Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Flowcytometri basert analyse for overvåking av NK cellefunksjoner

Published: October 30, 2016 doi: 10.3791/54615
Automatic Translation
*1,2, *3,4, 1,2, 1,2
1Childrens Hospital, Department of Pediatric Stem Cell Transplantation and Immunology, Johann Wolfgang Goethe-University, 2LOEWE Center for Cell and Gene Therapy, Johann Wolfgang Goethe-University, 3Institute for Cancer Research, Department of Cancer Immunology, Oslo University Hospital, Radiumhospital, 4The KG Jebsen Center for Cancer Immunotherapy, Institute of Clinical Medicine, University of Oslo
* These authors contributed equally

Summary

En enkel og pålitelig metode er beskrevet her for å analysere et sett av NK-celle-funksjoner som degranulering, cytokin og chemokin-produksjon innenfor forskjellige NK-celleundergrupper.

Introduction

Som en del av det medfødte immunsystemet natural killer (NK) celler bidra til den første linjen i forsvaret mot virus-infiserte eller malignantly transformerte celler. Et system av inhibitoriske og aktiverende reseptorer gjør dem i stand til å skjelne mellom friske og transformerte celler uten forutgående grunning antigen i motsetning til T-celler. Ved målcellen møte NK-celler frigjør innholdet av deres cytotoksiske granuler (f.eks perforin, granzymes) inn i immun synapse for å drepe deres mål. Dessuten, NK-celler produserer og utskiller forskjellige typer cytokiner (for eksempel interferon-y: IFN-γ, tumor nekrose faktor-α: TNF-α) og kjemokiner (f.eks, makrofag inflammatoriske protein-1β: MIP-1 p) ved målcellen interaksjon eller cytokin stimulering en.

Tilstrekkelig NK cellefunksjoner som cytotoksisitet, chemokine og cytokin produksjon har en viktig innvirkning på skjebnen til ulike disletter. Leukemi pasienter viser økt tilbakefall hvis de viser en defekt NK celle profil på diagnose som består av redusert IFN-γ produksjon og redusert uttrykk for å aktivere NK celle reseptorer 2. En tidlig gjenvinning av NK-celletall og funksjon, inkludert cytokinproduksjon ved mål-celle-interaksjon er forbundet med en redusert tilbakefall og forbedret overlevelse hos pasienter som mottar allogen stamcelletransplantasjon 3. Videre i begynnelsen av interferonbehandling i hepatitt C-virus-infiserte pasienter degranulation kapasitet på perifere NK-celler er sterkere i tidlige respondere enn hos ikke-respondere 4. NK celle tall (> 80 / mikroliter) på dag 15 etter autolog stamcelletransplantasjon (autoSCT) hos pasienter som lider av lymfom eller myelomatose er prediktive for en forbedret progresjon og total overlevelse fem. I melanom pasienter uttrykk for T-celle immunoglobulin- og mucin-domene-som ing molekyl-3 (TIM-3), en immun-regulerende protein på NK-celler, korrelerer med sykdoms stadium og prognose 6.

Forskere har overvåket NK celle funksjoner gjennom de siste tiårene. Den første analysen av NK-celle cytotoksisitet mot kreftceller uten grunning var adressert ved hjelp av en 51 Cr-release assay 7. Mer nylig har forskere utviklet en ikke-radioaktiv metode for å evaluere cytotoksisiteten av ekspanderte NK-celler 8. Cytokin og chemokin-produksjon har blitt hyppig evaluert ved hjelp av enzymbundet immunosorbent assay (ELISA) teknikker 9,10. I løpet av de siste tiårene disse metodene har blitt supplert med flowcytometri-baserte analyser. Bruken av proteintransport hemmere (f.eks Brefeldin A og monensin) og celle Permeabilization metoder i kombinasjon med konvensjonelle overflatefargingsprotokoller har aktivert forskere å studere chemokin og cytokin produksjon i ulike bestemte lymfeocyte undergrupper (f.eks T, B eller NK-celler) 11. Dessuten har forskjellig flow cytometri-baserte analyser blitt utviklet for å overvåke T- og NK-celle cytotoksisitet. I 2004 Alter et al., Beskrev overflate-ekspresjon av lysosomet tilknyttet protein CD107a (Lamp1) på NK-celler på målcellen møte som en markør for degranulering av cytotoksiske granuler 12. Siden et bredt spekter av forskjellige fluorokromer og flerkanals væskestrømsfotometere er tilgjengelige i våre dager, er det blitt mulig å samtidig overvåke forskjellige NK-cellefunksjoner (cytotoksisitet, cytokin og chemokin-produksjon) i ulike NK-celleundergrupper. Dette blir spesielt viktig i situasjoner der størrelsen på utvalget er begrenset, f.eks i biopsi eller blodprøver av pasienter som lider av leukopeni.

For å teste globale NK celle funksjoner, kan de forskjellige flowcytometri-baserte analyser effektivt sammen. Theorell et al. Stimulerte NK-celler fra healthy givere med tumor cellelinje K562 og analysert NK celle degranulering, innsiden ut signal og chemokin produksjon via flowcytometri 13. Nylig NK celle undergrupper, fenotyper og funksjoner i kreftpasienter under autoSCT ble analysert ved hjelp av flowcytometri-baserte analyser. Det ble demonstrert at NK-celler var i stand til å produsere cytokiner degranulate og / kjemokiner ved tumorcellegjenkjenning på meget tidlige tidspunkter etter autoSCT 11.

Her en protokoll beskrives for å vurdere NK-cellefunksjoner ved interaksjon med tumorceller, inkludert degranulering kapasitet, chemokine og cytokinproduksjon ved hjelp av en flowcytometri-baserte analysen som gjør det mulig å overvåke NK-cellefunksjoner i forskjellige undergrupper samtidig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne studien ble utført i samsvar med anbefalingene fra den lokale etikkutvalg ved universitetet i Frankfurt.

