Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Phospholipid Scramblase गतिविधि का एक प्रतिदीप्ति आधारित परख

Published: September 20, 2016 doi: 10.3791/54635
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biochemistry, Weill Cornell Medical College

Abstract

Scramblases bidirectionally एक एटीपी स्वतंत्र ढंग से झिल्ली bilayer भर फॉस्फोलिपिड सरकाना। पहले scramblase पहचान की है और biochemically सत्यापित opsin किया गया था, फोटोरिसेप्टर rhodopsin की apoprotein किया जाना है। Rhodopsin एक जी प्रोटीन युग्मित रेटिना जहां यह प्रकाश की धारणा के लिए जिम्मेदार है की रॉड फोटोरिसेप्टर डिस्क झिल्ली में स्थानीय रिसेप्टर है। Rhodopsin के scramblase गतिविधि अपने ligand 11 सीआईएस -retinal, यानी पर निर्भर नहीं करता है, apoprotein opsin भी एक scramblase के रूप में सक्रिय है। विधान और विनियमित फॉस्फोलिपिड पांव मार सेल शरीर क्रिया विज्ञान में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभानी है, केवल कुछ ही फॉस्फोलिपिड scramblases अब तक opsin इसके अलावा पहचान की गई है। यहाँ हम opsin के scramblase गतिविधि का एक प्रतिदीप्ति आधारित परख का वर्णन है। Opsin बड़े unilamellar phosphatidylcholine, phosphatidylglycerol और फ्लोरोसेंट NBD लेबल पीसी (1-पी के एक ट्रेस मात्रा से बना liposomes में पुनर्गठन किया गया हैalmitoyl-2- {6 [7-नाइट्रो-2-1,3-benzoxadiazole-4-YL) अमीनो] hexanoyl} - एस.एन. -glycero-3-phosphocholine)। Scramblase गतिविधि किस हद तक NBD-पीसी पुटिका के भीतरी पत्रक में स्थित अणुओं बाहरी पत्रक जहां उनके प्रतिदीप्ति रासायनिक एक एजेंट को कम करने कि झिल्ली को पार नहीं कर सकता से सफाया कर दिया है का उपयोग करने में सक्षम हैं मापने के द्वारा निर्धारित किया जाता है। हम तरीकों का वर्णन सामान्य प्रयोज्यता है और पहचान और अन्य झिल्ली प्रोटीन की scramblase गतिविधियों को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Introduction

फोटोरिसेप्टर rhodopsin, एक प्रोटोटाइप जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर (संदर्भ 1 में उदाहरण के लिए समीक्षा), पहली फॉस्फोलिपिड scramblase पहचाना जा रहा है और biochemically 2,3 सत्यापित। Scramblases फॉस्फोलिपिड ट्रांसपोर्टरों कि transbilayer फॉस्फोलिपिड आंदोलन की आंतरिक रूप से धीमी दर में वृद्धि कर रहे हैं एक द्विदिश में physiologically उचित स्तर तक, एटीपी स्वतंत्र ढंग 4-6। उनके कार्यों के उदाहरण जालिका और बैक्टीरियल cytoplasmic झिल्ली जहां विधान पांव मार झिल्ली homeostasis और विकास के लिए आवश्यक है, साथ ही ग्लाइकोसिलेशन रास्ते 5 की एक किस्म के लिए में पाया जा सकता है। विनियमित फॉस्फोलिपिड पांव मार apoptotic कोशिकाओं की सतह पर phosphatidylserine (पी एस) को बेनकाब करने की जरूरत है, जहां यह रूप में कार्य करता एक "खाने-मुझे" मैक्रोफेज 7 के लिए -signal और प्रोटीन कारक के उत्पादन को उत्प्रेरित करने के लिए सक्रिय ब्लड प्लेटलेट्स पर एक प्रोकोगुलैंट सतह प्रदान करता हैरक्त के थक्के के लिए आवश्यक रहा है। फोटोरिसेप्टर डिस्क झिल्ली में, rhodopsin के पांव मार गतिविधि bilayer कि एटीपी निर्भर, दिशाहीन लिपिड द्वारा उत्पन्न होता है की दो झिल्ली पत्रक के बीच असंतुलन फॉस्फोलिपिड प्रतिक्रिया करने के लिए सुझाव दिया गया है ABCA4 4,8,9 10-12 flippase।

Scramblases के शारीरिक महत्व के बावजूद, उनकी पहचान मायावी बना रहा जब तक rhodopsin फोटोरिसेप्टर डिस्क में एक scramblase 2, TMEM16 प्रोटीन परिवार के सदस्यों सीए के रूप में पहचान की गई 2 + निर्भर प्लाज्मा झिल्ली में पी एस जोखिम के लिए आवश्यक scramblases (संदर्भ में समीक्षा के रूप में सूचित किया गया था 13), और के रूप में एक लिपिड द्वितीय पेप्टीडॉग्लीकैन संश्लेषण के लिए आवश्यक 14 scramblase बैक्टीरियल प्रोटीन FtsW प्रस्तावित किया गया था। इन खोजों कार्यप्रणाली describ का उपयोग कर liposomes में शुद्ध प्रोटीन के पुनर्गठन और जिसके परिणामस्वरूप proteoliposomes में scramblase गतिविधि के प्रदर्शन के आधार पर किया गयायहाँ एड। अन्य संभावित scramblases 15-21 - MurJ और AMJ प्रोटीन पेप्टीडॉग्लीकैन biosynthesis में फंसा, WzxE और संबंधित प्रोटीन हे प्रतिजन व्यापारियों पांव मार में फंसा, एमपीआरएफ प्रोटीन बैक्टीरिया cytoplasmic झिल्ली भर aminoacylated phosphatidylglycerol सरकाना की जरूरत है, और Xkr8 परिवार के सदस्यों को प्रस्तावित किया गया है कि apoptotic कोशिकाओं की सतह पर पी एस बेनकाब करने के लिए - biochemically परीक्षण किया जा रह है। यह एक मजबूत परख के महत्व की पहचान करने और scramblase गतिविधि को चिह्नित करने के लिए प्रकाश डाला गया।

यहाँ, हम एक प्रतिदीप्ति आधारित परख का उपयोग जिसके परिणामस्वरूप proteoliposomes में शुद्ध opsin के पुनर्गठन, फोटोरिसेप्टर rhodopsin की apoprotein, बड़े unilamellar पुटिकाओं (LUVs) में, और scramblase गतिविधि के बाद के विश्लेषण का वर्णन है। वहाँ कई अच्छी तरह से वर्णित heterologous अभिव्यक्ति और opsin की शुद्धि के लिए साहित्य में उपलब्ध प्रोटोकॉल रहे हैं, इसलिए हम नहीं करेंगेइस प्रोटोकॉल में यह वर्णन; हम प्रोटोकॉल Goren एट अल। 3 में वर्णित के बारे में जो 100 एनजी पर झंडा टैग, थर्मास्टाइबल opsin पैदावार का उपयोग / 0.1% में μl (डब्ल्यू / वी) dodecylmaltoside (DDM)।

पुनर्गठन के लिए पर्याप्त साबुन के साथ LUVs के इलाज के लिए इतना है कि वे प्रफुल्लित लेकिन भंग नहीं है के द्वारा हासिल की है। इन शर्तों के तहत, एक झिल्ली प्रोटीन - प्रोटीन डिटर्जेंट micelles के रूप में आपूर्ति - liposomes में एकीकृत जाएगा और डिटर्जेंट हटाने पर liposome झिल्ली में पुनर्गठित हो जाते हैं, proteoliposomes में जिसके परिणामस्वरूप। (0.1% (w / v) DDM में एक शुद्ध प्रोटीन के रूप में प्राप्त) opsin पुनर्गठित करने, LUVs (POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl- एस.एन. -glycero-3-phosphocholine) और POPG का एक मिश्रण 1- से तैयार किया जाता है palmitoyl-2-oleoyl- एस.एन. -glycero-3- [phospho-rac- (1-ग्लिसरॉल)]) और opsin और NBD-पीसी जोड़ने से पहले DDM के साथ संतृप्त। डिटर्जेंट तो polystyrene मोती के साथ नमूना के इलाज से निकाल दिया जाता है।

