Abstract
Scramblasesは、ATP非依存的に双方向膜二重層を横切ってリン脂質を移動さ。識別され、生化学的に検証された最初のスクランブラーゼはオプシン、感光体ロドプシンのアポタンパク質でした。ロドプシンは、光の知覚の原因である網膜の桿体ディスク膜に局在するGタンパク質共役受容体です。ロドプシンのスクランブ活動、 すなわち 、そのリガンド11- シス -レチナールに依存しない、アポタンパク質オプシンは、スクランブラーゼとしても活躍。スクランブリング構成および調節リン脂質は、細胞生理学において重要な役割を果たしているが、わずか数リンscramblasesこれまでオプシン他に特定されています。ここでは、オプシンのスクランブラーゼ活性の蛍光ベースのアッセイを記載しています。オプシンは、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール及び蛍光NBD標識PCの微量（1-Pで構成される大単層リポソームに再構成され、almitoyl -2- {6- [7-ニトロ2-1,3ベンゾオキサジアゾール-4-イル）アミノ]ヘキサノイル} - SN -glycero -3-ホスホコリン）。スクランブラーゼ活性は、小胞の内部小葉に位置NBD-PCの分子はその蛍光が化学的に膜を通過することができない還元剤によって除去される外層にアクセスすることができる程度を測定することによって決定されます。我々が説明した方法は、一般的な適用性を有しており、他の膜タンパク質のスクランブ活動を特定し、特徴付けるために使用することができます。
Introduction
光受容体ロドプシン、（参照1、例えばレビュー）プロトタイプのGタンパク質共役型受容体は、同定され、生化学的に2,3を検証するための最初のリン脂質スクランブラーゼです。 Scramblasesは、双方向、ATPに依存しない方法4-6で二層間のリン脂質の動きに、生理学的に適切なレベルの本質的に遅い速度を向上させるリン脂質トランスポーターです。彼らの行動の例としては、小胞体および構成スクランブリングは、膜の恒常性と成長のためだけでなく、グリコシル化経路5の様々なために必要とされる細菌の細胞質膜で見つけることができます。規制リン脂質スクランブリングは、それが、マクロファージ7は、「食べる・私」-signalとして作用し、タンパク質因子の産生を触媒する活性化血小板の凝血促進表面を提供する、アポトーシス細胞の表面上のホスファチジルセリン（PS）を露出させるために必要とされます血液凝固に必要なのです。感光ディスク膜に、ロドプシンのスクランブル活性は、ATP依存性により生成される二重層の二つの膜リーフレットの間のリン脂質の不均衡を相殺することが提案されている、一方向性脂質は、ABCA4 4,8,9 10-12フリッパーゼ。
ロドプシンは、原形質膜でのPS露出のために必要2+依存性scramblasesが（参照して見直さ2、TMEM16タンパク質ファミリーのメンバーは、Caとして同定された感光体ディスクでスクランブラーゼとして報告されるまでscramblasesの生理学的重要性にもかかわらず、彼らのアイデンティティはとらえどころのないままでした13）、および細菌タンパク質FTSWは、ペプチドグリカン合成14のために必要な脂質IIスクランブとして提案されました。これらの発見は、方法論のdescribを使用して、得られたプロテオにおけるリポソーム及びスクランブ活動のデモンストレーションで精製されたタンパク質の再構成に基づいていましたここ編。他の潜在的なscramblases 15-21 -ペプチドグリカン生合成に関与MurJとAMJタンパク質、WzxEとO抗原前駆体をスクランブリングに関与し、関連するタンパク質、細菌の細胞質膜を横切ってアミノアシル化ホスファチジルを移行することが必要なMprFタンパク質、および提案されているXkr8ファミリーメンバーアポトーシス細胞の表面上にPSを露出させるためには、 - 生化学的に試験されていません。これは、スクランブ活動を識別し、特徴付けるための堅牢なアッセイの重要性を強調しています。
ここでは、精製されたオプシン、感光体ロドプシンのアポタンパク質、大型単層小胞（LUVを）に、蛍光ベースのアッセイを使用して、得られたプロテオリポソーム内のスクランブ活動のその後の分析の再構成を説明します。いくつかのよく記載されているプロトコルは、したがって、私たちはしません、オプシンの異種発現および精製のための文献で利用可能がありますこのプロトコルでそれを記述。我々は約100ngでFLAGタグ、耐熱性オプシン得ゴーレンら 3に記載されたプロトコルを使用/ 0.1％μL（w / v）のドデシルマルトシド（DDM）。
再構成は、彼らが膨潤するが溶解しないように、十分な洗剤でたLUVを処理することにより達成されます。これらの条件下では、膜タンパク質 - タンパク質 - 界面活性剤ミセルの形態で供給される - は、リポソーム内に統合し、プロテオリポソームを生じ、界面活性剤の除去時にリポソーム膜に再構成となるであろう。 （0.1％（w / v）のDDMで精製タンパク質として得られる）オプシンを再構成するために、たLUVはPOPC（1-パルミトイル-2- oleoyl- SN -glycero -3-ホスホコリン）とPOPGの混合物（1-から調製されますパルミトイル-2- oleoyl- SN -glycero -3- [ホスホrac-（1-グリセロール）]）とオプシンとNBD-PCを追加する前に、DDMで飽和。界面活性剤は、その後、ポリスチレンビーズとサンプルを処理することによって除去されます。