1. Dyrking av K562 Cells

  1. Kultur K562-celler i R10 medier (RPMI 1640 med glutamin medium, 1% penicillin / streptomycin, 10% føtalt kalveserum) ved en tetthet på 0,5-1 x 10 6 celler pr ml i en cellekulturflaske ved 37 ° C og 5% CO 2.
  2. Harvest-K562 Cells 24 hr før starten av et nytt eksperiment.
    1. Fjerne cellekulturflaske som inneholder K562-celler fra inkubatoren. Re-suspendere K562 celler i kultur media ved forsiktig pipettering opp og ned.
    2. Overfør kulturmedia inneholdende de K562-celler i et 15 eller 50 ml rør og pelletere cellene ved 400 x g i 8 min. Kast supernatanten og re-suspendere cellene i 5 ml R10 media og bland godt.
    3. Overføre 20 ul av celleløsningen inn i en brønn av en 96-U-brønns plate. Tilsett 20 mL trypanblått ogbland godt ved å pipettere opp og ned i minst 5 ganger. Pipetter 10 ul av oppløsningen inn i en celle tellekammer og telle cellene.
    4. Pellet cellene ved 400 xg i 8 min. Re-suspendere cellene i R10 media og justere K562 cellekonsentrasjonen til 0,5-1 x 10 6 celler per ml.
    5. Inkuber K562-celler i en cellekulturflaske ved 37 ° C og 5% CO2 inntil bruk.

2. Isolering av NK-celler

  1. Ifølge godkjenning og retningslinjer for lokale etikkutvalg, innhente skriftlig informert samtykke fra frisk donor eller pasienten før innsamling av 6-10 ml av enten EDTA eller heparinisert perifert blod.
  2. Oppbevar reagenser for NK-celleisolasjon ved 4 ° C inntil starten av eksperimentet og deretter bruke dem ved romtemperatur (RT) under sterile betingelser. Isolere NK-celler fra perifert blod ved hjelp av magnetiske mikroperler og en bestemt magnet for celleisolasjon i henhold til tHan produsentens instruksjoner.
    1. Rekonstituere en ampulle med den frysetørkede NK celle negativ isolasjon antistoff cocktail ved pipettering 7,5 ml av den medfølgende buffer A (inkludert i NK-celle isolasjon kit) i hetteglasset. Bland forsiktig ved å pipettere opp og ned 3-4 ganger.
      MERK: Pass på at suspensjonen er homogen før hver bruk.
    2. Fremstille den endelige cocktail løsning ved å blande passende mengder av den rekonstituerte pelleten fra trinn 2.2.1 og buffer B (innbefattet innenfor NK-celle isolasjonskit). For å bestemme disse volumene, definerer volumet av fullblodprøven i ml som volum = 1,0. Bruk 0,25 volumer av den rekonstituerte pellet (fra trinn 2.2.1) og 0,25 volumer av buffer B for å behandle en volum av fullblod.
    3. Overfør blandingen i en tilstrekkelig rør inneholdende fullblodprøven. Ikke pipetter opp og ned for å unngå tap av blod i pipetten. I stedet lukker røret og flytte den forsiktig opp og ned til setet fjæringSion er homogen. Ikke vortex.
    4. Ytterligere homogenisere prøven ved hjelp av et rør rotator i 5 min ved RT.
    5. Under sterile betingelser, fjerne hetten og plassere røret i den magnetiske separator i 15 minutter som anbefalt av produsenten. Pass på at slange etikettene vender mot baksiden av magneten for å tillate uforstyrret synlighet av skillelinjen. Ikke flytt magneten under separasjon, som denne prosedyren ville bli forstyrret.
    6. overføre nøye supernatanten inn i en ny 15 ml tube og fylle opp med komplett media (CM, blodkreft celle media, 1% penicillin / streptomycin, 5% humant serum). Pellet cellene ved 400 xg i 8 min.
      1. Valgfritt: Hvis pellet er rød, re-suspendere cellene i 1 ml erytrocytt lyseringsbuffer (for eksempel en ml av ammonium-klorid-kalium (ACK) lysebuffer: 155 mM NH4CI, 0,1 mM EDTA, 10 mM KHCO 3 i 1 liter destillert vann (DW)) og inkuberes i 8 minutter ved romtemperatur. Alternativt kan du bruke en ehythrocyte uttømming kit.
        MERK: Husk at bruk av ACK buffer kan negativt påvirke NK celle funksjoner 14.
      2. Hurtig fortynne ACK-buffer ved tilsetning av minst 1 ml av CM å stoppe lysis og sentrifuger ved 400 xg i 8 minutter for å pelletere cellene.
    7. Re-suspendere cellepelleten i 1 ml CM og fortsette med telling. Overfør 20 ul av NK-celleløsningen på en 96-U-brønns plate. Tilsett 20 mL av metylen blått til hver brønn og bland godt ved å pipettere opp og ned i minst 5 ganger. Pipetter 10 ul av oppløsningen inn i en celle tellekammer og telle celler. Alternativt kan bruke 30 pl ufortynnet cellesuspensjon for å telle med en kommersielt tilgjengelig celleteller.
    8. Juster cellene til en konsentrasjon på minst 2 x 10 4 NK-celler pr 100 ul CM.
    9. Utføre en overflate antistoff farging av det isolerte NK-cellepopulasjon for å kontrollere renheten ved hjelp av et strømningscytometer.
      1. prepare en masterblanding løsning ved å blande mengder av de angitte antistoffer i henhold til tabell 1.
      2. Re-suspendere cellene i 88,5 ul vaskebuffer (IM, 0,5% bovint serumalbumin (BSA), 0,1% NaN3 i PBS) og tilsett 11,5 mL av masterblanding løsning. Cellene inkuberes i 20 minutter ved 4 ° C i mørket.
        Forsiktig: NaN 3 er giftig og mutagen. Håndtere den deretter til den tilsvarende HMS-datablad (HMS).
      3. Tilsett 1 ml av WB og pellet cellene ved 400 xg i 4 min.
      4. Re-suspendere cellene i 300 mL flekker buffer pluss DAPI. Acquire cellene ved hjelp av en strømningscytometer.
        MERK: fortsette videre med den eksperiment bare hvis den NK-celle renhet er minst 80% av alle levende lymfocytter.