लड़की = "jove_content"> सिद्धांत अंतर्निहित प्रतिदीप्ति आधारित परख चित्रा 1 बी में दिखाया गया है। LUVs संतुलित रूप से NBD-पीसी या अन्य NBD लेबल फ्लोरोसेंट फॉस्फोलिपिड रिपोर्टर (चित्रा 1 ए) के एक मात्रा का पता लगाने के साथ पुनर्गठन कर रहे हैं। dithionite जोड़ने पर, एक झिल्ली impermeant dianion, LUVs के बाहरी पत्रक में NBD-पीसी अणुओं प्रदान कर रहे हैं NBD की नाइट्रो-समूह के रूप में गैर फ्लोरोसेंट एक गैर फ्लोरोसेंट एमिनो समूह के लिए कम है। न NBD-पीसी अणुओं और न ही dithionite प्रयोग (<10 मिनट) की समय-पैमाने पर झिल्ली को पार करने में सक्षम हैं, इस फ्लोरोसेंट संकेत के 50% की कमी का परिणाम है। हालांकि, अगर liposomes एक scramblase साथ पुनर्गठन कर रहे हैं, भीतरी पत्रक में NBD-पीसी अणुओं तेजी से बाहर है, जहां वे कम कर रहे हैं के लिए संघर्ष कर सकते हैं। यह आदर्श मामले (चित्रा 1 सी) में प्रतिदीप्ति का कुल नुकसान में परिणाम है।

es / ftp_upload / 54635 / 54635fig1.jpg "/>
। चित्रा 1: scramblase गतिविधि परख की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व परख एक फ्लोरोसेंट NBD लेबल संवाददाता लिपिड उपयोग करता है; NBD-पीसी दिखाया गया है (ए)। बड़े unilamellar पुटिकाओं NBD-पीसी की मात्रा का पता लगाने के साथ पुनर्गठन कर रहे हैं। पुनर्गठन NBD-पीसी बाहरी और भीतरी पत्रक में समान रूप से वितरित साथ, सममित पुटिकाओं पैदा करता है। Dithionite (एस 2 हे 4 2-) रासायनिक एक गैर फ्लोरोसेंट एमिनो समूह के लिए NBD की नाइट्रो-समूह को कम करता है। Dithionite (बी, ऊपर) के साथ प्रोटीन से मुक्त liposomes का उपचार बाहरी पत्रक में केवल NBD-पीसी अणुओं के बाद से प्रतिदीप्ति की 50% की कमी का कारण बनता है कम कर रहे हैं: dithionite नकारात्मक आरोप लगाया है और झिल्ली NBD-पीसी अणुओं के साथ प्रतिक्रिया करने के लिए पार नहीं कर सकते भीतरी पत्रक में। Opsin युक्त proteoliposomes (बी, नीचे), के Dithionite उपचार यानी, scramblase सक्रिय proteoliposomes, एफ के लिए 100% नुकसान में परिणामopsin के रूप में luorescence भीतरी और बाहरी पत्रक के बीच NBD-पीसी की आवाजाही की सुविधा। (सी) dithionite के साथ प्रोटीन से मुक्त liposomes और opsin युक्त proteoliposomes के इलाज पर प्राप्त आर्दश प्रतिदीप्ति निशान से पता चलता। प्रतिदीप्ति हानि की दर का संकेत dithionite द्वारा NBD की रासायनिक कमी दर सीमित है, और है कि पांव मार एक दर के बराबर या रासायनिक प्रतिक्रिया की दर से अधिक पर होता है दोनों ही मामलों में एक ही है। एक वास्तविक प्रयोग से प्राप्त निशान 3 चित्र में दिखाया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

हम तरीकों का वर्णन पुनर्गठन और अन्य शुद्ध प्रोटीन, साथ ही प्राप्त की, उदाहरण के लिए, डिटर्जेंट 22 के साथ microsomes निकालने के द्वारा झिल्ली प्रोटीन के मिश्रण की परख के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Liposomes और Proteoliposomes की तैयारी