LASS = "jove_contentは">蛍光ベースのアッセイの基礎となる原理は、図1Bに示されています。 LUVをは対称的にNBD-PCまたは他のNBD標識蛍光リン脂質レポーター（ 図1A）の微量で再構成されています。ジチオナイトを追加することで、NBDのニトロ基のような膜非透過性ジアニオン、LUVをの外側のリーフレットにおけるNBD-PC分子がレンダリングされる非蛍光は、非蛍光アミノ基に還元されます。 NBD-PC分子もジチオンいずれも実験（<10分）の時間スケールで膜を通過することができるように、これは、蛍光シグナルの50％の減少をもたらします。リポソームをスクランブで再構成されている場合は、内部リーフレットにおいてNBD-PCの分子は、それらが低減されている外部に迅速にスクランブルすることができます。これは、理想的な場合（ 図1C）における蛍光の総損失をもたらします。
エス/ ftp_upload / 54635 / 54635fig1.jpg "/>
図1：スクランブラーゼ活性アッセイの概略図アッセイは、蛍光NBD標識化レポーター脂質を使用しています;。 NBD-PCが示されている（A）。大型単層小胞は、NBD-PCの微量で再構成されています。再構成は、外側と内側のリーフレットに均等に分配NBD-PCで、対称的な小胞を生成します。亜ジチオン酸（S 2 O 4 2-）は 、化学的に非蛍光アミノ基とNBDのニトロ基を低減します。ジチオン酸は、負に帯電し、NBD-PCの分子と反応する膜を通過することはできません：外葉で唯一のNBD-PC分子が低減されるので、ジチオナイト（B、上）とのタンパク質を含まないリポソームの治療は、蛍光の50％の減少を引き起こします内側のリーフレットインチオプシン含有プロテオリポソーム（B、下）、 すなわち 、スクランブラーゼ活性のプロテオリポソーム、Fの100％損失の結果の亜ジチオン治療オプシンとしてluorescenceは、内側と外側のリーフレットの間NBD-PCの移動を容易にします。 （C）は、亜ジチオン酸でタンパク質を含まないリポソームとオプシン含有プロテオリポソームを処理して得られた理想化された蛍光トレースを示します。蛍光損失率は、亜ジチオン酸によるNBDの化学的還元は、スクランブリングは、化学反応の速度以上の速度で発生し、その律速であることを示す両方の場合で同じです。実際の実験から得られたトレースを図3に示す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
我々が説明した方法は、他の精製されたタンパク質、ならびに界面活性剤22とミクロソームを抽出することにより、例えば、得られた膜タンパク質の混合物を再構成し、アッセイするために使用することができます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
リポソームおよびプロテオリポソームの調製
- リポソーム生成
- ガラスシリンジを使用して、POPCのモル比で52.5モル脂質を得るために、丸底フラスコに（クロロホルム中、25 mg / mlで）および160μlのPOPG（クロロホルム中、25 mg / mlで）1,435μlのPOPCを追加：POPG = 9：1。
- （何の水浴を溶媒のこのボリュームのために必要とされていない）145回転の回転速度で回転蒸発器を用いて30分間、脂質を乾燥させ、次いで、室温で、一晩、少なくとも3時間、または真空デシケーターにフラスコを転送（RT）。
- 穏やかに均質な、濁った懸濁液が得られるまで、フラスコを旋回することによって、50mMのHEPES pH7.4中、100mMのNaCl（以下、緩衝液Aと称する）の10mlの乾燥した脂質フィルムを水和。
注：この段階で脂質濃度は、全く損失がこれまでに発生していないはずですとして5.25 mMのことが予想されます。 - 周波数Oで室温で10分間水浴中懸濁液を超音波処理40 kHzのF。解決策は、やや明確になります。
- 押出機を用いて、200 nmの細孔サイズを有する膜を介して4パスで押し出しの第2サイクルに続いて、400 nmの細孔サイズを有する膜を通して懸濁液を10回通過します。
注：結果LUVをの平均直径は〜175 nmです。必要であれば、たLUVのサイズおよび均質性は、製造業者の指示に従って、動的光散乱によって確認することができます。 - 1.2節で説明したように）LUV懸濁液のリン脂質濃度を定量化します。
注：押出時の損失のため、濃度は通常約3.6 mMであるため。 - すぐに使用しない場合は、約4℃で2週間LUVを保管してください。
- リン脂質定量
注：リン脂質再構成するために使用LUV懸濁液の濃度だけでなく、最終的に生成されたプロテオリポソームのことを決定するために、試料のアリコートはsubjeです過塩素酸による酸化にCTED。この手順は、その後、標準23と比較して比色アッセイによって定量化された無機リン酸を放出するためにリン脂質を分解します。- 脱イオン蒸留水にリン酸ナトリウム（のNa 2 HPO 4）の40mMのストック溶液を準備します。
- 4 mMのと校正標準となるソリューションをワーキング0.4 mMのを得るために、脱イオン蒸留水で原液を希釈します。
- 作業溶液を用いて、50μlの最終体積で0から80までの13×100 mm 2のガラス管中で基準nmolのリン酸ナトリウムを調製します。
- LUVおよびプロテオリポソームサンプルのそれぞれを定量化する10μLを取り、13×100ミリメートル2ガラス管中のddH 2 O40μlので希釈しました。
注：LUVをし、プロテオリポソームの脂質濃度が範囲内にあるように2.5-5μM、10μlのサンプルは、25-50ナノモル脂質のリンを含むべきです。 - 加熱ブロック中で145℃で1時間の標準およびサンプルや熱のそれぞれに300μlの過塩素酸を追加します。蒸発を防ぐために、チューブにビー玉を入れてください。
- チューブを室温まで冷却してみましょうとのddH 2 Oの1ミリリットルを追加
- 400μlの新たに調製した12グラム/ Lのモリブデン酸アンモニウムと50グラムの各/ミックスするLアスコルビン酸ナトリウムと渦を追加します。
- チューブの上にビー玉で100℃で10分間加熱します。加熱ブロックからチューブを取り外し、それらを室温まで冷却しましょう。
- 797ナノメートルの波長での分光器でブランク（0 nmolのリン酸ナトリウムを含む標準試料）に対するサンプルの吸光度を測定します。
