilização de inibidores de proteína de transporte (por exemplo, brefeldina A e monensina) e métodos de permeabilização celular em combinação com protocolos de coloração de superfície convencionais, permitiram aos cientistas estudar quimiocina e a produção de citocinas em diferentes linfa específicasubconjuntos ocyte (por exemplo, T, B ou células NK) 11. Além disso, ensaios baseados em citometria de fluxo diferentes têm sido desenvolvidos para monitorizar a citotoxicidade das células T e NK. Em 2004 Alter et ai. Descreveu a expressão de superfície da proteína associada ao lisossoma CD107a (LAMP1) em células NK mediante encontro de células alvo como um marcador para a desgranulação dos grânulos citotóxicos 12. Uma vez que uma ampla gama de diferentes fluorocromos e citómetros de fluxo multi-canal estão disponíveis nos nossos dias, tornou-se possível monitorizar simultaneamente diversas funções das células NK (citotoxicidade, produção de citoquinas e de quimioquinas) em diferentes subpopulações de células NK. Isto torna-se especialmente importante em situações em que o tamanho da amostra é limitado, por exemplo, em biopsias ou amostras de sangue de pacientes que sofrem de leucopenia.

Para testar as funções das células NK globais, os ensaios baseados em citometria de fluxo diferente pode ser eficientemente combinada. Theorell et al. Células NK estimuladas de headoadores imunda com a linha de células tumorais K562 e analisados a desgranulação das células, o sinal de dentro para fora e de quimiocina produção NK através de citometria de fluxo 13. Recentemente subgrupos de células NK, fenótipos e funções em pacientes com tumor durante autoSCT foram analisados ​​por meio de fluxo ensaios baseados em citometria. Demonstrou-se que as células NK foram capazes de produzir desgranulam e citocinas / quimiocinas sobre o reconhecimento de células de tumor em tempos precoces depois autoSCT 11.

Aqui é descrito um protocolo para avaliar as funções das células NK após interacção com células tumorais, incluindo a capacidade de desgranulação, produção de quimioquina e citoquina utilizando um fluxo de ensaio à base de citometria que faz com que seja possível controlar as funções das células NK em subconjuntos diferentes simultaneamente.

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Protocol

Este estudo foi realizado de acordo com as recomendações do comitê de ética local da Universidade de Frankfurt.

1. Cultura de células K562

  1. Cultura de células K562 em meios R10 (RPMI 1640 com meio de glutamina, 1% de penicilina / estreptomicina, 10% de soro fetal de vitela) a uma densidade de 0,5-1 x 10 6 culas por ml num balão de cultura de células a 37 ° C e 5% de CO 2.
  2. Células colheita K562 24 h antes do início de uma nova experiência.
    1. Retirar o frasco de cultura de células contendo as células K562 da incubadora. Re-suspender as células K562 dentro do meio de cultura cuidado pipetando para cima e para baixo.
    2. Transferir a meios de cultura contendo as células K562 para um tubo de 15 ou 50 ml e sedimentar as células a 400 xg durante 8 minutos. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 5 ml de meio R10 e misturar bem.
    3. Transferir 20 uL da solução de células em um poço de uma placa de 96-L-poço. Adicionar 20 l de azul de tripano emisture bem por pipetagem cima e para baixo por pelo menos 5 vezes. Pipetar 10 ml da solução numa câmara de contagem de células e contagem das células.
    4. Agregar as células a 400 xg durante 8 minutos. Re-suspender as células em meio R10 e ajustar a concentração de células K562 de 0,5-1 x 10 6 culas por ml.
    5. Incubar as células K562 em um frasco de cultura de células a 37 ° C e 5% de CO 2 até à sua utilização.

