Introduction
ブドウ （ 黄色ブドウ球菌）は、牛1における乳房内感染（IMI）のための世界的な責任を最も重要な病原体として知られています。欧州12カ国というの牛でCosandey ら 3及びボスら 4によりフルニエら 2スイス牛で実証・研究による研究S.ウシIMIから分離された黄色ブドウ球菌は、遺伝的に不均一な群です。 16S-23S rRNAの遺伝子間スペーサー領域のPCR増幅（RS-PCR）により、17遺伝子型の合計は、最初に101疫学的に独立した単離物2で検出されました。他の15の遺伝子型（GTS）は、各すべての分離株の1〜4％を作り、まれに発生していないのに対し、遺伝子型Bと遺伝子型C（GTC）は、（80％）が最も一般的でした。欧州レベル3では、GTBは、GTCは、GTF、GTI、およびGTRは、すべての分析株（N = 456）の76％を含む、最も重要な遺伝子型でした。 GTBは、ワット中央ヨーロッパに位置していましたhereas他の遺伝子型は、広く普及しました。株の残りの24％は41の遺伝子型が含まれ、それらの多くは、しかし、一度のみ観察されました。
フルニエ者らの研究ら 2、Cosandey ら 3、及びグラバーら 5は、さらに、遺伝子型が非常に欧州レベルでのように、スイスで、ならびに、それらの病原性遺伝子のパターンと関連していたことを実証しました。研究はさらにS.間のIMIの有病率の大幅な違いを明らかにしました球菌 GTB、GTCおよび他の遺伝子型2,5：GTB考慮して、群れでの牛の87％までは、この遺伝子型に感染していました。 GTCのと他の遺伝子型の場合には、しかし、IMIは唯一の群れの1〜2頭の牛に認められました。
IMI S.によって引き起こされます黄色ブドウ球菌は 、通常、対応する乳腺の炎症および乳中の炎症細胞の増加をもたらします。その結果、体細胞の共同乳中のunts（SCC）、ほとんどの国で乳質の重要な指標は、減少した牛乳の価格、あるいは配信停止につながる増加されます。
フルニエら 2のRS-PCRに加えて、他のタイプの方法は、Sのウシ株サブタイプについて記載されています球菌 8-11。 2つの一般的なものは、 スパタイピング 12と多座配列タイピング（MLST）13が含まれます。後者の1が7ハウスキーピング遺伝子の塩基配列決定を必要とするのに対し、前者は、プロテインAのブドウ球菌スパコードする遺伝子の可変スペーサー領域の配列を決定するDNAに基づいています。これは、1つの12および7のPCR 13は 、それぞれ、特定の装置を使用してアンプリコンの精製、配列決定反応及び分析を行い、実行する必要があることを意味します。 RS-PCRと比較すると、これらの方法は、低いサンプルスループットと高いコストが生じ、実験室にかなりの付加的な努力を必要とします。ザスループットは、PFGEのために特に低いです。 S.のウシの株について、これらの方法の解像度を考慮すると黄色ブドウ球菌 、RS-PCRは、少なくともMLST 4またはPFGE 15より4、より良いと入力し、スパと同じくらい良いです。
バイナリタイピング13を含むすべてのこれらの方法は、Sによって引き起こされるウシIMIの病因にさらなる洞察を得ることにその有効性を実証しました黄色ブドウ球菌 、しかし理由述べた制限の彼らは、大規模な臨床研究にはあまり適しています。また、RS-PCRによる遺伝子型決定フルニエらによって記載されているように2は 、疫学的及びS.の病原性の可能性のある信頼性の高い予測を可能にしますウシIMIに関与球菌 、臨床獣医学における2のキー値。
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Protocol
1. 黄色ブドウ球菌分離株
- S.10μlのスプレッド黄色ブドウ球菌株培養または1つのコロニーを5％ヒツジ血液（BA）を含むコロンビア寒天プレート上で選択培地上で増殖させました。
- 24時間〜18時間、37℃で好気的に培養します。
2. DNA抽出
- 10 mMトリス-塩酸および10mMのNa 2 EDTA、pHが8.5を含むTELバッファを準備します。 15分間、121℃でアリコートし、オートクレーブを準備します。
- 100μlのTELに滅菌プラスチックループまたは滅菌木製の歯のピックと再懸濁を使用して、BAから1コロニーを収集します。スクリューキャップで1.5ミリリットルチューブを使用してください。
- 10分間95℃でインキュベートします。その後、濡れた氷の上にすぐにサンプルを置きます。
- PCR（PCR用=鋳型DNA）に適したH 2 Oで100：サンプル1を希釈します。非希釈し、希釈した試料を1ヶ月間-20℃で保存することができます。
3. RS-PCR
- 標準的なPCRサイクラーで以下のサイクリングプログラムを実行します。7分間55℃で2分間ランプアニールに続いて1分間94°Cを含有する27サイクル、続いて15分95°C、。さらに2分勾配後、2分間72℃で延びています。 4℃に冷却し、続いて72℃で10分間の最終伸長によってPCRを終了します。
注：PCR産物は、5日間20℃で保存することができます。 - RS-PCRの各実行のために知られて遺伝子型（通常はGTB）とポジティブコントロール、 すなわち、サンプル、およびネガティブコントロール（H 2 O）が含まれます。
4.電気泳動
- 一緒にDNAのための市販の小型化電気泳動キット（MEDキット）を使用しますPCおよびインストールされたソフトウェアに接続されているバイオアナライザと。慎重に、メーカーの対応マニュアルを研究しています。
- チッププライミングステーションを設定し、製造業者の説明書に従ってシリンジクリップを調整します。
- 製造業者の説明書に従ってゲル - 色素ミックスを調製します。
- （製造業者の説明書に従って）ゲル - 色素ミックスをロードします。
- 使用前に30分間RTにゲル染料ミックスを平衡化します。
- チッププライミングステーション上の新たなDNAチップを置きます。よくマークされG.中のゲル - 色素のピペット9μlの
- プランジャが1ミリリットルに配置されていることを確認した後、チッププライミングステーションを閉じます。それは、シリンジクリップで固定されるまで押しプランジャ。 30秒後、シリンジクリップを解放するために正確に待ちます。
- 5秒間待ってください。ゆっくりと1ミリリットルの位置にプランジャーを引き戻します。
- 両方のウェル中のゲル色素のオープンチッププライミングステーションとピペット9μlを「G」をマークしました。
- Mのロードarker
- 全12サンプルウェル中、よくはしご中のマーカーのピペットを5μl。空のこれらの13のウェルのいずれかのままにしないでください。
- ラダーとサンプルをロードします。
- ラダー記号をよくマークさにDNAラダーのピペット1μlの。
- サンプルのピペット1μlの（使用のウェル）または脱イオン水（未使用井戸）の1μlの。
- 2400 rpmで1分間アダプタと渦に水平にチップを置きます。
- 5分以内にバイオアナライザーでチップを実行します。
- 分析の実行
- バイオアナライザーと接続されたコンピュータを起動します。ソフトウェアを開きます。
- バイオアナライザのふたを開け、（チップは一方向にしかフィット）チップホルダーにチップを置きます。慎重に蓋を閉じます。
- ソフトウェアのインストゥルメントの文脈では、「電気泳動">"のdsDNA ">" DNA 7500 "を選択します。ソフトウェアの現在のファイルの接頭辞を受け入れるか、またはそれを変更します。
- ソフトウェアに存在するスタートボタンをクリックします。ソフトウェアでサンプル名を入力します。チップの実行が終了すると（後に約30分） を実行し 、メッセージの終了は、バイオアナライザーソフトウェアに表示されます。
- 製造業者の指示に従ってチップを取り外し、バイオアナライザーの電極を清掃してください。
5.電気泳動プロファイルから遺伝子型の推定
- （ソフトウェアは作者から自由に利用可能です）・マハルのソフトウェアをロードします。
- マハルソフトにインポートする参照データ：「ファイル」>「インポート参考データ」
- バイオアナライザソフトウェアのデータコンテキストで実行電気泳動を開きます。 1サンプルの電気泳動プロファイルを選択します。
- 関連するピークを確認してください。
- 「ツール」>「平均蛍光」：関連するピークを確認するためにマハルソフトウェアを使用してください。 「蛍光」ボックスに挿入します蛍光値は、それらがバイオアナライザーソフトウェアから読み出すことができるように蛍光単位（FU）として示されます。昇順で最も高い蛍光を有する4（3）ピークを挿入し、カンマで区切られています。例：126130132137。
注：すべてのこれらのピークのFUのは、バイオアナライザーソフトウェアによって示されている場合、それらはプロットからそれらを読み出すことによって推定される必要があります。
- 「ツール」>「平均蛍光」：関連するピークを確認するためにマハルソフトウェアを使用してください。 「蛍光」ボックスに挿入します蛍光値は、それらがバイオアナライザーソフトウェアから読み出すことができるように蛍光単位（FU）として示されます。昇順で最も高い蛍光を有する4（3）ピークを挿入し、カンマで区切られています。例：126130132137。
- 「計算する」ボタンを押してください。観察された蛍光は、ボックス「最小ピーク高さ」で指定された値を超えた場合にピークが関連しています。
- 遺伝子型を推論します。
- 昇順にマハルのテキストボックス「入力ピークス（bp）の「すべての関連のピークの塩基対での大きさに挿入し、カンマで区切られています。例：440,462,519,579,637。
注：これらのピークの大きさの全てではないが、バイオアナライザーソフトウェアによって示されている場合、それらはプロットからそれらを読み出すことによって推定される必要があります。
- 昇順にマハルのテキストボックス「入力ピークス（bp）の「すべての関連のピークの塩基対での大きさに挿入し、カンマで区切られています。例：440,462,519,579,637。
- 「計算する」ボタンを押してください。
- リストでボックスには、最小限の二乗マハラノビス距離 "D2M」を探してください。それは≥0.05ある右に対応するP値は、その後確率は帰無仮説H 0が拒否されたこと≥5％である場合には（H 0：観察された基準プロファイルは同一である）が観察されたプロファイルが同じであることが認められていることを意味します指示された遺伝子型の基準プロファイル。
- D2Mが最小であるが、対応するP値のフィールドが空の場合、確率<5％H 0を棄却。
注：これはD2Mは最小限ですが、プロファイルが等しくないことを意味します。このような結果は、非平均電気泳動条件に起因し得ます。- これらの偏差を補正するために、値395「ピーク（bp）の観測」テキストボックスに挿入し、「計算」ボタンを押してください。最小限のD2Mと対応するP値≥0.05のために再度確認してください。成功しない場合、値は405、415、および425を試してみてください。
注：時々、小さなステップでもあります示されています。 、観察されたプロファイルが参照データには存在しない成功していないまだ場合、それは新たな遺伝子型または変異体であってもよいです。
- これらの偏差を補正するために、値395「ピーク（bp）の観測」テキストボックスに挿入し、「計算」ボタンを押してください。最小限のD2Mと対応するP値≥0.05のために再度確認してください。成功しない場合、値は405、415、および425を試してみてください。
- 様々なプロファイル
- 繰り返しますが、別途、各電気泳動プロファイルに対して5.6〜5.9を繰り返します。
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Representative Results
遺伝子型とその変種の定義
すべての識別された遺伝子型から複数の帯域が異なる電気泳動プロファイルが新たな遺伝子型であると考えられます。新しい遺伝子型に名前を付けて拡張フルニエらによると。5 GTZにGTAの遺伝子型につながる、GTBZに遺伝子型GTAZにGTAA、およびGTBAが続き、現在ではGTCCにGTCAされています。ただ一つのバンドの変化は、遺伝子型の変異体とみなされます。これは、遺伝子型（ 例えば、GTRI、GTRII）の名の後に上付きローマ数字で示されています。全体で、参照データベース141の遺伝子型及び変異体は、現在存在しています。
上記で概説した条件下では、フルニエらによるRS-PCRを。5 S.の株の遺伝子型を決定することは非常に再現性があります黄色ブドウ球菌 。の最終的な同定技術的な問題を排除することができれば、既知の遺伝子型または変異体は常に可能です。典型的な結果は、12 RS-PCR産物の電気泳動を示す図1に提示され、バイオアナライザーソフトウェアによって疑似ゲルモードで提示されます。各レーンは、末端に2つ以上のPCRバンドのパターンと前にマーカーバンド及びマーカーバンドによって特徴付けられます。レーンにダブルクリックすると、別のウィンドウに対応し、実際に測定された電気泳動プロファイルを開きます。バイオアナライザーソフトウェアが観察されたピークは、1つのピークは、疑似ゲルモードで正確に1つのバンドに対応できる（ 図3）の蛍光単位FUなどのサイズ（ 図2）または塩基対で読み出され、他の可能性の中で、可能にします。 FUのピーク読み取りは、遺伝子型を推定するための塩基対で読み、マハルソフトウェア（ 図4）でプロファイルの関連するピークを評価するために必要とされます。無関係なピークは小さなエンドウ豆などマハルソフトウェアで定義されていますその観測される蛍光FU KSが最も高い蛍光を有する4（3）ピークの幾何平均の40％を下回っています。 RS-PCR（> 30は、純粋なDNA /アッセイNG）2でDNAの過剰が存在する場合、それらは、通常観察されます。