- 校正標準曲線に対するサンプルのリン酸含量を決定します。
- オプシンの再構成
注：これらは、同様に、界面活性剤の性質に依存するように、再構成のための最適な膨潤条件を決定する必要がありますLUVをの脂質組成や濃度など。 LUVをプロセス膨潤にそれらの光散乱特性を変更するとリゴーとレヴィ24とGeertsma ら 25によってレビューとして吸光度（ 図2）を測定することによってモニターすることができます。- ピペットLUVを800μlの（セクション1.1から、押出成形後の脂質回収率が70％であるとして、LUVをの予測濃度が3.6 mMのリン脂質である）2ミリリットルマイクロチューブに。
- バッファAの5.3μlを、10％の34.7μlを添加し（w / v）のDDMは、緩衝液Aに溶解しました
- 転倒混合しながら室温で3時間インキュベートします。
- 一方、ポリスチレンビーズを準備します。
- サンプルあたりのビーズの400ミリグラムを使用し、ガラスビーカー中でそれらを量ります。
- 水、メタノールで二回三回洗っ一度緩衝液Aを用いて、各洗浄工程で使用するための液体を5ml、10分間ゆっくり撹拌します。
注：ポリスチレンを準備することをお勧めします一度に複数のサンプル、 例えばのためのビーズは、ビーズの6グラムで重さと液体の75ミリリットルで洗浄します。過剰のビーズは数日間冷蔵庫で保存することができます。
- サンプルあたり、NBD-PC（クロロホルム中1 mg / mlで、9.5μlのは0.4モル％をもたらす：小胞の不安定化の最後の30分の間、スクリューキャップのガラス管（ '再構成ガラス管'）におけるNBD標識リン脂質を乾燥総リン脂質の）ガラス管に、窒素気流下で乾燥させ、続いて緩衝液A中の0.1％の45μL（w / v）のDDMで溶解
- 小胞の不安定化の3時間後、DDM可溶化タンパク質を溶解-NBD標識リン脂質を追加し、1 mlの最終容積は、 すなわち 、7 mMの、DDM（w / v）の0.36パーセントを含有するようにバッファ。
- したがって、（0.1％DDMに溶解）NBD-PCの45μlを、0.1％のDDMとバッファAの55μlと60μlを添加（対照サンプルとして使用される）タンパク質を含まないリポソームを生成します。プロテオのための試験のために、追加しますPLE、0.1％DDMで（〜110 ngの/μlでの典型的なストック溶液から）は、タンパク質の40μlを、NBD-PCの45μlを（0.1％DDMに溶解）を、0.1％DDMとバッファAの55μlの20μlの。
注：記載されている添加の順序は次のようになります。
- したがって、（0.1％DDMに溶解）NBD-PCの45μlを、0.1％のDDMとバッファAの55μlと60μlを添加（対照サンプルとして使用される）タンパク質を含まないリポソームを生成します。プロテオのための試験のために、追加しますPLE、0.1％DDMで（〜110 ngの/μlでの典型的なストック溶液から）は、タンパク質の40μlを、NBD-PCの45μlを（0.1％DDMに溶解）を、0.1％DDMとバッファAの55μlの20μlの。
- 室温で端部の上に追加の時間の終わりのためのサンプルを混ぜます。
- 準備されたポリスチレンビーズの80ミリグラムを追加し、転倒を室温で1時間混合したサンプルをインキュベートします。
- 次ポリスチレンビーズの追加の160ミリグラムを追加し、転倒を室温でさらに2時間混合しながらインキュベートします。
- 新鮮なポリスチレンビーズの160 mgのガラススクリューキャップチューブに（背後に費やされたポリスチレンビーズを残して）サンプルを移し、4℃で一晩を混ぜます。
注：サンプルを転送し、ビーズを吸い取っ回避する最も簡単な方法は、小さな正の圧力でガラス管の底に押されたパスツールピペットを使用することです。ピペットの先端がでしっかりとしたらチューブの底部は、その後、サンプルは、ビーズからの干渉を受けることなく、容易に取り出すことができます。 - 翌朝は、スクランブラーゼ活性アッセイの準備のために氷の上でビーズや場所に運ぶことなく、マイクロチューブにサンプルを移します。
2.スクランブラーゼ活性アッセイ
注：緩衝液Aで希釈したリポソームまたはプロテオリポソームの蛍光強度は、蛍光分光計で亜ジチオン酸を添加して経時的にモニターされます。安定した開始強度を得るために、蛍光を絶えず撹拌試料に亜ジチオン酸塩を添加する前に、少なくとも50秒（または安定した信号が得られるまで）のために記録され、その後、亜ジチオン酸塩を添加した後、少なくとも500秒間続きます。
- ミニ撹拌棒を含むプラスチックキュベットに緩衝液Aの1950μLを加えます。
- 準備されたプロテオ（リポソーム）の50μLを加え、サンプルは蛍光分光で平衡化しましょういくつかの秒間一定に撹拌しながらメートル。
- 2つの標本がマイクロチューブに亜二チオン20mgを秤量し、使用直前に114μlの氷冷0.5 Mトリスに溶解し、次の氷上に保つために一方0.5 Mバッファなしのトリス（ 例えば、1 M亜ジチオン酸の溶液を調製サンプル）。
注：亜ジチオン酸溶液は新たに調製されなければならないと調製後20分以上を使用するべきではありません。多くの測定が行われるべき場合、ジチオナイトのアリコートを、予め秤量し、使用直前に溶解させることができます。 - （励起470nmで、発光530nmで幅0.5 nmのスリット）蛍光モニタリングを開始します。
- 記録蛍光（可能であればキュベットチャンバーの蓋にセプタムを使用）を開始した後、キュベット50秒に1 M亜二チオン酸溶液40μlを加え、さらに400から600秒間蛍光を記録し続けています。
- セクション3で説明したようにデータを分析します。
3。データ分析
- スクランブルの速度論
- 初期蛍光を定義することによって、スクランブ活性アッセイによって得られた各試料の蛍光トレースを特徴付ける、F、I、亜ジチオン酸塩を添加すること、およびエンドポイント蛍光Fは、到達する前に> 400秒後。 F iは 、前の亜ジチオン酸の添加30秒の期間についての蛍光の平均値として、各サンプルについて決定されます。
- 私は 、蛍光減少の程度に対応するエンドポイントデータを決定し、R = 100•F / F。我々はオプシン含有プロテオのためにタンパク質を含まないリポソームおよびR Pのための用語のR Lを使用します。
- 機能的に再構成スクランブラーゼの分子量を測定します
- 蛍光減少データは、以下の式に従って変換します。
P（≥1スクランブ）=（R P - R L）/（R 最大 -のR L）（式1）
注意：R maxは 、十分なタンパク質が試料中のすべての小胞は、少なくとも一つの機能スクランブを有するように再構成されたときに得られる最大の減少であり、pは、再構成された試料中の特定の小胞は、「スクランブ活性」される確率である場合、 すなわち 、それは、少なくとも1つの機能スクランブを有しています。 R maxは、（R maxは実験的>に1mg /ミリモルのPPRとオプシンプロテオのために決定することができる）の代わりに期待100％で、一般的に82.5パーセント3であるのに対し、R Lの値は、一般的に45％3です。 R maxと<100％は、小胞の亜集団は、再構成に対して不応性であることが想定されます。 R 最大 = 82.5パーセントのために、タンパク質を受け入れることができない小胞の割合は0.35です。 - 次のようにポアソン統計によりp（≥1スクランブラーゼ）およびPPR（mgタンパク質/ミリモルのリン脂質）との関係を説明します。
P（≥1スクランブ）= 1 - 電子 - 小胞の割合としては、（説明を参照）でも高いPPRでスクランブルに寄与しないに式を変更します。
P（≥1スクランブ）= 1 - expの（-PPR * /α）（式3）
注：PPR * = PPR /（1- f）は 、fは小胞の耐火集団であるか、この場合には、PPR * = PPR / 0.65（式4）。
注：適合定数αは単一指数関数とPPR *に対するP（≥1スクランブ）のグラフをフィッティングすることによって決定されます。オプシン（分子量41.7キロダルトン）は機能的に175 nmの直径の小胞に再構成する場合は、モノマーとして、α= 0.187ミリグラムミリモル-1（各小胞は28万リン脂質26を有しています）。スクランブラーゼ活性の小胞を得るために3を再構成のためにオプシンの二量化は、従来であれば、その後α= 0.37ミリグラムミリモル-1。 PPRはなくPPR *は、分析のために使用された場合には、対応するαの値は、0.122と0.244ミリグラムミリモル-1です。 αのためのこれらの予測値は、すべてのオプシン分子が機能的に有能であることを前提としています。分子の一部のみが、脂質をスクランブルする能力である場合、αの対応する値が大きくなります。
- 蛍光減少データは、以下の式に従って変換します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
我々は、蛍光ベースのアッセイを使用して、そのスクランブ活動を特徴づけるためたLUVへオプシンの再構成を説明します。私たちは、スクランブルオプシン媒介リン脂質の速度に下限を配置するとオプシンは、機能的に小胞に再構成したオリゴマー状態を決定するために、結果を分析します。
最適な再構成条件を特定するためには、経験的に、それらがタンパク質挿入に受容されるようにLUVを膨潤するために使用されなければならない界面活性剤の量を決定する必要があります。このような実験は、 図2Aに示されています。 POPCのアリコート：POPGのLUVを3時間、DDMの異なる量で処理し、試料の吸光度を540nmで測定し、濁度の測定値、したがって、小胞の大きさ。 540 nmの（OD 540）のグラフで測定した光学密度は、小胞がDDM concentrとして膨潤することを示していますエーションは4~6 mMのより増加するDDMがさらに増加すると、（濁度およびOD 540シグナルの損失に相当する）を可溶化するために開始する前に、約7 mmに飽和点に達します。 NBD-PCは、界面活性剤処理後に添加され、試料はさらに界面活性剤を除去するために、ポリスチレンビーズで処理される前に、時間インキュベートします。 NBD-PCの二層間の分布は（上述のように）小胞への亜ジチオン酸塩を添加した後、蛍光の損失を測定することによって決定されます。このように、NBD-PCは、ハイドロサルファイトするために、その完全なアクセシビリティによって示される界面活性剤の非存在下での小胞の外葉、に挿入します。 > 2mMのDDMで処理小胞のためのNBD-PCは、DDMが除去されるとことをNBD-PCの50％が亜ジチオンから保護されるように、両方の弁尖に対称的に分配することができます。
図2Bは 、基準2から再描画同様の不安定化、再構成実験を示します（</ SUP>）、オプシンの再構成を追跡するこの時間。この実験では、7 mMのDDMはオプシン媒介スクランブルの結果として、ハイドロサルファイトからアクセス可能（> 80％）NBD-PCが定量的になるようにオプシン再構築のために必要とされていることがわかります。
図2： 洗剤-不安定化小胞へのNBD-PCとオプシンの再構成 （A）小胞のアリコートを室温で3時間転倒を混合することにより、界面活性剤濃度（0-9 mM）の範囲で処理されています。 540nmでサンプルの吸光度を測定する潜伏期間（黒線）の終わりに。 （DDM w / vの0.1％に溶解）NBD-PCを添加し、界面活性剤は、ポリスチレンビーズ処理により除去される前に、試料を室温でさらに1時間インキュベートします。得られたリポソームは、フッ素で分析します NBD-PCが対称再構成される程度を決定するためにescent減少アッセイ（赤線）。 （B）（A）のようにしかし、卵リン脂質（卵PC /卵ホスファチジン酸、9：1モル/モル）から形成され、この実験の小胞はでDDMで不安定化し、オプシンがその結果、NBD-PCと一緒に添加しました。約80％の蛍光の減少は、タンパク質を効率的に再構成し、NBD-PCのスクランブリングを促進することができるされた後（基準2から変更）。 NBD-PCは対称的に2 mMのDDMで再構成したが、オプシンを再構成するための理想的な条件は、OD 540吸光度、 すなわち 、で示される小胞が原因でインターカレートされた洗剤に高度に膨潤したが、まだ可溶化していない点（ピークの周りに選ばれました矢印）。 POPC / POPG（9：1モル/モル）のために、小胞、8mmのDDM濃度NBD-PCおよびオプシン再構成の両方のために最適であることが見出されました。/54635/54635fig2large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
蛍光減少の程度は、再構成に使用するオプシンの量と共に増加します。図3Aは、蛍光リン脂質比に異なるタンパク質でオプシンで再構成NBD-PC含有タンパク質を含まないリポソーム（黒のトレース）およびプロテオリポソームにジチオナイトを加算して得られたトレース（ミリモルのリン脂質タンパク質1mg当たりの単位でPPR、赤トレース）を示しています。彼らはすべてが簡単に可視化のための同じ初期の蛍光（F I）の値を持つようにトレースは、正規化されています。トレースの単一指数フィットは20〜25秒に至るまで、非常に類似した時定数を示しています。タンパク質を含まないリポソーム中の亜ジチオン媒介NBD-PCの減少率は、プロテオリポソームの場合と同じであるとして、（TEXを参照スクランブルオプシン媒介の割合に低い見積もりを配置することのみ可能です詳細については、トン）。 図3Bは、（≥1）実験的に測定されたPPR（対スクランブラーゼ（少なくとも1つのスクランブラーゼを持つ小胞の確率は）PPR *に関連したpのプロットを得るために、蛍光減少アッセイから得られた分析データを示しています）上述のように。オプシンに対応する仮想的なフィットの実験結果の単一指数フィットの比較は、オプシンが二量体として機能的に再構成する単量体、二量体または四ショーとして再構成されています。
図3： オプシンのスクランブ活動ウェッジによって示される0から4.95μgの間の範囲のNBD-PCとオプシン量、で再構成小胞の治療をハイドロサルファイトに対応する（A）蛍光トレース。再構成されたオプシンの最低量は0.21ミリグラム/ミリモルのPPRに対応0.43ミリグラム/ミリモルおよび1.3ミリグラム/ミリモル、または平均で小胞あたり10オプシンに最高額の2番目の最高額。ジチオナイトが指示された時間（矢印）で添加し、NBD蛍光をさらに400秒間モニターしました。多くの実験の平均値は82.5パーセントであるのに対し、本実験で見られた蛍光減少の最大の程度は85％でした。 （B）スクランブリングのタンパク質依存性。パネルAと同様の実験からのデータは、（タンパク質が後に定量化した小胞のリン脂質比（PPR）のタンパク質に対する少なくとも一つのスクランブ（P≥1スクランブ）を有する小胞の確率のグラフを生成するために、ポアソン統計を用いて分析しました。ウエスタンブロット分析3およびリン脂質によって再構成）を酸加水分解の際に放出無機リン酸を測定することによって決定しました。赤い線は、データのための単一指数フィットを表します。破線灰色の線は、170nmの直径のVへオプシンの再構成のための単一指数フィットを表しますモノマー、予め形成された二量体または予め形成された四量体としてesicles。 x軸は（むしろPPR *よりも（）のメインテキストを参照してください）実験的に測定PPRを表すように、本 文で説明したように、適合定数は、むしろPPR *値よりもPPRに対応しています。 の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
スクランブラーゼ活性アッセイは、オプシンは、リン脂質スクランブラーゼ活性2を持っているかを決定するために、もともと私たちを可能にしました。アッセイはまた、（私たちは、図1AにNBD-PCのために示すように、アシル鎖にNBDで標識されたようなNBD-ホスファチジルエタノールアミンなどのNBD標識化レポーター脂質、さまざまなを使用、または上で私たちは、特異性をテストすることによってオプシンのスクランブ活動を特徴づけるために許可されました頭部基、NBD-スフィンゴミエリンまたはNBD-ホスファチジルセリン2）、小胞の脂質組成（小胞構成成分として、異なる量で例えば 、コレステロール）の効果、およびオプシンとすべての展示スクランブラーゼ活性のロドプシンの異なるコンホメーション状態かどうか。これらの分析は、リン脂質のための非特異的およびロドプシンの立体配座状態とは無関係に、またはそれはその発色団レチナール2,3が含まれているかどうかに関係なく、（毎秒万リン脂質>）ロドプシンのスクランブ活動が非常に高速であることを明らかにしました。ここに、我々はオプシンを含むプロテオリポソームを生成するための詳細な方法を提示し、リン脂質スクランブラーゼ活性のためのこれらの製剤をアッセイする方法を示しました。
記載の再構成プロトコルは、所与の脂質組成物のために、それは可溶化洗剤としてDDMを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製した後オプシンを再構成するために最適化されています。改変された条件のための理想的な再構成条件は、 図2で説明した「膨潤実験」を行うことによって決定されなければならないが、脂質組成、ならびに界面活性剤は、実験者のニーズに応じて変更することができる。DDMは、経験的に適しています安定した、アクティブな状態でオプシンを維持するため。しかしながら、このようなオクチルβグルコシド、CHAPSまたはトリトンX-100のような他の界面活性剤には、同様のプロトコールに従って使用することができます。トリトンX-100は、そのefficieとしてATP結合カセットトランスポーター（ABCトランスポーター）を再構成するために広く使用されている洗剤です膜の再構成を媒介する際にNCYは、他の界面活性剤のより高いであり、それはまた、予め形成されたリポソーム24と平衡するより少ない時間がかかります。
蛍光減少の程度は、リン脂質の比（PPRS）のタンパク質の範囲にわたって、すなわち 、オプシンの異なる量で再構成したサンプルについて得られた場合、機能的に再構成オプシンのオリゴマー状態を決定することが可能です。これを行うために、再構成された小胞のPPRは、明示的に、タンパク質とリン脂質の回収率として測定されなければならない変化してもよいです。タンパク質の回収は、再構成はに使用される精製されたタンパク質は全体の再構成されたサンプルの回収の比較を可能にする較正曲線を生成するために使用される定量的なウェスタンブロット分析によって推定することができるが、リン脂質の回復は、セクション1.2に記載のリン酸アッセイによって決定することができますPPR範囲（基準3で詳細に説明したように）試験しました。
スクランブラーゼ活性アッセイは、亜ジチオンが小胞に浸透していないことを前提に構築されています。この点は、小胞内に可溶性NBD標識化レポーターを捕捉し、亜ジチオン低減することができるかどうかを決定することによって確認することができます。この目的のために、NBD-グルコース（小胞の不安定化後に追加さ12.6μM）が代わりにNBD-PCの使用されています。小胞は密封され、したがって、亜ジチオンから保護されなければならないと、この水溶性分子は、プロテオリポソーム内に捕捉されます。還元のためのNBD-グルコースが完全にアクセスできるように、トリトンX-100を添加することができる（1％w / vで）、次いで100％減少3,27をもたらします。
プロテオリポソームは、レポーター脂質およびタンパク質の両方の再構成が対称であることを確認するように特徴付けることができます。後者はASPNプロテアーゼを使用して、プロテアーゼ保護戦略に基づいている前者はヨウ化物イオンを用いた衝突消光実験により達成されますオプシン3のC末端付近の特定の部位で切断します。
エンドポイント蛍光（F）にスクランブ活性アッセイで決定された初期蛍光（F i）をからの移行は複雑であるが、我々の目的のためには、合理的に、単一指数関数的減衰関数で近似することができます。指数関数的減衰（20秒）に関連する時定数は、大きく分けて、非アクティブリポソームおよびスクランブリングが早く、またはNBDフルオロフォアは亜ジチオンによって低減される速度よりも速く起こることを示すアクティブ、オプシン含有プロテオリポソームについても同様です。従って、スクランブラーゼ活性アッセイは、現在唯一のアクティブな、非常に遅いまたは非アクティブに変異体の分類を可能にする（亜ジチオン酸還元化学によって制限される）貧しい時間分解能を持っています。この分類は、カルシウム調節TMEM16 27スクランブために見ることができた：高のCa 2+レベルで、蛍光減衰は、股関節に一定の類似の時間を明らかにしましたトン律速段階は、脂質スクランブリングよりも亜ジチオンによってNBD-フルオロフォアの化学的還元であることを示す、タンパク質を含まないリポソームに見られます。逆に、低いの Ca 2+レベルで蛍光減少の定常状態は、二つの運動部品、外葉の亜ジチオン酸の減少に割り当てられた1と暴露に遅い1を区別することが可能となる、900秒後に到達しませんでした外部への内部リーフレットNBD-脂質の。
〜85％の減少（ 図3A）を超えることは困難である実験的現実に対する高いPPR（ 図1C）を用いて調製した小胞の亜ジチオン治療上の蛍光の予測100％損失との食い違いは小胞の割合は難治性であることを示唆しています再構成します。この画分は、洗剤をポリスチレンビーズに吸着されるように再構成手順中に早期にそのシールを小胞に対応するとしている可能性がありしたがって、もはやタンパク質を受信することができます。セクション3に記載の分析のために、我々は、この耐火性集団は、全小胞のF留分に相当すると仮定する。我々は難治性小胞にNBD-PC分子の半分（外葉におけるNBD-PCのプール）を想定した場合、我々は推定し、亜ジチオン削減のために利用可能であるF = 2•（1 - R / 最大 100）、または0.35時R 最大 = 82.5パーセント。
モノ指数方程式と*データPPRはオプシンは、単量体または二量体、またはより高次の多量体を含む状態の混合物として、機能的に再構成するかどうかを決定することが可能であるから、フィット感定数αを、提供する対のp（≥1スクランブラーゼ）のフィッティング。オプシン分子の割合がスクランブルに機能できない場合は、これらの結果の解釈が複雑になります。これは、そう、そのGタンパク質の全てを保持することを保証オプシンが精製される条件を与えている間に受容体活性は、二量体の機能的な挿入に対応するαの値も半分のタンパク質がscramblasesとして不活性であるオプシンの調製物からの単量体の機能的な挿入と解釈できます。考慮すべき追加的な点は、我々が提示する分析を再構成するために使用される小胞の大きさが均一であることを前提としていることです。実際には、小胞は平均直径の約3分の1に対応する標準偏差を有するガウス分布によって特徴づけられる直径の範囲を有します。幸いなことに、PPR *データ対Pの分析（≥1スクランブラーゼ）の結果が大幅に小胞の不均一性を考慮することによって影響されないので、我々が提示簡単な分析は、データを記述するのに十分です。
我々が記載された方法の潜在的な制限は、作業集約的手順は、サンプルaの非常に多数の高スループット測定を許可していないということですndはその小胞の不均一性は、読み出しを妨害する可能性があります。最初の問題は、スクランブアッセイのためのマイクロタイタープレートフォーマットを使用することによって克服されるかもしれません。第二は、TIRF顕微鏡を用いて、単一の小胞アッセイにより、将来的に解決することができます。
不安定化および再構成手順が確立されるとスクランブ活性を測定するためのジチオナイトアッセイは、非常に信頼性の高い堅牢なとみなすことができます。また、亜ジチオンアッセイから得られた結果を検証することができ、リン脂質の膜貫通輸送を定量化する別のアプローチは、脂肪酸不含ウシ血清アルブミン22を用いて、小胞の外側のリーフレットから短鎖NBD脂質の逆抽出です。逆抽出だけでなく、亜ジチオンアッセイはまた、28-33 P4型ATPアーゼのflippasesとABCトランスポーターを特徴づけ、識別するために使用されてきました。
ここに提示ツールは、簡単にdiffereに応じて適合させることができるようにNTは説明する手順は、汎用性がありますし、特定し、将来的にはリン脂質scramblasesを特徴づけるのに役立つだろう必要があります。細胞増殖中の生体膜の拡大のために必要なスクランブのものを含め、これらの多くのアイデンティティを学ぶことは最大限の生理学的に重要です。
追加の情報およびデータ分析の詳細については、読者は、我々の研究室2-4,27他と同様22,25,28,30から以前の出版物と呼ばれています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850457C | POPC |
| 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt) | Avanti Polar Lipids | 840457C | POPG |
| 1-palmitoyl-2-{6-[7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]hexanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 810130C | NBD-PC |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid | VWR Scientific | EM-5330 | HEPES |
| NaCl | Sigma | S7653-1KG | NaCl |
| Dodecyl-β-D-maltoside | Anatrace | D310 5 GM | DDM |
| Fluorimeter cuvettes | sigma | C0918-100EA | cuvettes |
| Spectrofluorometer | Photon Technology International, Inc. | fluorimeter | |
| Sodium hydrosulfite technical grade, 85% | Sigma | 157953-5G | dithionite |
| GraphPad Prism 5 software | Prism | ||
| Tris Base | VWR | JTX171-3 | Tris |
| LIPEX 10 ml extruder | Northern Lipids, Inc. | Extruder | |
| Whatman, Drain disc, PE, 25 mm | Sigma | 28156-243 | Disc support |
| Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes, 0.4 µm, 25 mm diameter | Sigma | WHA110607 | 400 nm membrane |
| Whatman Nucleopore Track-Etched Membranes, 0.2 µm, 25 mm diameter | Sigma | WHA110606 | 200 nm membrane |
| sodium phosphate | Sigma | S3264-500G | |
| VWR Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass, 13 x 100 mm | VWR Scientific | 47729-572 | glass tubes |
| Perchloric acid | Sigma | 30755-500ML | |
| Ammonium Molybdate Tetrahydrate | Sigma | A-7302 | ammonium molybdate |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma | A7631-25G | sodium ascorbate |
| Bio-Beads SM2 adsorbents | Bio Rad | 1523920 | polystyrene beads |
| 2.0 ml Microtubes clear | VWR Scientific | 10011-742 | Reconstitution tubes |
| Reconstitution glass tube | VWR Scientific | 53283-800 | Reconstitution glass tubes |
| Zetasizer | Malvern | DLS |
References
- Ernst, O. P., et al. Microbial and animal rhodopsins: structures, functions, and molecular mechanisms. Chem. Rev. 114, 126-163 (2014).
- Menon, I., et al.
- Goren, M. A., et al. Constitutive phospholipid scramblase activity of a G protein-coupled receptor. Nat. Commun. 5, 5115 (2014).
- Ernst, O. P., Menon, A. K.
- Sanyal, S., Menon, A. K. Flipping lipids: why an' what's the reason for? ACS Chem. Biol. 4, 895-909 (2009).
- Bevers, E. M., Williamson, P. L.
- Leventis, P. A., Grinstein, S. The distribution and function of phosphatidylserine in cellular membranes. Annu. Rev. Biophys. 39, 407-427 (2010).
- Quazi, F., Lenevich, S., Molday, R. S. ABCA4 is an N-retinylidene-phosphatidylethanolamine and phosphatidylethanolamine importer. Nat. Commun. 3, 925 (2012).
- Quazi, F., Molday, R. S. ATP-binding cassette transporter ABCA4 and chemical isomerization protect photoreceptor cells from the toxic accumulation of excess 11-cis-retinal. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 5024-5029 (2014).
- Ben-Shabat, S., et al. Formation of a nonaoxirane from A2E, a lipofuscin fluorophore related to macular degeneration, and evidence of singlet oxygen involvement. Angew. Chem. Int. Ed Engl. 41, 814-817 (2002).
- Sparrow, J. R., Wu, Y., Kim, C. Y., Zhou, J. Phospholipid meets all-trans-retinal: the making of RPE bisretinoids. J. Lipid Res. 51 (2010), 247-261 (2010).
- Schütt, F., Davies, S., Kopitz, J., Holz, F. G., Boulton, M. E. Photodamage to human RPE cells by A2-E, a retinoid component of lipofuscin. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41, 2303-2308 (2000).
- Picollo, A., Malvezzi, M., Accardi, A. TMEM16 proteins: unknown structure and confusing functions. J. Mol. Biol. 427, 94-105 (2015).
- Mohammadi, T., et al. Identification of FtsW as a transporter of lipid-linked cell wall precursors across the membrane. EMBO J. 30, 1425-1432 (2011).
- Meeske, A. J., et al. MurJ and a novel lipid II flippase are required for cell wall biogenesis in Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 6437-6442 (2015).
- Ruiz, N. Lipid Flippases for Bacterial Peptidoglycan Biosynthesis. Lipid Insights. 8, 21-31 (2015).
- Rick, P. D., et al. Evidence that the wzxE gene of Escherichia coli K-12 encodes a protein involved in the transbilayer movement of a trisaccharide-lipid intermediate in the assembly of enterobacterial common antigen. J. Biol. Chem. 278, 16534-16542 (2003).
- Suzuki, J., Imanishi, E., Nagata, S. Exposure of phosphatidylserine by Xk-related protein family members during apoptosis. J. Biol. Chem. 289, 30257-30267 (2014).
- Suzuki, J., Nagata, S. Phospholipid scrambling on the plasma membrane. Methods Enzymol. 544, 381-393 (2014).
- Alaimo, C., et al. Two distinct but interchangeable mechanisms for flipping of lipid-linked oligosaccharides. EMBO J. 25, 967-976 (2006).
- Ernst, C. M., Peschel, A. Broad-spectrum antimicrobial peptide restistance by MprF-mediated aminoacylation and flipping of phospholipids. Mol. Microbial. 80 (2), 290-299 (2011).
- Vehring, S., et al. Flip-flop of fluorescently labeled phospholipids in proteoliposomes reconstituted with Saccharomyces cerevisiae microsomal proteins. Eukaryot. Cell. 6, 1625-1634 (2007).
- Rouser, G., et al. Two dimensional then [sic] layer chromatographic separation of polar lipids and determination of phospholipids by phosphorus analysis of spots. Lipids. 5, 494-496 (1970).
- Rigaud, J. -L., Lévy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes. Methods Enzymol. 372, 65-86 (2003).
- Geertsma, E. R., Nik Mahmood, N. A. B., Schuurman-Wolters, G. K., Poolman, B. Membrane reconstitution of ABC transporters and assays of translocator function. Nat. Protoc. 3, 256-266 (2008).
- Mimms, L. T., Zampighi, G., Nozaki, Y., Tanford, C., Reynolds, J. A. Phospholipid vesicle formation and transmembrane protein incorporation using octyl glucoside. Biochemistry. 20, 833-840 (1981).
- Malvezzi, M., et al. Ca2+-dependent phospholipid scrambling by a reconstituted TMEM16 ion channel. Nat. Commun. 4, 2367 (2013).
- Eckford, P. D. W., Sharom, F. J. The reconstituted P-glycoprotein multidrug transporter is a flippase for glucosylceramide and other simple glycosphingolipids. Biochem. J. 389, 517-526 (2005).
- Marek, M., Günther-Pomorski, T. Assay of Flippase Activity in Proteoliposomes Using Fluorescent Lipid Derivatives. Methods Mol. Biol. 1377, 181-191 (2016).
- Coleman, J. A., Kwok, M. C. M., Molday, R. S. Localization purification, and functional reconstitution of the P4-ATPase Atp8a2, a phosphatidylserine flippase in photoreceptor disc membranes. J. Biol. Chem. 284, 32670-32679 (2009).
- Coleman, J. A., Quazi, F., Molday, R. S. Mammalian P4-ATPases and ABC transporters and their role in phospholipid transport. Biochim. Biophys. Acta. 1831, 555-574 (2013).
- Romsicki, Y., Sharom, F. J. Phospholipid flippase activity of the reconstituted P-glycoprotein multidrug transporter. Biochemistry. 40, 6937-6947 (2001).
- Zhou, X., Graham, T. R. Reconstitution of phospholipid translocase activity with purified Drs2p, a type-IV P-type ATPase from budding yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 16586-16591 (2009).