2. Isolamento de células NK

  1. De acordo com a aprovação e diretrizes do comitê de ética local, obter o consentimento informado por escrito do doador saudável ou doente, antes da recolha de 6-10 ml de EDTA ou sangue periférico heparinizado.
  2. Conservar os reagentes para o isolamento de células NK, a 4 ° C, até o início da experiência e depois usá-los à temperatura ambiente (RT), em condições estéreis. Isolar células NK de sangue periférico usando microesferas magnéticas e um íman específico para o isolamento de células T de acordo com aele as instruções do fabricante.
    1. Reconstituir um frasco da célula NK liofilizado cocktail de anticorpos de isolamento negativo pipetando 7,5 ml do tampão A, desde que (incluído no estojo de isolamento de células NK) para dentro do frasco. Misture suavemente pipetando para cima e para baixo 3-4 vezes.
      NOTA: Certifique-se, que a suspensão é homogênea antes de cada utilização.
    2. Preparar a solução final cocktail por mistura de volumes apropriados da pelete reconstituída a partir do passo 2.2.1 e tampão B (incluído no estojo de isolamento de células NK). Para determinar esses volumes, definir o volume de toda a amostra de sangue em ml de volume = 1,0. Use 0,25 volumes do sedimento reconstituído (a partir do passo 2.2.1) e 0,25 volumes de tampão B para processar um volume de sangue total.
    3. Transferir a mistura para um tubo adequado contendo a amostra de sangue. Não pipeta cima e para baixo para evitar a perda de sangue dentro da pipeta. Em vez disso, fechar o tubo e movê-lo com cuidado para cima e para baixo até que a suspenSion é homogênea. não vortex.
    4. Além disso homogeneizar a amostra, utilizando um rotor tubo durante 5 min à TA.
    5. Sob condições estéreis, remover a tampa e colocar o tubo para dentro do separador magnético durante 15 min, tal como recomendado pelo fabricante. Certifique-se de que os rótulos dos tubos viradas para a parte traseira do ímã para permitir a visibilidade sem perturbações da linha de separação. Não mova o íman durante a separação, já que este procedimento seria perturbado.
    6. Transferir cuidadosamente o sobrenadante para um novo tubo de 15 ml e preencher-se com meio completo (CM; meios de comunicação celular hematopoiética, 1% de penicilina / estreptomicina, 5% de soro humano). Agregar as células a 400 xg durante 8 minutos.
      1. Opcional: Se o sedimento é vermelho, re-suspender as células em 1 ml de tampão de lise de eritrócitos (por exemplo, 1 ml de amónio-cloreto e potássio (ACK) tampão de lise: 155 mM de NH 4 Cl, 0,1 mM de EDTA; 10 KHCO 3 mM em 1 L de água destilada (DW)) e incuba-se durante 8 minutos à temperatura ambiente. Como alternativa, use um erkit de depleção ythrocyte.
        NOTA: Tenha em mente, que o uso de tampão ACK pode impactar negativamente as funções das células NK 14.
      2. Rapidamente diluir o tampão ACK através da adição de pelo menos 1 ml de CM para parar a lise e centrifugar a 400 xg durante 8 minutos para sedimentar as células.
    7. Re-suspender o pellet celular em 1 ml de CM e prosseguir com a contagem. Transferir 20 uL da solução das células NK numa placa de 96-L-poço. Adicionar 20 ul de azul de metileno a cada poço e misturar bem por pipetagem para cima e para baixo por, pelo menos, 5 vezes. Pipetar 10 ml da solução numa câmara de contagem de células e as células contam. Em alternativa, usar 30 ul de suspensão de células não diluído para a contagem com um contador de células comercialmente disponível.
    8. Ajustar as células a uma concentração de pelo menos 2 x 10 4 células NK por 100 ul de CM.
    9. Executar uma coloração de anticorpos de superfície da população de célula NK isolados a verificar a pureza utilizando um citómetro de fluxo.
      1. Prepare uma solução mestre mistura por mistura dos volumes dos anticorpos indicados como na Tabela 1.
      2. Re-suspender as células em tampão de lavagem de 88,5 ul (WB; 0,5% de albumina de soro bovino (BSA), 0,1% NaN3 em PBS) e adicionar 11,5 mL da solução de mistura mestre. Incubam-se as células durante 20 min a 4 ° C no escuro.
        Cuidado: NaN 3 é tóxico e mutagênico. Segurá-lo em conformidade com a correspondente Ficha de Dados de Segurança do Material (MSDS).
      3. Adicionar 1 ml de WB e sedimentar as células a 400 xg durante 4 min.
      4. Re-suspender as células em tampão de coloração de 300 ul além DAPI. Adquirir as células utilizando um citómetro de fluxo.
        NOTA: prosseguir a experiência só se a pureza das células NK é pelo menos 80% de todos os linfócitos vivos.