  1. liposome गठन
    1. एक गिलास सिरिंज का प्रयोग, एक दौर नीचे फ्लास्क (25 मिलीग्राम / एमएल क्लोरोफॉर्म में) 1,435 μl POPC जोड़ने और 160 μl POPG (25 मिलीग्राम / एमएल, क्लोरोफॉर्म में) POPC की एक दाढ़ अनुपात में 52.5 μmol लिपिड प्राप्त करने के लिए: POPG = 9: 1।
    2. (कोई पानी से स्नान विलायक के इस खंड के लिए आवश्यक है) 145 आरपीएम की घूर्णन गति में एक रोटरी बाष्पीकरण का उपयोग कर 30 मिनट के लिए लिपिड सूखी है, तो कुप्पी एक निर्वात desiccator करने के लिए कम से कम 3 घंटा, या रात भर के लिए, हस्तांतरण कमरे के तापमान पर (आरटी)।
    3. 50 मिमी HEPES पीएच 7.4, 100 मिमी NaCl के 10 मिलीलीटर के साथ सूखे लिपिड फिल्म हाइड्रेट धीरे एक समरूप, पंकिल निलंबन परिणाम तक कुप्पी घूमता द्वारा (अब बफर के रूप में);
      नोट: इस चरण में लिपिड एकाग्रता 5.25 मिमी होना के रूप में कोई घाटा अब तक हुआ है चाहिए उम्मीद है।
    4. एक आवृत्ति ओ के साथ कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए एक पानी के स्नान में निलंबन Sonicateएफ 40 किलोहर्ट्ज़। समाधान कुछ हद तक स्पष्ट दिखेगा।
    5. एक extruder का प्रयोग, निलंबन एक 400 एनएम ताकना आकार, एक 200 एनएम ताकना आकार के साथ एक झिल्ली के माध्यम से 4 गुजरता के साथ बाहर निकालना के एक दूसरे चक्र के द्वारा पीछा के साथ एक झिल्ली के माध्यम से 10 बार गुजरती हैं।
      नोट: जिसके परिणामस्वरूप LUVs का मतलब व्यास ~ 175 एनएम है। यदि आवश्यक हो, आकार और LUVs की एकरूपता निर्माता के निर्देशों के अनुसार गतिशील लाइट छितराया द्वारा जाँच की जा सकती है।
    6. धारा 1.2 में वर्णित के रूप में LUV निलंबन की फॉस्फोलिपिड एकाग्रता यों)।
      नोट: क्योंकि बाहर निकालना के दौरान घाटे की, एकाग्रता आम तौर पर लगभग 3.6 मिमी है।
    7. के बारे में 2 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर LUVs दुकान तुरंत इस्तेमाल नहीं किया।
  2. फॉस्फोलिपिड मात्रा
    नोट: luv पुनर्गठन के लिए इस्तेमाल निलंबन की फॉस्फोलिपिड एकाग्रता, साथ ही proteoliposomes कि अंततः उत्पन्न कर रहे हैं के रूप में निर्धारित करने के लिए, नमूना के एक विभाज्य Subje हैperchloric एसिड से ऑक्सीकरण के लिए cted। यह प्रक्रिया अकार्बनिक फॉस्फेट कि है तो मानकों 23 के साथ तुलना में एक वर्णमिति परख द्वारा मात्रा जारी करने के लिए फॉस्फोलिपिड टूट जाती है।
    1. विआयनीकृत आसुत जल में सोडियम फास्फेट की एक 40 मिमी शेयर समाधान (ना 2 HPO 4) तैयार करें।
    2. 4 मिमी और 0.4 कि अंशांकन मानकों के रूप में काम करेगा समाधान काम कर मिमी प्राप्त करने के लिए विआयनीकृत आसुत जल के साथ शेयर समाधान पतला।
    3. काम कर समाधान का उपयोग करना, 13 x 100 मिमी 2 गिलास 0 से 50 μl के अंतिम मात्रा में 80 nmol सोडियम फास्फेट को लेकर ट्यूबों में मानकों तैयार करते हैं।
    4. 10 μl लव और proteoliposome नमूने के प्रत्येक मात्रा निर्धारित किया जा करने के लिए ले लो और 13 x 100 मिमी 2 ग्लास ट्यूब में DDH 2 हे के 40 μl के साथ पतला।
      नोट: LUVs और proteoliposomes के लिपिड एकाग्रता रेंज में है के रूप में 2.5-5 सुक्ष्ममापी, नमूना के 10 μl 25-50 nmol लिपिड फास्फोरस शामिल करना चाहिए।
    5. 300 μl perchloric एसिड एक हीटिंग ब्लॉक में 145 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए मानकों और नमूने और गर्मी से प्रत्येक के लिए जोड़ें। वाष्पीकरण को रोकने के लिए ट्यूब पर पत्थर रख दिया।
    6. ट्यूबों के कमरे के तापमान को शांत करते हैं और DDH 2 ओ के 1 मिलीलीटर जोड़ें
    7. 400 μl हौसले से तैयार 12 ग्राम / एल अमोनियम molybdate और 50 ग्राम / एल सोडियम ascorbate और भंवर में से प्रत्येक के मिश्रण करने के लिए जोड़ें।
    8. ट्यूबों के शीर्ष पर पत्थर के साथ 100 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए गर्मी। हीटिंग ब्लॉक से ट्यूबों निकालें और उन्हें कमरे के तापमान को ठंडा होने दें।
    9. 797 एनएम के तरंग दैर्ध्य में एक स्पेक्ट्रोमीटर के साथ रिक्त (मानक नमूना 0 nmol सोडियम फास्फेट युक्त) के खिलाफ नमूने के absorbance के उपाय।
    10. अंशांकन मानक वक्र के खिलाफ नमूनों की फॉस्फेट सामग्री का निर्धारण।
  3. Opsin का पुनर्गठन
    नोट: यह पुनर्गठन के लिए इष्टतम सूजन शर्तों का निर्धारण करने के लिए के रूप में इन डिटर्जेंट की प्रकृति पर निर्भर करते हैं, साथ ही आवश्यक हैलिपिड रचना और LUVs की एकाग्रता के रूप में। LUVs प्रक्रिया सूजन पर उनकी रोशनी बिखरने गुणों को बदलने के रूप में absorbance (चित्रा 2) के रूप में। Rigaud और लेवी 24 और Geertsma एट अल 25 द्वारा समीक्षा को मापने के द्वारा नजर रखी जा सकती है।
    1. पिपेट LUVs के 800 μl, एक 2 मिलीलीटर microfuge ट्यूब में (धारा 1.1 से बाहर निकालना के रूप में के बाद लिपिड वसूली 70% है, LUVs की उम्मीद की एकाग्रता 3.6 मिमी फॉस्फोलिपिड है)।
    2. (डब्ल्यू / वी) DDM बफर ए में भंग बफर के 5.3 μl और 10% की 34.7 μl जोड़े
    3. अंत ओवर के अंत मिश्रण के साथ कमरे के तापमान पर 3 घंटे के लिए सेते हैं।
    4. इस बीच polystyrene मोती तैयार:
      1. नमूना प्रति मोतियों की 400 मिलीग्राम का उपयोग करें और एक गिलास बीकर में उन्हें बाहर तौलना।
      2. उन्हें दो बार प्रत्येक धोने कदम उपयोग के लिए बफर ए के साथ पानी के साथ मेथनॉल के साथ धोने, तीन बार और एक बार तरल के 5 मिलीग्राम और 10 मिनट के लिए धीरे-धीरे हलचल।
        नोट: यह polystyrene तैयार करने के लिए सिफारिश की हैएक बार में कई नमूने, उदाहरण के लिए मोती, मोती की 6 ग्राम में वजन और तरल के 75 मिलीलीटर से धो लें। अतिरिक्त मोती कई दिनों के लिए एक रेफ्रिजरेटर में संग्रहीत किया जा सकता है।
    5. प्रति नमूना, NBD-पीसी के 9.5 μl (1 मिलीग्राम / क्लोरोफॉर्म में मिलीलीटर, उपज 0.4 मोल%: पुटिका अस्थिरता के अंतिम 30 मिनट के दौरान एक पेंच टोपी ग्लास ट्यूब में NBD लेबल फॉस्फोलिपिड ( 'पुनर्गठन ग्लास ट्यूब') सूखी कुल फॉस्फोलिपिड की) एक ग्लास ट्यूब में नाइट्रोजन की एक धारा के तहत सूख रहे हैं और बाद में 0.1% की 45 μl (डब्ल्यू / वी) बफर ए में DDM में भंग
    6. बाद पुटिका अस्थिरता के 3 घंटा भंग-NBD लेबल फॉस्फोलिपिड, DDM-solubilized प्रोटीन जोड़ने और एक ऐसी बफर कि 1 मिलीलीटर की अंतिम मात्रा 0.36% शामिल हैं (डब्ल्यू / वी), यानी, 7 मिमी, DDM।
      1. इस प्रकार, प्रोटीन-मुक्त liposomes (एक नियंत्रण नमूने के रूप में प्रयोग किया जाता) NBD-पीसी (0.1% DDM में भंग) के 45 μl, 0.1% DDM के 60 μl और बफर के 55 μl जोड़ने उत्पन्न करने के लिए; proteoliposomes के लिए परीक्षा के लिए जोड़ने के लिए,मिसाल, 0.1% DDM में (~ 110 एनजी / μl के एक ठेठ शेयर समाधान से) प्रोटीन के 40 μl, NBD-पीसी के 45 μl (0.1% DDM में भंग), 0.1% DDM के 20 μl और बफर के 55 μl ।
        नोट: इसके अलावा के आदेश के रूप में सूचीबद्ध किया जाना चाहिए।
    7. कमरे के तापमान पर अंत पर एक अतिरिक्त मानव संसाधन अंत के लिए नमूना मिक्स।
    8. तैयार polystyrene मोतियों की 80 मिलीग्राम जोड़ें और अंत ओवर के अंत आरटी पर 1 घंटे के लिए मिश्रण के साथ नमूना सेते हैं।
    9. अगली polystyrene मोतियों की एक अतिरिक्त 160 मिलीग्राम जोड़ सकते हैं और अंत ओवर के अंत आरटी पर एक और 2 घंटे के लिए मिश्रण के साथ सेते हैं।
    10. ताजा polystyrene मोतियों की 160 मिलीग्राम से युक्त एक गिलास पेंच टोपी ट्यूब के लिए नमूना (बिताया polystyrene मोती छोड़ने के पीछे) स्थानांतरण और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर मिश्रण।
      नोट: नमूना हस्तांतरण और मोतियों को चूसने से बचने के लिए सबसे आसान तरीका है एक पाश्चर विंदुक कि एक छोटे से सकारात्मक दबाव के साथ ग्लास ट्यूब के नीचे करने के लिए धक्का दिया है का उपयोग है। एक बार पिपेट की नोक पर मजबूती हैट्यूब के नीचे है, तो नमूना मोतियों से हस्तक्षेप के बिना आसानी से वापस लिया जा सकता है।
    11. अगली सुबह, पर scramblase गतिविधि परख के लिए तैयार करने में बर्फ पर माला और जगह ले जाने के बिना एक microfuge ट्यूब के लिए नमूना हस्तांतरण।

2. Scramblase गतिविधि परख

नोट: liposomes या proteoliposomes बफर के साथ पतला के प्रतिदीप्ति तीव्रता एक प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोमीटर में dithionite के अलावा पर समय के साथ नजर रखी है। एक स्थिर शुरू तीव्रता प्राप्त करने के लिए, प्रतिदीप्ति एक लगातार हड़कंप मच गया नमूने के लिए dithionite जोड़ने से पहले कम से कम 50 सेकंड (या जब तक एक स्थिर संकेत हासिल की है) के लिए दर्ज की गई है और उसके बाद dithionite जोड़ने के बाद कम से कम 500 सेकंड के लिए पीछा किया जाता है।