3. Høsting av K562 celler for NK Cell Stimulering

  1. Fjerne cellekulturflaske som inneholder K562-celler (fra trinn 1.2) fra th e kuvøse. Re-suspendere K562 celler i kultur media ved forsiktig pipettering opp og ned.
  2. Overfør hele kulturen medier i en 15 eller 50 ml tube og pellet cellene ved 400 xg i 8 min. Kast supernatanten og re-suspendere cellene i 5 ml fosfatbufret saltvann (PBS) og bland godt.
  3. Overføre 20 ul av celleløsningen inn i en brønn av en 96-U-brønns plate. Tilsett 20 mL trypanblått og bland godt ved å pipettere opp og ned i minst 5 ganger. Pipetter 10 ul av oppløsningen inn i en celle tellekammer og telle cellene. Alternativt kan bruke 30 pl ufortynnet cellesuspensjon for å telle med en kommersielt tilgjengelig celleteller.
  4. Pellet cellene ved 400 xg i 8 min. Re-suspendere celler i CM i en konsentrasjon på minst 2 x 10 4 K562 celler pr 100 ul media.
    MERK: Bruk samme K562 og NK cellekonsentrasjoner for å ruge både en effektor: target (E: T) forholdet 1: 1 senere.
"> 4. Stimulering av NK-celler med tumorcellelinje K562 og Cytokiner

  1. Bland forsiktig cellene ved pipettering dem opp og ned i minst 5 ganger. Fordel 100 ul / brønn av NK-celleløsning inn de nødvendige brønner i en 96-V-brønns plate.
    1. Bruk minst to brønner for hver donor, en med og en uten et stimulus (for eksempel, K562-tumorceller og cytokiner). Når det er mulig, utfører forsøket minst i to og legg en positiv kontroll (f.eks forbol 12-myristat 13-acetat (PMA) og ionomycin, endelig konsentrasjon: 50 nM PMA, 1fiM ionomycin per brønn). Forbered oppdatert flowcytometri kompensasjon for datoen for forsøket.
      MERK: Titrer antistoffene før bruk (se diskusjon).
  2. Slå av lyset og tilsett den anti-CD107a antistoffet (2 ul; sluttkonsentrasjon: 1: 100) til hver brønn med NK-celler i 96-V-brønns plate.
  3. blande K562 celler forsiktig ved pipettering dem opp og ned iminst 5 ganger.
    1. Fra brønnene inneholdende NK-celle / anti-CD107a antistoff-løsning, identifisere de som er planlagt for stimulering med K562-celler. Tilsett 100 ul / brønn av K562 celleløsning inn i disse brønnene. Bland forsiktig ved å pipettere opp og ned i minst 5 ganger.
    2. Legg interleukin-2 (IL-2; sluttkonsentrasjon 100 U / ml) og interleukin-15 (IL-15; sluttkonsentrasjon 10 ng / ml) til brønnene som inneholdt K562-celler og NK-celle / anti-CD107a antistoffoppløsningen.
      1. Valgfritt: Test virkningen av enten K562 celler eller cytokiner alene på distribuerte NK-celler til å dechiffrere tumorindusert versus cytokin-indusert NK celle funksjoner.
    3. Identifisere brønnene på den 96-V-brønns plate planlagt som negative kontroller uten stimulus. Tilsett 100 ul / brønn CM til disse brønner inneholdende bare den NK-celle / anti-CD107a antistoffoppløsningen. Bland forsiktig ved å pipettere opp og ned i minst 5 ganger.
      1. Valgfritt: For en positiv kontroll, tilsett 100 μ; L CM inneholder PMA og ionomycin (endelig konsentrasjon: 50 nM PMA, 1 uM ionomycin per brønn) til en brønn med NK-celle / anti-CD107a antistoffoppløsningen.
  4. Cellene inkuberes i 3 timer i mørke ved 37 ° C og 5% CO2.
  5. Forbered et protein transport inhibitor løsning (f.eks Brefeldin A og / eller monensin) i CM. Etter 1 time inkubering, tilsett løsningen til hver brønn av 96-V-brønns plate med lyset slått av (sluttkonsentrasjon: 0.5-1μM Brefeldin A og 2-3 uM monensin). Bland forsiktig ved å pipettere opp og ned i minst 5 ganger. Fortsett inkubasjonen for de resterende 2 timer.