3. A colheita das células K562 para a estimulação das células NK

  1. Retirar o frasco de cultura de células contendo as células K562 (a partir do passo 1.2) a partir th e incubadora. Re-suspender as células K562 dentro do meio de cultura cuidado pipetando para cima e para baixo.
  2. Transferir todo o meio de cultura para um tubo de 15 ou 50 ml e sedimentar as células a 400 xg durante 8 minutos. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 5 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e misture bem.
  3. Transferir 20 uL da solução de células em um poço de uma placa de 96-L-poço. Adicionar 20 l de azul de tripano e misture bem por pipetagem cima e para baixo por pelo menos 5 vezes. Pipetar 10 ml da solução numa câmara de contagem de células e contagem das células. Como alternativa, use 30 ul de suspensão de células não diluído para contar com um contador de células disponíveis comercialmente.
  4. Agregar as células a 400 xg durante 8 minutos. Células em CM Re-suspender a uma concentração de pelo menos 2 x 10 4 K562 células por 100 ul de meios de comunicação.
    NOTA: É o mesmo K562 e as concentrações de células NK, a fim de, tanto a incubar um efector: alvo (E: T) proporção de 1: 1, mais tarde.
"> 4. Estimulação das células NK com o tumor celular Linha K562 e citocinas

  1. Misturar suavemente as células por pipetagem para cima e para baixo por, pelo menos, 5 vezes. Distribuir 100 ^ l / poço da solução de células NK nos poços necessários de uma placa de 96 poços V.
    1. Utilizam pelo menos dois poços para cada doador, um com e um sem estímulo (por exemplo, células tumorais K562 e citoquinas). Sempre que possível, a realização da experiência, pelo menos, em duplicado, e adicionar um controlo positivo (por exemplo, de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) e ionomicina; concentração final: 50 nM de PMA, ionomicina 1 uM por poço). Prepare fluxo atualizada citometria de compensações para a data do experimento.
      NOTA: Titular os anticorpos uso anterior (ver discussão).
  2. Desligar a luz e adicione o anticorpo anti-CD107a (2 ul, concentração final: 1: 100) a cada poço com células NK na placa de 96-V-poço.
  3. Misture suavemente as células K562 pipetando para cima e para baixo por peloPelo menos 5 vezes.
    1. Dos poços contendo o anti-CD107a solução de anticorpos de células NK /, identifique a que está planeada para a estimulação com células K562. Adicionam-se 100 ul / poço de solução de células K562 para estes poços. Misture com cuidado pipetando cima e para baixo por pelo menos 5 vezes.
    2. Adicionar a interleucina-2 (IL-2; concentração final 100 U / ml) e interleucina-15 (IL-15; concentração final de 10 ng / ml) aos poços que contêm as células K562 e a solução de anticorpos das células NK / anti-CD107a.
      1. Opcional: testar o impacto da utilização de células K562 ou citoquinas por si só nas células NK distribuídos para decifrar contra as funções das células NK induzida por citoquinas induzidas por tumor.
    3. Identificar os poços na placa de 96-V-planeado bem como controlos negativos sem estímulo. Adicionam-se 100 ul / poço cm a estes poços contendo apenas a solução de anticorpos das células NK / anti-CD107a. Misture com cuidado pipetando cima e para baixo por pelo menos 5 vezes.
      1. Opcional: Para um controlo positivo, adicionar 100 μ; L CM contendo PMA e ionomicina (concentração final: 50 nM de PMA, ionomicina 1 uM por poço) para um poço com a solução de anticorpos das células NK / anti-CD107a.
  4. Incubar as células durante 3 h no escuro, a 37 ° C e 5% de CO 2.
  5. Prepara-se uma solução de inibidor de transporte de proteínas (por exemplo, brefeldina A e / ou monensina) em CM. Após 1 h de incubação, adicionar a solução a cada poço da placa de 96-V-bem com a luz desligada (concentração final: 0.5-1μM brefeldina A e 2-3 pM monensina). Misture com cuidado pipetando cima e para baixo por pelo menos 5 vezes. Continuar a incubação durante 2 horas a restante.

5. Superfície de Coloração Intracelular e

  1. Após o período de incubação de 3 h, misturar as células dentro dos poços da placa de 96 poços V cuidadosamente, pipetando para cima e para baixo por, pelo menos, 5 vezes e transferi-los para tubos de citometria de fluxo. Adicionar 1 ml / tubo de WB. células pelete a 400 x g durante 4 min.
    1. Opcional: antes da centrifugação lave os poços com 100 ul / poço de PBS, a fim de optimizar a recuperação de células, por pipetagem para cima e para baixo por, pelo menos, 5 vezes antes da transferência das células para o respectivo tubo de FACS.
  2. Descartar o sobrenadante e continue com as manchas na superfície.
  3. Incluir um corante fluorescente reactivo com amina que é não-permeado a células vivas com um máximo de emissão de 423 nm, como um marcador de célula morta fixável (DCM). Realizar a coloração antes (ver abaixo) ou em paralelo com a superfície de coloração de anticorpo, dependendo do tipo do o DCM usado.
    1. Re-suspender as células em 99 ul / tubo PBS e adicionar 1 ul / tubo do fixável DCM (concentração final: 1: 100). Misturar bem as células utilizando um vortex e incubar durante 15 min à temperatura ambiente no escuro.
    2. Preparar uma solução mestre mistura misturando os anticorpos "superfície" listadas na Tabela 2 (ver coloração coluna passo destacado em azul). Use o emdicated volumes / tubo e multiplicá-las com o número de tubos de citometria de fluxo de ser manchada.
    3. Após a incubação ter a tubos de citometria de fluxo com as células e adicionar 1 mL / tubo de WB. Agregar as células a 400 xg durante 4 min.
    4. Descartar o sobrenadante, re-suspender as células em 84 mL / tubo de WB e adicionar 16 mL / tubo de solução mestre mix. Misturar bem as células usando um vórtice. Incubar as células durante 20 min a 4 ° C no escuro.
    5. Depois de 20 min adicionar 1 ml / tubo de WB e células de pelotas a 400 xg durante 4 min.
  4. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 100 uL / tubo de uma solução de fixação a frio (por exemplo, 2% () paraformaldeído final ou formaldeído). Misturar bem as células usando um vórtice. Incubar as células durante 10 min a 4 ° C no escuro.
    1. Corar as células para as citocinas intracelulares / quimiocinas após este passo ou armazená-los durante a noite a 4 ° C em WB.
      NOTA: Depois de incubação durante a noite, uma recuperação de células inferior pode ocorrer.
  5. Lave as células em 1 ml de WB / tubo a 400 xg durante 4 min e prossiga com a etapa de permeabilização.
  6. Preparar um tampão de permeabilização (PB) (por exemplo, 0,2% de saponina, solução de BSA a 1% em PBS).
  7. Lavar as células duas vezes com 1 mL / tubo de PB a 400 xg durante 4 min. Continue com a coloração intracelular.
    Cuidado: A saponina é potencialmente irritante. Segurá-lo em conformidade com a correspondente Ficha de Dados de Segurança do Material (MSDS).
  8. Preparar uma solução mestre mix usando os indicados volumes de anticorpos "intracelular" da Tabela 2 (destacada em verde). Multiplicar estes volumes com o número de tubos a serem corados.
    1. Re-suspender as células em 90 ul de PB / tubo e aplicar 10 ul / tubo de solução de anticorpo a mistura mestre. Misturar bem utilizando um vortex e incubar as células durante três0 min a 4 ° C no escuro.
  9. Lave as células duas vezes com 1 mL / tubo de PB a 400 xg durante 4 min.
  10. Descartar o sobrenadante e re-suspender as células em 400 PB ul / tubo. Misturar bem as células usando um vórtice. Colocar as células em gelo, no escuro, até à medição.

6. Citometria de Fluxo de Remuneração e Aquisição

  1. Selecionar os canais para os diferentes fluorocromos (ver Tabela 2) dentro da citometria de fluxo software de aquisição na pasta configuração dos parâmetros. Além disso, os canais para escolher FSC-A e -H, bem como para SSC-A e -H.
  2. Carregar uma matriz de compensação criado para os parâmetros escolhidos para o arquivo de aquisição.
    1. Criar uma matriz de compensação usando células NK isolados a partir do passo 2.2.8, realizando uma única mancha de cor para cada fluorocromo utilizados (ver Tabela 2). Usar o protocolo de coloração de superfície descrito nos passos 5,1-5,4. Incluir um controlo imaculada (sem anticorpos), bem como controles isotípicos e / ou de fluorescência menos um controles (FMO).
      NOTA: Como alternativa à remuneração baseada em célula, use pérolas como controles de compensação IgG de ligação.
    2. Colocar cada tubo para amostras de manchas individuais e a amostra sem anticorpos na porta de injecção de amostra (SIP). Clique no botão "record" no programa de aquisição de citometria de fluxo e adquirir um número de células de pelo menos 5 x 10 3 células NK por amostra.
    3. Use o aplicativo de cálculo da compensação do software de aquisição de citometria para criar uma matriz de compensação.
  3. Criar gráficos de pontos para identificar o celular População NK.
    1. Identificar células individuais usando / SSC-H gráficos de pontos SSC-A FSC-A / FSC-H e. Clique no botão "gate polígono". Desenhar uma porta em torno das células, que têm um padrão de distribuição linear em ambos os gráficos de pontos. Dê um duplo clique sobre os portões para abrir um novo gráfico de pontos.
    2. Escolha um terreno FSC-A / SSC-Um ponto de identificar o linfócito/ População de células NK (ver Figura 1). Desenhe um portão polígono em torno dele e clique duas vezes no portão.
  4. Colocar cada tubo de amostra do ensaio de estimulação da célula NK para o SIP. Clique no botão "record" e adquirir um número de células de pelo menos 5 x 10 3 células NK por amostra.

7. Análise e Estatísticas

  1. Abra a citometria de fluxo do programa de software de análise. Clique no botão de amostra de carga para abrir a amostra de controlo não estimulado.
  2. Criar um Sistema de Supressão para as diferentes subpopulações NK celular (ver Figura 1).
    1. Clique no botão gráfico de pontos para criar uma FSC-A / SSC-A trama. Clique no botão porta retângulo e desenhe um portão retângulo sobre todos os eventos com um FSC-Um valor> 5 x 10 4 a excluir detritos. Abra o portão, clicando duas vezes no portão.
    2. Escolha novamente os / SSC-A parâmetros FSC-A no âmbito do novo diagrama de pontos e clique no botão portão polígono. Dem bruto de um portão polígono em torno da população de linfócitos (ver Figura 1). Abra o portão.
    3. Selecione o SSC-Um parâmetro / SSC-H para o novo gráfico de pontos e desenhar um portão polígono ao redor todas as células individuais. Células individuais demonstrar uma distribuição linear entre os parâmetros do FSC-A / FSC-H e SSC-A / SSC-H (ver Figura 1). Abra o portão com um duplo clique sobre ele.
    4. Repita o passo 7.2.3, usando os parâmetros FSC-A / FSC-H neste momento.
    5. Use o CD45 parâmetro e despejo de canal (CD3; CD14; CD19; DCM) para excluir as células mortas. Desenhe um portão retângulo ao redor de todo o CD45 positivo e Dump células negativas canal. Abra o portão, clicando duas vezes no portão.
    6. Identificar toda a população de células NK, usando o CD56 e despejo parâmetros do canal. Criar uma porta retângulo ao redor do CD56 positivo e Dump canalizar células negativas. Abra o portão com um duplo clique sobre ele.
    7. Desenhe um portão retângulo ao redor de todas as três subpopulações de células NK dentro de um CD56 gráfico de pontos / CD16. Identify os diferentes subgrupos como CD56 ++ CD16 -, CD56 ++ CD16 + e subpopulações de células CD56 + CD16 ++ NK.
  3. Analisar as funções das células NK para cada célula Subconjunto individual NK.
    1. Clique em um dos três portões NK subconjunto de células para abri-lo. Criar três gráficos de pontos diferentes para CD56 / CD107a, CD56 / IFN-γ e CD56 / MIP-1β.
    2. Desenhar um portão rectângulo de células positivas para CD56, que são positivas, bem como para CD107a, IFN-γ ou MIP-1β respectivamente (ver Figura 1).
    3. Repetir o passo 7.3.1-7.3.2 para cada subconjunto de células NK restante.
  4. Repita o passo 7.2 e 7.3 para todas as amostras estimuladas. Guardar todos os valores estatísticos de cada amostra individual, clicando no botão de exportação de estatística dentro do software de análise.
  5. Abra os arquivos contendo os valores estatísticos das amostras individuais para analisar as funções das células NK. Selecione os valores para a célula NK indivíduosubconjuntos (por exemplo, CD56 ++ CD16 - células NK), copiando-os em outro arquivo.
    1. Subtrair a percentagem de células positivas NK CD107a, que não foram tratados com um estímulo, a partir da percentagem de células NK positivos CD107a, que foram tratados com um estímulo.
      NOTA: É o resultado para demonstrar a capacidade de desgranulação deste subconjunto de células NK particular, em resposta ao estímulo.
    2. Repetir o passo 7.5.1 em células NK MIP-1ß-positivos IFN-γ e para demonstrar a produção de citocina e quimiocina, em resposta ao estímulo.
    3. Repita o passo 7.5.1-7.5.2 para cada subconjunto de células NK restante para avaliar a sua capacidade de degranulação e produção de citocinas / quimiocinas após estimulação.

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Representative Results

A estratégia de propagação para analisar a desgranulação, produção de citoquinas e de quimioquinas de toda a população de células NK e três subconjuntos de células NK diferentes estão ilustradas na Figura 1.

Os resultados representativos de um dador saudável estão ilustrados na Figura 2. As células NK sem qualquer estímulo produzido nem IFN-γ nem MIP-1β e não manifestou CD107a na sua superfície (Figura 2A). Em contraste, as células NK estimuladas com células de tumor e citocinas produzidas quantidades significativas de intracelular IFN-γ e MIP-1β. Além disso, mais de 20% deles degranulados após interacção de células de tumor indicado pelo CD107a expressando na sua superfície (Figura 2C). PMA e ionomicina foram estimulação utilizada como um controlo (Figura 2B).

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Figura 1:. Gating estratégia subsequente portões são plotados. Em primeiro lugar, os detritos são excluídos em um FSC-A / SSC-A trama. Em seguida, os linfócitos são identificados e dobletes são excluídos usando duas parcelas com SSC-A / SSC-H e FSC-A / FSC-H. Depois disso, um portão, incluindo todos os CD45 + células e excluindo todos os CD3 +, CD14 + e CD19 + células mortas, é definida através da representação gráfica CD45 canal / Dump. Em seguida, as células NK são identificados por gating em células CD56 +. Um lote com CD56 / CD16 pode ser usado para identificar as principais subpopulações de células NK. Finalmente, dentro de toda a população de células NK, marcadores funcionais são identificados através da representação gráfica contra CD56 CD107a, IFN-γ e MIP-1β, respectivamente. Isso pode ser feito, bem como para todos os diferentes tipos de subconjuntos de células NK. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.


Figura 2:. Os resultados representativos de um dador de células NK saudáveis, utilizando a estratégia de gating descrito na Figura 1, marcadores funcionais das células NK como CD107a (por desgranulação), IFN-γ e MIP-1β podem ser identificados. A coluna à esquerda (A) mostra os resultados usando células NK na ausência de um estímulo. A coluna do meio (B) demonstra os resultados na presença do controlo positivo com PMA / ionomicina. A coluna da direita (C) apresenta os resultados para células NK estimuladas com a linha de células tumorais K562 e na presença das citocinas IL-2 (100 U / ml) e IL-15 (10 ng / ml). Por favor clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

"Tabela Tabela 1: Anticorpos para verificação de pureza.

mesa 2
Tabela 2: Os anticorpos para a coloração extra e intracelular.

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Discussion

O método descrito é um método fácil, rápido e fiável para estudar as funções das células NK, a partir de amostras de sangue completo de dadores saudáveis ​​ou de pacientes. Este método oferece a grande vantagem de purificar as células NK directamente a partir de sangue total, evitando o demorado centrifugação em gradiente de densidade, que é obrigatória em muitos outros métodos de purificação 15. Além disso, requer um menor tamanho da amostra em relação ao "clássico" de isolamento de células NK / métodos de enriquecimento, o que o torna uma alternativa adequada para amostras de pacientes pediátricos e / ou imuno-deficientes. Este protocolo pode ser usada para obter valores basais de funções das células NK ex-vivo, mas também permite uma maior cultura NK e expansão, sendo desta forma complementar com outros métodos anteriormente descrito 8. No entanto, alguns passos críticos têm de ser tomadas em consideração. Uma vez que o ensaio é baseado na extra- e coloração do anticorpo intracelular, que é fundamental para determinar o óptimo WOrking concentração para cada primeiro anticorpo. Especialmente para a coloração intracelular, uma avaliação cuidadosa dos anticorpos utilizados é altamente recomendável. Uma boa abordagem consiste em testar uma série de diluições do anticorpo utilizado (por exemplo, 1: 100 a 1: 12,5) de uma suspensão de células estimuladas com ou sem PMA / ionomicina. Posteriormente, a proporção de eventos positivos entre as amostras estimuladas e não-estimulada são calculados e plotados. A diluição do anticorpo com a maior proporção de mudança dobra positiva (melhor relação sinal-para-fundo) deve ser utilizado para outras experiências 16. Além disso, o uso de controles como controles isotype- e FMO pode revelar-se fundamental especialmente para coloração intracelular, a fim de porta corretamente nas populações de células positivas.

No entanto, existem algumas limitações importantes do método descrito. CD107a expressão é um marcador desgranulação e, por conseguinte, apenas indirectamente indica a citotoxicidade das células NK. NK citotoxicidade celular umaND capacidade de degranulação pode ser diferente. A sobre-regulação da via de autofagia em células tumorais resulta na degradação de secretada granzima b e reduz a morte celular por interacção 17 células NK. Por conseguinte, uma DCM adicional (por exemplo, caspase 3) pode ser adicionada ao painel de coloração, a fim de monitorar eventos de morte celular nas células alvo 18. Além disso, a citotoxicidade das células NK é influenciada pela quantidade de proteínas citotóxicas nos seus grânulos (por exemplo, perforina, granzima B), que pode ser quantificada por uma coloração intracelular 19,20.

Além disso, existem diferentes possibilidades de modificar o protocolo. Em vez de células NK isoladas, as células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) podem ser usados. Embora a pessoa tem que estar ciente de que o número absoluto de células NK na população PBMC difere entre os vários doadores e até mesmo entre as amostras provenientes do mesmo doador em momentos diferentes. degranul células NKção é altamente dependente da proporção E: T. A fim de comparar as funções das células NK entre diferentes doadores ou em vários pontos de tempo, o número absoluto de células NK na população de PBMC deve ser usado para estabelecer uma constante E: razão T ao longo de todas as experiências. Se as funções das células NK são monitorizados em diferentes pontos no tempo dentro do mesmo dador, as PBMCs podem ser congeladas e a análise pode ser feita ao mesmo tempo para todos os pontos de tempo diferentes, a fim de reduzir as variações inter-experimentais 11.

Uma vez que a coloração painéis com até 18 cores são possíveis, a análise de funções das células NK, pode ser alargada a uma muito maior detalhe. Usando marcadores de superfície adicionais, incluindo CD57, NKG2A e receptores do tipo imunoglobulina células assassinas (KIR), outras subpopulações de células NK pode ser identificado. As células NK educadas que expressam pelo menos um auto-KIR desgranulam mais forte sobre a interacção com células K562 que as células NK sem instrução. Em contraste, CD57 mais diferenciada + CD56 + - células NK CD56 + 21. Além disso, outros marcadores da função das células NK pode ser dirigida. LFA-1 é uma molécula importante para a adesão de células NK e é expressa na sua conformação aberta após a activação das células NK. Este denominado "sinal de dentro para fora" é um marcador de activação de células NK precoce 22.

Finalmente, os estímulos de teste para as funções das células NK, pode ser modificado, bem. Em nossa experiência recentemente isoladas células NK única desgranulam mal na interação celular K562 se não citocinas são adicionados. Utilizando PBMC isolados de fresco sem qualquer outra adição de citoquinas contornar este problema, por causa da influência de células espectadoras. Além disso, a produção de citoquinas, especialmente de IFN-γ e TNF-α, pode ser iniciado através de IL-12 e IL-18 de estimulação 23. a produção de IFN-γ dentro dos subconjuntos de células NK pode diferir depending no estímulo utilizado (citocina contra a estimulação induzida por alvo) 24. Além disso, em vez de usar células K562 como células alvo, as células de tumor primárias derivadas de pacientes com tumor poderia ser usada a fim de testar as funções das células NK contra células tumorais autólogas antes ou durante terapias imuno-moduladores (por exemplo, monoclonais tratamento com anticorpo ou imuno-moduladores drogas (IMiDs)).

Nos últimos anos, o campo da imunoterapia tem vindo a evoluir rapidamente, com a aprovação clínica de inibidores de checkpoint imunes (por exemplo, ipilumumab, nivolumumab, pembrolizumab 25) e bem sucedidos utilizando os ensaios do receptor de antigénio quimérico geneticamente modificado (CAR) -expressing células T assim CARRO como células-NK (revisto em 26 de referência), para o tratamento de pacientes com tumores hematológicos 27. Portanto imunoterapia baseada em células NK está ficando cada vez mais em foco. Os anticorpos anti-CD20 têm sido um grande sucesso no treatment de linfomas malignos dentro das últimas duas décadas 28. A grande maioria das células NK expressam a afinidade de Fc CD16 receptor de baixa permitindo que as células de reconhecer e matar células alvo marcadas de anticorpos (citotoxicidade celular dependente de anticorpos - ADCC). A capacidade do anticorpo para desencadear as funções das células NK pode ser testada in vitro utilizando o protocolo descrito 29. Terszowski et ai. ADCC analisadas células NK 'contra uma linha celular de linfoblastóide B usando anticorpos anti-CD20 diferentes clinicamente aprovados. Enquanto ADCC induzida após tratamento com rituximab (primeira clinicamente aprovado anti-CD20 30) foi influenciado negativamente pelo KIR interação / HLA, este efeito não foi observado quando se utiliza obinutuzumab (um novo tipo II anticorpo monoclonal glycoengineered CD20) 31, 32. Além disso, as funções das células NK são influenciados por diferentes drogas anti-tumorais novos como o Imid lenalidomida 33 e diferentes tirosina-Kinasinibidores E (TKI) 34. Actualmente inibidores de checkpoint específicos de células NK são testados em ensaios clínicos. Constituem exemplos a utilização de anticorpos anti-KIR 35,36 ou anticorpos anti-NKG2A (NCT02331875), assim como activadores, como agonistas de um anticorpo anti-CD137 (NCT01775631; NCT02110082).

Importante, a transferência adoptiva de células NK foi realizado em uma variedade de diferentes doenças malignas com efeitos clínicos promissores 37. Com o objectivo de seleccionar o melhor doador, as funções das células NK contra o tumor do paciente pode ser testado in vitro, utilizando amostras de sangue de doadores potenciais de células NK.

Em resumo, o protocolo descrito foi concebido para analisar diversas funções das células NK, a partir de dadores saudáveis ​​ou de pacientes. Essas funções podem ser monitorizados em diversos subconjuntos de células NK de vários estímulos em pontos de tempo seleccionados.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 + glutamine Invitrogen 6187-044
penicilin/streptomycin Invitrogen 15140-122
BD Falcon Round Bottom Tube BD 352008
fetal calf serum Invitrogen 10270-106 heat inactivated before use
T-flask Greiner Bio-One 690195
K562 tumor cell line DSMZ GmbH ACC 10
ammonium-chloride-potassium (ACK) lysis buffer made in house / components are listed in the text
Distilled water: Ampuwa Spüllösung 1,000 ml Plastipur Fresenius Kabi 1088813
Megafuge 40R Centrifuge Heraeus /
EDTA blood collector tubes Sarstedt 386453 S-Monovette 7.5 ml, K3EDTA
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Life Technologies 15575-020
Hematopoietic media (XVIVO) Lonza Group Ltd BE04-743Q
human serum DRK Blutspendedienst, Frankfurt/M  / healthy donors with blood type AB; heat inactivated before use
Neubauer-improved counting chamber, bright line Marienfeld superior/ LO-Laboroptik Ltd. 0640030/ 1110000
trypan blue solution (0.4%) Invitrogen 15250-061
3% acetic acid with methylene blue Stemcell Technologies  07060
Corning 96 Well Clear V-Bottom TC-treated Microplates Corning  3894
Falcon 96 Well Round Bottom Not Treated Microplates Corning  351177
DPBS (Ca2+- and Mg2+-free) Gibco Invitrogen 14190-169
BSA Sigma Aldrich A2153-100G
NaN3 Sigma Aldrich 08591-1ML-F
phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)  Merck 524400-1MG
ionomycin  PromoKine PK-CA577-1566-5
interleukin 15 (IL-15) PeproTech 200-15
Proleukin S (IL-2)  Novartis Pharma 730523
Golgi Stop, Protein Transport Inhibitor (containing Monensin) BD Biosciences 554724 This product can be used in combination or instead of Golgi Plug. The best combination for the wished experimental setting has to be tested.
Golgi Plug, Protein Transport Inhibitor (containing Brefeldin A) BD Biosciences 555029
paraformaldehyde AppliChem UN2209
saponin Sigma Aldrich 47036
flow cytometer: Canto10C BD Biosciences /
FlowJo TreeStar Inc. /
Graph Pad Graph Pad Inc. /
MACSxpress Separator Miltenyi Biotec  130-098-308
MACSxpress NK isolation kit Miltenyi Biotec  130-098-185
MACSxpress Erythrocyte Depletion Kit, human Miltenyi Biotec  130-098-196
MACSmix Tube Rotator  Miltenyi Biotec  130-090-753
anti-human CD3 APC Biolegend 300412
anti-human CD3 V450 BD Biosciences 560366
anti-human CD14 PerCP Miltenyi Biotec  130-094-969
anti-human CD14 V450 BD Biosciences 560349
anti-human CD16 PE Biolegend 302008
anti-human CD16 PerCP Biolegend 302029
anti-human CD19 PE-Cy7 Biolegend 302216
anti-human CD19 V450 BD Biosciences 560353
anti-human CD45 BV510 BD Biosciences 563204
anti-human CD56 FITC Biolegend 345811
anti-human CD107a PE Biolegend 328608
anti-human IFN-γ AF-647 BD Biosciences 557729
anti-human MIP-1β APC-H7 BD Biosciences 561280
DAPI Biolegend 422801
Zombie Violet Fixable Viability Kit Biolegend 423113 fixable dead cell marker

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References

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Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, N., Ullrich, E. Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions. J. Vis. Exp. (116), e54615, doi:10.3791/54615 (2016).

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