Introduction
Transductie-transplantatie is een bruikbare methode voor hematologische maligniteiten model bij muizen. Deze techniek is bijzonder waardevol voor het bestuderen van myeloïde maligniteiten die teruggaat tot de eerste demonstratie dat ectopische expressie van BCR-ABL1 trouw kon recapituleren chronische myeloïde leukemie in muizen 1 geweest. Deze techniek is vervolgens vergemakkelijkt de uitgebreide studie van JAK2 V617F en MPL W515K / L gemuteerd myeloproliferatieve aandoening (MPN).
MPN zijn een groep van hematologische kwaadaardigheden welke door de overproductie van rijpe myeloïde cellen en beenmerg fibrose. Deze ziekten meestal voort uit de klonale expansie van een hematopoietische stamcel die een somatische mutatie in beide Jak2, MPL of CALr heeft verworven. Transductie-transplantatie JAK2 V617F en MPL W515K / L-modellen vertonen de klinische kenmerken van polycytemie vera en myelofibrosis 2-5 </ Sup>. Onlangs heeft een muismodel van calreticuline gemuteerde MPN is ook gemaakt met de transductie-transplantatie methode 6. Deze muizen ontwikkelen een essentiële trombocytemie-achtige ziekte met verhoogde bloedplaatjes, verhoogd aantal megakaryocyten en beenmerg fibrose. Samen hebben deze modellen niet alleen de gelegenheid om inzicht te krijgen in de moleculaire pathogenese van MPN, maar ook het vermogen ontwikkelen en therapie te bestuderen in een pre-klinische setting.
Dit manuscript geeft een gedetailleerde beschrijving van transductie-transplantatie methode met een focus op de CALRdel52 mutatie. Deze techniek houdt transplantatie van retroviraal getransduceerde beenmergcellen expressie het mutante construct in bestraalde syngene ontvangende muizen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deze studie werd goedgekeurd en uitgevoerd in overeenstemming met de aanbevelingen van de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de Universiteit van Californië, Irvine uitgevoerd. Alle procedures werden uitgevoerd onder isofluraananesthesie en alle inspanningen werden gedaan om het lijden te minimaliseren.
1. Generatie van ecotrope retrovirus
- Bereid hoogwaardige plasmiden met een concentratie van ten minste 1 ug / ul met behulp van een commercieel maxi-prep kit of cesiumchloride zuivering.
Opmerking: Deze omvatten een MSCV hoofdketen vector coderend voor het gen van belang (hier CALr 7,8) en teller keuze (GFP, Neo, etc.) en een ecotropische inpak plasmide, coderend voor gag-pol-env (bedoelde hier plasmide). - Ontdooien en uitbreiding weinig overgezette 293T cellen in DMEM gesupplementeerd met 10% FBS en L-glutamine met penicilline / streptomycine (D10). Plate 5 x 10 6 cellen in een 10 cm weefselkweek behandeld schotel in een vochtigeweefselkweek incubator bij 37 ° C en 5% CO2.
- Uitbreiden 293T-cellen in de cultuur. De dag voor transfectie, wassen cellen door toevoeging van 1 ml PBS en zuig supernatant in een vacuüm kolf.
- Cellen trypsinize, voeg 2 ml 0,05% trypsine en incubeer gerechten in een bevochtigde weefselcultuur incubator gedurende 2-3 minuten bij 37 ° C en 5% CO2.
- Om behandeling met trypsine te stoppen, voeg 3 ml D10 voor te schotelen en overdracht cellen om een 15 ml conische buis. Spin cellen bij 400 xg gedurende 10 min.
- Zuig supernatant in een vacuüm kolf en resuspendeer celpellet in 2 ml D10.
- Tel de cellen met behulp van trypan blauw exclusie onder toepassing van een hemocytometer.
- Seed 2 x 10 6 cellen per schaaltje in drie 10 cm weefselkweek behandeld gerechten per virus gegenereerd.
OPMERKING: Voor een optimaal resultaat, niet toestaan dat de cellen tot 30 hoger is dan - 50% samenvloeiing op het moment van transfectie of een slechte virus opbrengst kan worden verkregen. - Onmiddellijk voor transfectieaspireren media in een vacuüm kolf en te vervangen door 5 ml vers D10.
- Voor elke 10 cm Petrischaal te transfecteren bereiden individuele steriele 1,5 ml microcentrifugebuis.
- Pipetteer 760 ul gereduceerd serum medium in elk microcentrifugebuis, dan wordt voorzichtig 40 pl transfectiereagens direct in het medium. Incubeer de buizen in weefselkweek kap bij kamertemperatuur gedurende 5 min.
- Voeg 30 ug MSCV vector met gen van interesse (15 ug bij gebruik lege vector) en 5 ug plasmide aan elke respectieve buis en meng voorzichtig op en neer te pipetteren. Incubeer bij kamertemperatuur in weefselkweek kap gedurende nog 15 min.
OPMERKING: Kleinere vectoren hebben de neiging om een hogere virale opbrengsten hebben. - Voeg voorzichtig het totale volume van elke reactie (ongeveer 800 ui) druppelsgewijs in zijn respectievelijke 10 cm petrischaal en zachtjes kantelt de schaal van links naar rechts om te mengen. Terug cellen aan de bevochtigde weefsel culture incubator.
- Na 8 uur of overnacht incuberen in weefselkweek incubator, aspiraat media in een vacuüm fles en voorzichtig vervangen door 10 ml vers D10.
- Op 48 uur na transfectie supernatant te verzamelen in een 35 ml spuit en filtreer door een 0,45 urn membraan celresten te verwijderen.
- OPTIE: Plaats 10 ml vers D10 terug op de 293T-cellen en aanvullende virus kan worden geoogst 72 uur na transfectie.
- Gooi 293T-cellen in biologisch gevaarlijk afval als er geen extra virus wordt verzameld.
- Aliquot virale supernatant in voor eenmalig gebruik volumes (bijvoorbeeld 1 ml voor virustiter of 6,5 ml voor BM-infectie). Flash-freeze virus met vloeibare stikstof en opslag virus bij -80 ° C.
LET OP: Vermijd herhaalde vries / dooicycli als zij zeer virustiter te verminderen.
2. Bepaal Relatieve virale titer door flowcytometrie
- 3T3 cellen ontdooien en handhaven D10. Cultuur van de cellen in een 10 cmweefselkweek behandelde schotel in een bevochtigde weefselcultuur incubator bij 37 ° C en 5% CO2.
- Uitvoeren virale titer in drievoud. Om cellen te bereiden, wassen cellen door het toevoegen van 1 ml PBS en zuig supernatant in een thermoskan.
- Cellen trypsinize, voeg 2 ml 0,05% trypsine en incubeer gerechten in een bevochtigde weefselcultuur incubator bij 37 ° C en 5% CO2.
- Om behandeling met trypsine te stoppen, voeg 3 ml D10 voor te schotelen en overdracht cellen om een 15 ml conische buis. Spin cellen bij 400 xg gedurende 10 min.
- Zuig supernatant in een vacuüm kolf en resuspendeer celpellet in 2 ml D10.
- Tel de cellen met behulp van trypan blauw exclusie onder toepassing van een hemocytometer.
- Zaad 3T3 cellen bij een dichtheid van 1 x 10 5 cellen in vijftien 60 mm weefselkweek behandelde gerechten en incubeer overnacht.
- Maak 1: 3, 1:10, 1:30 en 1: 100 verdunningen van ontdooide virale supernatant middels D10 in een totaal van 1 ml. Ook een virus-vrij controle.
- aspireren media van 3T3 cellen in een vacuüm kolf en vervangen door 4 ml D10.
- Overlay de 3T3 cellen met verdunningen van virale supernatant en voeg polybreen tot een eindconcentratie van 8 ug / ml elk gerecht. Incubeer gedurende 48 uur in de weefselkweek incubator bij 37 ° C en 5% CO2.
- Bepaal relatieve virale titer met stroomcytometrie:
- Om de cellen te wassen, zuigen de media in een vacuüm kolf en voeg 5 ml PBS.
- Zuig het PBS in een thermoskan. Voeg 1 ml 0,05% trypsine en incubeer bij 37 ° C gedurende 2-5 minuten om cellen los van de schotel.
- Voeg 3 ml D10 en pipet op en neer om alle resterende cellen van de plaat los te maken. Breng de cellen een FACS buis en centrifugeer bij 400 xg gedurende 10 min.
- Decanteer supernatant en was cellen met 3 ml PBS. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 10 min en decanteren supernatant. Resuspendeer in 200 ul PBS.
- Run cellen op een flowcytometer 9. Verzamel tussen de 20.000 - 30.000 events binnen tHij woont cel gate (bepaald door FSC vs. SSC) en bereken het percentage van de GFP + en GFP - cellen.
OPMERKING: De virale titer wordt aanvaardbaar geacht wanneer de 1:30 verdunning van viraal supernatant opbrengst minimaal 50% GFP + 3T3 cellen. Als deze verdunning geeft minder dan 50% GFP + cellen vervolgens suboptimale transductie resultaten kunnen worden verkregen. De berekening van virale titer te bepalen werd aangepast van Limon et al. , Blood (1997) 9. - Relatieve virus titer te bepalen, gebruik maken van de vergelijking: virus titer = deeltje eenheden (PFU) / ml = [(Aantal 3T3 Cellen × frequentie van GFP + cellen) / Volume van Supernatant (ml)] × Verdunningfactor.
3. transduceren Donor Bone Marrow Cells
- Om donor muizen voor het beenmerg te bereiden (BM) oogst, eerst verdoven muizen door isofluraan vaporizer met een debiet van 5% gecombineerde supplementairezuurstof bij 1 l / min. Knijp voet naar responsiviteit te beoordelen.
OPMERKING: Donormuizen (minder dan 8 weken oud) worden bereid 5 dagen voorafgaand aan beenmerg oogst (8 dagen voorafgaand aan de transplantatie). Één donor muizen genoeg cellen minstens 2 ontvangers. - Injecteren 150 mg / kg 5-fluorouracil (5-FU) via retro-orbitale injectie in verdoofde muizen met behulp van een 27 G x ½ "naald.
VOORZICHTIGHEID! 5-FU een anti-kanker chemotherapeutisch middel. handvat 5-FU altijd in een gecertificeerde zuurkast of een getunnelde bioveiligheid kast. Neem contact op met het laboratorium en dierlijke veiligheid commissie van de instelling om de juiste etikettering van muizen behandeld met 5-FU te bepalen.- Plaats de verdoofde muis op zijn kant en beperken door zowel de duim en wijsvinger, zodat de gaten enigszins uitsteekt uit de kop.
- Te beginnen met de naald lateraal van de mediale ooghoek en met de schuine kant naar boven, steek de naald op een 45° hoek in het mediale richting en stopt wanneer de naald half ingebracht. Langzaam injecteren cellen en verwijderen verwijder voorzichtig de naald.
LET OP: Als deze techniek correct wordt uitgevoerd, moet het oog iets terug te trekken en er geen weerstand moet op de naald inbrengen worden gevoeld. - Onderzoek muis op tekenen van schade zoals zwelling of bloeding.
- Oogst beenmerg 5 dagen na 5-FU behandeling (3 dagen voorafgaand aan de transplantatie).
- Verdoven muizen met isofluraan vaporizer met een stroomsnelheid van 5% gecombineerde extra zuurstof bij 1 l / min. Knijp voet naar responsiviteit te beoordelen.
- Sacrifice muis door cervicale dislocatie. Steriliseren muis door royaal besproeien met 70% EtOH totdat vacht nat wordt.
- Gebruik ontleden schaar, een insnijding in de huid en fascia ontleden de weg van de beenspieren. Vervolgens ontleden het been uit de buurt van de muis door het scheiden van het dijbeen op de heup en het scheenbeen bij de enkel.
- Bochthet been in een "L" vorm en scheiden elke poot bot door te snijden bij het kniegewricht met het ontleden van een schaar.
- Kraakbeen bij de distale einden van elk been bot verwijderen met het ontleden schaar om voorzichtig schrapen de spieren in de richting van het ene uiteinde van het been bot totdat het kraakbeen is uitgeschakeld.
- Met behulp van een spuit met een 27 G x ½ inch naald, flush elk been bot met PBS aangevuld met 2% FBS meer dan 100 um nylon membraan in een 50 ml conische buis. Flush been tot been wit wordt het aantal cellen geoogst maximaliseren.
- Gebruik de plunjer van een injectiespuit aan cellen mash door het nylon membraan in de 50 ml conische buis om een enkele celsuspensie te verkrijgen. Herhaal dit met andere muis been.
- Centrifugeer cellen bij 4 ° C gedurende 10 min bij 400 xg en verwijder het supernatant. Resuspendeer BM in 5 ml ammoniumchloride kalium (ACK) buffer om rode bloedcellen te lyseren. Incubeer cellen op ijs gedurende 10 min.
- Vulbuis met PBS om cellysis te stoppen. Centrifuge cellen bij 4 ° C gedurende 10 min bij 400 xg en verwijder het supernatant. Herhaal lysis stap als de BM pellet rode kleur.
- Hersuspenderen in 5 ml PBS en tel cellen door trypan blauw exclusie onder toepassing van een hemocytometer.
- Resuspendeer cellen bij 2 x 10 6 cellen per m met 2x pre-stim cocktail die bestaat uit DMEM aangevuld met 20% FBS, L-glutamine, penicilline / streptomycine, IL-3 (14 ng / ml), IL-6 (24 ng / ml) en SCF (112 ng / ml). Plaat 2 ml per putje in 6 well platen.
- Incubeer de cellen overnacht bij 37 ° C en 5% CO2.
- Voeg 2 ml virale supernatant aan elk putje met BM cellen en voeg polybreen (8 ug / ml). Spin platen bij 30 ° C gedurende 90 min bij 1500 xg dan plaat terug naar de weefselkweek incubator overnacht.
- Pipet celsuspensie in conische buizen en centrifugeer bij 4 ° C gedurende 10 min bij 400 xg, niet de plaat verwijderen. Resuspendeer cellen in 2 ml vers 2x pre-stim cocktail per putje en terug te keren naar de oorspronkelijke bronnen. Voer een 2e spinoculation door herhalen van de stappen 3,7-3,9.
4. Transplant donorcellen in Ontvanger Muizen
- Bereid syngene ontvangende muizen voor transplantatie met letale dosis totale lichaamsbestraling <24 uur voor de injectie van BM cellen.
OPMERKING: Lethal stralingsdosis voor BALB / c-muizen typisch 800-900 cGy en 1,000-1,200 cGy voor C57B / 6 10. De dosis wordt gewoonlijk verdeeld in twee sessies van bestraling afstand tenminste 3-4 uur apart. - Vervolg van stap 3.11, oogst getransduceerde donorcellen van de 6 wells platen door voorzichtig pipetteren supernatant in conische buizen. Was elk putje met 1 ml PBS om resterende cellen te verzamelen en voeg aan 50 ml conische buizen.
- Voeg 0,5 ml van 0,05% trypsine aan de putjes en incubeer bij 37 ° C in de weefselkweek incubator gedurende 5 min.
- Voeg 1 ml D10 te putten en los eventuele resterende cellen door zachte pipetteren. cellen toe te voegen aan de respectievelijke buiss van stap 4,2 en pellet door centrifugeren bij 4 ° C gedurende 10 minuten bij 400 x g.
- Was de cellen met PBS en centrifugeer bij 4 ° C gedurende 10 minuten bij 400 x g. Hersuspenderen in 5 ml PBS en tel cellen met een hemocytometer door trypan blauw exclusie.
OPMERKING: Als de vector een GFP-tag dan kwantificeren van het percentage GFP-positieve cellen met een flowcytometer. - Resuspendeer 5 x 10 5 - 2x 10 6 cellen in 50-100 pi PBS voor injectie in muizen.
- Injecteren cellen via retro-orbitale injectie in verdoofde muizen met behulp van een steriele 27 G x ½ "naald.
LET OP: Overige injectie technieken zijn staart-ader, milt, of dijbeen.- Verdoven muis met behulp van isofluraan en pinch voet naar responsiviteit te beoordelen.
- Plaats de muis op zijn kant en beperken door zowel de duim en wijsvinger, zodat de gaten enigszins uitsteekt uit de kop.
- Met de schuine kant naar boven, steek de needle lateraal van de mediale ooghoek bij een 45 ° hoek.
LET OP: Als deze techniek correct wordt uitgevoerd, moet het oog iets terug te trekken en er geen weerstand moet op de naald inbrengen worden gevoeld. - Onderzoek muis op tekenen van schade zoals zwelling of bloeding.
NB: Na de transplantatie muizen zal lage bloeddruk telt voor een aantal weken te hebben en dus vatbaar zijn voor infecties. Profylaxe met antibiotica of het gebruik van aangezuurd water worden gebruikt.
- Een maand na de transplantatie, meet de% GFP in het perifere bloed als indicator voor getransplanteerde donor cellen door flowcytometrie.
OPMERKING: GFP alleen niet succes van implantatie van de cellen te bepalen. De virale transductie mogelijk mislukt nog aanslaan kan zijn opgetreden. In dit geval zou er geen GFP + cellen worden gedetecteerd, maar aanslaan van getransplanteerde cellen succesvol was.- Neem 10 pi van perifeer bloed by aanprikken van de ader vena been met een 21 G x 1 ½ "spuit en voeg deze toe aan 100 mM EDTA in PBS om stolling te voorkomen.
- Voeg 1 ml ACK om bloed en Lyse op ijs gedurende 10 min. Pellet cellen door centrifugatie bij 400 xg gedurende 10 min.
- Aspireren supernatant in een vacuüm kolf en voeg 1 ml PBS aangevuld met 2% FBS aan lysis te stoppen. Pellet cellen door centrifugatie bij 400 xg gedurende 10 min.
- Aspiraat supernatant onder vacuüm kolf en resuspendeer pellet in 100 pl PBS gesupplementeerd met 2% FBS.
- Run monsters op een flowcytometer en het verzamelen van 300.000 events binnen de levende cellen gate (bepaald door FSC vs. SSC) en bereken het percentage van de GFP + en GFP - cellen 9.
- Daarnaast is op 1 maand na de transplantatie, uit te voeren complete bloedbeeld (CBC) met behulp van een geautomatiseerde veterinaire hematologie-analyse 18 tot progressie van de ziekte te volgen.
LET OP: Ga door met de ziekte door% bewakenGFP in perifeer bloed en CBC maandelijks. - Om het experiment te beëindigen, verdoven muis met behulp van isofluraan en pinch voet naar responsiviteit te beoordelen. Sacrifice muis door cervicale dislocatie en de oogst milt en beenmerg voor histopathologie.
OPMERKING: De duur van het experiment is subjectief en de einddatum worden beoordeeld op basis van het verwachte fenotype.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De transductie-transplantatietechniek resulteert in hematopoietische reconstitutie van de ontvangende muizen met cellen het gen van belang tot expressie brengen. Figuur 1 toont een overzicht van de transductie-transplantatie muismodel van calreticuline gemuteerde MPN. Kort samengevat, retrovirus expressie CALRwt of CALRdel52 wordt gebruikt om BM cellen te infecteren van een C57B / 6 donormuis. Getransduceerde cellen worden getransplanteerd in bestraalde C57B / 6 ontvanger muis en donorcel innesteling optreedt tijdens de eerste maand na de transplantatie. Het bewijs van een ziekte fenotype blijkt 3 maanden na de transplantatie, waar muizen vertonen verhoogde bloedplaatjes en megakaryocyten, gevolgd door beenmergfibrose bij 6-10 maanden na de transplantatie. Als donor cellen niet om aan te slaan, kunnen muizen dood optreden binnen de eerste 2 weken na transplantatie. Naast de slechte injectie of trauma's tijdens de injectie, kunnen andere technische fouten slecht aanslaan van transduceren veroorzakend cellen of muis dood. Deze omvatten sub-optimale bestraling van ontvangende muizen, als dit komt het meest voor hematopoietische cellen van de ontvanger in plaats van donor oorsprong. Anderzijds kan overmatige bestraling ontvangers muizen veroorzaken bestraling geïnduceerde ziekte of zelfs de dood ontwikkelen. Lage virale titers leidt tot lage efficiëntie van infectie donorcellen. Als gevolg lage aantallen donor cellen het gen van belang zal innemen en dus muizen mogen niet het gewenste fenotype te tonen. Daarom is het cruciaal dat virus met hoge titers wordt gebruikt om donorcellen te transduceren. Figuur 2 laat zien hoe de relatieve virale titer waar de% GFP wordt berekend op basis van gebeurtenissen verzameld uit de levende cellen gate berekenen. Figuur 2B toont een titer van meer dan één virusdeeltje per cel (1: 3 verdunning) en titers met één virale deeltjes per cel (1:30, 1:10 en 1: 100 supernatant). Idealiter zou ten minste 50% GFP + cellen te detected met 1:30 verdunning van viraal supernatant. Figuur 3 toont het bewijs van een succesvolle transplantatieontvanger wanneer CALRdel52 muizen vertonen een fenotype met een verhoogde MPN bloedplaatjes, megakaryocyten verhoogd in het beenmerg en beenmerg fibrose.
Figuur 1: Overzicht van de Transductie-Transplantatie Mouse Model van myeloproliferatieve neoplasmen. A) Retrovirus genereren en bepaling van de virale titer optreedt 1-2 weken voor transplantatie. B) D (-8) (vijf dagen voorafgaand aan beenmerg oogst), donor muizen behandeld met 5-FU op lijn-voorbestemde cellen te verminderen en induceren hematopoietische stamcellen fietsen. C) Op D (-3), wordt het beenmerg geoogst van botten en gekweekt in 2x pre-stim 's nachts naar celdeling van hematopoietische stamcellen te induceren. D) Donor cellen geïnfecteerd met virale supernatans op D (-2) en de cellen worden gecentrifugeerd bij 400 x g bij 30 ° C gedurende 1,5 uur gedurende de 1 ste spinoculation. E) op D (-1), een 2 nd spinoculation wordt uitgevoerd op donorcellen. Bovendien, muizen zijn bestraald om cellen te verminderen in het gastland beenmerg niche mogelijk te maken voor donor cel innesteling. F) Getransduceerde donorcellen worden getransplanteerd in bestraalde syngene ontvangende muizen D0. G) Als donor cellen niet om aan te slaan dan de dood plaatsvindt op dag 12 - 14 na transplantatie als letale dosis bestraling is gebruikt. H) De MPN fenotype wordt duidelijk door 3 maanden na de transplantatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
jpg "/>
Figuur 2: Bepaling van de virale titer door flowcytometrie. 3T3 cellen getransduceerd met verschillende concentraties van virus en transductie efficiëntie wordt via flowcytometrie. A) Gebeurtenissen worden opgevangen binnen de levende cellen poort zoals gevisualiseerd door FSC vs. SSC. Dode cellen zijn uitgesloten van GFP analyse. B) Histogrammen tonen GFP% per volume van virale supernatant getest. De virale titer is aanvaardbaar wanneer ten minste 50% van de 3T3 cellen GFP + wanneer geïnfecteerd met de 1:30 verdunning van viraal supernatant. Met de vergelijking van stap 2.11.6, werd de virustiter werd berekend door celgetal van 400.000 cellen. De berekening virale titer bij een 1:30 verdunning volgt: [(400.000 x 0,56) / 1) x 30] = 6,72 x 10 6 PFU / ml. Per stap 3,7, infecteren 4 x 10 6 cellen met 2 ml virale supernatant zou resulteren in elke cel die 3 virale deeltjes.iles / ftp_upload / 54624 / 54624fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Bewijs van succesvolle Donor Cell Engraftment en MPN fenotype. Bestraalde ontvanger muizen overleven na 2 weken na transplantatie geeft een succesvolle implantatie van de geïnjecteerde cellen. A) getransplanteerde donor cellen kan worden gevolgd door GFP% in perifeer bloed. B) Bovendien moet CBC tellingen worden om ziekteprogressie te controleren. Verhoogde bloedplaatjes worden gedetecteerd zo vroeg als 2 maanden na de transplantatie in CALRdel52 in vergelijking met CALRwt en lege vector controle. C) Op het moment van beëindiging CALRdel52 muizen vertonen klassieke kenmerken van de MPN fenotype inclusief splenomegalie (niet getoond), beenmerg hypercellularity, de uitbreiding van megakaryocytes in het beenmerg en beenmerg fibrose. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| technische fout | Oorzaken | Resultaat |
| Slechte Injection of Trauma | Transplant Afwijzing | Transplant Failure |
| Slechte kwaliteit van donorcellen | Transplant Afwijzing | Transplant Failure of Death |
| Lage virustiter | Slechte transductie van HSC | Transplant Failure |
| Hoge bestralingsdosis | Bestraling veroorzaakte ziekte | Dood |
| Low Bestraling Dose | Transplant Afwijzing | Transplant Failure |
| Old Donor Muizen (12 weken) | Low Input HSC | Transplant Failure |
Tabel 1: Technische fouten die kunnen leiden tot Mouse Death or Transplant Failure. Deze tabel bevat voorbeelden van technische fouten en de bijbehorende oorzaken die kunnen optreden bij beenmergtransplantatie protocol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol geeft een gedetailleerde beschrijving van het beenmerg transplantaties uitgevoerd bij muizen een essentiële trombocytemie-achtige ziekte met progressie herhalen om myelofibrose met CALRdel52 mutatie als de bestuurder van ziekte. Succesvolle transplantatie van cellen die CALRdel52 resulteert in verhoogde bloedplaatjes, uitbreiding van megakaryocyten en beenmerg fibrose. Beenmerg transplantatie een meerstaps proces is het belangrijk om stappen waarbij technische fout kan worden vermeden slechte engraftment van cellen die het gen van interesse of zelfs muis dood te voorkomen erkennen.
Van doorslaggevend belang voor een succesvolle transductie-transplantatiemodel vaak vergeten is de kwaliteit van het virus. Virus met hoge titers maakt goede transductie efficiëntie en dus een sterke basis voor de ziekte, terwijl met behulp van een virus geassocieerd met lage titer treden minder cellen die het gen van interesse. transductie efficirantie kan worden verbeterd door reagentia die contact tussen virus en cellen, zoals polybreen en retronectin verhogen. Transductie van HSC bekend moeilijk, zelfs met hoge concentraties van virus te zijn, slechts ecotroop retrovirus infecteert delende cellen. Het doel van "pre-stim" medium (bevattende SCF, IL-3 en IL-6) is fietsen ruststroom HSCs induceren. Lentivirale systeem kan worden gebruikt als een alternatieve methode indien infectie van niet-delende cellen nodig.
Een andere factor die van invloed is op virusproductie kan hebben is het type transfectie reagens. Optimale transfectie reagentia moeten empirisch worden bepaald als grote verschillen in cel toxiciteit waargenomen tussen onderzoeksgroepen. De transfectiereagens hier gebruikt heeft geresulteerd in goede virale opbrengst met lage toxiciteit cel. Andere veel voorkomende transfectie reagentia omvatten calciumfosfaat 11 en liposomale transfectie reagens zoals Fugene. Dit protocol maakt gebruik van plasmide alsde verpakking vector met specifiek weefsel trophisms voor muis en rat. Als gezien andere diermodellen voor transductie transplantatie, zouden andere verpakkingsvectoren bredere trophisms ook worden gebruikt om amfotrofe (muis, rat, mens) of pantrophic (breed scala trophisms) retrovirus produceren.
Een bijkomend voordeel van het beenmerg transplantatie transductie-model is de mogelijkheid te onderzoeken van het concurrentievoordeel van twee verschillende donoren populaties of meerdere genen van belang uit te drukken tegelijk met behulp van unieke markers om elke populatie van belang te wijzen. Dergelijke transplantaten vaak gebruik congenic C57BL / 6 muizen donorcellen volgen dan het gebruik van een geïntegreerde GFP merker. Omdat congenic C57BL / 6 muizen leukocyten markers voor zowel CD45.1 of CD45.2 kan uitdrukken, kunnen donorcellen worden verkregen uit een achtergrond en getransplanteerd in de andere. Bovendien kan een hybride F1 stam worden gegenereerd om nageslacht te produceren die zowel CD45.1 en CD45.2markers. Als alternatief kan de MSCV retrovirale vector is beschikbaar met verschillende labels, waaronder unicistronic (bijvoorbeeld FLAG HA) of bicistronisch (bijvoorbeeld GFP, RFP, YFP, mCherry, hCD4) bouwt. Deze constructen kunnen gelijktijdig worden gebruikt in competitieve transplantaties om discriminatie tussen donor populaties mogelijk en kan vooral handig wanneer differentiatie via CD45.1 / CD45.2 expressie niet beschikbaar is, zoals BALB / c muizenstam zijn.
Een ander voordeel van transductie-transplantatie is de mogelijkheid om de bijdrage van specifieke celtypen ziekte initiatie onderzoeken. Hoewel dit protocol beschrijft alleen de transductie-transplantatie van hele beenmerg, kunnen andere experimentele ontwerpen de verrijking of isolatie van verschillende HSC compartimenten noodzakelijk. In dat geval zal het aantal donorcellen afhankelijk van de specifieke donorpopulatie gebruikt. Bovendien, redding cellen van een naïeve donor moetworden gebruikt als aanvulling op de muis tot HSC engraftment en expansie kan optreden ondersteunen. Tabel 2 beschrijft het aanbevolen aantal donor cellen voor transplantatie van beenmerg verschillende compartimenten 12-15.
| # Van Cellen / Ontvanger van de Transplantatie | # Van steuncellen / Ontvanger van de Transplantatie | |
| Hele Bone Marrow | 500,000-2,000,000 | n / a |
| c-Kit + | 1.000-10.000 | 200.000 |
| Lin-c-Kit + Sca-1 + (LKS) | 100-10.000 | 200.000 |
| LKS CD150 + CD48 - SP | 1-100 | 200.000 |
| LKS CD150 + CD34 - | 1-100 | 200.000 |
Tabel 2. Aantal donorcellen te verplanten.
Verder kunnen secundaire transplantatie worden uitgevoerd om het vermogen van de getransduceerde cellen serieel transplanteren ziekte te beoordelen.
Transductie-transplantatie is een veelzijdige werkwijze die veel sneller en aanzienlijk meer kostenefficiënt opzichte transgene knock-in of xenograft modellen. Het laat toe om snel te bepalen of het gen van belang is voldoende om een hematologische maligniteit induceren, en kan worden gebruikt als een in vivo preklinische model voor het testen van drugs. Andere voordelen van de transductie-transplantatietechniek is dat het voorkomt expressie in niet-hematopoëtische cellen en de retrovirale insertieplaats dient als klonale marker. Beperkingen van deze techniek include non-fysiologische niveaus van getransduceerde gen en verschillen in de integratieplaats van het gen 16,17. Nemen alle hierboven genoemde voordelen en beperkingen in aanmerking, transductie-transplantatie voor de hand voor de initiële in vivo modellering van vermeende hematopoietische oncogenen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Lines | |||
| DMEM | Corning | MT-10-013-CV | |
| 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| 3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | |
| Plasmids | |||
| EcoPak, also known as pCL-Eco | Addgene | 12371 | Retroviral packaging cell lines, such as EcoPack 2-293, may be used in place of the EcoPak plasmid and standard 293T cells. Additional γ-retrovirus envelope and packaging plasmids are available from Addgene and others. |
| MSCV-IRES-GFP (MIG) | Addgene | 20672 | Additional γ-retroviral transfer plasmids are available from Addgene and others. |
| Consumables | |||
| 27 G x 1/2" needles | BD | 305620 | |
| Fetal bovine serum | Corning | MT-35-010-CV | |
| Penicillin/streptomycin/L-glutamine | Corning | MT-30-009-CI | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Corning | MT-25-052-CI | Can be homemade |
| PBS | Corning | MT-21-031-CV | |
| 10 cm dishes | Fisher | 172931 | |
| 15 ml conical tubes | Fisher | 12565268 | |
| 60 mm dishes | Fisher | 150288 | |
| Polybrene | Fisher | NC9840454 | |
| 5-FU | Fisher | A13456-06 | |
| 100 µm cell strainers | Fisher | 22363549 | |
| 50 ml conical tubes | Fisher | 12565270 | |
| 6-well plate | Fisher | 130184 | |
| FACS tubes | Fisher | 14-959-5 | |
| 0.45 μm syringe filters | Fisher | 0974061B | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | |
| ACK buffer | Lonza | 10-548E | Can be homemade |
| Recombinant murine IL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| Recombinant murine IL-6 | Peprotech | 216-16 | |
| Recombinant murine SCF | Peprotech | 250-03 | |
| X-tremeGENE 9 | Roche | 6365809001 | Transfection reagent |
| 1.5 ml centrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Equipment | |||
| BD Accuri C6 | |||
| X-ray irradiator |
References
- Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome. Science(New York, N.Y.). 247 (4944), 824-830 (1990).
- Wernig, G., Mercher, T., Okabe, R., Levine, R. L., Lee, B. H., Gilliland, D. G. Expression of Jak2V617F causes a polycythemia vera-like disease with associated myelofibrosis in a murine bone marrow transplant model. Blood. 107 (11), 4274-4281 (2006).
- Lacout, C., Pisani, D. F., Tulliez, M., Gachelin, F. M., Vainchenker, W., Villeval, J. L. JAK2V617F expression in murine hematopoietic cells leads to MPD mimicking human PV with secondary myelofibrosis. Blood. 108 (5), 1652-1660 (2006).
- Zaleskas, V. M., Krause, D. S., et al. Molecular pathogenesis and therapy of polycythemia induced in mice by JAK2 V617F. PloS One. 1, e18 (2006).
- Bumm, T. G. P., Elsea, C., et al. Characterization of murine JAK2V617F-positive myeloproliferative disease. Cancer Res. 66 (23), 11156-11165 (2006).
- Marty, C., Pecquet, C., et al. Calreticulin mutants in mice induce an MPL-dependent thrombocytosis with frequent progression to myelofibrosis. , Blood. (2015).
- Klampfl, T., Gisslinger, H., et al. Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms. N. Engl. J. Med. 369 (25), 2379-2390 (2013).
- Araki, M., Yang, Y., et al. Activation of the thrombopoietin receptor by mutant calreticulin in CALR-mutant myeloproliferative neoplasms. Blood. , (2016).
- Limón, A., Briones, J., et al. High-Titer Retroviral Vectors Containing the Enhanced Green Fluorescent Protein Gene for Efficient Expression in Hematopoietic Cells. Blood. 90 (9), 3316-3321 (1997).
- Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 48 (1), 11-22 (2009).
- Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells. J. Vis. Exp. (10), (2007).
- Challen, G. A., Boles, N., Lin, K. K., Goodell, M. A. Mouse Hematopoietic Stem Cell Identification And Analysis. Cytometry A. 75 (1), 14-24 (2009).
- Ergen, A. V., Jeong, M., Lin, K. K., Challen, G. A., Goodell, M. A. Isolation and characterization of mouse side population cells. Methods Mol. Bio. (Clifton, N.J.). 946, 151-162 (2013).
- Weksberg, D. C., Chambers, S. M., Boles, N. C., Goodell, M. A. CD150- side population cells represent a functionally distinct population of long-term hematopoietic stem cells. Blood. 111 (4), 2444-2451 (2008).
- Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
- Li, J., Kent, D. G., Chen, E., Green, A. R. Mouse models of myeloproliferative neoplasms: JAK of all grades. Dis. Model. Mech. 4 (3), 311-317 (2011).
- Mullally, A., Lane, S. W., Brumme, K., Ebert, B. L. Myeloproliferative neoplasm animal models. Hematol. Oncol. Clin. North Am. 26 (5), 1065-1081 (2012).
- Scil animal care company GmbH. , Source: http://www.scilvet.us/company-downloads (2005).