5. Surface og Intracellulær Farging

  1. Etter 3 timers inkubasjonsperioden blande cellene i brønnene i 96-V-brønns plate nøye ved å pipettere opp og ned i minst 5 ganger, og overføre dem til flowcytometri rør. Tilsett 1 ml / rør av WB. Pellet cellene ved 400 xg for 4 min.
    1. Valgfritt: Før sentrifugering, skylling av brønnene med 100 ul / brønn PBS, for å optimalisere utvinning cellen, ved å pipettere opp og ned i minst 5 ganger før overføring av cellene inn i det respektive FACS røret.
  2. Kast supernatanten og Fortsett med Surface farging.
  3. Omfatte en amin-reaktivt fluorescerende fargestoff som er ikke-permeant for å leve-celler med et emisjonsmaksimum på 423 nm som en festbar dødt cellemarkør (DCM). Utføre farging før (se nedenfor) eller parallelt med antistoffet overflate flekker avhengig av typen av DCM som brukes.
    1. Re-suspendere celler i 99 pl / rør PBS og tilsett 1 mL / tube av fikses DCM (endelig konsentrasjon: 1: 100). Bland godt celler ved hjelp av en vortex og inkuber dem i 15 minutter ved romtemperatur i mørke.
    2. Forbered en mester mix løsning ved å blande sammen "overflaten" antistoffer oppført i tabell 2 (se flekker skritt kolonnen uthevet i blått). Bruk idicated volum / rør og multiplisere dem med antallet av flowcytometri rør for å være farget.
    3. Etter inkubering ta flowcytometri rør med cellene og tilsett 1 ml / rør av WB. Pellet cellene ved 400 xg i 4 min.
    4. Kast supernatanten, re-suspendere cellene i 84 mL / tube med WB og tilsett 16 ul / rør av master mix løsning. Bland celler brønn med en vortex. Inkuber cellene i 20 minutter ved 4 ° C i mørket.
    5. Etter 20 min tilsett 1 ml / rør WB og pellets cellene ved 400 xg i 4 min.
  4. Kast supernatanten og re-suspendere cellene i 100 ul / rør av en kald fikseringsløsning (for eksempel 2% (endelig) paraformaldehyd eller formaldehyd). Bland celler brønn med en vortex. Inkuber cellene i 10 minutter ved 4 ° C i mørket.
    1. Flekk cellene for intracellulære cytokiner / chemokiner etter dette trinnet, eller lagre dem over natten ved 4 ° C i WB.
      MERK: Etter inkubasjon over natten, kan det oppstå en lavere celle utvinning.
  5. Vask cellene i 1 ml / rør WB ved 400 xg for 4 min og gå videre med permeabilization trinn.
  6. Forbered en permeabiliseringsbuffer (PB) (for eksempel 0,2% saponin, 1% BSA løsning i PBS).
  7. Vask cellene to ganger i 1 ml / rør av PB ved 400 x g i 4 min. Fortsett med den intracellulære flekker.
    Forsiktig: Saponin er potensielt irriterende. Håndtere den deretter til den tilsvarende HMS-datablad (HMS).
  8. Forbered en mester miks løsning ved hjelp av de angitte "intracellulære" antistoffmengder i tabell 2 (uthevet i grønt). Multipliser disse volumene med antall rør for å være farget.
    1. Re-suspendere cellene i 90 ul / rør PB og anvende 10 ul / rør av antistoffet masterblanding løsning. Bland godt ved hjelp av en vortex og inkuberes cellene i tre0 min ved 4 ° C i mørket.
  9. Vask cellene to ganger i 1 ml / rør av PB på 400 xg for 4 min.
  10. Kast supernatanten og re-suspendere cellene i 400 mL / tube PB. Bland celler brønn med en vortex. Plasser celler på isen i mørket før målingen.

6. Flowcytometri Kompensasjon og oppkjøp

  1. Velg kanaler for de ulike fluorokromer (se tabell 2) innen flowcytometri oppkjøpet programvare i parameteroppsettet mappen. I tillegg velger kanaler for FSC-A og -h, så vel som for SSC-A og -H.
  2. Last inn en kompensasjon matrise laget for de valgte parametrene i oppkjøpet filen.
    1. Lag en kompensasjon matrise ved hjelp av isolerte NK-celler fra trinn 2.2.8 ved å utføre en enkelt farge flekken for hver brukte fluorochrome (se tabell 2). Bruk overflatefarging protokoll beskrevet i trinn 5,1-5,4. Inkluder en unstained kontroll (uten antistoffer) samt isotype kontroller og / eller fluorescens minus en kontroller (FMO).
      MERK: Som et alternativ til cellebasert kompensasjon, bruke IgG-bindende perler som kompensasjon kontroller.
    2. Plassere hvert rør for enkeltflekkprøver, og prøven uten antistoffer i prøven injeksjonsporten (SIP). Klikk på "record" -knappen i flowcytometri oppkjøpet programvare og få en celle nummer på minst 5 x 10 3 NK celler per prøve.
    3. Bruk kompensasjon beregning anvendelsen av cytometri oppkjøpet programvare for å lage en kompensasjon matrise.
  3. Lag Dot Tomter for Identifisere NK-cellepopulasjon.
    1. Identifisere enkeltceller ved hjelp av FSC-A / FSC-H og SSC-A / SSC-H dot plots. Klikk på "polygon gate" -knappen. Tegn en gate rundt celler, som har en lineær fordeling mønster i begge dot plots. Dobbeltklikk på portene for å åpne et nytt prikkplott.
    2. Velg en FSC-A / SSC-A dot komplott for å identifisere lymfocytter/ NK-cellepopulasjonen (se figur 1). Tegn et polygon gate rundt det og dobbeltklikk på porten.
  4. Plassere hver prøverør av NK-cellestimuleringsanalyse inn i SIP. Klikk på "record" -knappen og få en celle nummer på minst 5 x 10 3 NK celler per prøve.