  1. एक मिनी हलचल-बार युक्त एक प्लास्टिक क्युवेट करने के लिए बफर के 1,950 μl जोड़ें।
  2. तैयार proteo के 50 μl (लिपिड) जोड़ें और नमूना प्रतिदीप्ति Spectro में संतुलित करनाकई सेकंड के लिए लगातार सरगर्मी के साथ मीटर।
  3. इस बीच 0.5 एम unbuffered Tris (जैसे, के लिए दो नमूने एक microfuge ट्यूब में dithionite के 20 मिलीग्राम वजन और 114 में भंग में 1 एम dithionite का एक समाधान तैयार μl ठंडा 0.5 एम Tris सीधे उपयोग करने से पहले और अगले के लिए बर्फ पर रख नमूना)।
    नोट: dithionite समाधान हौसले से तैयार किया जाना चाहिए और तैयारी के बाद 20 से अधिक मिनट नहीं किया जाना चाहिए; अगर कई मापन किया जा करने के लिए कर रहे हैं, dithionite की aliquots अग्रिम में बाहर तौला और सही उपयोग करने से पहले भंग किया जा सकता है।
  4. प्रतिदीप्ति की निगरानी शुरू (उत्तेजना 470 एनएम, उत्सर्जन 530 एनएम, भट्ठा चौड़ाई 0.5 एनएम)।
  5. प्रतिदीप्ति रिकॉर्डिंग (क्युवेट चैम्बर यदि संभव हो तो के ढक्कन में पट का उपयोग करें) शुरू करने के बाद क्युवेट 50 सेकंड के लिए 1 एम dithionite समाधान के 40 μl जोड़ें और एक आगे 400-600 सेकंड के लिए प्रतिदीप्ति रिकॉर्ड करने के लिए जारी है।
  6. धारा 3 में वर्णित के रूप में डेटा का विश्लेषण।

3।डेटा विश्लेषण

  1. पांव मार के काइनेटिक्स
    1. प्रारंभिक प्रतिदीप्ति परिभाषित द्वारा scramblase गतिविधि परख द्वारा प्राप्त प्रत्येक नमूने की प्रतिदीप्ति का पता लगाने की विशेषताएँ, च मैं, dithionite जोड़ने, और अंत बिंदु प्रतिदीप्ति, एफ, पहुँच से पहले के बाद> ​​400 सेकंड। च मैं dithionite के अलावा पहले 30 सेकंड की अवधि के लिए प्रतिदीप्ति का मतलब मूल्य के रूप में प्रत्येक नमूने के लिए चुना गया है।
    2. प्रतिदीप्ति कमी की हद, आर = 100 के लिए इसी अंत बिंदु डेटा निर्धारित • एफ / एफ रहा। हम opsin युक्त proteoliposomes के लिए प्रोटीन से मुक्त liposomes और आर पी के लिए शर्तों आर एल का उपयोग करें।
  2. कार्यात्मक पुनर्गठन Scramblase की आणविक वजन का निर्धारण
    1. निम्नलिखित समीकरण के अनुसार प्रतिदीप्ति कमी डेटा कन्वर्ट:
      पी (≥1 scramblase) = (आर पी - आर एल) / (आर अधिकतम - आर एल) (समीकरण 1)
      ध्यान दें: कहां आर अधिकतम अधिकतम कमी है कि जब पर्याप्त प्रोटीन है कि इस तरह के नमूने में सभी पुटिकाओं कम से कम एक कार्यात्मक scramblase अधिकारी का पुनर्गठन किया गया है प्राप्त किया जाता है, और पी संभावना है कि एक पुनर्गठन नमूने में एक विशेष पुटिका 'scramblase सक्रिय' है, यानी, यह कम से कम एक कार्यात्मक scramblase के पास। आर एल के लिए मूल्य आम तौर पर 45% 3 जबकि आर अधिकतम उम्मीद 100% (आर अधिकतम प्रयोगात्मक> 1 मिलीग्राम / mmol की एक पीपीआर के साथ opsin proteoliposomes के लिए निर्धारित किया जा सकता है) के बजाय, 82.5% 3 आम तौर पर है। आर मैक्स के रूप में <100% यह माना जाता है कि पुटिकाओं की एक उप-जनसंख्या पुनर्गठन करने के लिए आग रोक है। आर अधिकतम = 82.5% के लिए, पुटिकाओं का अंश है कि प्रोटीन को स्वीकार करने में असमर्थ है 0.35 है।
    2. पॉसों आंकड़ों से पी (≥1 scramblase) और पीपीआर (मिलीग्राम प्रोटीन / mmol फॉस्फोलिपिड) के बीच संबंध का वर्णन इस प्रकार है:
      पी (≥1 scramblase) = 1 - ई नोट: जहां एम = मिलीग्राम प्रोटीन / mmol फॉस्फोलिपिड की इकाइयों में पुटिका और α = मोनो घातीय फिट निरंतर प्रति scramblases की संख्या।
    3. जैसा कि पुटिकाओं का एक अंश (चर्चा देखने के लिए) भी उच्च पीपीआर पर पांव मार करने के लिए योगदान नहीं है, के लिए समीकरण को संशोधित:
      पी (≥1 scramblase) = 1 - EXP (-PPR * / α) (3 समीकरण)
      नोट: कहां पीपीआर * = पीपीआर / (1- एफ), जहां च पुटिकाओं की दुर्दम्य आबादी है या इस मामले, पीपीआर * = पीपीआर / 0.65 (समीकरण 4) में,।
      नोट: फिट लगातार α एक मोनो घातीय समारोह के साथ पी (≥1 scramblase) बनाम पीपीआर * का ग्राफ फिटिंग द्वारा निर्धारित किया जाता है। Opsin (आणविक वजन 41.7 केडीए) कार्यात्मक 175 एनएम व्यास vesicles में reconstitutes तो एक मोनोमर के रूप में, α = 0.187 मिलीग्राम mmol -1 (प्रत्येक पुटिका 280,000 फॉस्फोलिपिड 26) है। Opsin dimerizes तो पहले की scramblase सक्रिय पुटिकाओं उपज के लिए 3 पुनर्गठन करने के लिए, तो α= 0.37 मिलीग्राम mmol -1। पीपीआर के बजाय पीपीआर * विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा रहे थे, तो इसी α मूल्यों 0.122 और 0.244 मिलीग्राम mmol -1 होगा। α के लिए इन मूल्यों की भविष्यवाणी मानते हैं कि सभी opsin अणुओं कार्यात्मक रूप से सक्षम हैं। अगर केवल अणुओं का एक अंश लिपिड हाथापाई करने के लिए सक्षम है, तो α की समान मूल्यों बड़ा होगा।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

हम LUVs में opsin के पुनर्गठन का वर्णन एक प्रतिदीप्ति आधारित परख का उपयोग कर अपने scramblase गतिविधि को चिह्नित करने के लिए। हम परिणामों का विश्लेषण opsin की मध्यस्थता फॉस्फोलिपिड पांव मार की दर पर एक कम सीमा के लिए जगह और oligomeric राज्य में जो opsin कार्यात्मक vesicles में reconstitutes निर्धारित करने के लिए।

इष्टतम पुनर्गठन की स्थिति की पहचान करने के लिए, यह अनुभव से कि LUVs प्रफुल्लित करने के लिए इतना है कि वे प्रोटीन प्रविष्टि को स्वीकार कर रहे इस्तेमाल किया जाना चाहिए डिटर्जेंट की राशि का निर्धारण करने के लिए आवश्यक है। इस तरह के प्रयोग चित्रा 2A में सचित्र है। POPC की aliquots: POPG LUVs 3 घंटे के लिए DDM के विभिन्न मात्रा के साथ व्यवहार कर रहे हैं और नमूने के absorbance के 540 एनएम, मैलापन का एक उपाय और पुटिका आकार की इसलिए कम से मापा जाता है। ऑप्टिकल घनत्व 540 एनएम (आयुध डिपो 540) ग्राफ में मापा पता चलता है कि पुटिकाओं DDM concentr के रूप में प्रफुल्लितव्यावहारिक 4-6 मिमी से वृद्धि हुई है, (मैलापन की हानि और आयुध डिपो 540 संकेत के लिए इसी) solubilize के रूप में DDM आगे बढ़ जाती है शुरू करने से पहले लगभग 7 मिमी पर एक संतृप्ति बिंदु तक पहुँचने। NBD-पीसी डिटर्जेंट उपचार के बाद कहा है और नमूने आगे polystyrene मोतियों के साथ इलाज किया जा रहा डिटर्जेंट दूर करने के लिए पहले एक घंटे के लिए incubated हैं। NBD-पीसी की transbilayer वितरण पुटिकाओं को dithionite जोड़ने के बाद प्रतिदीप्ति नुकसान को मापने के द्वारा निर्धारित किया जाता है (जैसा कि ऊपर वर्णित है)। इस प्रकार, NBD-पीसी डिटर्जेंट के अभाव में, अपनी पूरी पहुंच dithionite ने संकेत में पुटिकाओं के बाहरी पत्रक में सम्मिलित करता है। > 2 मिमी DDM, के साथ इलाज के लिए पुटिकाओं NBD-पीसी इतना है कि एक बार DDM निकाल दिया जाता है NBD-पीसी का 50% dithionite से सुरक्षित है संतुलित रूप से दोनों पत्रक में वितरित करने के लिए सक्षम है।

चित्रा 2 बी एक समान अस्थिरता-पुनर्गठन प्रयोग (संदर्भ 2 से दोबारा बनाई चलता </ Sup>), इस बार opsin के पुनर्गठन ट्रैकिंग। इस प्रयोग में यह देखा जा सकता है कि 7 मिमी DDM opsin पुनर्गठन कि इस तरह के NBD-पीसी मात्रात्मक हो जाता है (> 80%) सुलभ opsin की मध्यस्थता पांव मार का एक परिणाम के रूप में dithionite करने के लिए आवश्यक है।

चित्र 2
चित्रा 2:। NBD-पीसी और डिटर्जेंट अस्थिर vesicles में opsin के पुनर्गठन (ए) पुटिकाओं के Aliquots डिटर्जेंट सांद्रता (0-9 मिमी) की एक सीमा के साथ कमरे के तापमान पर 3 घंटे के लिए अंत से अधिक अंत मिश्रण से इलाज कर रहे हैं । ऊष्मायन अवधि 540 एनएम पर नमूने के absorbance मापा जाता है (काला लाइन) के अंत में। NBD-पीसी (v DDM / डब्ल्यू 0.1% में भंग) तो जोड़ा जाता है और इससे पहले कि डिटर्जेंट polystyrene मोती उपचार से निकाल दिया जाता है नमूना कमरे के तापमान पर एक और 1 घंटे के लिए incubated है। जिसके परिणामस्वरूप liposomes स्त्राव से विश्लेषण कर रहे हैं escent कमी परख (लाल रेखा) किस हद तक NBD-पीसी संतुलित रूप से पुनर्गठित किया जाता है निर्धारित करने के लिए। (बी) (ए) के रूप में है, लेकिन इस प्रयोग अंडे फॉस्फोलिपिड से गठित पुटिकाओं में (अंडे पीसी / अंडा phosphatidic एसिड, 9: 1 मोल / मोल) एक में जिसके परिणामस्वरूप, DDM के साथ अस्थिर कर रहे थे, और opsin NBD-पीसी के साथ एक साथ जोड़ा गया था के बारे में 80% की कमी प्रतिदीप्ति एक बार प्रोटीन कुशलता का पुनर्गठन और NBD-पीसी के पांव मार सुविधा के लिए सक्षम है (संदर्भ 2 से संशोधित)। NBD-पीसी संतुलित रूप से 2 मिमी DDM पर पुनर्गठन किया गया था हालांकि, opsin पुनर्गठन के लिए आदर्श स्थिति आयुध डिपो 540 absorbance, यानी, इस मुद्दे पर जहां पुटिकाओं intercalated डिटर्जेंट के कारण अत्यधिक सूज गए थे, लेकिन अभी तक solubilized नहीं (ने संकेत के शिखर के आसपास चुने गए हैं तीर)। POPC / POPG (9: 1 मोल / मोल) के लिए पुटिकाओं, 8 मिमी की एक DDM एकाग्रता दोनों NBD-पीसी और opsin पुनर्गठन के लिए इष्टतम होना पाया गया।/54635/54635fig2large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

प्रतिदीप्ति कमी की हद तक पुनर्गठन के लिए इस्तेमाल किया opsin की राशि के साथ बढ़ जाती है। चित्रा 3 ए को dithionite जोड़ने NBD-PC-युक्त प्रोटीन से मुक्त liposomes (काला ट्रेस) और proteoliposomes फॉस्फोलिपिड अनुपात (पीपीआर, mmol फॉस्फोलिपिड प्रति मिलीग्राम प्रोटीन, लाल निशान की इकाइयों में) करने के लिए विभिन्न प्रोटीन पर opsin के साथ पुनर्गठन पर प्राप्त प्रतिदीप्ति निशान से पता चलता; निशान तो यह है कि वे सभी एक ही प्रारंभिक प्रतिदीप्ति (एफ आई) आसान दृश्य के लिए मूल्य नहीं है सामान्यीकृत किया गया है। निशान के monoexponential फिट बैठता है बहुत ही इसी समय स्थिरांक संकेत मिलता है, 20-25 सेकंड से लेकर; dithionite की मध्यस्थता प्रोटीन से मुक्त liposomes में NBD-पीसी कमी की दर के रूप में proteoliposomes के रूप में ही है, यह तभी संभव है (टेक्स देख opsin की मध्यस्थता पांव मार की दर पर एक अनुमान कम करने के लिए जगहअधिक जानकारी के लिए टी)। चित्रा 3 बी पी (≥1) scramblase (एक पुटिका कम से कम एक scramblase होने की संभावना) बनाम मापा प्रयोगात्मक पीपीआर (पीपीआर से संबंधित भूखंडों की उपज के लिए प्रतिदीप्ति कमी assays से प्राप्त डेटा का विश्लेषण से पता चलता * जैसा कि ऊपर चर्चा)। काल्पनिक opsin के लिए इसी दौरे में प्रयोगात्मक परिणामों के monoexponential फिट की तुलना एक मोनोमर, डिमर या टेट्रामर चलता है कि opsin एक डिमर के रूप में कार्यात्मक रूप reconstitutes के रूप में पुनर्गठित किया जा रहा।

चित्र तीन
चित्रा 3:। Opsin के Scramblase गतिविधि (ए) प्रतिदीप्ति निशान 0-4.95 माइक्रोग्राम के बीच लेकर NBD-पीसी और opsin मात्रा के साथ पुनर्गठन पुटिकाओं के उपचार के लिए इसी dithionite, कील ने संकेत दिया। opsin की न्यूनतम राशि का पुनर्गठन 0.21 मिलीग्राम / mmol की एक पीपीआर, से मेल खाती है0.43 मिलीग्राम / mmol करने के लिए दूसरा सबसे अधिक राशि और 1.3 मिलीग्राम / mmol, या औसत पर पुटिका प्रति 10 opsins करने के लिए सबसे अधिक राशि। Dithionite संकेत समय (तीर) पर जोड़ा गया है और NBD प्रतिदीप्ति एक और 400 सेकंड के लिए नजर रखी थी। प्रतिदीप्ति कमी इस प्रयोग में देखा की अधिकतम सीमा 85% थी, जबकि कई प्रयोगों से अधिक औसत 82.5% है। (बी) के पांव मार के प्रोटीन निर्भरता। पैनल के लिए इसी तरह के प्रयोगों से डाटा पॉसों आँकड़ों का उपयोग पुटिकाओं के कम से कम एक scramblase (पी ≥1 scramblase) फॉस्फोलिपिड अनुपात (पीपीआर) के लिए प्रोटीन की तुलना में होने की संभावना पुटिकाओं का ग्राफ उत्पन्न करने के लिए विश्लेषण किया गया (प्रोटीन बाद मात्रा निर्धारित की गई थी वेस्टर्न ब्लाट विश्लेषण 3 और फॉस्फोलिपिड द्वारा पुनर्गठन अकार्बनिक फॉस्फेट एसिड हाइड्रोलिसिस पर जारी) को मापने के द्वारा निर्धारित किया गया था। लाल रेखा के डेटा के लिए एक मोनो घातीय फिट प्रतिनिधित्व करता है; धराशायी ग्रे लाइनों 170 एनएम व्यास वी में opsin के पुनर्गठन के लिए मोनो घातीय फिट बैठता प्रतिनिधित्वmonomers, पूर्व गठित dimers या पूर्व गठित tetramers के रूप में esicles। के रूप में एक्स अक्ष मापा प्रयोगात्मक पीपीआर का प्रतिनिधित्व करता है (बल्कि पीपीआर * से (मुख्य पाठ देखें)), फिट स्थिरांक पीपीआर के अनुरूप नहीं बल्कि पीपीआर * मूल्यों की तुलना में, के रूप में मुख्य पाठ में चर्चा की। कृपया यहाँ का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें यह आंकड़ा।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Scramblase गतिविधि परख है कि opsin फॉस्फोलिपिड scramblase गतिविधि 2 है निर्धारित करने के लिए मूल रूप से सक्षम होना चाहिए। परख भी हमें विशिष्टता के परीक्षण के द्वारा opsin के scramblase गतिविधि को चिह्नित करने की अनुमति दी है (हम इस तरह के NBD-phosphatidylethanolamine, के रूप में चित्रा 1 ए में NBD-पीसी के लिए दिखाया गया है, या पर एक एसाइल श्रृंखला पर NBD के साथ लेबल के रूप में NBD लेबल संवाददाता लिपिड की एक किस्म का इस्तेमाल किया headgroup, NBD-sphingomyelin या NBD- phosphatidylserine 2), पुटिका लिपिड रचना (के प्रभाव जैसे, पुटिका घटक के रूप में अलग अलग मात्रा में कोलेस्ट्रॉल), और opsin और सभी प्रदर्शनी scramblase गतिविधि rhodopsin के विभिन्न राज्यों गठनात्मक है। ये विश्लेषण से पता चला है कि rhodopsin के scramblase गतिविधि बहुत तेज है (> प्रति सेकंड 10,000 फॉस्फोलिपिड), फॉस्फोलिपिड के लिए गैर विशिष्ट और rhodopsin के गठनात्मक राज्य के स्वतंत्र या या नहीं, यह अपने क्रोमोफोर रेटिना 2,3 शामिल हैं। यहाँ,हम एक विस्तृत विधि opsin युक्त proteoliposomes उत्पन्न करने के लिए प्रस्तुत किया है और फॉस्फोलिपिड scramblase गतिविधि के लिए इन तैयारियों की परख के लिए कैसे दिखाया।

वर्णित पुनर्गठन प्रोटोकॉल दी लिपिड रचना के लिए और opsin पुनर्गठन के बाद यह आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी DDM solubilizing डिटर्जेंट के रूप में उपयोग करके शुद्ध किया गया था के लिए अनुकूलित है। लिपिड संरचना के रूप में अच्छी तरह से साबुन के रूप में प्रयोगकर्ता की जरूरतों के हिसाब से बदला जा सकता है, हालांकि बदल स्थितियों के लिए आदर्श पुनर्गठन की स्थिति "सूजन-प्रयोग" चित्रा 2 में वर्णित प्रदर्शन द्वारा निर्धारित किया जाना है। DDM अनुभव से अच्छी तरह से अनुकूल है स्थिर और सक्रिय हालत में opsin बनाए रखने के लिए। हालांकि, इस तरह octyl-β-glucoside, लोग या ट्राइटन X-100 के रूप में अन्य डिटर्जेंट समान प्रोटोकॉल का पालन किया जा सकता है। ट्राइटन X-100 है अपने कुशल के रूप में एटीपी बाध्यकारी कैसेट ट्रांसपोर्टरों (एबीसी ट्रांसपोर्टरों) के पुनर्गठन के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल डिटर्जेंट हैझिल्ली पुनर्गठन मध्यस्थता में ncy अन्य डिटर्जेंट की तुलना में अधिक है और यह भी कम समय preformed liposomes 24 के साथ संतुलित करने के लिए ले जाता है।

यह समय अगर फ्लोरोसेंट कमी की हद फॉस्फोलिपिड अनुपात (PPR से) के लिए प्रोटीन की एक सीमा से अधिक, यानी opsin के विभिन्न मात्रा के साथ पुनर्गठन के नमूने के लिए प्राप्त की है कार्यात्मक पुनर्गठन opsin के oligomeric राज्य निर्धारित करने के लिए संभव है। आदेश में यह करने के लिए, पुनर्गठन पुटिकाओं की पीपीआर स्पष्ट रूप से प्रोटीन और फॉस्फोलिपिड की वसूली भिन्न हो सकते हैं के रूप में मापा जाना चाहिए। फॉस्फोलिपिड वसूली, धारा 1.2 में वर्णित फॉस्फेट परख द्वारा निर्धारित किया जा सकता है, जबकि प्रोटीन वसूली मात्रात्मक वेस्टर्न ब्लाट विश्लेषण, जिसमें शुद्ध reconstitutions के लिए इस्तेमाल किया प्रोटीन एक अंशांकन वक्र है कि भर में पुनर्गठन के नमूनों की वसूली करने के लिए तुलना की अनुमति देता उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं से अनुमान लगाया जा सकता पीपीआर रेंज से परीक्षण (के रूप में संदर्भ 3 में विस्तार से समझाया गया)।

scramblase गतिविधि परख धारणा है कि dithionite पुटिकाओं में तर नहीं है पर बनाया गया है। इस बिंदु पुटिकाओं के भीतर एक घुलनशील NBD लेबल संवाददाता फँसाने और निर्धारण किया जाए यह dithionite द्वारा कम किया जा सकता द्वारा सत्यापित किया जा सकता है। इस प्रयोजन के लिए, NBD ग्लूकोज (12.6 माइक्रोन के पुटिका अस्थिरता के बाद जोड़ा) NBD-पीसी के बजाय प्रयोग किया जाता है। यह पानी में घुलनशील अणु proteoliposomes के अंदर फंस एक बार पुटिकाओं सील कर रहे हैं और इसलिए dithionite से संरक्षित किया जाना चाहिए। कमी के लिए NBD ग्लूकोज पूरी तरह से सुलभ बनाने के लिए, ट्राइटन X-100 जोड़ा जा सकता है (1% w / v) जो तब 100% की कमी 3,27 में यह परिणाम है।

proteoliposomes कि पुनर्गठन सत्यापित करने के लिए दोनों के रिपोर्टर लिपिड और प्रोटीन सममित है विशेषता जा सकता है। जबकि बाद AspN प्रोटीज का उपयोग कर एक प्रोटीज सुरक्षा रणनीति पर आधारित है पूर्व आयोडाइड आयनों का उपयोग collisional शमन प्रयोगों द्वारा हासिल की है किopsin 3 की सी टर्मिनस के निकट एक विशिष्ट साइट पर कटौती।

प्रारंभिक प्रतिदीप्ति (एफ आई) अंत बिंदु प्रतिदीप्ति (एफ) को scramblase गतिविधि परख में निर्धारित से संक्रमण जटिल है, लेकिन हमारे उद्देश्यों के लिए यह काफी एक एकल घातीय क्षय समारोह इसका अनुमान लगाया जा सकता है। समय घातीय क्षय (20 सेकंड) के साथ जुड़े लगातार मोटे तौर पर निष्क्रिय और सक्रिय liposomes, opsin युक्त proteoliposomes यह दर्शाता है कि पांव मार के रूप में तेजी, या दर है जिस पर NBD fluorophore dithionite से कम है की तुलना में तेजी से होता है के लिए एक ही है। इस प्रकार scramblase गतिविधि परख एक गरीब समय संकल्प (dithionite कमी रसायन विज्ञान के द्वारा सीमित) जो वर्तमान में केवल म्यूटेंट के वर्गीकरण के लिए परमिट है सक्रिय, बहुत धीमी गति से या निष्क्रिय। इस वर्गीकरण कैल्शियम विनियमित scramblase TMEM16 27 के लिए देखा जा सकता है: उच्च सीए 2 स्तरों पर, प्रतिदीप्ति क्षय एक समय था करने के लिए निरंतर समान का पता चलाटी प्रोटीन से मुक्त liposomes में देखा है, यह दर्शाता है कि कदम दर सीमित लिपिड पांव मार से dithionite द्वारा NBD-fluorophore की रासायनिक कमी है। इसके विपरीत, कम सीए 2 स्तरों पर फ्लोरोसेंट कमी की स्थिर अवस्था दो गतिज घटकों, एक बाहरी पत्रक के dithionite कमी को सौंपा और प्रदर्शन करने के लिए धीमी गति से एक के बीच भेद करने के लिए 900 सेकंड के बाद तक पहुँच नहीं था, यह संभव बनाने बाहर करने के लिए भीतरी-पत्रक NBD-लिपिड की।

उच्च पीपीआर (चित्रा 1 सी) बनाम प्रयोगात्मक वास्तविकता जहां यह मुश्किल है के साथ तैयार पुटिकाओं के dithionite उपचार पर प्रतिदीप्ति की भविष्यवाणी की 100% नुकसान के बीच विसंगति ~ 85% की कमी (चित्रा 3 ए) से अधिक चलता है कि पुटिकाओं का एक अंश है आग रोक पुनर्गठन करने के लिए। यह अंश पुनर्गठन प्रक्रिया के दौरान जल्दी है कि मुहर vesicles के रूप में डिटर्जेंट polystyrene मोती को adsorbed है अनुरूप हैं और हो सकता हैइसलिए अब कोई प्रोटीन प्राप्त करने में सक्षम। विश्लेषण धारा 3 में वर्णित के लिए, हम यह है कि इस आग रोक आबादी कुल पुटिकाओं के च एक अंश से मेल खाती ग्रहण किया। हम आग रोक पुटिकाओं में NBD-पीसी अणुओं की है कि आधे (बाहरी पत्रक में NBD-पीसी के पूल) मान dithionite कमी के लिए उपलब्ध है, तो हम अनुमान च = 2 • (1 - आर अधिकतम / 100), या 0.35 जब आर अधिकतम = 82.5%।

पी (≥1 scramblase) बनाम पीपीआर * एक मोनो घातीय समीकरण के साथ डेटा फिट लगातार α, जिसमें से यह निर्धारित करने के लिए कि क्या opsin एक मोनोमर या डिमर, या उच्च आदेश multimers सहित राज्यों के एक मिश्रण के रूप में कार्यात्मक रूप reconstitutes संभव है प्रदान करता है की फिटिंग । यदि opsin अणुओं का एक अंश पांव मार में काम नहीं कर सकते इन परिणामों की व्याख्या जटिल हो जाता है। यह संभावना स्थिति है जिसके तहत opsin शुद्ध होता है जो गारंटी है कि वह अपने जी प्रोटीन के सभी को बरकरार रखे हुए दिया जाता है जबकिरिसेप्टर गतिविधियों, α dimers के कार्यात्मक प्रविष्टि के लिए इसी का एक मूल्य भी opsin की तैयारी जहां आधे प्रोटीन scramblases के रूप में निष्क्रिय हैं से monomers के कार्यात्मक प्रविष्टि के रूप में व्याख्या की जा सकती है। विचार करने के लिए एक अतिरिक्त अंक विश्लेषण है कि हम वर्तमान मान लिया गया है कि पुनर्गठन के लिए इस्तेमाल किया पुटिकाओं आकार में सजातीय हैं। हकीकत में, पुटिकाओं एक मानक विचलन मतलब व्यास का लगभग एक तिहाई के लिए इसी के साथ एक गाऊसी वितरण की विशेषता व्यास की एक श्रृंखला है। सौभाग्य से, पी (≥1 scramblase) बनाम पीपीआर * आंकड़ों के विश्लेषण के नतीजे काफी पुटिका विविधता के विचार और विश्लेषण इतना आसान है कि हम प्रस्तुत डाटा का वर्णन करने के लिए पर्याप्त है से प्रभावित नहीं है।

तरीकों कि हम वर्णित की एक संभावित सीमा यह है कि काम गहन प्रक्रिया की अनुमति नहीं है नमूनों की एक एक बहुत ही उच्च संख्या के उच्च throughput मापनएन डी कि पुटिका विविधता readout परेशान हो सकता है। पहली समस्या scramblase परख के लिए एक microtiter प्लेट स्वरूप का उपयोग कर दूर किया जा सकता है; दूसरी TIRF माइक्रोस्कोपी का उपयोग एकल पुटिका assays के द्वारा भविष्य में हल किया जा सकता है।

scramblase गतिविधि को मापने के लिए dithionite परख बहुत विश्वसनीय और मजबूत के रूप में माना जा सकता है एक बार अस्थिरता और पुनर्गठन प्रक्रियाओं की स्थापना कर रहे हैं। एक वैकल्पिक दृष्टिकोण फॉस्फोलिपिड की transmembrane परिवहन, वह भी dithionite परख से प्राप्त परिणामों की पुष्टि करने की अनुमति देता है जिसका अंदाजा लगाना, फैटी एसिड मुक्त गोजातीय सीरम albumin 22 का उपयोग कर पुटिकाओं के बाहरी पत्रक से लघु श्रृंखला NBD-लिपिड के पीछे-निष्कर्षण है। पीछे-निकासी के रूप में अच्छी तरह से परख भी dithionite विशेषताएँ और पी 4-प्रकार ATPases और एबीसी ट्रांसपोर्टरों 28-33 की flippases की पहचान करने के लिए नियोजित किया गया है।

यहाँ प्रस्तुत उपकरण आसानी से विभिन्न के अनुसार अनुकूलित किया जा सकता हैNT जरूरत वर्णित प्रक्रियाओं बहुमुखी हैं और की पहचान करने और भविष्य में फॉस्फोलिपिड scramblases निस्र्पक में मदद मिलेगी। इनमें से बहुत से, scramblase सेल के विकास के दौरान biogenic झिल्ली के विस्तार के लिए आवश्यक है कि सहित, की पहचान सीखना अत्यंत शारीरिक महत्व का है।

अतिरिक्त जानकारी और डेटा विश्लेषण का विस्तृत विवरण के लिए, पाठकों हमारी प्रयोगशाला 2-4,27 साथ ही दूसरों 22,25,28,30 से पिछले प्रकाशनों में भेजा जाता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850457C POPC
1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt) Avanti Polar Lipids 840457C POPG
1-palmitoyl-2-{6-[7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]hexanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 810130C NBD-PC
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid VWR Scientific EM-5330 HEPES
NaCl Sigma S7653-1KG NaCl
Dodecyl-β-D-maltoside Anatrace D310 5 GM DDM
Fluorimeter cuvettes sigma C0918-100EA cuvettes
Spectrofluorometer Photon Technology International, Inc. fluorimeter
Sodium hydrosulfite technical grade, 85% Sigma 157953-5G dithionite
GraphPad Prism 5 software Prism
Tris Base VWR JTX171-3 Tris
LIPEX 10 ml extruder  Northern Lipids, Inc. Extruder
Whatman, Drain disc, PE, 25 mm Sigma 28156-243 Disc support
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes, 0.4 µm, 25 mm diameter Sigma WHA110607 400 nm membrane
Whatman Nucleopore Track-Etched Membranes, 0.2 µm, 25 mm diameter Sigma WHA110606 200 nm membrane
sodium phosphate Sigma S3264-500G
VWR Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass, 13 x 100 mm VWR Scientific 47729-572 glass tubes
Perchloric acid Sigma 30755-500ML
Ammonium Molybdate Tetrahydrate Sigma A-7302 ammonium molybdate
(+)-Sodium L-ascorbate Sigma A7631-25G sodium ascorbate
Bio-Beads SM2 adsorbents Bio Rad 1523920 polystyrene beads
 2.0 ml Microtubes clear VWR Scientific 10011-742 Reconstitution tubes
Reconstitution glass tube VWR Scientific 53283-800 Reconstitution glass tubes
Zetasizer  Malvern  DLS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ernst, O. P., et al. Microbial and animal rhodopsins: structures, functions, and molecular mechanisms. Chem. Rev. 114, 126-163 (2014).
  2. Menon, I., et al. Opsin is a phospholipid flippase. Curr. Biol. CB. 21, 149-153 (2011).
  3. Goren, M. A., et al. Constitutive phospholipid scramblase activity of a G protein-coupled receptor. Nat. Commun. 5, 5115 (2014).
  4. Ernst, O. P., Menon, A. K. Phospholipid scrambling by rhodopsin. Photochem. Photobiol. Sci. Off. J. Eur. Photochem. Assoc. Eur. Soc. Photobiol. , (2015).
  5. Sanyal, S., Menon, A. K. Flipping lipids: why an' what's the reason for? ACS Chem. Biol. 4, 895-909 (2009).
  6. Bevers, E. M., Williamson, P. L. Phospholipid scramblase: an update. FEBS Lett. 584, 2724-2730 (2010).
  7. Leventis, P. A., Grinstein, S. The distribution and function of phosphatidylserine in cellular membranes. Annu. Rev. Biophys. 39, 407-427 (2010).
  8. Quazi, F., Lenevich, S., Molday, R. S. ABCA4 is an N-retinylidene-phosphatidylethanolamine and phosphatidylethanolamine importer. Nat. Commun. 3, 925 (2012).
  9. Quazi, F., Molday, R. S. ATP-binding cassette transporter ABCA4 and chemical isomerization protect photoreceptor cells from the toxic accumulation of excess 11-cis-retinal. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 5024-5029 (2014).
  10. Ben-Shabat, S., et al. Formation of a nonaoxirane from A2E, a lipofuscin fluorophore related to macular degeneration, and evidence of singlet oxygen involvement. Angew. Chem. Int. Ed Engl. 41, 814-817 (2002).
  11. Sparrow, J. R., Wu, Y., Kim, C. Y., Zhou, J. Phospholipid meets all-trans-retinal: the making of RPE bisretinoids. J. Lipid Res. 51 (2010), 247-261 (2010).
  12. Schütt, F., Davies, S., Kopitz, J., Holz, F. G., Boulton, M. E. Photodamage to human RPE cells by A2-E, a retinoid component of lipofuscin. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41, 2303-2308 (2000).
  13. Picollo, A., Malvezzi, M., Accardi, A. TMEM16 proteins: unknown structure and confusing functions. J. Mol. Biol. 427, 94-105 (2015).
  14. Mohammadi, T., et al. Identification of FtsW as a transporter of lipid-linked cell wall precursors across the membrane. EMBO J. 30, 1425-1432 (2011).
  15. Meeske, A. J., et al. MurJ and a novel lipid II flippase are required for cell wall biogenesis in Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 6437-6442 (2015).
  16. Ruiz, N. Lipid Flippases for Bacterial Peptidoglycan Biosynthesis. Lipid Insights. 8, 21-31 (2015).
  17. Rick, P. D., et al. Evidence that the wzxE gene of Escherichia coli K-12 encodes a protein involved in the transbilayer movement of a trisaccharide-lipid intermediate in the assembly of enterobacterial common antigen. J. Biol. Chem. 278, 16534-16542 (2003).
  18. Suzuki, J., Imanishi, E., Nagata, S. Exposure of phosphatidylserine by Xk-related protein family members during apoptosis. J. Biol. Chem. 289, 30257-30267 (2014).
  19. Suzuki, J., Nagata, S. Phospholipid scrambling on the plasma membrane. Methods Enzymol. 544, 381-393 (2014).
  20. Alaimo, C., et al. Two distinct but interchangeable mechanisms for flipping of lipid-linked oligosaccharides. EMBO J. 25, 967-976 (2006).
  21. Ernst, C. M., Peschel, A. Broad-spectrum antimicrobial peptide restistance by MprF-mediated aminoacylation and flipping of phospholipids. Mol. Microbial. 80 (2), 290-299 (2011).
  22. Vehring, S., et al. Flip-flop of fluorescently labeled phospholipids in proteoliposomes reconstituted with Saccharomyces cerevisiae microsomal proteins. Eukaryot. Cell. 6, 1625-1634 (2007).
  23. Rouser, G., et al. Two dimensional then [sic] layer chromatographic separation of polar lipids and determination of phospholipids by phosphorus analysis of spots. Lipids. 5, 494-496 (1970).
  24. Rigaud, J. -L., Lévy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes. Methods Enzymol. 372, 65-86 (2003).
  25. Geertsma, E. R., Nik Mahmood, N. A. B., Schuurman-Wolters, G. K., Poolman, B. Membrane reconstitution of ABC transporters and assays of translocator function. Nat. Protoc. 3, 256-266 (2008).
  26. Mimms, L. T., Zampighi, G., Nozaki, Y., Tanford, C., Reynolds, J. A. Phospholipid vesicle formation and transmembrane protein incorporation using octyl glucoside. Biochemistry. 20, 833-840 (1981).
  27. Malvezzi, M., et al. Ca2+-dependent phospholipid scrambling by a reconstituted TMEM16 ion channel. Nat. Commun. 4, 2367 (2013).
  28. Eckford, P. D. W., Sharom, F. J. The reconstituted P-glycoprotein multidrug transporter is a flippase for glucosylceramide and other simple glycosphingolipids. Biochem. J. 389, 517-526 (2005).
  29. Marek, M., Günther-Pomorski, T. Assay of Flippase Activity in Proteoliposomes Using Fluorescent Lipid Derivatives. Methods Mol. Biol. 1377, 181-191 (2016).
  30. Coleman, J. A., Kwok, M. C. M., Molday, R. S. Localization purification, and functional reconstitution of the P4-ATPase Atp8a2, a phosphatidylserine flippase in photoreceptor disc membranes. J. Biol. Chem. 284, 32670-32679 (2009).
  31. Coleman, J. A., Quazi, F., Molday, R. S. Mammalian P4-ATPases and ABC transporters and their role in phospholipid transport. Biochim. Biophys. Acta. 1831, 555-574 (2013).
  32. Romsicki, Y., Sharom, F. J. Phospholipid flippase activity of the reconstituted P-glycoprotein multidrug transporter. Biochemistry. 40, 6937-6947 (2001).
  33. Zhou, X., Graham, T. R. Reconstitution of phospholipid translocase activity with purified Drs2p, a type-IV P-type ATPase from budding yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 16586-16591 (2009).

Tags

जैव रसायन अंक 115 जैव रसायन अंक polystyrene मोती डिटर्जेंट flippase GPCR liposomes फॉस्फोलिपिड पॉसों आँकड़े proteoliposomes पुनर्गठन rhodopsin scramblase झिल्ली प्रोटीन
Phospholipid Scramblase गतिविधि का एक प्रतिदीप्ति आधारित परख
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ploier, B., Menon, A. K. A… More

Ploier, B., Menon, A. K. A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity. J. Vis. Exp. (115), e54635, doi:10.3791/54635 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter