Introduction
Transduktion-transplantation är en användbar metod för att modellera hematologiska maligniteter hos möss. Denna teknik har varit särskilt värdefull för att studera myeloida maligniteter som går tillbaka till den första demonstrationen att ektopiskt uttryck av BCR-ABL1 troget kan rekapitulera kronisk myeloisk leukemi hos möss 1. Denna teknik har därefter underlättat omfattande studie av JAK2 V617F och MPL W515K / L muterade myeloproliferativ tumör (MPN).
MPN är en grupp av hematologiska maligniteter som kännetecknas av överproduktionen av mogna myeloidceller och benmärgsfibros. Dessa sjukdomar uppstår i allmänhet från klonal expansion av en hematopoetisk stamcellstransplantation som har förvärvat en somatisk mutation i antingen JAK2, MPL eller CALR. Transduktion-transplantation JAK2 V617F och MPL W515K / L modeller uppvisar de kliniska egenskaperna hos polycytemia vera och myelofibros 2-5 </ Sup>. Nyligen har en musmodell för calreticulin-muterade MPN också genererats med transduktion transplantation metod 6. Dessa möss utvecklar en essentiell trombocytemi liknande sjukdom med ökad blodplättar, ökat antal megakaryocyter och benmärgsfibros. Tillsammans har dessa modeller inte bara ges möjlighet att få en inblick i den molekylära patogenesen av MPN, men också förmågan att utveckla och studera läkemedel i en pre-klinisk miljö.
Detta manuskript ger en detaljerad beskrivning av transduktion transplantation metodik med fokus på CALRdel52 mutationen. Denna teknik innebär transplantation av retroviralt transducerade benmärgsceller som uttrycker mutant-konstruktionen i bestrålade syngena mottagaren möss.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna studie godkändes och genomförs i enlighet med rekommendationerna från Institutional Animal Care och användning kommittén vid University of California, Irvine. Alla förfaranden utfördes under isoflurananestesi och alla ansträngningar gjordes för att minimera lidandet.
1. Framställning av ekotropa retrovirus
- Framställa högkvalitativa plasmider med en koncentration av minst 1 | j, g / | al med användning av antingen en kommersiell maxi-prep kit eller cesiumklorid rening.
OBS: Dessa inkluderar en MSCV ryggrad vektor som kodar genen av intresse (i detta fall CALR 7,8) och markör för val (GFP, Neo, etc.) samt en ekotropa packande plasmid, som kodar för gag-pol-env (som avses här som plasmid). - Tö och expandera låg-passage 293T-celler i DMEM kompletterat med 10% FBS och L-glutamin med penicillin / streptomycin (D10). Plattan 5 x 10 6 celler i en 10 cm vävnadsodlingsbehandlade skålen i en fuktadvävnadsodlingsinkubator vid 37 ° C och 5% CO2.
- Expandera 293T-celler i odling. På dagen före transfektion, tvätta cellerna genom att tillsätta 1 ml PBS och aspirera supernatanten i en vakuumkolv.
- Att trypsinize celler, tillsätt 2 ml 0,05% trypsin och inkubera rätter i en fuktig vävnadsodlingsinkubator till 2 - 3 min vid 37 ° C och 5% CO2.
- För att stoppa trypsinisering, tillsätt 3 ml D10 att dela och överföra celler till en 15 ml koniska rör. Snurra cellerna vid 400 xg under 10 min.
- Aspirera supernatanten i en termos och resuspendera cellpelleten i 2 ml D10.
- Räkna cellerna genom trypanblått uteslutning med användning av en hemocytometer.
- Seed 2 x 10 6 celler per skål i tre 10 cm vävnadskulturbehandlade rätter per virus genereras.
OBS: För bästa resultat, inte tillåta cellerna att överstiga 30 - 50% sammanflödet vid tidpunkten för transfektion eller en dålig virusutbyte kan erhållas. - Omedelbart före transfektion,Aspirera media i en termos och ersätta med 5 ml färsk D10.
- För varje 10 cm petriskål som skall transfekteras förbereda en individuell steril 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Pipett 760 pl minskade serum media i varje mikrocentrifugrör, då försiktigt 40 pl transfektionsreagens direkt i mediet. Inkubera rören i vävnadsodling huven vid rumstemperatur under 5 min.
- Tillsätt 30 | j, g av MSCV vektor med genen av intresse (15 ^ g om man använder tom vektor) samt 5 ^ g av plasmid till varje respektive rör och blanda försiktigt genom att pipettera upp och ned. Inkubera vid rumstemperatur i vävnadsodling huven under ytterligare 15 min.
OBS: Mindre vektorer tenderar att ha högre virala utbyten. - Tillsätt försiktigt den totala volymen av varje reaktion (ca 800 | j, l) droppvis till dess respektive 10 cm petriskål och försiktigt luta skålen från sida till sida för att blanda. Återgå celler till fuktad vävnads culture inkubator.
- Efter en åtta timmar eller över natten inkubation i vävnadskultur inkubator, aspirera media i en termos och försiktigt ersätta med 10 ml färsk D10.
- Vid 48 h efter transfektion samla supernatanten i en 35 ml spruta och filtrera genom ett 0,45 | im membran för att avlägsna cellrester.
- EXTRA: Placera 10 ml färsk D10 tillbaka på 293T-celler och ytterligare viruset kan skördas vid 72 timmar efter transfektion.
- Avyttra 293T celler i biologiskt avfall när ingen ytterligare virus samlas.
- Fördela viral supernatant i engångs volymer (t ex 1 ml för virustiter eller 6,5 ml för BM-infektion). Flash-freeze-virus med flytande kväve och lagra virus vid -80 ° C.
OBS: Undvik upprepad frysning / upptiningscykler som de kraftigt minska virus titer.
2. Bestäm Relativ virustiter med flödescytometri
- Tina 3T3-celler och underhålla i D10. Kultur cellerna i en 10 cmvävnadsodlingsbehandlade skålen i en fuktad vävnadskulturinkubator vid 37 ° C och 5% CO2.
- Utför virustiter i tre exemplar. För att framställa cellerna, tvätta cellerna genom att tillsätta 1 ml PBS och aspirera supernatanten i en vakuumkolv.
- Att trypsinize celler, tillsätt 2 ml 0,05% trypsin och inkubera rätter i en fuktig vävnadsodlingsinkubator vid 37 ° C och 5% CO2.
- För att stoppa trypsinisering, tillsätt 3 ml D10 att dela och överföra celler till en 15 ml koniska rör. Snurra cellerna vid 400 xg under 10 min.
- Aspirera supernatanten i en termos och resuspendera cellpelleten i 2 ml D10.
- Räkna cellerna genom trypanblått uteslutning med användning av en hemocytometer.
- Frö 3T3-celler vid en densitet av 1 x 10 5 celler till femton 60 mm vävnadskulturbehandlade rätter och inkubera över natten.
- Gör 1: 3, 1:10, 1:30 och 1: 100 späd av den upptinade viral supernatant med hjälp av D10 i totalt 1 ml. Också innehålla en virusfri kontroll.
- aspirera migdia från 3T3-celler i en termos och ersätta med 4 ml D10.
- Överlagra de 3T3-celler med utspädningar av viral supernatanten och till polybren till en slutlig koncentration av 8 | ig / ml till varje skål. Inkubera under 48 h i vävnadsodlingsinkubator vid 37 ° C och 5% CO2.
- Bestämma relativ virustiter genom flödescytometri:
- Att tvätta celler, aspirera media i en termos och tillsätt 5 ml PBS.
- Aspirera PBS i en vakuumflaska. Tillsätt 1 ml 0,05% trypsin och inkubera vid 37 ° C under 2-5 min för att lösgöra cellerna från skålen.
- Tillsätts 3 ml D10 och pipettera upp och ned för att lösgöra eventuella kvarvarande celler från plattan. Överföra celler till en FACS-rör och centrifugera vid 400 xg under 10 min.
- Dekantera supernatanten och tvätta cellerna med 3 ml PBS. Centrifugera vid 400 xg under 10 min och dekantera supernatanten. Återsuspendera i 200 pl PBS.
- Kör celler på en flödescytometer 9. Samla mellan 20.000 - 30.000 händelser inom than lever cell grind (bestäms av FSC mot SSC) och beräkna andelen GFP + och GFP - celler.
OBS: Den virala titer anses acceptabelt när det 1:30 utspädning av virus supernatant ger åtminstone 50% GFP + 3T3-celler. Om denna utspädning resulterar i mindre än 50% GFP + celler då suboptimala överförings resultat kan erhållas. Beräkningen för att bestämma viral titer anpassades från Limon et al. , Blood (1997) 9. - För att bestämma relativ virustiter, använda ekvationen: virustiter = partikelbildande enheter (PFU) / ml = [(antal 3T3 Celler × Frekvens av GFP + celler) / Volym av supernatant (ml)] x utspädningsfaktor.
3. omvandla givarbenmärgsceller
- För att förbereda donatormöss för benmärg (BM) skörd, först söva möss genom isofluran förångare med en flödeshastighet på 5% kombinerad kompletterandesyre vid 1 L / min. Nyp foten för att bedöma responsen.
OBS: donatormöss (mindre än 8 veckor gamla) bör förberedas 5 dagar före benmärgs skörd (8 dagar före transplantation). En donatormöss kommer att tillhandahålla tillräckligt med celler under minst 2 mottagare. - Injicera 150 mg / kg 5-fluorouracil (5-FU) via retro-orbital injektion i bedövade möss med hjälp av en 27 G x ½ "nål.
FÖRSIKTIGHET! 5-FU en anti-kemoterapeutiskt medel mot cancer. Hantera alltid 5-FU i en certifierad dragskåp eller en tunnel biosäkerhet skåp. Rådgör med institutionens laboratorium och djur skyddskommitté för att bestämma lämplig märkning av möss som behandlats med 5-FU.- Placera sövda musen på dess sida och hålla tillbaka genom att använda både tummen och pekfingret, så att ögat utskjuter något från huvudet.
- Från och med nålen i sidled till mediala ögonvrå och med det koniska uppåt, in nålen i 45° vinkel i den mediala riktningen och slutar när nålen är halvvägs in. Långsamt injicera celler och ta försiktigt bort nålen.
OBS: Om denna teknik utförs korrekt, bör ögat dras något och inget motstånd skall kännas vid nålinförande. - Undersök musen för några tecken på skador, såsom svullnad eller blödning.
- Skörd benmärg 5 dagar efter 5-FU-behandling (3 dagar före transplantation).
- Söva möss genom isofluran förångare med en flödeshastighet på 5% kombinerad extra syrgas vid ett L / min. Nyp foten för att bedöma responsen.
- Offra musen genom cervikal dislokation. Sterilisera musen genom att spraya generöst med 70% EtOH tills päls blir våt.
- Med hjälp dissekera sax, gör ett snitt i huden och dissekera fascian bort från benmusklerna. Därefter dissekera benet bort från musen genom att bryta lårbenet vid höften och skenbenet vid ankeln.
- Böjabenet i en "L" -form och separera varje ben ben genom att skära vid knäleden med dissekera sax.
- För att ta bort brosk vid de distala ändarna av varje ben ben, använd dissekera sax för att försiktigt skrapa muskler mot ena änden av benet ben tills brosk är urkopplad.
- Med hjälp av en spruta med en 27 G x ½ tum nål, spola varje ben ben med PBS kompletterat med 2% FBS över 100 iM nylonmembran i en 50 ml koniska rör. Spola ben tills ben blir vit för att maximera antalet celler som skördats.
- Använd kolven hos en spruta för att mosa celler genom nylonmembranet in i 50 ml koniska rör för att erhålla en enkelcellsuspension. Upprepa med andra mus benet.
- Centrifugera cellerna vid 4 ° C under 10 min vid 400 xg och kassera supernatanten. Resuspendera BM i 5 ml ammoniumklorid kalium (ACK) buffert för att lysera röda blodkroppar. Inkubera cellerna på is under 10 min.
- Fyll röret med PBS för att stoppa cellys. centriFuge celler vid 4 ° C under 10 min vid 400 xg och kassera supernatanten. Upprepa lys steg om BM pellets har röd färg.
- Resuspendera i 5 ml PBS och räkna cellerna genom trypanblått-uteslutning med användning av en hemocytometer.
- Återsuspendera celler vid 2 x 10 6 celler per m med 2x pre-stim cocktail som innehåller DMEM kompletterat med 20% FBS, L-glutamin, penicillin / streptomycin, IL-3 (14 ng / ml), IL-6 (24 ng / ml), och SCF (112 ng / ml). Plattan 2 ml per brunn i 6-brunnsplattor.
- Inkubera cellerna över natten vid 37 ° C och 5% CO2.
- Tillsätt 2 ml av viral supernatant till varje brunn innehållande BM-celler och tillsätt polybren (8 ug / ml). Spin plattorna vid 30 ° C under 90 min vid 1500 xg återgår sedan plattan till vävnadsodlingsinkubator över natten.
- Pipett cellsuspension i koniska rör och centrifugera vid 4 ° C under 10 min vid 400 xg, kassera inte plattan. Resuspendera cellerna i 2 ml färskt 2x pre-stim cocktail per brunn och återgå till de ursprungliga brunnarna. Utför en 2: a spinoculation av steg 3,7-3,9 upprepas.
4. Transplant givarceller in i mottagarmöss
- Förbered syngena mottagande möss för transplantation med dödlig dos helkroppsbestrålning <24 h före injektion av BM-celler.
OBS: Dödlig dos strålning för BALB / c-möss är typiskt 800-900 cGy och 1000-1200 cGy för C57B / 6 10. Dosen är normalt uppdelad i två sessioner bestrålning åtskilda åtminstone 3-4 timmars mellanrum. - Fortsättning från steg 3,11, skörd omvandlade givarceller från plattor med 6 brunnar genom att försiktigt pipettera supernatanten i koniska rör. Tvätta varje brunn med 1 ml PBS för att samla in kvarvarande celler och lägga till 50 ml koniska rör.
- Tillsätt 0,5 ml av 0,05% trypsin till brunnar och inkubera vid 37 ° C i vävnadsodlingsinkubator under 5 min.
- Tillsätt 1 ml D10 till brunnar och lossa eventuella kvarvarande celler genom försiktig pipettering. Lägg celler till respektive rörs från steg 4,2 och pellet genom centrifugering vid 4 ° C under 10 min vid 400 x g.
- Tvätta cellerna med PBS och centrifugera vid 4 ° C under 10 min vid 400 x g. Resuspendera i 5 ml PBS och räkna celler med hjälp av en hemocytometer av trypan blå utslagning.
OBS: Om vektorn har en GFP tag sedan kvantifiera andelen GFP-positiva celler med en flödescytometer. - Resuspendera 5 x 10 5 - 2 x 10 6 celler i 50-100 pl PBS för injektion i möss.
- Injicera celler via retroorbital injektion i sövda möss med användning av en steril 27 G x ½ "nål.
OBS: Andra injektionsteknik inkluderar tail-ven, mjälten eller lårbens.- Söva musen med isofluran och nypa foten för att bedöma responsen.
- Placera musen på dess sida och hålla tillbaka genom att använda både tummen och pekfingret, så att ögat utskjuter något från huvudet.
- Med koniska uppåt, sätt needle lateralt till den mediala ögonvrå vid en 45 ° vinkel.
OBS: Om denna teknik utförs korrekt, bör ögat dras något och inget motstånd skall kännas vid nålinförande. - Undersök musen för några tecken på skador, såsom svullnad eller blödning.
OBS: efter transplantation möss har låga blodvärden för ett antal veckor och så är mottagliga för infektion. Profylax med antibiotika eller användning av surgjort vatten kan användas.
- En månad efter transplantation, mäta% GFP i det perifera blodet som en indikator för engrafted givarceller genom flödescytometri.
OBS: ensam GFP kan inte avgöra framgången för inympning av cellerna. Den virala överföring kan ha misslyckats ännu engraftment kan ha inträffat. I detta fall skulle inga GFP + celler detekteras, men inympning av de transplanterade cellerna var framgångsrik.- Ta 10 pl perifert blod by punktera vena benet ven med en 21 G x 1 ½ "spruta och lägga till 100 mM EDTA i PBS för att förhindra koagulering.
- Tillsätt 1 ml ACK till blod och lysera på is under 10 min. Pelletera celler genom centrifugering vid 400 xg under 10 min.
- Sug ut supernatant i en vakuumflaska och tillsätt 1 ml PBS kompletterad med 2% FBS att stoppa lys. Pelletera celler genom centrifugering vid 400 xg under 10 min.
- Sug ut supernatant i en termos och återsuspendera pelleten i 100 pl PBS kompletterad med 2% FBS.
- Kör prover på en flödescytometer och samla 300.000 händelser inom levande celler gate (bestäms av FSC mot SSC) och beräkna andelen GFP + och GFP - celler 9.
- Dessutom på en månad efter transplantation, utföra fullständigt blodstatus (CBC) med hjälp av en automatiserad veterinär hematologianalysator 18 för att övervaka sjukdomsförloppet.
OBS: Fortsätta att övervaka sjukdom genom%GFP i perifert blod och CBC månadsvis. - För att avsluta försöket, söva musen med isofluran och nypa foten för att bedöma responsen. Offra musen genom cervikal dislokation och skörd mjälte och benmärg för histopatologi.
OBS: Längden av experimentet är subjektiv och bör bedömas datum uppsägning baseras på sjukdomsfenotyp förväntat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Transduktionen-transplantationsteknik resulterar i hematopoietisk återuppbyggnad av de mottagande mössen med celler som uttrycker den intressanta genen. Figur 1 visar en översikt av transduktion transplantation musmodell av kalretikulin muterade MPN. Kortfattat, retrovirus som uttrycker CALRwt eller CALRdel52 används för att infektera BM-celler från en C57B / 6 donator mus. Transducerade celler transplanteras i bestrålade C57B / 6 mottagaren mus och donatorcellen engraftment inträffar under den första månaden efter transplantation. Bevis på en sjukdomsfenotyp blir uppenbara 3 månader efter transplantationen där möss uppvisar ökad blodplättar och megakaryocyter, följt av benmärgsfibros vid 6 - 10 månader efter transplantation. Om givarceller inte ympa kan död mus inträffar inom de första 2 veckorna efter transplantation. Förutom dålig injektion eller trauma under injektion kan andra tekniska fel orsaka dålig inympning av omvandlad celler eller död mus. Dessa inkluderar suboptimala bestrålning av mottagande möss, om detta inträffar mest hematopoetiska celler kommer att vara mottagare snarare än givare ursprung. Å andra sidan kan överdriven bestrålning av mottagare orsakar möss att utveckla bestrålning-inducerad sjukdom eller dödsfall. Låga virala titrar kommer att resultera i låg infektionseffektivitet av givarceller. Som en konsekvens låga antal av donatorceller kommer att uttrycka genen av intresse och så möss kan inte påvisa den önskade fenotypen. Av denna anledning är det viktigt att virus med höga titrar användes för att transducera givarceller. Figur 2 visar hur man beräknar relativ virustiter där% GFP beräknas utifrån händelser som samlats in från den levande cellen gate. Figur 2B illustrerar en titer med mer än en viruspartikel per cell (1: 3 spädning) samt titrar med enstaka viruspartiklar per cell (1:30, 1:10, och 1: 100 supernatant). Helst skulle åtminstone 50% GFP + celler vara detektionsTed med 1:30 utspädning av virusvätskan. Figur 3 visar tecken på en lyckad transplantation mottagare där CALRdel52 möss uppvisar en MPN fenotyp med ökad blodplättar ökade megakaryocyter i benmärgen, och benmärgsfibros.
Figur 1: Översikt över Transduktion-Transplantation musmodell av Myeloproliferativa neoplasier. A) Retrovirus generation och bestämning av virustiter sker 1 - 2 veckor före transplantation. B) D (-8) (fem dagar före benmärgs skörd) är donator möss som behandlats med 5-FU att utarma härstamnings begått celler och inducera hematopoetisk stamcellstransplantation cykling. C) Den D (-3), är benmärg skördas från ben ben och odlades i 2x pre-stim över natten för att inducera cellcykling av hematopoetiska stamceller. D) givarceller infekteras med viral supematant på D (-2) och cellerna centrifugerades vid 400 xg vid 30 ° C under 1,5 h för en st spinoculation. E) Den D (-1), är en 2: a spinoculation utförs på givarceller. Dessutom, möss bestrålas att utarma celler i värdbenmärgs nisch för att möjliggöra donatorcellen engraftment. F) Omvandlade givarceller transplanteras till bestrålade syngena mottagaren möss på D0. G) Om givarceller inte ympa sedan döden kommer att inträffa vid dag 12-14 efter transplantation om dödlig dos strålning har använts. H) Den MPN fenotyp blir tydlig efter 3 månader efter transplantation. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
jpg "/>
Figur 2: Bestämning av virustiter med flödescytometri. 3T3-celler transducerades med olika koncentrationer av virus och transduktionseffektiviteten övervakas via flödescytometri. A) Händelser samlas i levande celler porten som visualiseras genom FSC kontra SSC. Döda celler är undantagna från GFP analys. B) Histogram visar% GFP för varje volym av viral supernatant testas. Virustiter är acceptabelt när åtminstone 50% av 3T3-celler är GFP + när infekterade med 1:30 utspädning av virusvätskan. Med hjälp av ekvationen från steg 2.11.6, var virustiter beräknas på ett celltal av 400.000 celler. Beräkningen för viral titer på 1:30 utspädning på följande sätt: [(400.000 x 0,56) / 1) x 30] = 6,72 x 10 6 PFU / ml. Per steg 3,7, infektera 4 x 10 6 celler med 2 ml viral supematant skulle resultera i varje cell som tar emot 3 viruspartiklar.iles / ftp_upload / 54624 / 54624fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Bevis på framgångsrik Donor Cell Engraftment och MPN Fenotyp. Bestrålade mottagarmöss överlevande efter 2 veckor efter transplantation indikerar framgångsrik engraftment av injicerade celler. A) Transplanterade donatorceller kan övervakas genom% GFP i perifert blod. B) Dessutom bör CBC räknas vidtas för att övervaka sjukdomsförloppet. Ökade blodplättar upptäcks så tidigt som två månader efter transplantation i CALRdel52 jämfört med CALRwt och tom vektor kontroll. C) Vid tidpunkten för uppsägningen, CALRdel52 möss uppvisar klassiska funktioner i MPN fenotypen inklusive splenomegali (ej visad), benmärgs hypercellularity, utbyggnad av megakaryocytes i benmärgen, och benmärgsfibros. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| tekniskt fel | orsaker | Resultat |
| Dålig Injection eller Trauma | transplantatavstötning | transplantation Underlåtenhet |
| Dålig kvalitet givarceller | transplantatavstötning | Transplantation misslyckande eller död |
| Låg Virustiter | Dålig Transduktion av HSC | transplantation Underlåtenhet |
| Hög strålningsdos | Bestrålning inducerad sjukdom | Död |
| Låg Bestrålning DoSE | transplantatavstötning | transplantation Underlåtenhet |
| Gamla givarmöss (+12 veckor) | Låg HSC Input | transplantation Underlåtenhet |
Tabell 1: Tekniska fel som kan leda till mus Död eller Trans Fel. Denna tabell visar exempel på tekniska fel och tillhörande orsaker som kan uppstå med benmärgstransplantation protokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll ger en detaljerad beskrivning av hur man utför benmärgstransplantationer i möss för att rekapitulera en essentiell trombocytemi liknande sjukdom med progression till myelofibros med CALRdel52 mutation som förare av sjukdomen. Lyckad transplantation av celler som uttrycker CALRdel52 resulterar i ökade blodplättar, expansion av megakaryocyter, och benmärgsfibros. Som benmärgstransplantation är en flerstegsprocess, är det viktigt att erkänna steg där tekniskt fel kan undvikas för att förhindra dålig ympning av celler som uttrycker genen av intresse eller ens död mus.
En kritisk faktor för en lyckad överföring transplantation modell som ofta förbises är kvaliteten på viruset. Virus med höga titrar underlättar god omvandlingseffektivitet och därmed en stark grund för sjukdom, medan användning av ett virus i samband med låg titer kommer att resultera i färre celler som uttrycker genen av intresse. Transduction efficivitet kan förbättras genom reagens som ökar kontakt mellan virus och celler, såsom polybren och retronectin. Transduktion av HSC: er är kända för att vara svårt även med höga koncentrationer av virus, bara ekotropiska retrovirus infekterar delande celler. Syftet med "pre-Stim" media (innehållande SCF, IL-3 och IL-6) är att förmå cykling av vilande HSCs. Lentiviral-systemet skulle kunna användas som en annan metod om infektion av icke-delande celler är nödvändig.
En annan faktor som kan ha en effekt på virusgenerering är den typ av transfektion använda reagenset. Optimala transfektionsreagens bör bestämmas empiriskt som markerade skillnader i celltoxicitet har observerats mellan forskargrupper. Transfektion reagens som används här har resulterat i god viral utbyte med toxicitet låg cell. Andra vanliga transfektionsreagens inkluderar kalciumfosfat 11 och nonliposomal transfektionsreagens såsom Fugene. Detta protokoll använder plasmid somförpacknings vektorn med specifika vävnads trophisms för mus och råtta. Om överväger andra djurmodeller för transduktion-transplantation, kan andra förpacknings vektorer med bredare trophisms också användas för att generera amphotrophic (mus, råtta, människa) eller pantrophic (bred trophisms range) retrovirus.
En ytterligare fördel med benmärgsöverföring transplantation modell är förmågan undersöka konkurrensfördel av två olika givarpopulationer eller för att uttrycka flera gener av intresse samtidigt genom att använda unika markörer för att beteckna varje population av intresse. Sådana transplantationer utnyttjar ofta kongena C57BL / 6 möss för att spåra donatorceller än användningen av en integrerad GFP markör. Eftersom kongena C57BL / 6-möss kan uttrycka leukocyt markörer för antingen CD45.1 eller CD45.2, kan donatorceller erhållas från en bakgrund och transplanterades in i den andra. Dessutom kan genereras en hybrid F1 stam för att producera avkomma som uttrycker både CD45.1 och CD45.2markörer. Alternativt finns med flera olika taggar, inklusive unicistronic (t.ex. FLAG HA) eller bicistronisk (t.ex. GFP, RFP, YFP, mCherry, hCD4) konstruerar MSCV retroviral vektor. Dessa konstruktioner kan användas samtidigt i konkurrerande transplantationer för att möjliggöra diskriminering mellan givarpopulationer och kan vara särskilt användbart i situationer där differentieringen via CD45.1 / CD45.2 uttryck är inte tillgänglig, såsom BALB / c-mus stam.
En annan fördel med transduktion transplantation är förmågan att undersöka bidragen från specifika celltyper till sjukdom initiering. Även om detta protokoll beskrivs endast transduktionen-transplantation av hela benmärgen, kan andra experimentella konstruktioner nödvändiggöra anrikning eller isolering av olika HSC fack. I dessa fall kommer antalet givarceller variera beroende på den specifika givaren befolkningen använde. Dessutom, räddnings celler från en naiv givare böranvändas som ett komplement för att stödja musen tills HSC engraftment och expansion kan förekomma. Tabell 2 beskriver det rekommenderade antalet givarceller för transplantation av olika benmärgen fack 12-15.
| # Av celler / transplantatmottagare | # Av stödceller / transplanterad | |
| Hela Benmärgs | 500,000-2,000,000 | n / a |
| c-Kit + | 1,000-10,000 | 200000 |
| Lin-c-Kit + Sca-1 + (LKS) | 100-10,000 | 200000 |
| LKS CD150 + CD48 - SP | 1-100 | 200000 |
| LKS CD150 + CD34 - | 1-100 | 200000 |
Tabell 2. Antal givarceller transplantation.
Vidare kan sekundär transplantation också göras för att bedöma förmågan hos omvandlade celler till serietrans sjukdom.
Transduktion-transplantation är en mycket mångsidig metod som är mycket snabbare och betydligt mer kostnadseffektiv jämfört med transgena, knock-in, eller xenograft-modeller. Det tillåter en att snabbt bestämma om den intressanta genen är tillräcklig för att inducera en hematologisk malignitet, och kan användas som en in vivo pre-klinisk modell för att testa läkemedel. Andra fördelar med den transduktion-transplantationsteknik är att den undviker expression i icke-hematopoietiska celler och att den retrovirala insättningsstället tjänar som en klonal markör. Begränsningar med denna teknik include non-fysiologiska nivåer av omvandlade genen och skillnader i integrationsstället i gen 16,17. Ta alla de ovan nämnda fördelar och begränsningar beaktas, är överföring transplantation det självklara valet för inledande in vivo modellering av förmodade hematopoetiska onkogener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Lines | |||
| DMEM | Corning | MT-10-013-CV | |
| 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| 3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | |
| Plasmids | |||
| EcoPak, also known as pCL-Eco | Addgene | 12371 | Retroviral packaging cell lines, such as EcoPack 2-293, may be used in place of the EcoPak plasmid and standard 293T cells. Additional γ-retrovirus envelope and packaging plasmids are available from Addgene and others. |
| MSCV-IRES-GFP (MIG) | Addgene | 20672 | Additional γ-retroviral transfer plasmids are available from Addgene and others. |
| Consumables | |||
| 27 G x 1/2" needles | BD | 305620 | |
| Fetal bovine serum | Corning | MT-35-010-CV | |
| Penicillin/streptomycin/L-glutamine | Corning | MT-30-009-CI | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Corning | MT-25-052-CI | Can be homemade |
| PBS | Corning | MT-21-031-CV | |
| 10 cm dishes | Fisher | 172931 | |
| 15 ml conical tubes | Fisher | 12565268 | |
| 60 mm dishes | Fisher | 150288 | |
| Polybrene | Fisher | NC9840454 | |
| 5-FU | Fisher | A13456-06 | |
| 100 µm cell strainers | Fisher | 22363549 | |
| 50 ml conical tubes | Fisher | 12565270 | |
| 6-well plate | Fisher | 130184 | |
| FACS tubes | Fisher | 14-959-5 | |
| 0.45 μm syringe filters | Fisher | 0974061B | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | |
| ACK buffer | Lonza | 10-548E | Can be homemade |
| Recombinant murine IL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| Recombinant murine IL-6 | Peprotech | 216-16 | |
| Recombinant murine SCF | Peprotech | 250-03 | |
| X-tremeGENE 9 | Roche | 6365809001 | Transfection reagent |
| 1.5 ml centrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Equipment | |||
| BD Accuri C6 | |||
| X-ray irradiator |
References
- Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome. Science(New York, N.Y.). 247 (4944), 824-830 (1990).
- Wernig, G., Mercher, T., Okabe, R., Levine, R. L., Lee, B. H., Gilliland, D. G. Expression of Jak2V617F causes a polycythemia vera-like disease with associated myelofibrosis in a murine bone marrow transplant model. Blood. 107 (11), 4274-4281 (2006).
- Lacout, C., Pisani, D. F., Tulliez, M., Gachelin, F. M., Vainchenker, W., Villeval, J. L. JAK2V617F expression in murine hematopoietic cells leads to MPD mimicking human PV with secondary myelofibrosis. Blood. 108 (5), 1652-1660 (2006).
- Zaleskas, V. M., Krause, D. S., et al. Molecular pathogenesis and therapy of polycythemia induced in mice by JAK2 V617F. PloS One. 1, e18 (2006).
- Bumm, T. G. P., Elsea, C., et al. Characterization of murine JAK2V617F-positive myeloproliferative disease. Cancer Res. 66 (23), 11156-11165 (2006).
- Marty, C., Pecquet, C., et al. Calreticulin mutants in mice induce an MPL-dependent thrombocytosis with frequent progression to myelofibrosis. , Blood. (2015).
- Klampfl, T., Gisslinger, H., et al. Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms. N. Engl. J. Med. 369 (25), 2379-2390 (2013).
- Araki, M., Yang, Y., et al. Activation of the thrombopoietin receptor by mutant calreticulin in CALR-mutant myeloproliferative neoplasms. Blood. , (2016).
- Limón, A., Briones, J., et al. High-Titer Retroviral Vectors Containing the Enhanced Green Fluorescent Protein Gene for Efficient Expression in Hematopoietic Cells. Blood. 90 (9), 3316-3321 (1997).
- Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 48 (1), 11-22 (2009).
- Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells. J. Vis. Exp. (10), (2007).
- Challen, G. A., Boles, N., Lin, K. K., Goodell, M. A. Mouse Hematopoietic Stem Cell Identification And Analysis. Cytometry A. 75 (1), 14-24 (2009).
- Ergen, A. V., Jeong, M., Lin, K. K., Challen, G. A., Goodell, M. A. Isolation and characterization of mouse side population cells. Methods Mol. Bio. (Clifton, N.J.). 946, 151-162 (2013).
- Weksberg, D. C., Chambers, S. M., Boles, N. C., Goodell, M. A. CD150- side population cells represent a functionally distinct population of long-term hematopoietic stem cells. Blood. 111 (4), 2444-2451 (2008).
- Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
- Li, J., Kent, D. G., Chen, E., Green, A. R. Mouse models of myeloproliferative neoplasms: JAK of all grades. Dis. Model. Mech. 4 (3), 311-317 (2011).
- Mullally, A., Lane, S. W., Brumme, K., Ebert, B. L. Myeloproliferative neoplasm animal models. Hematol. Oncol. Clin. North Am. 26 (5), 1065-1081 (2012).
- Scil animal care company GmbH. , Source: http://www.scilvet.us/company-downloads (2005).
