Introduction
Transduktion-Transplantation ist eine nützliche Methode hämatologischen Malignomen in Mäusen zu modellieren. Diese Technik ist besonders wertvoll myeloischen malignen Erkrankungen , für das Studium an der ersten Demonstration aus dem Jahr die ektopische Expression von BCR-ABL1 getreulich chronischer myeloischer Leukämie in Mäusen 1 rekapitulieren könnte. Diese Technik hat in der Folge der umfangreichen Studie von JAK2 V617F und MPL W515K / L mutierten myeloproliferativen Neoplasien (MPN) erleichtert.
MPN sind eine Gruppe von hämatologischen durch die Überproduktion von reifen myeloischen Zellen und Knochenmarkfibrose gekennzeichnet malignen Erkrankungen. Diese Krankheiten im Allgemeinen ergeben sich aus der klonalen Expansion einer hämatopoetischen Stammzellen, die eine somatische Mutation in entweder Jak2, MPL oder CALR erworben hat. Transduction-Transplantation JAK2 V617F und MPL W515K / L - Modelle zeigen die klinischen Merkmale von Polyzythämie und Myelofibrose 2 bis 5 </ Sup>. Vor kurzem wurde ein Mausmodell für Calreticulin-mutierten MPN auch mit der Transduktion-Transplantationsverfahren 6 erzeugt worden ist . Diese Mäuse eine essentielle Thrombozythämie-ähnliche Erkrankung mit einem erhöhten Blutplättchen, erhöhte Anzahl von Megakaryozyten und Knochenmarkfibrose entwickeln. Zusammen haben diese Modelle nicht nur bot die Gelegenheit, einen Einblick in die molekularen Pathogenese der MPN zu gewinnen, sondern auch die Fähigkeit Therapeutika in einer präklinischen Einstellung zu entwickeln und zu studieren.
Dieses Manuskript enthält eine detaillierte Beschreibung der Transduktion-Transplantation Methodik mit einem Schwerpunkt auf der CALRdel52 Mutation. Diese Technik beinhaltet die Transplantation von retroviral transduzierte Knochenmarkszellen exprimieren die Mutante in bestrahlte syngene Empfängermäuse konstruieren.
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Protocol
Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den Empfehlungen von der Institutional Animal Care und Use Committee an der University of California, Irvine genehmigt und durchgeführt. Alle Verfahren wurden unter Isofluran-Narkose durchgeführt und alle Anstrengungen unternommen wurden, Leiden zu minimieren.
1. Erzeugung von ekotropischen Retrovirus
- Bereiten hochwertige Plasmide mit einer Konzentration von mindestens 1 & mgr; g / & mgr; l entweder eine kommerzielle maxi-prep Kits oder Cäsiumchlorid-Reinigung verwendet wird.
HINWEIS: Dazu gehören ein MSCV Rückgrat Vektor codiert , das Gen von Interesse (in diesem Fall CALR 7,8) und Marker der Wahl (GFP, Neo, etc.) sowie eine ekotropischen Verpackung Plasmid, Codierung gag-pol-env (bezeichnet hier als Plasmid). - Tauen und erweitern Low-Passage 293T-Zellen in DMEM mit 10% FBS und L-Glutamin mit Penicillin / Streptomycin (D10) ergänzt. Platte 5 x 10 6 Zellen in einer 10 cm Gewebekultur-behandelte Schale in einem befeuchtetenGewebekultur - Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2.
- 293T-Zellen in Kultur erweitern. Am Tag vor der Transfektion, waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 1 ml PBS und absaugen Überstand in ein Vakuumflasche.
- Um Zellen trypsinize, 2 ml 0,05% Trypsin und Inkubation Gerichte in einem befeuchteten Gewebekultur - Inkubator für 2 - 3 min bei 37 ° C und 5% CO 2.
- So stoppen Sie Trypsinierung, 3 ml D10 auf Schüssel und Transfer-Zellen zu einem 15 ml konischen Röhrchen. Spin-Zellen bei 400 xg für 10 min.
- Absaugen Überstand in einen Vakuumkolben und resuspendieren Zellpellet in 2 ml D10.
- Zählen Sie die Zellen durch Trypanblau-Ausschluss unter Verwendung einer Zählkammer.
- Seed 2 x 10 6 Zellen pro Schale in drei 10 cm - Gewebekulturschalen pro behandelten Virus erzeugt.
HINWEIS: Für optimale Ergebnisse erlauben nicht die Zellen 30 zu überschreiten - 50% Konfluenz zum Zeitpunkt der Transfektion oder eine schlechte Virus Ausbeute erhalten werden kann. - Unmittelbar vor der Transfektionabsaugen Medien in eine Vakuumflasche und ersetzen mit 5 ml frischem D10.
- Für 10 cm Petrischale zu transfizierenden eine individuelle sterile 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen vorbereiten.
- Pipette 760 ul reduziert Serum Medien in jedes Mikrozentrifugenröhrchen, fügen Sie dann vorsichtig 40 ul Transfektionsreagenz direkt in den Medien. Die Röhrchen in der Gewebekultur-Haube bei Raumtemperatur für 5 min.
- In 30 ug MSCV Vektor mit Gen von Interesse (15 ug, wenn ein leerer Vektor verwendet wird) sowie 5 ug Plasmid zu jedem jeweiligen Rohr und vorsichtig mischen durch Pipettieren von oben und unten. Inkubieren bei Raumtemperatur in der Gewebekultur-Haube für weitere 15 min.
HINWEIS: Kleinere Vektoren höhere Virusausbeuten zu neigen. - Vorsichtig das Gesamtvolumen jeder Reaktion (etwa 800 ul) tropfenweise in die jeweiligen 10 cm Petrischale und sanft die Schale von einer Seite kippen zu mischen zu Seite. Rück Zellen an die befeuchtete Gewebe culture Inkubator.
- Nach einer 8 Stunden oder über Nacht Inkubation in Gewebekultur-Inkubator, absaugen Medien in eine Vakuumflasche und ersetzen vorsichtig mit 10 ml frischem D10.
- Bei 48 h nach der Transfektion Überstand in ein 35 ml-Spritze gesammelt und filtriert durch ein 0,45 um Membranzelltrümmer zu entfernen.
- OPTIONAL: Platz 10 ml frisch D10 zurück auf den 293T-Zellen und zusätzliche Virus kann bei 72 Stunden nach der Transfektion geerntet werden.
- Entsorgen 293T-Zellen in Biohazard Abfall, wenn keine zusätzlichen Virus gesammelt wird.
- Aliquotieren Virusüberstand in den einmaligen Gebrauch Volumina (zum Beispiel 1 ml für Virustiter oder 6,5 ml für BM-Infektion). Flash-Freeze-Virus mit flüssigem Stickstoff und Speicher-Virus bei -80 ° C.
Hinweis: Wiederholtes Einfrieren / Auftauen vermeiden , da sie stark Virustiter reduzieren.
2. Bestimmen Relative Virustiter von Flow Cytometry
- Thaw 3T3-Zellen und in D10 halten. Kultur der Zellen in einem 10 cmGewebekulturschale in einem befeuchteten Gewebekultur - Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2 behandelt.
- Führen Sie virale Titer in dreifacher Ausfertigung. Zur Herstellung von Zellen, waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 1 ml PBS und absaugen Überstand in ein Vakuumflasche.
- Um trypsinize Zellen, 2 ml 0,05% Trypsin und Inkubation Gerichte in einem befeuchteten Gewebekultur - Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2.
- So stoppen Sie Trypsinierung, 3 ml D10 auf Schüssel und Transfer-Zellen zu einem 15 ml konischen Röhrchen. Spin-Zellen bei 400 xg für 10 min.
- Absaugen Überstand in einen Vakuumkolben und resuspendieren Zellpellet in 2 ml D10.
- Zählen Sie die Zellen durch Trypanblau-Ausschluss unter Verwendung einer Zählkammer.
- Seed - 3T3 - Zellen bei einer Dichte von 1 x 10 5 Zellen in fünfzehn 60 mm Gewebekultur-behandelten Speisen und über Nacht inkubieren.
- Machen 1: 3, 1.10, 1.30 und 1: 100 Verdünnungen der aufgetauten viralen Überstand unter Verwendung von D10 in insgesamt 1 ml. Auch gehören eine virenfreie Kontrolle.
- absaugen michdia von 3T3-Zellen in einen Vakuumkolben und ersetzen mit 4 ml D10.
- Überlagern, die 3T3-Zellen mit den Verdünnungen des Virusüberstand und fügen Polybren bis zu einer Endkonzentration von 8 & mgr; g / ml zu jeder Schale. Inkubieren für 48 Stunden in der Gewebekultur - Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2.
- Bestimmen relativer Virustiter mittels Durchflusszytometrie:
- Um Zellen zu waschen, saugen die Medien in eine Vakuumflasche und mit 5 ml PBS.
- Saugen Sie das PBS in eine Vakuumflasche. 1 ml 0,05% Trypsin und Inkubation bei 37 ° C für 2 bis 5 min Zellen von Schale zu lösen.
- 3 ml D10 und Pipette nach oben und unten um alle verbleibenden Zellen von der Platte zu lösen. Übertragung der Zellen auf eine FACS-Röhrchen und zentrifugiert bei 400 xg für 10 min.
- Dekantieren Überstand und waschen Sie die Zellen mit 3 ml PBS. Zentrifuge bei 400 × g für 10 min und umfüllen Überstand. Resuspendieren in 200 ul PBS.
- Führen Zellen auf einem Durchflusszytometer 9. Sammeln Sie zwischen 20.000 - 30.000 Ereignisse innerhalb von ter leben Zell - Gate (bestimmt durch FSC gegen SSC) und berechnen Sie den Prozentsatz der GFP + und GFP - Zellen.
HINWEIS: Der Virustiter wird als akzeptabel angesehen , wenn die Verdünnung 01.30 viraler Überstand Ausbeuten von mindestens 50% GFP + 3T3 - Zellen. Wenn diese Verdünnung führt zu weniger als 50% GFP + Zellen dann suboptimale Transduktion Ergebnisse erhalten werden. Die Berechnung auf virale Titer Bestimmung wurde von Limon et al angepasst. , Blood (1997) 9. - Um zu bestimmen , relativ Virustiter, verwenden Sie die Gleichung: Virustiter = Partikelbildenden Einheiten (PFU) / ml = [(Anzahl der 3T3 - Zellen × Häufigkeit von GFP + Zellen) / Volumen der Überstand (ml)] × Verdünnungsfaktor.
3. transduzieren Spender-Knochenmarkzellen
- Um Spendermäuse für Knochenmark (BM) Ernte ersten Mäuse betäuben durch Isofluran Verdampfer mit einer Flussrate von 5% kombiniert zusätzliche VorbereitungSauerstoff bei 1 l / min. Pinch Fuß Ansprechbarkeit zu beurteilen.
HINWEIS: Donor - Mäuse (weniger als 8 Wochen alt) sollte 5 Tage vor der Ernte des Knochenmarks (8 Tage vor der Transplantation) hergestellt werden. Ein Spendermäuse genügend Zellen zur Verfügung stellen für mindestens zwei Empfänger. - Injizieren von 150 mg / kg 5-Fluorouracil (5-FU) über retro-orbitale Injektion an narkotisierten Mäusen unter Verwendung einer 27 G × ½ "Nadel.
VORSICHT! 5-FU ein Anti-Krebs-Chemotherapeutikum. Immer Griff 5-FU in einem zertifizierten chemischen Abzugshaube oder ein Abluft- Biosicherheitsschrank. Wenden Sie sich an den Labor- und Tierschutzausschuss des Instituts entsprechende Kennzeichnung von Mäusen, die mit 5-FU behandelt zu bestimmen.- Positionieren Sie den narkotisierten Maus auf die Seite und zurückhalten, indem Sie sowohl den Daumen und Zeigefinger, so dass das Auge leicht aus dem Kopf herausragt.
- Beginnend mit der Nadel seitlich zur inneren Augenwinkel und mit der Fase nach oben, legen Sie die Nadel in einem 45° Winkel in medialer Richtung und zu stoppen, wenn die Nadel zur Hälfte eingelegt ist. Langsam Zellen injizieren und sorgfältig Nadel entfernen entfernen.
HINWEIS: Wenn diese Technik richtig ausgeführt wird, sollte das Auge etwas einfahren und keinen Widerstand sollte bei Nadelung zu spüren sein. - Untersuchen Sie die Maus auf Anzeichen von Verletzungen wie Schwellungen oder Blutungen.
- Ernte-Knochenmark 5 Tage nach der 5-FU-Behandlung (3 Tage vor der Transplantation).
- Anästhesieren Mäuse durch Isofluran-Verdampfer mit einer Durchflussrate von 5% kombinierten zusätzlichem Sauerstoff bei 1 L / min. Pinch Fuß Ansprechbarkeit zu beurteilen.
- Sacrifice Maus durch Genickbruch. Sterilisieren Maus durch großzügig mit 70% EtOH Spritzen bis Fell nass wird.
- Mit einer Schere zu sezieren, machen einen Einschnitt in der Haut und sezieren aus der Beinmuskulatur der Faszie entfernt. Als nächstes sezieren von der Maus, das Bein weg durch den Femur an der Hüfte und der Tibia an dem Knöcheltrennen.
- Biegedas Bein in eine "L" -Form und trennen Sie die einzelnen Beinknochen, indem sie mit Dissektionsscheren am Kniegelenk zu schneiden.
- Um Knorpel an den distalen Enden jedes Beinknochen zu entfernen, verwenden Sie die Dissektionsscheren sanft Muskel zu einem Ende des Beinknochen kratzen, bis Knorpel ausgerückt ist.
- Unter Verwendung einer Spritze mit einer 27 G x ½ inch Nadel, ergänzt flush jedes Bein Knochen mit PBS mit 2% FBS über eine 100 uM Nylonmembran in einem 50 ml konischen Röhrchen. Flush Knochen, bis Knochen weiß wird die Anzahl der Zellen geerntet zu maximieren.
- Verwenden Sie den Kolben einer Spritze Zellen durch die Nylonmembran in die 50 ml konischen Röhrchen Maische eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Wiederholen Sie mit anderen Maus Bein.
- Zentrifugenzellen bei 4 ° C für 10 min bei 400 xg und Überstand verwerfen. Resuspendieren BM in 5 ml Ammoniumchlorid Kalium (ACK) -Puffer roten Blutkörperchen zu lysieren. Inkubieren Zellen auf Eis für 10 min.
- Füllen Sie Röhrchen mit PBS Zell-Lyse zu stoppen. Centrifuge Zellen bei 4 ° C für 10 min bei 400 xg und Überstand verwerfen. Wiederholen Sie die Lyse Schritt, wenn das BM-Pellet rote Farbe hat.
- Resuspendieren in 5 ml PBS und Zellen durch Trypanblau-Ausschluss zählen eine Zählkammer.
- Die Zellen bei 2 x 10 6 Zellen pro m mit 2x pre-stim Cocktail, enthält DMEM mit 20% FBS ergänzt, L-Glutamin, Penicillin / Streptomycin, IL-3 (14 ng / ml), IL-6 (24 ng / ml) und SCF (112 ng / ml). Plate 2 ml pro Vertiefung in 6-Well-Platten.
- Inkubieren der Zellen über Nacht bei 37 ° C und 5% CO 2.
- 2 ml Virusüberstand in jeder Vertiefung enthält, BM-Zellen und fügen Polybren (8 ug / ml). Spin-Platten bei 30 ° C für 90 min bei 1500 xg dann zurück Platte auf die über Nacht Inkubator Kultur Gewebe.
- Pipette Zellsuspension in konische Röhrchen und Zentrifuge bei 4 ° C für 10 min bei 400 · g, nicht verwerfen die Platte. Die Zellen in 2 ml frisch 2x pre-stim Cocktail pro Vertiefung und Rückkehr zu den ursprünglichen Brunnen. Führen Sie eine 2. spinoculation durch die Schritte 3,7-3,9 wiederholen.
4. Transplantations-Spenderzellen in Empfängermäuse
- Bereiten syngene Empfängermäuse für die Transplantation mit letalen Dosis Ganzkörperbestrahlung <24 h vor der Injektion von BM-Zellen.
HINWEIS: Lethal dose Bestrahlung für Balb / c - Mäusen ist in der Regel 800-900 cGy und 1000-1200 cGy für C57B / 6 10. Die Dosis wird in der Regel in zwei Sitzungen der Bestrahlung gespalten mindestens 3-4 Stunden Abstand. - Fortsetzung von Schritt 3.11 Ernte transduzierten Spenderzellen aus den 6-Well-Platten durch leichtes Überstand in konische Röhrchen pipettieren. Waschen Sie jede Vertiefung mit 1 ml PBS Restzellen zu sammeln und zu 50 ml konischen Röhrchen hinzufügen.
- 0,5 ml von 0,05% Trypsin in die Vertiefungen und Inkubieren bei 37 ° C in der Gewebekultur-Inkubator für 5 min.
- 1 ml D10 in die Vertiefungen und lösen alle verbleibenden Zellen durch vorsichtiges Pipettieren. Hinzufügen von Zellen zu dem jeweiligen Rohrs aus Schritt 4.2 und Pellet durch Zentrifugation bei 4 ° C für 10 min bei 400 x g.
- Wasche die Zellen mit PBS und Zentrifugation bei 4 ° C für 10 min bei 400 x g. Resuspendieren in 5 ml PBS und zählen Zellen einer Zählkammer durch Trypanblau-Ausschluss verwenden.
HINWEIS: Wenn der Vektor ein GFP - Tag hat dann quantifizieren den Prozentsatz der GFP-positiven Zellen mit einem Durchflusszytometer. - Resuspendieren 5 x Oktober 5-02 x 10 6 Zellen in 50 bis 100 & mgr; l PBS für die Injektion in Mäuse.
- Injizieren Zellen über retro-orbitale Injektion in narkotisierten Mäusen eine sterile 27 G x ½ "Nadel.
Hinweis: andere Injektionstechniken umfassen Schwanz-Vene, Milz- oder femoralis.- Anesthetize Maus Isofluran und Prise Fuß mit Ansprechbarkeit zu bewerten.
- Bewegen Sie die Maus auf die Seite und zurückhalten, indem Sie sowohl den Daumen und Zeigefinger, so dass das Auge leicht aus dem Kopf herausragt.
- Mit der Schräge nach oben ein, legen Sie die needle lateralen zur medialen Augenwinkel in einem 45 ° -Winkel.
HINWEIS: Wenn diese Technik richtig ausgeführt wird, sollte das Auge etwas einfahren und keinen Widerstand sollte bei Nadelung zu spüren sein. - Untersuchen Sie die Maus auf Anzeichen von Verletzungen wie Schwellungen oder Blutungen.
HINWEIS: Nach der Transplantation Mäuse werden für eine Reihe von Wochen niedrigen Blutbild und sind so anfällig für Infektionen. Prophylaxe mit Antibiotika oder die Verwendung von angesäuerten Wasser verwendet werden.
- Einen Monat nach der Transplantation, messen Sie die% GFP im peripheren Blut als Indikator für die transplantierten Spenderzellen mittels Durchflusszytometrie.
HINWEIS: GFP allein kann nicht den Erfolg der Transplantation der Zellen zu bestimmen. Die virale Transduktion konnten möglicherweise nicht noch Verpflanzung aufgetreten sind. In diesem Fall + keine GFP Zellen würde erkannt, aber engraftment der transplantierten Zellen erfolgreich war.- Nehmen Sie sich 10 ul peripheren Blut by Punktierung der Vena Beinvenen mit einem 21 G x 1 ½ "Spritze und fügen Sie es zu 100 mM EDTA in PBS Koagulation zu verhindern.
- 1 ml ACK an Blut und lyse auf Eis für 10 min. Pellet Zellen durch Zentrifugation bei 400 xg für 10 min.
- Überstand wird abgesaugt in einem Vakuumkolben und 1 ml PBS mit 2% FBS Lyse zu stoppen. Pellet Zellen durch Zentrifugation bei 400 xg für 10 min.
- Überstand wird abgesaugt in einem Vakuumkolben und Pellet in 100 ul PBS, ergänzt mit 2% FBS.
- Führen Sie Proben auf einem Durchflusszytometer und sammeln 300.000 Ereignisse innerhalb des Live - Zell - Gate (bestimmt durch FSC gegen SSC) und berechnen Sie den Prozentsatz der GFP + und GFP - Zellen 9.
- Zusätzlich nach 1 Monat nach der Transplantation, führen Sie ein komplettes Blutbild (CBC) , ein automatisiertes veterinär Hämatologieanalysator 18 mit Fortschreiten der Krankheit zu überwachen.
HINWEIS: Weiter Krankheit , die durch% zu überwachenGFP im peripheren Blut und monatlichen CBC. - Um das Experiment zu beenden, betäuben Maus mit Isofluran und Prise Fuß Ansprechbarkeit beurteilen. Sacrifice Maus durch Genickbruch und Ernte Milz und Knochenmark für die Histopathologie.
HINWEIS: Die Länge des Experiments ist subjektiv und das Abschlussdatum zu erwarten auf der Grundlage der Krankheits - Phänotyp beurteilt werden.
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Representative Results
Die Transduktion-Transplantationstechnik führt in hämatopoetische Rekonstitution der Empfängermäuse mit Zellen, die das Gen von Interesse exprimieren. Abbildung 1 zeigt einen Überblick über die transduktionsfertige Transplantation Mausmodell der Calretikulin mutiert MPN. Kurz gesagt, wird Retro CALRwt oder CALRdel52 exprimieren, verwendet BM-Zellen aus einem C57B / 6 Spendermaus zu infizieren. Transduzierten Zellen transplantiert in bestrahlten C57B / 6 Empfängermaus und Spenderzelle Verpflanzung tritt während des ersten Monats nach der Transplantation. Der Nachweis einer Krankheits-Phänotyp wird deutlich, 3 Monate nach der Transplantation, wo Mäuse zeigen Plättchen und Megakaryozyten erhöht, gefolgt von Knochenmarkfibrose bei 6 bis 10 Monate nach der Transplantation. Wenn Spenderzellen zu engraft scheitern, Maus Tod innerhalb der ersten 2 Wochen nach der Transplantation auftreten können. Neben der schlechten Injektion oder Trauma während der Injektion können auch andere technische Fehler verursachen schlechte Verpflanzung von Transduced-Zellen oder Maus Tod. Dazu gehören suboptimalen Bestrahlung von Empfängermäusen, wenn dies der Fall ist den meisten hämatopoetischen Zellen des Empfängers sein wird, eher als Spender Herkunft. übermäßige Bestrahlung der Empfänger auf der anderen Seite, können Mäuse verursachen, durch Strahlung verursachte Krankheit oder sogar zum Tod entwickeln. Niedrige virale Titer wird bei niedrigen Infektionseffizienz von Spenderzellen zur Folge haben. Als Folge geringer Anzahl von Spenderzellen, die das Gen von Interesse exprimieren und so Mäuse den gewünschten Phänotyp nicht zeigen kann. Aus diesem Grund ist es entscheidend, dass Virus mit hohem Titer verwendet wird Spenderzellen zu transduzieren. Figur 2 zeigt , wie relativen Virustiter zu berechnen , wo der GFP% von Ereignissen aus der Lebendzell Gate gesammelt wird berechnet. 2B veranschaulicht einen Titer mit mehr als einem Viruspartikel pro Zelle (1: 3 Verdünnung) sowie Titer mit einzelnen Viruspartikel pro Zelle (1:30, 1:10 und 1: 100 - Überstand). Im Idealfall wäre, um mindestens 50% GFP + -Zellen detected mit 01.30 Verdünnung der viralen Überstand. Abbildung 3 zeigt Beweise für eine erfolgreiche Transplantation Empfänger , wo CALRdel52 Mäuse eine MPN - Phänotyp mit erhöhter Blutplättchen zeigen, erhöhte Megakaryozyten im Knochenmark und Knochenmarkfibrose.
Abbildung 1: Übersicht über Transduction-Transplantation Maus - Modell der myeloproliferativen Neoplasmen. A) Retrovirus Erzeugung und Bestimmung von Virustiter tritt auf 1 - 2 Wochen vor der Transplantation. B) D (-8) (5 Tage vor der Knochenmarkernte), sind Spender Mäusen , die mit 5-FU Abstammungslinie determinierten Zellen zu verarmen und hämatopoetische Stammzellzyklus induzieren. C) D (-3), wird Knochenmark aus Beinknochen gewonnen und kultiviert in 2x über Nacht prä-stim Zellzyklus von hämatopoetischen Stammzellen zu induzieren. D) Spenderzellen sind mit viralen Überstand auf D infiziert (-2) und die Zellen bei 400 · g bei 30 ° C für 1,5 Std für die 1. spinoculation zentrifugiert. E) auf D (-1), eine 2. spinoculation auf Spenderzellen durchgeführt. Zusätzlich werden Mäuse bestrahlt, um Zellen in dem Wirtsknochenmark Nische abzureichern für Donorzelle engraftment zu ermöglichen. F) Transduzierte Spenderzellen werden in bestrahlte syngene Empfängermäuse auf D0 transplantiert. G) Wenn Spenderzellen dann wird von Tag 12 auftreten Tod engraft scheitern - 14 nach Transplantation , wenn tödliche Dosis der Bestrahlung verwendet wurde. H) Die MPN - Phänotyp wird spätestens 3 Monate nach der Transplantation deutlich. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 2: Bestimmung der Virustiter durch Durchflusszytometrie. 3T3-Zellen werden mit unterschiedlichen Konzentrationen von Virus und Transduktionseffizienz transduziert wird über Durchflusszytometrie überwacht. A) Die Ereignisse werden in der Live - Zell - Gate gesammelt , wie von FSC vs. SSC visualisiert. Tote Zellen werden von GFP Analyse ausgeschlossen. B) Histogramme zeigen% GFP für jedes Volumen von Virusüberstand getestet. Der Virustiter ist akzeptabel , wenn mindestens 50% der 3T3 - Zellen GFP + sind , wenn sie mit der Verdünnungs 01.30 viraler Überstand infiziert. Unter Verwendung der Gleichung von Schritt 2.11.6 wurde der Virustiter basierend auf einer Zellzahl von 400.000 Zellen berechnet. Die Berechnung für die virale Titer bei einer Verdünnung 01.30 folgt: [(400.000 x 0,56) / 1) x 30] = 6,72 x 10 & sup6 ; PFU / ml. Pro Schritt 3,7, Infizieren 4 x 10 6 Zellen mit 2 ml Virusüberstand in jeder Zelle führen würde , die 3 viralen Partikeln.iles / ftp_upload / 54624 / 54624fig2large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Der Nachweis der erfolgreichen Spenderzelle Engraftment und MPN Phänotyps. Bestrahlte Empfängermäuse über 2 Wochen nach der Transplantation überleben zeigt die erfolgreiche Verpflanzung von injizierten Zellen. A) Die transplantierten Spenderzellen können durch% GFP in peripherem Blut überwacht werden. B) Außerdem sollte CBC Zählwerte genommen Fortschreiten der Krankheit zu überwachen. Erhöhte Plättchen werden so früh wie 2 Monate nach der Transplantation in CALRdel52 erfasst wird, wenn zu CALRwt und leeren Vektorkontrolle verglichen. C) Zum Zeitpunkt der Beendigung zeigen CALRdel52 Mäuse klassischen Merkmale des MPN - Phänotyp einschließlich Splenomegalie (nicht dargestellt), Knochenmark Hyperzellularität, die Erweiterung der megakaryocytes im Knochenmark und Knochenmarkfibrose. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Technischer Fehler | Ursachen | Ergebnis |
| Schlechte Injektion oder Trauma | Transplantatabstoßung | Transplantatversagen |
| Schlechte Qualität von Spenderzellen | Transplantatabstoßung | Transplantatversagen oder Tod |
| Niedrige Virustiter | Schlechte Transduction von HSC | Transplantatversagen |
| Hohe Bestrahlungsdosis | Die Bestrahlung induzierten Krankheit | Tod |
| Low Bestrahlung Dose | Transplantatabstoßung | Transplantatversagen |
| Alte Spendermäuse (12 Wochen) | Low HSC-Eingang | Transplantatversagen |
Tabelle 1: Technische Fehler , die in Maus Tod oder Transplantatversagen führen kann. In dieser Tabelle sind Beispiele für technische Fehler und die damit verbundenen Ursachen, die mit Knochenmark-Transplantation Protokoll auftreten könnten.
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Discussion
Dieses Protokoll stellt eine detaillierte Beschreibung, wie Knochenmark-Transplantationen bei Mäusen führen ein wesentlicher thrombocythemia ähnliche Erkrankung mit Progression zu Myelofibrose mit CALRdel52 Mutation als Treiber der Krankheit zu rekapitulieren. Erfolgreiche Transplantation von Zellen CALRdel52 führt zu einer erhöhten Thrombozyten Expansion von Megakaryozyten und Knochenmarkfibrose exprimieren. Als Knochenmarktransplantation ein mehrstufiger Prozess ist, ist es wichtig, Maßnahmen zu erkennen, wo technische Fehler vermieden werden können schlechte Verpflanzung von Zellen Tod Expression des Gens von Interesse oder sogar die Maus zu verhindern.
Ein entscheidender Faktor für eine erfolgreiche transduktionsfertige Transplantationsmodell, das oft übersehen wird, ist die Qualität des Virus. Virus mit hohen Titern ermöglicht eine gute Übertragungseffizienz und damit eine starke Basis für Krankheit, während ein Virus mit niedrigem Titer im Zusammenhang verwendet, wird in weniger Zellen zur Folge haben, die das Gen von Interesse exprimieren. transduction efficiparenz kann durch Reagenzien verbessert werden, die den Kontakt zwischen Virus erhöhen und Zellen wie Polybren und retronectin. Transduktion von HSCs bekannt ist schwierig, selbst mit hohen Konzentrationen an Virus zu sein, nur ecotropen Retrovirus infiziert teilende Zellen. Der Zweck der "pre-stim" Medien (mit SCF, IL-3 und IL-6) ist cycling ruhender HSCs zu induzieren. Die lentiviralen System könnte als Alternative verwendet werden, wenn die Infektion von sich nicht teilende Zellen notwendig ist.
Ein weiterer Faktor, der eine Auswirkung auf die Viruserzeugung haben kann, ist die Art des Transfektionsreagenz verwendet. Optimale Transfektionsreagentien sollte empirisch bestimmt werden, wie deutliche Unterschiede in der Zelltoxizität wurden zwischen Forschungsgruppen beobachtet. Das Transfektionsreagenz verwendet hier in einem guten Virusausbeute bei geringer Zelltoxizität geführt. Andere häufige Transfektionsreagentien umfassen Calciumphosphat 11 und nicht - liposomalen Transfektionsreagenz wie Fugene. Dieses Protokoll verwendet Plasmid alsdie Verpackungsvektor mit spezifischen Gewebe trophisms für Maus und Ratte. Wenn im Hinblick auf andere Tiermodelle für transduktionsfertige Transplantation, andere Verpackungs Vektoren mit breiter trophisms auch verwendet werden könnten amphotrophen (Maus, Ratte, Mensch) oder pantrophic (breites Spektrum trophisms) Retrovirus zu erzeugen.
Ein zusätzlicher Vorteil für die transduktionsfertige Transplantationsmodell Knochenmark ist die Fähigkeit, den Wettbewerbsvorteil von zwei verschiedenen Spenderpopulationen untersuchen oder mit einzigartigen Marker mehrere Gene von Interesse gleichzeitig zum Ausdruck bringen jede Population von Interesse zu bezeichnen. Solche Transplantate verwenden häufig kongenen C57BL / 6-Mäuse Spenderzellen über die Verwendung eines integrierten GFP-Marker zu verfolgen. Weil kongenen C57BL / 6-Mäuse für Leukozyten-Marker entweder CD45.1 oder CD45.2 exprimieren können, können Spenderzellen von einem Hintergrund und transplantiert in die andere erhalten werden. Darüber hinaus kann ein Hybrid-F1-Stamm erzeugt werden, Nachkommen zu produzieren sowohl CD45.1 und CD45.2 ausdrückenMarker. Alternativ ist die MSCV retroviraler Vektor mit verschiedenen Tags, einschließlich unicistronic (zB FLAG HA) oder bicistronischen (zB GFP, RFP, YFP, mCherry, hCD4) konstruiert. Diese Konstrukte können gleichzeitig in Wettbewerbs Transplantationen verwendet werden, Diskriminierung unter Spenderpopulationen zu ermöglichen und vor allem nützlich sein kann in Situationen, in denen die Differenzierung über CD45.1 / CD45.2 Ausdruck ist nicht verfügbar, wie die Balb / c-Maus-Stamm.
Ein weiterer Vorteil der Transduktion der Transplantation ist die Möglichkeit, die Beiträge von spezifischen Zelltypen zu Krankheitsinitiations zu untersuchen. Während dieses Protokoll nur die transduktionsfertige Transplantation ganzer Knochenmark, andere experimentelle Designs beschreibt die Anreicherung oder Isolation der verschiedenen HSC Fächer erforderlich machen. In diesen Fällen variiert die Anzahl von Spenderzellen entsprechend der spezifischen Spenderpopulation verwendet. Zusätzlich Rettungs Zellen von einem gesunden Donor solltezu unterstützen, kann die Maus, bis HSC Verpflanzung und Expansion auftreten als Ergänzung verwendet werden. Tabelle 2 führt die empfohlene Anzahl von Spenderzellen für die Transplantation der verschiedenen Knochenmark Fächer 12 bis 15.
| Anzahl der Zellen / Transplantations - Empfänger | Anzahl der Support - Zellen / Transplantation Empfänger | |
| Gesamtknochenmark | 500,000-2,000,000 | n / a |
| c-Kit + | 1000-10000 | 200.000 |
| Lin-c-Kit + Sca-1 + (LKS) | 100-10000 | 200.000 |
| LKS CD150 + CD48 - SP | 1-100 | 200.000 |
| LKS CD150 + CD34 - | 1-100 | 200.000 |
Tabelle 2. Anzahl von Spenderzellen zu verpflanzen.
Darüber hinaus können auch sekundäre Transplantation durchgeführt werden, die Fähigkeit von transduzierten Zellen zu bewerten, seriell Krankheit verpflanzen.
Transduktion-Transplantation ist ein sehr vielseitiges Verfahren, das viel schneller und wesentlich kostengünstiger ist, als im Vergleich zu transgenen, Knock-in oder Xenograft-Modellen. Es ermöglicht einen schnell zu bestimmen , ob das interessierende Gen ausreicht, um eine hämatologische Malignität zu induzieren, und kann als ein in vivo präklinischen Modell verwendet werden , um Medikamente zu testen. Weitere Vorteile der transduktionsfertige Transplantationstechnik sind, dass sie die Expression in nicht-hämatopoetischen Zellen vermeidet und dass die retroviralen Insertionsstelle dient als klonalen Marker. Einschränkungen dieser Technik include unphysiologische Mengen an transduzierten Gens und Unterschieden in der Integrationsstelle des Gens 16,17. Unter Berücksichtigung all der oben genannten Vorteile und Einschränkungen zu berücksichtigen, transduktionsfertige Transplantation ist die offensichtliche Wahl für die anfängliche In - vivo - Modellierung von mutmaßlichen hämatopoetischen Onkogene.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Lines | |||
| DMEM | Corning | MT-10-013-CV | |
| 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| 3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | |
| Plasmids | |||
| EcoPak, also known as pCL-Eco | Addgene | 12371 | Retroviral packaging cell lines, such as EcoPack 2-293, may be used in place of the EcoPak plasmid and standard 293T cells. Additional γ-retrovirus envelope and packaging plasmids are available from Addgene and others. |
| MSCV-IRES-GFP (MIG) | Addgene | 20672 | Additional γ-retroviral transfer plasmids are available from Addgene and others. |
| Consumables | |||
| 27 G x 1/2" needles | BD | 305620 | |
| Fetal bovine serum | Corning | MT-35-010-CV | |
| Penicillin/streptomycin/L-glutamine | Corning | MT-30-009-CI | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Corning | MT-25-052-CI | Can be homemade |
| PBS | Corning | MT-21-031-CV | |
| 10 cm dishes | Fisher | 172931 | |
| 15 ml conical tubes | Fisher | 12565268 | |
| 60 mm dishes | Fisher | 150288 | |
| Polybrene | Fisher | NC9840454 | |
| 5-FU | Fisher | A13456-06 | |
| 100 µm cell strainers | Fisher | 22363549 | |
| 50 ml conical tubes | Fisher | 12565270 | |
| 6-well plate | Fisher | 130184 | |
| FACS tubes | Fisher | 14-959-5 | |
| 0.45 μm syringe filters | Fisher | 0974061B | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | |
| ACK buffer | Lonza | 10-548E | Can be homemade |
| Recombinant murine IL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| Recombinant murine IL-6 | Peprotech | 216-16 | |
| Recombinant murine SCF | Peprotech | 250-03 | |
| X-tremeGENE 9 | Roche | 6365809001 | Transfection reagent |
| 1.5 ml centrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Equipment | |||
| BD Accuri C6 | |||
| X-ray irradiator |
References
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