一例として、 図1のサンプル211に存在する遺伝子型が推測されます。無関係なピークをテストするためのツールを使用してマハルソフトウェアとの電気泳動図2のプロファイル（バイオアナライザソフトウェア）および分析の視覚分析は、395塩基対、432塩基対、453塩基対、505塩基対、567塩基対のピークサイズの6該当するピークを明らかにしました622塩基対（ 図3）。これらの値は、中に充填し、テキストボックス「入力ピークス（bp）の「マハルソフトウェアの（ 図4）にカンマで区切られます。ラン固有のずれを補正するために、値415は「ピーク観測（bp）の「テキストボックス（ 図4）に挿入しました。 "Cを押した後alculate」ボタン、リストが一緒に照会し、示された遺伝子型プロファイル間の二乗マハラノビス距離D2Mと遺伝子型によって順序付け提示されている。最小限のD2Mを探してリストをスクロールします。この場合、最小限のD2Mは4.499に等しい（ 図4）と照会プロファイルが大幅にGTBの1異ならないことを意味P≥0.05の値は、。
遺伝子型の変異体は、マハルソフトウェアで_XVする_Iとして示されています。遺伝子型Bの場合には、3つの変種GBT I、GBT II、およびGBT IIIは B_I、B_II、およびソフトウェアでB_III（ 図4）のようにそこに示されています。
MEDキットのチップは、一度に12 RS-PCRの産物を分析できます。以下の製品が用意されていた場合は、残りのウェルを脱イオン水でロードする必要があります。結果は、コントロールだけあれば解釈することができる私RS-PCRでncluded適切です。
12 RS-PCR産物とその推定された遺伝子型を表す図1.擬似ゲル。S.の12の異なる株黄色ブドウ球菌は、バイオアナライザーおよび付属のソフトウェアと共にMEDキットを使用してRS-PCRによって分析しました。左側のレーンは塩基対でのシステムのサイズ較正のためのマーカーまたは「はしご」を示しています。マハルソフトウェアによって得られたグラフィックス、サンプル名と、対応する遺伝子型が起訴されているの上に。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
SAの 図2. 電気泳動プロフィール測定された蛍光がFUに示されるピークの上部に図1のmple 161存在。バイオアナライザーソフトウェアによって検出されなかった、視覚的に区別可能なピークが。（青）113 FUの推定蛍光値でピークを行っとしてプロットからそれらを読み出すことにより推定される必要があり、このの拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。図。
図3.そのサイズはBPで示されたピークの上部には、図1に存在するサンプル211の電気泳動プロファイル 。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
マハルソフトウェアの 図4. スクリーンショット。テキストボックス「入力ピークス（BP）」は、図3からのサンプル211のピークサイズが充填されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
RS-PCR（> 30純粋なDNA /アッセイをNG）におけるDNAの過剰がある場合手順全体の最も重要なステップがある2。そのすべてのピークがベースラインから始まり、最後ならば一般的には、プロファイルの解像度が最適です。 2つのピークが一緒に近すぎる場合は、解像度が不完全です。手動識別が必要とされるように、これらの条件下では、バイオアナライザーソフトウェアが不適切なピーク同定につながり得ます。
BPまたはFUとして表現すべて目に見えて分離し、関連するピークは、さらなる分析のために含まれています。ピークの重なりや減損解像度をピークまでのRS-PCRの結果のためにあまりにも多くの鋳型DNA広いピークで、したがって。また、移行は遺伝子型がもはや推論されることがないように、誤って増加しているピークのサイズに遅い有力です。最後に、無関係なピークの数が大きいです。以上の3つのピークを持つプロファイルの場合、最大蛍光を有するピークは、通常150 FUを超えてはなりません。
機械への投資が必要で、無料マハルソフトウェアが必要であるという事実によって制限されている記載されているように、RS-PCRによるジェノタイピング。実際には、標準的なPCR機、バイオアナライザが必要とされています。後者はより高価であるのに対し、前者は、今日ではかなり安いです。アガロースベースの電気泳動の解像度は、高解像度のアガロースを使用しても十分ではありません。これらの条件下ではGTB、GTC、及び、他の全ての遺伝子型を区別することだけが可能です。 MEDキットまたはアガロース電気泳動を用いて電気泳動するためのコストは、しかし、似ています。さらにバイオアナライザと一緒にMEDキットはまっすぐ進む、後者の方法が便利であることのように標準的なアガロース電気泳動を凌駕し、得られたデータは、かなりのストレージ、さらに分析を簡素化し、電子形式で存在しています。原則として全ての市販のbioanalyzersは、このタイプの分析に適しているelectrophoretことを提供IC解像度が適切であるとのバンドの得られるサイズは、正確かつ公平です。
S.のウシ株のためのRS-PCRの解像度黄色ブドウ球菌は高いです。それは、 スパタイピングと同様に良好であり、MLSTとPFGE 4,14よりも良いです。また、一般的にサブタイプS.のために使用される他のすべてのタイピング法に比べ96サンプルは1 RCRの（通常はO / N）実行し、電気泳動で処理することができ、DNAの抽出が容易と高速であり、遺伝子型推論は単純です： 黄色ブドウ球菌 （ スパタイピング 、MLST、PFGE）は、そのサンプルのスループットが高いです。 96サンプルの完全な分析は、PCRのために1泊電気泳動および評価のために1日を必要とします。フルニエら 2によるRS-PCRの他の利点は、両方の方向15に配列決定される7つの遺伝子を必要とMLSTに比べ、特に低コストです。また、RS-PCRは、株の伝播性や病原性を予測する唯一の方法であり、ウシ乳房炎2,5に関与黄色ブドウ球菌 、臨床獣医学における重要な予測因子。最後に、RS-PCRは、単独で、ウシS.の疫学を研究するのに十分です球菌 3,4,5,14。唯一のいくつかの主要な遺伝子型は2,3を観察しているように、データの解釈があっても国際的な文脈でまっすぐです。後者の方法は、広く多くのデータが利用可能であるように、人間の株をサブタイピングのために使用されるようにウシおよびヒトの株、RS-PCR、 スパタイピング間の疫学的な比較のために一緒に好適です。 MLSTは、しかしながら、株15のクローン性を評価するために適しており、系統4を分析します 。
PCRサイクラー、MEDキット、およびバイオアナライザーに関するトラブルシューティングについては、対応するマニュアルはご相談ください。適切な陽性および陰性PCR対照が株式会社である場合に、RS-PCR法の場合には、トラブルシューティングを大量に簡略化されます各実行でluded。陽性コントロールが負の場合、PCR混合物は、適切に構成および/またはコントロールDNAが分解されたされませんでした。陰性対照（H 2 O）は、一つ以上のバンドを生成した場合、PCRミックスは、いくつかのDNAが混入していました。両方の場合において、プロファイルは解釈されてはならず、RS-PCRを繰り返す必要があります。解釈があるため、電気泳動問題で不可能な場合、電気泳動は、新しいチップを使用して繰り返す必要があります。電気泳動の問題は通常、不適切な移行と1の配向や不適切なロードとチップの操作に起因する両方のマーカーバンドを特徴とします。得られた電気泳動プロファイルがMahalのソフトウェアによって解釈することができない場合は、バイオアナライザーソフトウェアによって生成されたプロファイル・ファイルは、さらなる評価のために作成者に送信されます。 RS-PCRまたはプロファイルが新たな遺伝子型または遺伝子型変異体を表すために、通常、あまりにも多くの鋳型DNAを用いました。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethan | Merck | 1.08382.0500 | Mw = 121.14 g/mol |
| Titriplex III | Merck | 1.08418.0250 | Mw = 372.24 g/mol; Substance is equivalent to Na2EDTA·2H2O |
| Hydrochloric acid 5 mol/L | Merck | 1.09911.0001 | |
| Columbia agar+5% sheep blood | bioMérieux | 43049 | |
| Agilent DNA7500 Kit | Agilent Technologies | 5067-1504 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2940CA | |
| Agilent 2100 expert sofware | Agilent Technologies | ||
| HotStarTaq master mix | Qiagen | 203445 | |
| Primer L1 | Mycrosinth | 5'CAA GGC ATC CAC CGT3' | |
| Primer G1 | Mycrosinth | 5'GAA GTC GTA ACA AGG3' |
References
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