7. Analyse og statistikk

  1. Åpne flowcytometri analyseprogram. Klikk på laste prøven knappen for å åpne unstimulated kontrollutvalget.
  2. Lag en gating system for de ulike NK celle subpopulasjoner (se figur 1).
    1. Klikk på prikkplott for å opprette en FSC-A / SSC-A plot. Klikk på rektangelet gate knappen og tegne et rektangel gate i løpet av alle hendelser med en FSC-A verdi> 5 x 10 4 for å utelukke rusk. Åpne porten ved å dobbeltklikke på porten.
    2. Velg igjen til FSC-A / SSC-A parametre innenfor den nye prikkplott og klikk på polygon gate knappen. Drå et polygon gate rundt lymfocyttpopulasjon (se figur 1). Åpne porten.
    3. Velg SSC-A / SSC-H parameter for den nye prikkplott og tegne et polygon gate rundt alle enkeltceller. Enkeltceller viser en lineær fordeling over FSC-A / FSC-H og SSC-A / SSC-H parametere (se figur 1). Åpne porten ved å dobbeltklikke på den.
    4. Gjenta trinn 7.2.3 ved hjelp av FSC-A / FSC-H parametere denne gangen.
    5. Bruk parameter CD45 og Dump kanal (CD3, CD14, CD19, DCM) for å utelukke døde celler. Tegn et rektangel gate rundt alle CD45 positive og Dump kanal negative celler. Åpne porten ved å dobbeltklikke på porten.
    6. Identifiser hele NK cellepopulasjon ved hjelp av CD56 og Dump kanalparametrer. Lag et rektangel gate rundt CD56 positive og Dump kanalisere negative celler. Åpne porten ved å dobbeltklikke på den.
    7. Tegn et rektangel gate rundt alle tre NK celle undergrupper innenfor et CD56 / CD16 prikkplott. Identify de ulike undergrupper som CD56 ++ CD16 -, CD56 ++ CD16 + og CD56 + CD16 ++ NK celle undergrupper.
  3. Analyser NK celle funksjoner for hver enkelt NK Cell Delsett.
    1. Klikk på en av de tre NK celle undergruppe porter for å åpne den. Lag tre forskjellige prikk tomter for CD56 / CD107a, CD56 / IFN-γ og CD56 / MIP-1β.
    2. Tegn et rektangel port for CD56-positive celler som er positive så vel for CD107a, IFN-γ eller MIP-1β henholdsvis (se figur 1).
    3. Gjenta trinn 7.3.1-7.3.2 for hver gjenværende NK celle undergruppe.
  4. Gjenta trinn 7.2 og 7.3 for alle stimulert prøver. Lagre alle statistiske verdier for hver enkelt prøve ved å klikke på statistikken eksporterende knappen i analyseprogramvare.
  5. Åpne filene med de statistiske verdiene av de enkelte prøver å analysere NK celle funksjoner. Velg verdiene for individuell NK celleundergrupper (f.eks CD56 ++ CD16 - NK-celler) ved å kopiere dem til en annen fil.
    1. Trekk fra prosentandelen av positive CD107a NK-celler, som ikke har blitt behandlet med en stimulans, fra prosentandelen av positive CD107a NK-celler, som er blitt behandlet med et stimulus.
      MERK: Bruk resultatet for å demonstrere den degranulering kapasiteten til denne NK-celleundersett som reaksjon på stimuli.
    2. Gjenta trinn 7.5.1 for IFN-γ og MIP-1SS-positive NK-celler for å demonstrere cytokin og chemokin-produksjon som reaksjon på stimuli.
    3. Gjenta trinn 7.5.1-7.5.2 for hver gjenværende NK celle undergruppe for å evaluere deres degranulation kapasitet og cytokin / chemokin produksjon ved stimulering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Portstyringsstrategi for å analysere degranulering, cytokin og chemokin produksjon av hele NK-cellepopulasjon og tre forskjellige NK-celleundergrupper er illustrert i figur 1.

Representative resultater fra en frisk donor er illustrert i figur 2. NK-celler uten noen stimulans hverken produsert IFN-γ eller MIP-1β og uttrykte ikke CD107a på deres overflate (figur 2A). I motsetning til dette, NK-celler stimulert med tumorceller og cytokiner som produseres betydelige mengder av intracellulær IFN-γ og MIP-1β. Videre er over 20% av dem degranulated på tumorcelleinteraksjon indikert ved å uttrykke CD107a på deres overflate (figur 2C). PMA og Ionomycin stimulering ble anvendt som en kontroll (figur 2B).

e en "src =" / files / ftp_upload / 54615 / 54615fig1.jpg "/>
Figur 1:. Avblending strategi Følgende porter er plottet. Først blir rusk utelukket i en FSC-A / SSC-A plot. Deretter lymfocytter blir identifisert og dubletter er utelukket ved hjelp av to tomter med SSC-A / SSC-H og FSC-A / FSC-H. Deretter en gate inkludert alle CD45 + celler og uten alle døde, CD3 +, CD14 + og CD19 + celler satt ved å plotte CD45 / Dump kanal. Deretter blir NK-celler identifisert ved signalutvelgelse på CD56 + celler. En opptegning med CD56 / CD16 kan brukes til å identifisere de viktigste NK-celleundergrupper. Til slutt, i løpet av hele NK-cellepopulasjonen, blir funksjonelle markører identifiseres ved plotting av CD56 versus CD107a, henholdsvis IFN-γ og MIP-1β,. Dette kan gjøres i tillegg for alle forskjellige typer NK celle undergrupper. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.


Figur 2:. Representative resultater fra en frisk donor NK-celle ved hjelp av portstyringsstrategien som er beskrevet på figur 1, NK-celle funksjonelle markører som CD107a (for degranulering), IFN-γ og MIP-1β kan identifiseres. Den venstre kolonne (A) viser resultatene ved anvendelse av NK-celler i fravær av en stimulus. Den midterste kolonne (B) viser resultatene i nærvær av den positive kontrollen PMA / ionomycin. Den høyre kolonne (C) presenterer resultater for NK-celler stimulert med tumor cellelinje K562 og i nærvær av cytokinene IL-2 (100 U / ml) og IL-15 (10 ng / ml). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

"Tabell Tabell 1: Antistoffer til renhet sjekk.

Tabell 2
Tabell 2: Antistoffer for ekstra- og intracellulære farging.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den beskrevne fremgangsmåten er en enkel, rask og pålitelig metode for å undersøke NK-cellefunksjoner fra fullblodprøver fra friske donorer eller pasienter. Denne metoden har den store fordel for direkte å rense NK-celler fra helblod, unngår den tidkrevende tetthetsgradient-sentrifugering, noe som er obligatorisk for mange andre rensemetoder 15. Dessuten krever det en mindre utvalgsstørrelse i forhold til "klassisk" NK celle isolasjon / berikelse metoder, noe som gjør det til et egnet alternativ for prøver av barn og / eller immun-mangel pasienter. Denne protokollen kan bli benyttet for å oppnå basale verdier av NK cellefunksjoner ex vivo, men det tillater også den ytterligere NK kultur og vekst, blir på denne måte komplementære med andre fremgangsmåter som tidligere er beskrevet åtte. Likevel noen viktige skritt må tas i betraktning. Siden analysen er basert på ekstra- og intracellulært antistoff flekker, er det viktig å bestemme den optimale working konsentrasjon for hvert antistoff første. Spesielt for den intracellulære flekker, er en nøye vurdering av de benyttede antistoffer sterkt anbefalt. En god tilnærming er å teste en fortynningsserie av den anvendte antistoff (f.eks, 1: 100 til 1: 12,5) i en cellesuspensjon stimulert med eller uten PMA / ionomycin. Deretter forholdet mellom positive hendelser mellom stimulert og un-stimulert prøvene beregnes og plottes. Antistoffet fortynning med den høyeste positive fold endringsforholdet (beste signal-til-bakgrunnsforhold) skal brukes for videre eksperimenter 16. Dessuten kan bruk av kontroller som isotype- og FMO kontroller vise seg å være grunnleggende spesielt for intracellulær farging for å gate riktig på de positive cellepopulasjoner.

Det er imidlertid noen viktige begrensninger ved den beskrevne fremgangsmåten. CD107a uttrykk er en degranulering markør og derfor bare indirekte indikerer NK-celle cytotoksisitet. NK-celle cytotoksisitet ennd degranulation kapasitet kan være annerledes. Oppregulering av autophagy reaksjonsveien i tumorceller resulterer i nedbrytning av utskilt granzyme b og reduserer celledød på NK-celleinteraksjon 17. Derfor er en ytterligere DCM (som spaltes caspase 3) kan bli tilsatt til farging panel for å overvåke celle dødsfall innenfor målcellene 18. I tillegg er NK-celle cytotoksisitet påvirket av mengden av cytotoksiske proteiner i deres granuler (f.eks perforin, granzyme b), som kan kvantifiseres ved en intracellulær farging 19,20.

Videre er det forskjellige muligheter for å modifisere protokollen. Istedenfor isolerte NK-celler, kan perifere mononukleære blodceller (PBMC) benyttes. Selv om man må være klar over at det absolutte NK celle nummer i PBMC befolkningen varierer mellom ulike givere og selv mellom prøver fra samme donor ved ulike tidspunkt. NK celle degranulasjon er svært avhengig av E: T-forhold. For å kunne sammenligne NK-cellefunksjoner mellom ulike givere eller ved forskjellige tidspunkter, benyttes det absolutte NK-celletallet i PBMC-populasjon for å etablere en konstant E: T-forhold i alle eksperimenter. Hvis NK-cellefunksjoner blir overvåket ved forskjellige tidspunkter i løpet av den samme donor, kan PBMC fryses, og analysen kan utføres på en gang for alle forskjellige tidspunkter for å redusere inter-eksperimentelle variasjoner 11.

Etter farging paneler med opp til 18 farger er mulig, kan analyse av NK-cellefunksjoner bli utvidet til en mye større detalj. Ved hjelp av ekstra overflatemarkører inkludert CD57, NKG2A og killer celle immunoglobulin-lignende reseptorer (kirs), kan ytterligere NK celle undergrupper identifiseres. Utdannede NK-celler som uttrykker minst ett selv KIR degranulate sterkere ved interaksjon med K562 celler enn uutdannede NK-celler. I kontrast, mer differensiert CD57 + CD56 + - CD56 + NK-celler 21. I tillegg kan andre markører for NK-cellefunksjonen tas opp. LFA-1 er et viktig molekyl for NK-celle adhesjon og er uttrykt i åpen konformasjon på NK-celleaktivering. Denne såkalte "innsiden ut signal" er en tidlig NK-celleaktivering markør 22.

Endelig kan stimuli for testing av NK-cellefunksjoner endres også. I vår erfaring nylig isolerte NK-celler bare degranulate dårlig på K562 celle interaksjon hvis ingen cytokiner er lagt til. Ved hjelp av nyisolerte PBMC uten ytterligere tilsetning cytokin omgå dette problemet, på grunn av påvirkning av bystander celler. Videre cytokin produksjon, spesielt IFN-γ og TNF-α, kan initieres ved IL-12 og IL-18 stimulering 23. IFN-γ produksjon innenfor NK celle undergrupper kan variere depending av den brukte stimulus (cytokine- versus target-indusert stimulering) 24. I tillegg, i stedet for ved hjelp av K562-celler som målceller, primære tumorceller avledet fra kreftpasienter kan brukes for å teste NK-cellefunksjoner mot autologe tumorceller før eller i løpet av immunmodulerende terapi (for eksempel monoklonale antistoff behandling eller immuno-modulerende medikamenter (IMiDs)).

Innenfor de siste årene, har feltet immunterapi blitt utvikler seg raskt med klinisk godkjenning av immun sjekkpunkt hemmere (f.eks ipilumumab, nivolumumab, pembrolizumab) 25 og vellykkede forsøk med genmodifiserte kimære antigen reseptor (CAR) -expressing T-celler i tillegg som CAR-NK-celler (anmeldt i referanse 26), for behandling av hematologiske kreftpasienter 27. Derfor NK cellebasert immunterapi blir stadig mer i fokus. Anti-CD20 antistoffer har vært en stor suksess i renseanleggnt av maligne lymfomer i løpet av de siste to tiårene 28. De aller fleste av NK-celler uttrykker lave affinitet Fc-reseptor CD16 gjør det mulig for cellene å gjenkjenne og drepe antistoff-merkede målceller (antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet - ADCC). Antistoffets evne til å utløse NK-cellefunksjoner kan testes in vitro ved å bruke den beskrevne protokoll 29. Terszowski et al. Analyserte NK-celler 'ADCC mot et B lymfoblastoid cellelinje ved hjelp av ulike klinisk godkjente anti-CD20-antistoffer. Mens ADCC indusert ved rituximab behandling (første klinisk godkjent anti-CD20 antistoff 30) ble negativt påvirket av KIR / HLA samhandling, denne effekten ble ikke observert ved bruk obinutuzumab (en roman glycoengineered type II CD20 monoklonalt antistoff) 31, 32. Videre er NK celle funksjoner påvirkes av ulike nye anti-tumor legemidler som imid lenalidomid 33 og ulike tyrosin-Kinase-hemmere (TKI) 34. Foreløpig NK celle spesifikke checkpoint-hemmere blir testet i kliniske studier. Eksempler på dette er bruken av anti-KIR 35,36 eller anti-NKG2A antistoffer (NCT02331875) samt aktivering av agonister som en anti-CD137 antistoff (NCT01775631, NCT02110082).

Viktigere, har adoptiv NK-celleoverføring blitt utført på en rekke forskjellige ondartede sykdommer med lovende kliniske effekter 37. Med sikte på å velge den beste donor, kan NK-cellefunksjoner mot pasientens tumor testes in vitro ved bruk av blodprøver fra potensielle NK-celledonorer.

Oppsummert er det beskrevet protokoll utviklet for å analysere ulike NK celle funksjoner fra friske donorer eller pasienter. Disse funksjonene kan overvåkes i ulike NK celle undergrupper på ulike stimuli på utvalgte tidspunkter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 + glutamine Invitrogen 6187-044
penicilin/streptomycin Invitrogen 15140-122
BD Falcon Round Bottom Tube BD 352008
fetal calf serum Invitrogen 10270-106 heat inactivated before use
T-flask Greiner Bio-One 690195
K562 tumor cell line DSMZ GmbH ACC 10
ammonium-chloride-potassium (ACK) lysis buffer made in house / components are listed in the text
Distilled water: Ampuwa Spüllösung 1,000 ml Plastipur Fresenius Kabi 1088813
Megafuge 40R Centrifuge Heraeus /
EDTA blood collector tubes Sarstedt 386453 S-Monovette 7.5 ml, K3EDTA
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Life Technologies 15575-020
Hematopoietic media (XVIVO) Lonza Group Ltd BE04-743Q
human serum DRK Blutspendedienst, Frankfurt/M  / healthy donors with blood type AB; heat inactivated before use
Neubauer-improved counting chamber, bright line Marienfeld superior/ LO-Laboroptik Ltd. 0640030/ 1110000
trypan blue solution (0.4%) Invitrogen 15250-061
3% acetic acid with methylene blue Stemcell Technologies  07060
Corning 96 Well Clear V-Bottom TC-treated Microplates Corning  3894
Falcon 96 Well Round Bottom Not Treated Microplates Corning  351177
DPBS (Ca2+- and Mg2+-free) Gibco Invitrogen 14190-169
BSA Sigma Aldrich A2153-100G
NaN3 Sigma Aldrich 08591-1ML-F
phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)  Merck 524400-1MG
ionomycin  PromoKine PK-CA577-1566-5
interleukin 15 (IL-15) PeproTech 200-15
Proleukin S (IL-2)  Novartis Pharma 730523
Golgi Stop, Protein Transport Inhibitor (containing Monensin) BD Biosciences 554724 This product can be used in combination or instead of Golgi Plug. The best combination for the wished experimental setting has to be tested.
Golgi Plug, Protein Transport Inhibitor (containing Brefeldin A) BD Biosciences 555029
paraformaldehyde AppliChem UN2209
saponin Sigma Aldrich 47036
flow cytometer: Canto10C BD Biosciences /
FlowJo TreeStar Inc. /
Graph Pad Graph Pad Inc. /
MACSxpress Separator Miltenyi Biotec  130-098-308
MACSxpress NK isolation kit Miltenyi Biotec  130-098-185
MACSxpress Erythrocyte Depletion Kit, human Miltenyi Biotec  130-098-196
MACSmix Tube Rotator  Miltenyi Biotec  130-090-753
anti-human CD3 APC Biolegend 300412
anti-human CD3 V450 BD Biosciences 560366
anti-human CD14 PerCP Miltenyi Biotec  130-094-969
anti-human CD14 V450 BD Biosciences 560349
anti-human CD16 PE Biolegend 302008
anti-human CD16 PerCP Biolegend 302029
anti-human CD19 PE-Cy7 Biolegend 302216
anti-human CD19 V450 BD Biosciences 560353
anti-human CD45 BV510 BD Biosciences 563204
anti-human CD56 FITC Biolegend 345811
anti-human CD107a PE Biolegend 328608
anti-human IFN-γ AF-647 BD Biosciences 557729
anti-human MIP-1β APC-H7 BD Biosciences 561280
DAPI Biolegend 422801
Zombie Violet Fixable Viability Kit Biolegend 423113 fixable dead cell marker

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Watzl, C. How to trigger a killer: modulation of natural killer cell reactivity on many levels. Adv Immunol. 124, 137-170 (2014).
  2. Khaznadar, Z., et al. Defective NK Cells in Acute Myeloid Leukemia Patients at Diagnosis Are Associated with Blast Transcriptional Signatures of Immune Evasion. J Immunol. 195 (6), 2580-2590 (2015).
  3. Pical-Izard, C., et al. Reconstitution of natural killer cells in HLA-matched HSCT after reduced-intensity conditioning: impact on clinical outcome. Biol Blood Marrow Transplant. 21 (3), 429-439 (2015).
  4. Ahlenstiel, G., et al. Early changes in natural killer cell function indicate virologic response to interferon therapy for hepatitis C. Gastroenterology. 141 (4), 1231-1239 (2011).
  5. Porrata, L. F., et al. Early lymphocyte recovery predicts superior survival after autologous stem cell transplantation in non-Hodgkin lymphoma: a prospective study. Biol Blood Marrow Transplant. 14 (7), 807-816 (2008).
  6. Silva, I. P., et al. Reversal of NK-cell exhaustion in advanced melanoma by Tim-3 blockade. Cancer Immunol Res. 2 (5), 410-422 (2014).
  7. Kiessling, R., Klein, E., Wigzell, H. "Natural" killer cells in the mouse. I. Cytotoxic cells with specificity for mouse Moloney leukemia cells. Specificity and distribution according to genotype. Eur J Immunol. 5 (2), 112-117 (1975).
  8. Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells. J Vis Exp. (48), (2011).
  9. Mariani, E., et al. Chemokine production by natural killer cells from nonagenarians. Eur J Immunol. 32 (6), 1524-1529 (2002).
  10. Reefman, E., et al. Cytokine secretion is distinct from secretion of cytotoxic granules in NK cells. J Immunol. 184 (9), 4852-4862 (2010).
  11. Jacobs, B., et al. NK Cell Subgroups, Phenotype, and Functions After Autologous Stem Cell Transplantation. Front. Immunol. 6, 583 (2015).
  12. Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. J Immunol Methods. 294 (1-2), 15-22 (2004).
  13. Theorell, J., et al. Sensitive and viable quantification of inside-out signals for LFA-1 activation in human cytotoxic lymphocytes by flow cytometry. J Immunol Methods. 366 (1-2), 106-118 (2011).
  14. Brander, C., et al. Inhibition of human NK cell-mediated cytotoxicity by exposure to ammonium chloride. J Immunol Methods. 252 (1-2), 1-14 (2001).
  15. Beeton, C., Chandy, K. G. Enrichment of NK cells from human blood with the RosetteSep kit from StemCell technologies. J Vis Exp. (8), e326 (2007).
  16. Lamoreaux, L., Roederer, M., Koup, R. Intracellular cytokine optimization and standard operating procedure. Nat. Protoc. 1 (3), 1507-1516 (2006).
  17. Baginska, J., et al. Granzyme B degradation by autophagy decreases tumor cell susceptibility to natural killer-mediated lysis under hypoxia. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (43), 17450-17455 (2013).
  18. He, L., et al. A sensitive flow cytometry-based cytotoxic T-lymphocyte assay through detection of cleaved caspase 3 in target cells. J Immunol Methods. 304 (1-2), 43-59 (2005).
  19. Sutton, V. R., et al. Serglycin determines secretory granule repertoire and regulates NK cell and CTL cytotoxicity. FEBS J. 283 (5), 947-961 (2016).
  20. Schönberg, K., Hejazi, M., Uhrberg, M. Protocol for the clonal analysis of NK cell effector functions by multi-parameter flow cytometry. Methods Mol Biol. 903, 381-392 (2012).
  21. Björkström, N. K., et al. Expression patterns of NKG2A, KIR, and CD57 define a process of CD56dim NK-cell differentiation uncoupled from NK-cell education. Blood. 116 (19), 3853-3864 (2010).
  22. Bryceson, Y. T., Ljunggren, H. G., Long, E. O. Minimal requirement for induction of natural cytotoxicity and intersection of activation signals by inhibitory receptors. Blood. 114 (13), 2657-2666 (2009).
  23. Cooper, M. A., et al. Human natural killer cells: a unique innate immunoregulatory role for the CD56(bright) subset. Blood. 97 (10), 3146-3151 (2001).
  24. Fauriat, C., Long, E. O., Ljunggren, H. G., Bryceson, Y. T. Regulation of human NK-cell cytokine and chemokine production by target cell recognition. Blood. 115 (11), 2167-2176 (2010).
  25. Postow, M. A., Callahan, M. K., Wolchok, J. D. Immune Checkpoint Blockade in Cancer Therapy. J Clin Oncol. 33 (17), 1974-1982 (2015).
  26. Glienke, W., et al. Advantages and applications of CAR-expressing natural killer cells. Front Pharmacol. 6, 21 (2015).
  27. Curran, K. J., Brentjens, R. J. Chimeric antigen receptor T cells for cancer immunotherapy. J Clin Oncol. 33 (15), 1703-1706 (2015).
  28. Zappasodi, R., de Braud, F., Di Nicola, M. Lymphoma Immunotherapy: Current Status. Front. Immunol. 6, 448 (2015).
  29. Laprevotte, E., et al. Endogenous IL-8 acts as a CD16 co-activator for natural killer-mediated anti-CD20 B cell depletion in chronic lymphocytic leukemia. Leuk Res. 37 (4), 440-446 (2013).
  30. Maloney, D. G., et al. IDEC-C2B8 (Rituximab) anti-CD20 monoclonal antibody therapy in patients with relapsed low-grade non-Hodgkin's lymphoma. Blood. 90 (6), 2188-2195 (1997).
  31. Salles, G., et al. Phase 1 study results of the type II glycoengineered humanized anti-CD20 monoclonal antibody obinutuzumab (GA101) in B-cell lymphoma patients. Blood. 119 (22), 5126-5132 (2012).
  32. Terszowski, G., Klein, C., Stern, M. KIR/HLA interactions negatively affect rituximab- but not GA101 (obinutuzumab)-induced antibody-dependent cellular cytotoxicity. J Immunol. 192 (12), 5618-5624 (2014).
  33. Hsu, A. K., et al. The immunostimulatory effect of lenalidomide on NK-cell function is profoundly inhibited by concurrent dexamethasone therapy. Blood. 117 (5), 1605-1613 (2011).
  34. Salih, J., et al. The BCR/ABL-inhibitors imatinib, nilotinib and dasatinib differentially affect NK cell reactivity. Int J Cancer. 127 (9), 2119-2128 (2010).
  35. Benson, D. M., et al. A phase 1 trial of the anti-KIR antibody IPH2101 in patients with relapsed/refractory multiple myeloma. Blood. 120 (22), 4324-4333 (2012).
  36. Vey, N., et al. A phase 1 trial of the anti-inhibitory KIR mAb IPH2101 for AML in complete remission. Blood. 120 (22), 4317-4323 (2012).
  37. Terme, M., Ullrich, E., Delahaye, N. F., Chaput, N., Zitvogel, L. Natural killer cell-directed therapies: moving from unexpected results to successful strategies. Nat Immunol. 9 (5), 486-494 (2008).

Tags

Immunologi NK-celler CD107a cytotoksisitet funksjon IFN-y MIP-1B K562 celler
Flowcytometri basert analyse for overvåking av NK cellefunksjoner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, … More

Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, N., Ullrich, E. Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions. J. Vis. Exp. (116), e54615, doi:10.3791/54615 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter