Introduction
Transduction-transplantation est une méthode utile pour modéliser les hémopathies malignes chez les souris. Cette technique a été particulièrement précieux pour l' étude des tumeurs malignes myéloïdes remontant à la première démonstration que l' expression ectopique de BCR-ABL1 pourrait fidèlement récapituler la leucémie myéloïde chronique chez les souris 1. Cette technique a ensuite facilité l'étude approfondie de JAK2 V617F et MPL W515K / L muté syndrome myéloprolifératif (MPN).
NPP sont un groupe de tumeurs malignes caractérisées par une surproduction de cellules myéloïdes matures et une fibrose de la moelle osseuse. Ces maladies proviennent généralement de l'expansion clonale d'une cellule souche hématopoïétique qui a acquis une mutation somatique soit dans Jak2, MPL ou CALR. Transduction-transplantation JAK2 V617F et MPL W515K / L modèles présentent les caractéristiques cliniques de la maladie de Vaquez et myélofibrose 2-5 </ Sup>. Récemment, un modèle de souris de la calréticuline mutée MPN a été généré par la méthode de transduction transplantation 6. Ces souris développent une maladie thrombocytémie comme essentielle à l'augmentation des plaquettes, l'augmentation du nombre de mégacaryocytes et la fibrose de la moelle osseuse. Ensemble, ces modèles ont non seulement donné l'occasion de mieux comprendre la pathogenèse moléculaire de MPN, mais aussi la capacité à développer et à étudier la thérapeutique dans un cadre pré-clinique.
Ce manuscrit fournit une description détaillée de la méthodologie transduction-transplantation avec un accent sur la mutation CALRdel52. Cette technique implique la transplantation de cellules de moelle osseuse transduites par un retrovirus exprimant le mutant de construction dans des souris receveuses syngéniques irradiés.
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Protocol
Cette étude a été approuvée et réalisée conformément aux recommandations formulées par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle à l'Université de Californie, Irvine. Toutes les procédures ont été réalisées sous anesthésie à l'isoflurane et tous les efforts ont été faits pour minimiser la souffrance.
1. Production de retrovirus écotropique
- Préparer des plasmides de haute qualité avec une concentration d'au moins 1 pg / pl en utilisant soit un kit maxi-prep commerciale ou la purification de chlorure de césium.
NOTE: notamment un vecteur MSCV squelette codant pour le gène d'intérêt (dans ce cas CALR 7,8) et marqueur de choix (GFP, Neo, etc.) ainsi qu'un emballage plasmide écotrope, codant gag-pol-env (appelé ici en tant que plasmide). - Décongeler et divertissez cellules 293T faible passage dans DMEM additionné de 10% de FBS et L-glutamine avec de la pénicilline / streptomycine (D10). Plate 5 x 10 6 cellules dans une boîte de culture traitée de tissu 10 cm dans un humidifiéla culture tissulaire incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Développer des cellules 293T en culture. Le jour avant la transfection, laver les cellules en ajoutant 1 ml de PBS et aspirer le surnageant dans un ballon à vide.
- À trypsiniser cellules, ajouter 2 ml de trypsine à 0,05% et on incube la vaisselle dans un incubateur de culture tissulaire humidifiée pendant 2 à 3 min à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Pour arrêter trypsinisation, ajouter 3 ml D10 à plat et les cellules de transfert à un tube conique de 15 ml. Faire tourner les cellules à 400 xg pendant 10 min.
- Aspirer le surnageant dans un flacon à vide et resuspendre le culot de cellules dans 2 ml de D10.
- Compter les cellules par exclusion du bleu trypan en utilisant un hémocytomètre.
- Seed 2 x 10 6 cellules par boîte en trois 10 cm de culture tissulaire traités plats par virus générés.
REMARQUE: Pour des résultats optimaux, ne permettent pas aux cellules de dépasser 30 - 50% de confluence au moment de la transfection ou un rendement de virus pauvre peut être obtenu. - Immédiatement avant la transfection,médias aspirés dans une fiole à vide et remplacer par 5 ml de D10 frais.
- Pour tous les 10 cm boîte de Pétri à transfecter préparer un tube de 1,5 ml stérile individuel.
- Pipette 760 ul de milieu de sérum réduit dans chaque tube à centrifuger, puis ajouter soigneusement 40 ul de réactif de transfection directement dans les médias. Incuber les tubes dans la hotte de culture de tissu à la température ambiante pendant 5 min.
- Ajouter 30 pg de MSCV vecteur avec le gène d'intérêt (15 ug si on utilise un vecteur vide), ainsi que 5 ug de plasmide dans chaque tube respectif et mélanger doucement par pipetage de haut en bas. Incuber à la température ambiante sous la hotte de culture tissulaire pendant 15 minutes supplémentaires.
NOTE: Les petits vecteurs ont tendance à avoir des rendements viraux plus élevés. - Ajouter délicatement le volume total de chaque réaction (environ 800 pi) goutte à goutte dans sa 10 cm boîte de Pétri respective et inclinez légèrement le plat d'un côté à l'autre pour mélanger. cellules Retour à la cu tissulaire humidifiéincubateur lture.
- Après 8 heures, ou une nuit d'incubation dans une culture tissulaire incubateur, les médias aspirés dans une fiole à vide et doucement remplacer par 10 ml de D10 frais.
- A 48 heures post-transfection recueillir surnageant dans une seringue de 35 ml et filtrer à travers une membrane de 0,45 um pour éliminer les débris cellulaires.
- EN OPTION: Placer 10 ml D10 frais de retour sur les cellules 293T et virus supplémentaire peut être récolté à 72 heures après la transfection.
- Jeter les cellules 293T dans les déchets biohazard quand aucun virus supplémentaire est recueilli.
- aliquote surnageant viral dans des volumes à usage unique (par exemple 1 ml pour le titre viral ou 6,5 ml pour une infection BM). virus Flash gel avec de l'azote liquide et le virus de la conserver à -80 ° C.
REMARQUE: Éviter les cycles répétés de gel / dégel , car ils réduisent grandement le titre viral.
2. Déterminer Titer Relative Viral par cytométrie de flux
- Décongeler les cellules 3T3 et maintenir en D10. La culture des cellules dans 10 cmculture tissulaire traitée plat dans un incubateur humidifié de culture tissulaire à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Effectuer le titre viral en triple exemplaire. Pour préparer des cellules, laver les cellules en ajoutant 1 ml de PBS et aspirer le surnageant dans un ballon à vide.
- À trypsiniser cellules, ajouter 2 ml de trypsine à 0,05% et on incube la vaisselle dans un incubateur humidifié de culture tissulaire à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Pour arrêter trypsinisation, ajouter 3 ml D10 à plat et les cellules de transfert à un tube conique de 15 ml. Faire tourner les cellules à 400 xg pendant 10 min.
- Aspirer le surnageant dans un flacon à vide et resuspendre le culot de cellules dans 2 ml de D10.
- Compter les cellules par exclusion du bleu trypan en utilisant un hémocytomètre.
- Semence des cellules 3T3 à une densité de 1 x 10 5 cellules dans les quinze boîtes de culture de tissus traités par 60 mm et incuber pendant une nuit.
- Faire 1: 3, 1:10, 1:30 et 1: 100 dilutions de surnageant viral décongelé en utilisant D10 dans un total de 1 ml. Inclure aussi un contrôle sans virus.
- aspirer media de cellules 3T3 dans un flacon à vide et la remplacer par 4 ml de D10.
- Superposer les cellules 3T3 avec les dilutions du surnageant viral et ajoute du polybrène à une concentration finale de 8 ug / ml dans chaque boîte. Incuber pendant 48 heures dans la culture tissulaire incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Déterminer par rapport titre viral par cytométrie de flux:
- Pour laver les cellules, aspirer les médias dans un flacon à vide et ajouter 5 ml de PBS.
- Aspirer le PBS dans un flacon à vide. Ajouter 1 ml de 0,05% de trypsine et incuber à 37 ° C pendant 2 - 5 min pour détacher les cellules du plat.
- Ajouter 3 ml D10 et la pipette de haut en bas pour détacher toutes les cellules restantes de la plaque. Transférer les cellules dans un tube FACS et centrifuger à 400 g pendant 10 min.
- Décanter le surnageant et laver les cellules avec 3 ml de PBS. Centrifugeuse à 400 g pendant 10 min et le surnageant de décantation. Remettre en suspension dans 200 ul de PBS.
- Cellules Exécuter sur un cytomètre de flux 9. Collecter entre 20.000 - 30.000 événements dans til vit la porte de la cellule (déterminée par FSC vs SSC) et calculer le pourcentage de la GFP + et GFP - cellules.
NOTE: Le titre viral est considéré comme acceptable lorsque la dilution 1:30 du rendement surnageant viral au moins 50% GFP + 3T3 cellules. Si cette dilution des résultats dans moins de 50% des cellules GFP + , puis les résultats de transduction suboptimales peuvent être obtenus. Le calcul pour déterminer le titre viral a été adapté de Limon et al. Blood (1997) 9. - Pour déterminer par rapport titre du virus, utilisez l'équation: titre viral = particules formant des unités (PFU) / ml = [(Nombre de cellules 3T3 × Fréquence de cellules GFP +) / volume de surnageant (ml)] x facteur de dilution.
3. transduction donateurs cellules de moelle osseuse
- Pour préparer souris donneuses pour la moelle osseuse (BM) récolte, premier anesthésier souris par vaporiseur isoflurane avec un taux de 5% supplémentaire combiné de débitoxygène à 1 L / min. Pincez pied pour évaluer la réactivité.
NOTE: Les souris donneuses (moins de 8 semaines) devraient être préparés 5 jours avant la récolte de la moelle osseuse (8 jours avant la transplantation). Un souris donateurs fourniront suffisamment de cellules pour au moins 2 destinataires. - Injecter 150 mg / kg de 5-fluorouracile (5-FU) par injection rétro-orbital dans des souris anesthésiées au moyen d'un 27 G x ½ "aiguille.
PRUDENCE! 5-FU, un agent chimiothérapeutique anti-cancéreux. Toujours manipuler 5-FU dans une hotte chimique certifié ou une enceinte de biosécurité canalisé. Consulter avec le comité de sécurité en laboratoire et des animaux de l'institution pour déterminer l'étiquetage approprié des souris traitées avec le 5-FU.- Placez la souris anesthésiée sur le côté et retenir en utilisant à la fois le pouce et l'index de telle sorte que l'œil dépasse légèrement de la tête.
- En commençant par la partie latérale de l'aiguille du canthus interne et avec le biseau vers le haut, insérer l'aiguille à un 45° angle dans le sens médial et arrêter lorsque l'aiguille est à mi-chemin inséré. Injecter lentement les cellules et enlever retirer délicatement l'aiguille.
NOTE: Si cette technique est effectuée correctement, l'œil doit se rétracter légèrement et aucune résistance doit être ressentie lors de l' insertion de l' aiguille. - Examiner la souris pour tout signe de blessure, tels que le gonflement ou de saignements.
- Récolte de moelle osseuse de 5 jours après le traitement 5-FU (3 jours avant la transplantation).
- Anesthetize souris par vaporisateur isoflurane avec un débit de 5% d'oxygène supplémentaire combiné à 1 L / min. Pincez pied pour évaluer la réactivité.
- Sacrifiez la souris par dislocation cervicale. Stériliser souris par pulvérisation généreusement avec 70% EtOH jusqu'à ce que la fourrure est mouillé.
- Utilisation de disséquer des ciseaux, faire une incision dans la peau et disséquer le fascia loin des muscles de la jambe. Ensuite, disséquer la jambe loin de la souris en coupant le fémur à la hanche et le tibia à la cheville.
- plierla jambe en forme de «L» et séparer chaque os jambe en coupant à l'articulation du genou avec des ciseaux de dissection.
- Pour retirer le cartilage aux extrémités distales de chaque os de la jambe, utiliser les ciseaux de dissection pour gratter délicatement le muscle vers une extrémité de l'os de la jambe jusqu'à ce que le cartilage est désengagé.
- En utilisant une seringue avec une aiguille 27 G x ½ pouces, rincer chaque os jambe avec du PBS additionné de 2% de FBS sur une membrane en nylon de 100 uM dans un tube conique de 50 ml. os Flush jusqu'à l'os devient blanc pour maximiser le nombre de cellules récoltées.
- Utiliser le piston d'une seringue pour écraser les cellules à travers la membrane en nylon dans le tube conique de 50 ml pour obtenir une suspension cellulaire unique. Répétez avec l'autre jambe de la souris.
- Centrifuger les cellules à 4 ° C pendant 10 min à 400 xg et jeter le surnageant. Remettre en suspension dans 5 ml BM chlorure d'ammonium potassium (ACK) du tampon pour lyser les globules rouges. Incuber les cellules sur de la glace pendant 10 minutes.
- Remplir le tube avec du PBS pour arrêter la lyse cellulaire. Centricellules Fuge à 4 ° C pendant 10 min à 400 xg et jeter le surnageant. Répétez l'étape de lyse si le culot BM a la couleur rouge.
- Remettre en suspension dans 5 ml de PBS et compter les cellules par exclusion du bleu trypan en utilisant un hémocytomètre.
- Resuspendre les cellules à 2 x 10 6 cellules par m avec un cocktail de pré-Stim 2x contenant du DMEM supplémenté avec 20% de FBS, L-glutamine, de la pénicilline / streptomycine, l' IL-3 (14 ng / ml), l' IL-6 (24 ng / ml) et du SCF (112 ng / ml). Plate 2 ml par puits en plaques à 6 puits.
- Incuber les cellules pendant une nuit à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Ajouter 2 ml de surnageant viral dans chaque puits contenant des cellules BM et ajouter polybrène (8 ug / ml). plaques de Spin à 30 ° C pendant 90 min à 1500 xg retournent ensuite la plaque au tissu incubateur de culture durant la nuit.
- Pipette suspension cellulaire dans des tubes coniques et centrifuger à 4 ° C pendant 10 min à 400 g, ne jetez pas la plaque. Resuspendre les cellules dans 2 ml cocktail frais pré-stim 2x par puits et retourner dans les puits d'origine. Effectuer une 2 ème spinoculation en répétant les étapes 3,7-3,9.
4. Les cellules Transplant des donateurs sur les souris receveuses
- Préparer des souris receveuses syngéniques pour la transplantation avec une dose létale totale irradiation corporelle <24 heures avant l'injection de cellules BM.
NOTE: l' irradiation de la dose létale pour les souris BALB / c est typiquement 800-900 cGy et 1000-1200 cGy pour C57B / 6 10. La dose est généralement divisée en deux sessions d'irradiation espacées d'au moins 3-4 heures d'intervalle. - Suite de l'étape 3.11, les cellules du donneur de récolte transduction des plaques 6 puits par pipetage surnageant dans des tubes coniques. Laver chaque puits avec 1 ml de PBS pour recueillir les cellules résiduelles et l'ajouter à 50 ml tubes coniques.
- Ajouter 0,5 ml de trypsine à 0,05% dans les puits et incuber à 37 ° C dans l'incubateur de culture tissulaire pendant 5 min.
- Ajouter 1 ml D10 aux puits et détacher les cellules restantes par pipetage doux. Ajouter les cellules au tube respectifs à l'étape 4.2 et le culot par centrifugation à 4 ° C pendant 10 min à 400 x g.
- Laver les cellules avec du PBS et on centrifuge à 4 ° C pendant 10 min à 400 x g. Resuspendre dans 5 ml de PBS et compter les cellules en utilisant un hémocytomètre par exclusion au bleu trypan.
NOTE: Si le vecteur a une balise GFP puis quantifier le pourcentage de cellules GFP-positives avec un cytomètre de flux. - Remettre en suspension à 5 x 10 5 - 2 x 10 6 cellules de 50 à 100 ul de PBS pour l' injection à des souris.
- Injecter cellules par injection rétro-orbital dans des souris anesthésiés en utilisant un 27 G x ½ "aiguille stérile.
NOTE: D' autres techniques d'injection comprennent la queue veine, splénique ou fémorale.- Anesthetize souris à l'aide d'isoflurane et pincer le pied pour évaluer la réactivité.
- Placez la souris sur le côté et retenir en utilisant à la fois le pouce et l'index de telle sorte que l'œil dépasse légèrement de la tête.
- Avec le biseau vers le haut, insérez le nEedle latéral au canthus interne à un angle de 45 °.
NOTE: Si cette technique est effectuée correctement, l'œil doit se rétracter légèrement et aucune résistance doit être ressentie lors de l' insertion de l' aiguille. - Examiner la souris pour tout signe de blessure, tels que le gonflement ou de saignements.
REMARQUE: les souris de transplantation suivants ont des numérations globulaires faibles pour un certain nombre de semaines et sont donc sensibles à l' infection. Prophylaxie avec des antibiotiques ou l'utilisation de l'eau acidifiée peut être utilisé.
- Un mois après la transplantation, mesurer la GFP% dans le sang périphérique comme un indicateur de cellules donneuses greffées par cytométrie de flux.
NOTE: GFP seule ne peut pas déterminer le succès de la greffe des cellules. La transduction virale peut avoir encore échoué greffe peut avoir eu lieu. Dans ce cas, pas de cellules GFP + seraient détectés, mais la prise de greffe des cellules transplantées était réussie.- Prendre 10 pl de sang périphérique by perforer la veine saphène de la jambe avec une 21 G x 1 ½ "la seringue et l'ajouter à 100 mM d'EDTA dans du PBS pour empêcher la coagulation.
- Ajouter 1 ml ACK au sang et lyse sur la glace pendant 10 min. cellules à pellets par centrifugation à 400 g pendant 10 min.
- Aspirer le surnageant dans un flacon à vide et ajouter 1 ml de PBS additionné de 2% de FBS pour arrêter la lyse. cellules à pellets par centrifugation à 400 g pendant 10 min.
- Aspirer le surnageant dans un flacon à vide et remettre en suspension le culot dans 100 pl de PBS additionné de 2% de FBS.
- Exécutez des échantillons sur un cytomètre de flux et de recueillir 300.000 événements au sein de la grille de cellules vivantes (déterminé par FSC vs SSC) et calculer le pourcentage de la GFP + et GFP - cellules 9.
- De plus à 1 mois après la transplantation, effectuer la numération globulaire complète (CBC) à l' aide d' un analyseur d' hématologie vétérinaire automatisé 18 pour surveiller la progression de la maladie.
NOTE: Continuer à surveiller la maladie en%GFP dans le sang périphérique et CBC mensuel. - Pour mettre fin à l'expérience, anesthésier la souris en utilisant l'isoflurane et pincée pied pour évaluer la réactivité. Sacrifiez la souris par dislocation cervicale et la récolte de la rate et de la moelle osseuse pour l'histopathologie.
NOTE: La durée de l'expérience est subjective et la date de résiliation doit être évaluée en fonction du phénotype de la maladie attendue.
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Representative Results
La technique de transduction transplantation se traduit par la reconstitution hématopoïétique des souris receveuses avec des cellules exprimant le gène d'intérêt. La figure 1 montre une vue d' ensemble du modèle de souris transduction transplantation de calréticuline muté NPP. En bref, un retrovirus exprimant CALRwt ou CALRdel52 est utilisé pour infecter des cellules BM à partir d'un donneur de souris C57B / 6. Les cellules transduites sont transplantées dans irradiée C57B / 6 souris receveuse et cellule du donneur se produit au cours de la greffe après transplantation premier mois. La preuve d'un phénotype de la maladie devient apparente 3 mois post-greffe où les souris présentent des plaquettes et des mégacaryocytes a augmenté, suivie d'une fibrose de la moelle osseuse à 6 - 10 mois post-transplantation. Si les cellules du donneur ne parviennent pas à greffer, la mort de la souris peut se produire dans les 2 premières semaines suivant la transplantation. En plus de la mauvaise injection ou d'un traumatisme lors de l'injection, d'autres erreurs techniques peuvent entraîner une mauvaise greffe de transducecellules d ou la mort de la souris. Ceux-ci comprennent l'irradiation sous-optimale des souris receveuses, si cela se produit la plupart des cellules hématopoïétiques seront des bénéficiaires plutôt que l'origine des donateurs. D'autre part, l'irradiation excessive des bénéficiaires peut causer des souris de développer la maladie induite par irradiation ou même la mort. De faibles titres viraux se traduira par une faible efficacité d'infection des cellules du donneur. En conséquence un faible nombre de cellules du donneur expriment le gène d'intérêt et ainsi de souris ne peuvent pas démontrer le phénotype souhaité. Pour cette raison, il est crucial que le virus avec de hauts titres est utilisé pour la transduction de cellules du donneur. La figure 2 illustre comment calculer le titre viral par rapport lorsque la GFP% est calculé à partir des événements collectés à partir de la grille de cellules vivantes. La figure 2B illustre un titre de plus d'une particule virale par cellule (1: 3 de dilution), ainsi que les titres individuels avec des particules virales par cellule (1:30, 1:10 et 1: 100 surnageant). Idéalement, les cellules GFP + au moins 50% seraient détected 1:30 avec dilution du surnageant viral. La figure 3 montre la preuve d'un receveur de greffe réussie où les souris CALRdel52 présentent un phénotype NPP avec une augmentation des plaquettes, les mégacaryocytes accrue dans la moelle osseuse, et la fibrose de la moelle osseuse.
Figure 1: Vue d'ensemble de la souris transduction-Transplantation Modèle de myéloprolifératifs Tumeurs. A) la génération de Rétrovirus et la détermination du titre viral se produit 1 - 2 semaines avant la transplantation. B) D (-8) (cinq jours avant la récolte de la moelle osseuse), souris donneuses sont traitées avec le 5-FU pour épuiser les cellules de la lignée hématopoïétique commise et induire le cycle des cellules souches. C) à D (-3), la moelle osseuse est récoltée à partir des os de la jambe et cultivées pendant une nuit dans 2 x pré-Stim pour induire le cycle cellulaire des cellules souches hématopoïétiques. D) Les cellules donneuses sont infectées par le surnageant viral sur D (-2) et les cellules sont centrifugés à 400 g à 30 ° C pendant 1,5 heure pour le 1 er spinoculation. E) Le D (-1), un 2 e spinoculation est effectuée sur les cellules du donneur. En outre, les souris sont irradiés pour éliminer les cellules dans la niche de la moelle osseuse hôte pour permettre la prise de greffe des cellules du donneur. F) les cellules du donneur transduites sont transplantées dans des souris receveuses irradiées syngéniques sur D0. G) Si les cellules du donneur ne parviennent pas à engraft puis la mort se produira par jour 12-14 après la greffe si l' irradiation de dose létale a été utilisée. H) Le phénotype MPN devient évident par 3 mois après la transplantation. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 2: Détermination du titre viral par cytométrie de flux. 3T3 sont transduites avec différentes concentrations de virus et de l'efficacité de transduction est surveillée par cytométrie de flux. A) Les événements sont recueillies dans la porte de cellules vivantes comme visualisées par FSC vs SSC. Les cellules mortes sont exclues de l'analyse de la GFP. B) Les histogrammes représentent% GFP pour chaque volume de surnageant viral testé. Le titre viral est acceptable quand au moins 50% des cellules 3T3 sont GFP + lorsqu'elles sont infectées par la dilution du surnageant 01:30 virale. En utilisant l'équation de l'étape 2.11.6, le titre viral a été calculé sur la base d'un comptage cellulaire de 400.000 cellules. Le calcul pour le titre viral à une dilution de 1:30 comme suit: [(400 000 x 0,56) / 1) x 30] = 6,72 x 10 6 UFP / ml. À l' étape 3.7, infectant 4 x 10 6 cellules avec 2 ml de surnageant viral se traduirait par chaque cellule recevant 3 particules virales.iles / ftp_upload / 54624 / 54624fig2large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Preuve de réussite de donneurs de cellules et de prise de greffe MPN Phénotype. souris receveuses irradiées survivants au-delà de 2 semaines après la transplantation indique la greffe réussie de cellules injectées. A) des cellules du donneur transplantées peuvent être surveillés par la GFP% dans le sang périphérique. B) En outre, les chiffres de la SRC devraient être prises pour surveiller la progression de la maladie. plaquettes accrues sont détectées dès que 2 mois après la transplantation dans CALRdel52 par rapport à CALRwt vide et contrôle vectoriel. C) Au moment de la résiliation, les souris CALRdel52 présentent des caractéristiques classiques du phénotype MPN compris splénomégalie (non représenté), hypercellularité de la moelle osseuse, l' expansion de megakaryocytes dans la moelle osseuse, et la fibrose de la moelle osseuse. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| erreur technique | Causes | Résultat |
| Pauvre Injection ou Trauma | Rejet de greffe | Transplant échec |
| Mauvaise qualité des cellules du donneur | Rejet de greffe | Échec de greffe ou la mort |
| Virus faible titre | Pauvre transduction de HSC | Transplant échec |
| Haute Irradiation Dose | Irradiation maladie induite | Décès |
| Low Irradiation Dose | Rejet de greffe | Transplant échec |
| Les souris donneuses anciennes (+12 semaines) | Low Input HSC | Transplant échec |
Tableau 1: Erreurs techniques qui peuvent entraîner la mort de la souris ou Transplant Failure. Ce tableau donne des exemples d'erreurs techniques et leurs causes associées qui pourraient se produire avec le protocole de greffe de moelle osseuse.
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Discussion
Ce protocole fournit une description détaillée de la façon d'effectuer des greffes de moelle osseuse chez des souris de récapituler une maladie thrombocytémie comme essentielle à la progression de la myélofibrose avec mutation CALRdel52 comme le conducteur de la maladie. transplanter avec succès des cellules exprimant les résultats CALRdel52 une augmentation des plaquettes, l'expansion des mégacaryocytes et la fibrose de la moelle osseuse. Comme greffe de moelle osseuse est un processus en plusieurs étapes, il est important de reconnaître les étapes où l'erreur technique peut être évitée pour prévenir une mauvaise greffe de cellules exprimant le gène d'intérêt ou même la mort de la souris.
Un facteur critique pour un modèle transduction-transplantation réussie qui est souvent négligé est la qualité du virus. Avec des titres élevés du virus facilite une bonne efficacité de transduction et donc une base solide pour la maladie, alors que l'utilisation d'un virus associé à un faible titre entraînera moins de cellules exprimant le gène d'intérêt. effici de transductionence peut être améliorée par des réactifs qui augmentent le contact entre le virus et les cellules telles que polybrène et rétronectine. Transduction de CSH est connu pour être difficile, même avec des concentrations élevées de virus, retrovirus écotropes infecte seulement les cellules de division. Le but des médias "pré-Stim» (contenant SCF, IL-3 et IL-6) est d'induire le cyclisme de CSH quiescentes. Le système lentiviral peut être utilisé comme une solution de rechange en cas d'infection des cellules ne se divisant pas nécessaire.
Un autre facteur qui peut avoir un effet sur la production de virus est le type de réactif de transfection utilisé. des réactifs de transfection optimales doivent être déterminées de manière empirique que des différences marquées dans la toxicité cellulaire n'a été observée entre les groupes de recherche. Le réactif de transfection utilisé ici a donné lieu à un bon rendement viral avec une faible toxicité cellulaire. D' autres réactifs de transfection communs comprennent le phosphate de calcium 11 et nonliposomal réactif de transfection Fugene tel. Ce protocole utilise plasmidele vecteur d'emballage avec trophisms tissulaires spécifiques pour la souris et le rat. Si vous envisagez d'autres modèles animaux pour la transduction-transplantation, d'autres vecteurs d'emballage avec trophisms plus larges pourraient également être utilisés pour générer amphotrophique (souris, rat, humaine) ou pantrophic (large gamme trophisms) retrovirus.
Un avantage supplémentaire au modèle transduction-transplantation de la moelle osseuse est la capacité d'enquêter l'avantage concurrentiel des deux populations de donneurs différents ou d'exprimer plusieurs gènes d'intérêt simultanément en utilisant des marqueurs uniques pour désigner chaque population d'intérêt. De telles greffes utilisent souvent congéniques C57BL / 6 pour suivre les cellules du donneur au-delà de l'utilisation d'un marqueur GFP intégré. Parce que congéniques C57BL / 6 peuvent exprimer des marqueurs leucocytaires pour soit CD45.1 ou CD45.2, les cellules du donneur peuvent être obtenues à partir d'un arrière-plan et transplantées dans l'autre. En outre, une souche hybride F1 peut être généré pour produire des descendants exprimant à la fois CD45.1 et CD45.2des feutres. En variante, le vecteur rétroviral de MSCV est disponible avec plusieurs étiquettes différentes, y compris unicistronic (par exemple, FLAG HA) ou bicistronique (par exemple, GFP, RFP, YFP, mCherry, hCD4) construit. Ces constructions peuvent être utilisées simultanément dans les greffes compétitifs pour permettre la discrimination entre les populations de donneurs et peut être particulièrement utile dans les situations où la différenciation via l'expression CD45.1 / CD45.2 ne sont pas disponibles, comme le / c souche de souris BALB.
Un autre avantage de la transduction transplantation est la capacité d'analyser les contributions des types de cellules spécifiques à l'initiation de la maladie. Bien que ce protocole ne décrit que la transduction-transplantation de toute la moelle osseuse, d'autres modèles expérimentaux peuvent nécessiter l'enrichissement ou l'isolement des différents compartiments HSC. Dans ces cas, le nombre de cellules du donneur varie en fonction de la population des donneurs spécifiques utilisés. En outre, les cellules de secours provenant d'un donneur naïf devraitêtre utilisé comme complément pour soutenir la souris jusqu'à ce que la prise de greffe HSC et l'expansion peut se produire. Le tableau 2 présente le nombre recommandé de cellules du donneur pour une transplantation de la moelle osseuse différents compartiments 12-15.
| Nombre de cellules / receveurs de greffes | Nombre de cellules de soutien / receveurs de greffes | |
| Whole moelle osseuse | 500,000-2,000,000 | n / a |
| c-Kit + | 1,000-10,000 | 200.000 |
| Lin-c-Kit + Sca-1 + (LKS) | 100-10,000 | 200.000 |
| LKS CD150 + CD48 - SP | 1-100 | 200.000 |
| LKS CD150 + CD34 - | 1-100 | 200.000 |
Tableau 2. Nombre de cellules du donneur à transplanter.
En outre, la transplantation secondaire peut également être réalisée afin d'évaluer l'aptitude des cellules transduites à repiquer en série les maladies.
Transduction-transplantation est une méthode très polyvalent qui est beaucoup plus rapide et beaucoup plus rentable par rapport aux modèles transgéniques, knock-in, ou xénogreffe. Elle permet de déterminer rapidement si le gène d'intérêt est suffisante pour induire une hémopathie maligne, et peut être utilisé comme un modèle pré-clinique in vivo pour tester des médicaments. D'autres avantages de la technique de transduction de transplantation est qu'il évite l'expression dans les cellules non hématopoïétiques et que le site d'insertion rétrovirale sert de marqueur clonale. Limitations de cette technique include Les niveaux non-physiologiques du gène transduit et les différences dans le site d'intégration du gène 16,17. Compte tenu de tous les avantages et les limites mentionnées ci - dessus en compte, la transduction-transplantation est le choix évident pour la modélisation initiale in vivo des oncogènes hématopoïétiques putatifs.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Lines | |||
| DMEM | Corning | MT-10-013-CV | |
| 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| 3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | |
| Plasmids | |||
| EcoPak, also known as pCL-Eco | Addgene | 12371 | Retroviral packaging cell lines, such as EcoPack 2-293, may be used in place of the EcoPak plasmid and standard 293T cells. Additional γ-retrovirus envelope and packaging plasmids are available from Addgene and others. |
| MSCV-IRES-GFP (MIG) | Addgene | 20672 | Additional γ-retroviral transfer plasmids are available from Addgene and others. |
| Consumables | |||
| 27 G x 1/2" needles | BD | 305620 | |
| Fetal bovine serum | Corning | MT-35-010-CV | |
| Penicillin/streptomycin/L-glutamine | Corning | MT-30-009-CI | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Corning | MT-25-052-CI | Can be homemade |
| PBS | Corning | MT-21-031-CV | |
| 10 cm dishes | Fisher | 172931 | |
| 15 ml conical tubes | Fisher | 12565268 | |
| 60 mm dishes | Fisher | 150288 | |
| Polybrene | Fisher | NC9840454 | |
| 5-FU | Fisher | A13456-06 | |
| 100 µm cell strainers | Fisher | 22363549 | |
| 50 ml conical tubes | Fisher | 12565270 | |
| 6-well plate | Fisher | 130184 | |
| FACS tubes | Fisher | 14-959-5 | |
| 0.45 μm syringe filters | Fisher | 0974061B | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | |
| ACK buffer | Lonza | 10-548E | Can be homemade |
| Recombinant murine IL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| Recombinant murine IL-6 | Peprotech | 216-16 | |
| Recombinant murine SCF | Peprotech | 250-03 | |
| X-tremeGENE 9 | Roche | 6365809001 | Transfection reagent |
| 1.5 ml centrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Equipment | |||
| BD Accuri C6 | |||
| X-ray irradiator |
References
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