Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Assay מבוסס-הקרינה של פעילות פוספוליפידים Scramblase

Published: September 20, 2016 doi: 10.3791/54635
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biochemistry, Weill Cornell Medical College

Abstract

Scramblases translocate פוספוליפידים ברחבי bilayer הממברנה באופן דו-כיווני בצורה ATP-עצמאית. Scramblase הראשון להיות מזוהה ומאומת ביוכימית היה opsin, את apoprotein של rhodopsin קולטי האור. Rhodopsin הוא G חלבון בשילוב קולטן מקומי ממברנות דיסק קולטי אור מוט של הרשתית שבו הוא אחראי על תפיסת האור. פעילות scramblase של Rhodopsin אינה תלויה ליגנד שלה 11- ציס -retinal, כלומר, opsin apoprotein פעיל גם scramblase. למרות פוספוליפידים מכוננים מוסדרים ערבול לשחק תפקיד חשוב בפיזיולוגית תא, רק כמה scramblases פוספוליפידים זוהה עד כה מלבד opsin. כאן אנו מתארים assay מבוסס קרינה של פעילות scramblase של opsin. Opsin הוא מחדש לתוך ליפוזומים unilamellar גדול המורכב phosphatidylcholine, phosphatidylglycerol וכמות זכר PC שכותרתו NBD ניאון (1-palmitoyl-2- {6- [7-ניטרו-2-1,3-benzoxadiazole-4-י.ל.) אמינו] hexanoyl} - SN -glycero-3-phosphocholine). פעילות Scramblase נקבעת על ידי מדידת המידה שבה מולקולות NBD-PC ממוקמות העלון הפנימי של השלפוחית ​​מסוגלות לגשת העלון החיצוני שבו הקרינה שלהם מתבטלת כימית על ידי סוכן צמצום שאי אפשר לחצות את הממברנה. השיטות נתאר יש תחולה כללית והוא יכול לשמש כדי לזהות ולאפיין פעילויות scramblase של חלבונים בממברנה אחרים.

Introduction

Rhodopsin קולטי האור, קולטן חלבון בשילוב אבטיפוס G (הנסקרת למשל ביחס 1), הוא scramblase פוספוליפידים הראשון להיות מזוהה מבחינה ביוכימית אומת 2,3. Scramblases הם מובילי פוספוליפידים להגביר את הקצב האיטי מיסודם של transbilayer תנועה פוספוליפידים לרמות מתאימות פיזיולוגית בתוך דו-כיוונית, ATP-עצמאי באופן 4-6. דוגמאות לפעולות שלהם ניתן למצוא ב reticulum endoplasmic הממברנה cytoplasmic חיידקים שבו מכונן ערבול דרוש הומאוסטזיס וצמיחת קרום, כמו גם עבור מגוון רחב של מסלולי glycosylation 5. פוספוליפידים מוסדרים ערבול נדרשת לחשוף phosphatidylserine (PS) על פני השטח של תאים אפופטוטיים שבו היא פועלת כמו "לאכול-לי" -signal עבור מקרופאגים 7 והוא מספק משטח procoagulant על ​​טסיות הדם מופעל כדי לזרז את הייצור של גורם חלבוןs דרוש קרישת דם. בממברנות דיסק קולטי אור, פעילות הערבול של rhodopsin הוצעה כדי לנטרל את חוסר האיזון פוספוליפידים בין שני העלונים הממברנה של bilayer כי מופק על ידי ATP תלוי, השומנים חד כיווני flippase ABCA4 4,8,9 10-12.

למרות החשיבות פיזיולוגיות של scramblases, זהותם נותר חמקמק עד rhodopsin היתה כפי שדווח scramblase דיסקים קולטי האור 2, בני משפחת חלבון TMEM16 זוהו Ca 2+ scramblases תלויי הדרושים חשיפה PS על הממברנה פלזמה (הנסקרת תוך התייחסות 13), ואת החלבון חיידקי FtsW הוצע בתור ליפידים השנייה scramblase הדרושים לסינתזת פפטידוגליקן 14. תגליות אלו התבססו על הכינון מחדש של חלבונים מטוהרים ליפוזומים והדגמה של הפעילות scramblase ב proteoliposomes וכתוצאה מכך באמצעות describ מתודולוגיהאד כאן. Scramblases פוטנציאליות נוספות 15-21 - החלבונים MurJ ו AMJ מעורב ביוסינתזה פפטידוגליקן, WzxE וחלבונים הקשורים מעורב ערבול מבשרי O-אנטיגן, חלבון MprF צריכה translocate phosphatidylglycerol aminoacylated דרך הממברנה cytoplasmic בקטריאלי, ובני משפחה Xkr8 כי הוצעו לחשוף PS על פני השטח של תאים אפופטוטיים - להישאר להיבדק ביוכימית. זה מדגיש את החשיבות של assay חזק כדי לזהות ולאפיין פעילות scramblase.

כאן, אנו מתארים את הכינון מחדש של opsin המטוהר, את apoprotein של rhodopsin קולטי האור, אל שלפוחית ​​unilamellar הגדולה (חביב), ואת ניתוח בדיעבד של פעילות scramblase ב proteoliposomes וכתוצאה מכך באמצעות assay המבוסס-קרינה. ישנם מספר פרוטוקולים היטיבו לתאר זמינים בספרות לביטוי Heterologous וטיהור opsin, ולכן אנחנו לא לתאר את זה בפרוטוקול זה; אנו משתמשים בפרוטוקולים המתואר גורן ואח '. 3 אשר מניב FLAG-מתויג, opsin thermostable בסביבות 100 ng / μl ב 0.1% (w / v) dodecylmaltoside (DDM).

כינון מושג על ידי טיפול חביב עם חומר ניקוי מספיק כך שהם להתנפח אבל אינם נמסים. בתנאים אלה, חלבון הממברנה - סיפק בצורת מיצלות חלבון-דטרגנט - ישתלב ליפוזומים הופכים מחדש לתוך הממברנה ליפוזום עם הסרת חומר ניקוי, וכתוצאה מכך proteoliposomes. כדי לשקם opsin (שהושג כמו פרוטאין טהור ב 0.1% (w / v) DDM), חביבי ערוכים מתערובת של POPC (1-Palmitoyl-2-oleoyl- SN -glycero-3-phosphocholine) ו POPG (1- Palmitoyl-2-oleoyl- SN -glycero-3- [-rac- phospho (1-גליצרול)]) ורווי DDM לפני הוספת opsin ו-PC NBD. הדטרגנט מוסר מכן על ידי טיפול המדגם עם חרוזי פוליסטירן.

הילדה = "jove_content"> העיקרון שבבסיס assay הקרינה המבוססת מוצגת באיור 1B. החביבים הם מחדש באופן סימטרי עם כמות זכר-PC NBD או אחרים כתב פוספוליפידים פלורסנט NBD שכותרתו (איור 1 א). על הוספת dithionite, dianion קרום impermeant, מולקולות-PC NBD בעלון החיצוני של חביבי ניתנים ללא ניאון כמו קבוצת ניטרו של NBD מצטמצם אמינו-קבוצה ללא ניאון. כמו לא מולקולות-PC NBD ולא dithionite מסוגלים לחצות את קרום על הזמן בקנה מידה של הניסוי (<10 דק '), זו התוצאה 50% הפחתה של אות ניאון. עם זאת, אם ליפוזומים הם מחדש עם scramblase, מולקולות-PC NBD בעלון הפנימי יכולים לזחול במהירות אל מחוץ שבו הם מופחתים. זו התוצאה של אובדן מוחלט של הקרינה במקרה האידיאלי (תרשים 1C).

es / ftp_upload / 54,635 / 54635fig1.jpg "/>
. איור 1: ייצוג סכמטי של assay פעילות scramblase את assay משתמשת שומנים כתבו ניאון שכותרתו NBD; NBD-PC מוצג (א). שלפוחית ​​unilamellar גדולה הן מחדש עם כמות זכר-PC NBD. כינון מייצר שלפוחית ​​סימטרית, עם NBD-PC מופץ באופן שווה את הכרוזים החיצוניים ופנימיים. Dithionite (S 2 O 4 2) כימי מפחית את הקבוצה נטר של NBD אל אמינו-קבוצה ללא ניאון. טיפול של ליפוזומים ללא חלבון עם dithionite (B, למעלה) גורמת ירידה של 50% של הקרינה מאז רק מולקולות-PC NBD בעלון החיצוני מופחתים: dithionite טעון שלילית ולא יכול לחצות את הממברנה להגיב עם מולקולות-PC NBD בעלון הפנימי. טיפול Dithionite של proteoliposomes המכילים opsin (B, למטה), כלומר, proteoliposomes scramblase-פעיל, התוצאות בהפסד 100% של fluorescence כמו opsin מקל תנועה של NBD-PC בין הפנימי לבין העלון החיצוני. (C) מראה עקבות קרינת אידיאליזציה מתקבלות על טיפול ליפוזומים חינם בחלבוני proteoliposomes המכיל opsin עם dithionite. שיעור הפסד קרינה הוא זהה בשני המקרים המציין כי הירידה הכימית של NBD ידי dithionite היא הגבלת קצב, וכי ערבול מתרחש בקצב שווה או גדול מהשיעור של התגובה הכימית. עקבות המתקבלות ניסוי בפועל מוצגות באיור 3. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

השיטות אנו מתארים ניתן להשתמש בו כדי לשקם ו assay חלבונים מטוהרים אחרים, כמו גם תערובות של חלבונים בממברנה שהושגו, למשל, על ידי מיצוי microsomes עם חומר ניקוי 22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנה ליפוזומים Proteoliposomes

  1. גיבוש liposome
    1. באמצעות מזרק זכוכית, להוסיף 1,435 μl POPC (25 מ"ג / מ"ל, כלורופורם) ו -160 μl POPG (25 מ"ג / מ"ל, כלורופורם) בבקבוק תחתית עגולה להשיג 52.5 μmol שומנים טוחנת יחס של POPC: POPG = 9: 1.
    2. ייבש את השומנים למשך 30 דקות באמצעות מאייד סיבובי במהירות סיבוב של 145 סל"ד (לא באמבט מים דרוש נפח זה של ממס), ולאחר מכן להעביר את הבקבוק כדי ואקום ייבוש לפחות 3 שעות, או הלילה, בטמפרטורת חדר (RT).
    3. מימה הסרט השומנים יבשים עם 10 מ"ל של 50 מ"מ HEPES pH 7.4, 100 מ"מ NaCl (להלן המכונה חיץ) על ידי מתערבל את הבקבוק בעדינות עד תוצאות ההשעיה הומוגנית, עכור;
      הערה: ריכוז השומנים בשלב זה צפוי להיות 5.25 מ"מ כמו שאף פסדים צריכים התרחשו עד כה.
    4. Sonicate ההשעיה באמבט מים במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר עם תדר of 40 קילוהרץ. הפתרון ייראה קצת יותר ברור.
    5. שימוש מכבש, להעביר את ההשעיה 10 פעמים דרך קרום עם גודל נקבובי 400 ננומטר, ואחריו מחזור שני של שחול עם 4 עובר דרך קרום עם גודל נקבובי 200 ננומטר.
      הערה: הקוטר הממוצע של חביבי המתקבלים הוא ~ 175 ננומטר. במידת הצורך, את הגודל ואת ההומוגניות של חביבי ניתן לבדוק על ידי Dynamic Light פיזור על פי הוראות היצרן.
    6. לכמת את ריכוז פוספוליפידים של ההשעיה LUV כמפורט בסעיף 1.2).
      הערה: בגלל הפסדים במהלך שחול, הריכוז הוא בדרך כלל סביב 3.6 מ"מ.
    7. אחסן את חביבי ב 4 מעלות צלזיוס למשך כ 2 שבועות אם לא נעשה שימוש באופן מיידי.
  2. כימות פוספוליפידים
    הערה: כדי לקבוע את ריכוז פוספוליפידים של ההשעיה LUV המשמש הכינון מחדש, כמו גם זה של proteoliposomes כי הם בסופו של דבר שנוצר, aliquot של המדגם הוא subjected לחמצון על ידי חומצה על-כלורית. הליך זה מתפרק פוספוליפידים לשחרר פוספטים אנאורגניים כי היא לכמת מכן על ידי assay colorimetric בהשוואה לתקני 23.
    1. כן פתרון מניות 40 מ"מ של פוספט נתרן (4 Na 2 HPO) במים מזוקקים deionized.
    2. לדלל את פתרון המניות עם מים מזוקקים deionized להשיג 4 מ"מ ו -0.4 מ"מ עובד פתרונות שישמשו סטנדרטי כיול.
    3. באמצעות הפתרונות עבודה, להכין סטנדרטים 13 x 100 מ"מ 2 צינורות זכוכית בטווח שבין 0 ל 80 פוספט nmol נתרן בנפח סופי של 50 μl.
    4. קח 10 μl כל אחת מהדגימות LUV ו proteoliposome כדי לכמת לדלל עם 40 μl של DDH 2 O ב 13 x 100 מ"מ 2 צינורות זכוכית.
      הערה: ככל ריכוז השומנים של חביבי ו proteoliposomes הוא בטווח 2.5-5 מיקרומטר, 10 μl של מדגם אמור להכיל 25-50 nmol זרחן השומנים.
    5. הוספת 300 μl perchloric חומצה לכל אחד מן הסטנדרטים דגימות וחום עבור שעה 1 ב 145 ° C בתוך גוש חימום. שים גולה על הצינורות כדי למנוע אידוי.
    6. תנו צינורות להתקרר לטמפרטורת החדר ומוסיפים 1 מ"ל של DDH 2 O.
    7. להוסיף 400 μl כל אחד מוכן טרי 12 גר '/ ל אמוניום molybdate ו ascorbate נתרן 50 גר' / ל ו מערבולת לערבב.
    8. חום במשך 10 דקות ב 100 מעלות צלזיוס עם גולות על גבי הצינורות. הסר את הצינורות מגוש החימום ולתת להם להתקרר לטמפרטורת חדר.
    9. מדוד את הספיגה של הדגימות נגד (המדגם סטנדרטי המכיל פוספט נתרן 0 nmol) הריק עם ספקטרומטר באורך גל של 797 ננומטר.
    10. קבע את התוכן פוספט של דגימות נגד עקומת סטנדרט כיול.
  3. כינון של opsin
    הערה: יש צורך לקבוע תנאי נפיחות אופטימליים עבור כינון מחדש כמו אלה תלוי אופיו של חומרי הניקוי, כמו גםכמו הרכב השומנים וריכוז של חביבי. כפי חביבים לשנות תכונות פיזור האור שלהם על נפיחות התהליך יכול להיות במעקב על ידי מדידה ספיגה (איור 2) כפי שנסקר על ידי ריגו, לוי 24 ו Geertsma et al. 25.
    1. פיפטה 800 μl של חביבי (מסעיף 1.1; התאוששות שומנים לאחר שהחול היא 70%, הריכוז הצפוי של חביבי הוא 3.6 מ"מ פוספוליפידים) לתוך צינור microfuge 2 מיליליטר.
    2. להוסיף 5.3 μl של חיץ ו 34.7 μl של 10% (w / v) DDM מומס חיץ א
    3. דגירה של 3 שעות בטמפרטורת החדר עם ערבוב הקצה על הקצה.
    4. בינתיים מכינים את חרוזי פוליסטירן:
      1. השתמש 400 מ"ג של חרוזים לדגימה ולשקול אותם בכוס זכוכית.
      2. לשטוף אותם פעמיים עם מתנול, שלוש פעמים עם מים ופעם עם חיץ א עבור כל שימוש כביסה צעד 5 מ"ל של נוזל ומערבבים לאט במשך 10 דקות.
        הערה: מומלץ להכין את פוליסטירןחרוזים במשך כמה דגימות בעת ובעונה אחת, למשל, לשקול 6 גרם של חרוזים ולשטוף עם 75 מ"ל של נוזל. חרוזים עודפים ניתן לאחסן במקרר למשך כמה ימים.
    5. במהלך יציבות שלפוחית ​​30 דקות של האחרון לייבש את פוספוליפידים NBD שכותרתו בתוך שפופרת זכוכית בורג מכסה ( "שפופרת זכוכית הכינון מחדש '): מדגם Per, 9.5 μl של NBD-PC (1 מ"ג / מ"ל ​​כלורופורם, מניב 0.4 mol% של פוספוליפידים סה"כ) הם מיובשים תחת זרם של חנקן בתוך שפופרת זכוכית מומס וכפועל יוצא מזה 45 μl של 0.1% (w / v) DDM ב חיץ א
    6. אחרי 3 שעות של יציבות שלפוחית ​​להוסיף פוספוליפידים מומס-NBD שכותרתו, החלבון-solubilized DDM ואת הצפת כך נפח סופי של 1 מ"ל מכיל 0.36% (w / v), כלומר, 7 מ"מ, DDM.
      1. לכן, כדי ליצור ליפוזומים חלבון ללא (המשמש מאז כמדגם שליטה) להוסיף 45 μl של-PC NBD (מומס 0.1% DDM), 60 μl של DDM 0.1% ו -55 μl של חיץ; עבור proteoliposomes להוסיף, לבחינהple, 40 μl של חלבון (מפתרון המניות אופייני ~ 110 ng / μl) ב DDM 0.1%, 45 μl של-PC NBD (מומס DDM 0.1%), 20 μl של DDM 0.1% ו -55 μl של חיץ .
        הערה: הסדר של תוספת צריך להיות כפי שרשום.
    7. מערבב את המדגם עבור קץ hr נוסף על הסוף בטמפרטורת חדר.
    8. הוסף 80 מ"ג של חרוזי פוליסטירן מוכן דגירה המדגם עם ערבוב הקצה מעל לקצה עבור שעה 1 ב RT.
    9. הבא להוסיף 160 מ"ג נוספים של חרוזי פוליסטירן דגירה עם ערבוב הקצה על הקצה במשך שעה 2 נוספת ב RT.
    10. מעבירים את המדגם (עזיבת חרוזי פוליסטירן בילה מאחורי) לצינור זכוכית בורג מכסה המכיל 160 מ"ג של חרוזי פוליסטירן טרי ומערבבים לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
      הערה: הדרך הקלה ביותר להעביר את המדגם ולהימנע מתחנפים חרוזים היא להשתמש פיפטה פסטר כי נדחק לתחתית שפופרת הזכוכית עם לחץ חיובי קטן. לאחר קצה פיפטה הוא בתקיפות בביתהחלק התחתון של הצינור, ואז המדגם ניתן למשוך בקלות ללא הפרעה מן החרוזים.
    11. למחרת בבוקר, להעביר את המדגם כדי צינור microfuge ללא ובה למעלה חרוזים ומניחים על קרח כהכנה assay פעילות scramblase.

2. Assay פעילות Scramblase

הערה: עוצמת הקרינה של ליפוזומים או proteoliposomes מדולל חיץ מנוטרת לאורך זמן על התוספת של dithionite בספקטרומטר קרינה. כדי לקבל עוצמת החל יציבה, הקרינה היא רשמה שני 50 לפחות (או עד אות יציבה מושגת) לפני הוספת dithionite מדגם לנער ללא הפסקה ולאחר מכן הוא במעקב במשך לפחות 500 שניות לאחר הוספת dithionite.

  1. להוסיף 1,950 μl של חיץ א 'עד קובט פלסטיק המכיל ומערבבים-מיני בר.
  2. הוסף 50 μl של proteo המוכן (ליפוזומים) ולתת המדגם לאזן את spectro הקרינהמטר עם ערבוב מתמיד במשך כמה שניות.
  3. בינתיים מכינים תמיסה של 1 M dithionite ב 0.5 M unbuffered טריס (למשל, עבור שני מדגמים לשקול את 20 מ"ג של dithionite בתוך שפופרת microfuge ו להתמוסס 114 μl קרים כקרח 0.5 M טריס ישירות לפני השימוש ולשמור על הקרח עבור הבא לִטעוֹם).
    הערה: פתרון dithionite חייב להיות מוכן טרי ולא צריך לשמש יותר מ 20 דקות לאחר הכנה; אם מדידות רבות הם להיעשות, aliquots של dithionite יכול להישקל החוצה מראש ופיזר ממש לפני השימוש.
  4. הפעל את ניטור הקרינה (עירור 470 ננומטר, פליטת 530 ננומטר, ושיסף ננומטר 0.5 רוחב).
  5. הוסף 40 μl של פתרון 1 M dithionite ל- SEC 50 קובט לאחר תחילת הקרינה הקלטה (להשתמש מחצה במכסה של החדר קובט אם אפשר) ולהמשיך להקליט את הקרינה במשך שניות 400-600 נוספת.
  6. לנתח את הנתונים כפי שתואר בסעיף 3.

3.ניתוח נתונים

  1. קינטיקה של ערבול
    1. לאפיין את עקבות הקרינה של כל מדגם המתקבל על ידי assay פעילות scramblase ידי הגדרת הקרינה הראשונית, F אני, לפני הוספת dithionite, ואת קרינת נקודת סיום, F, הגיע לאחר> 400 שניות. אני F נקבע עבור כל דגימה כערך הממוצע של קרינה לתקופת 30 שניות לפני תוספת של dithionite.
    2. קבע את נתוני נקודת הסיום המתאים את היקף הפחתת קרינה, R = 100 • F / F i. אנו משתמשים L R התנאים ליפוזומים חלבון ללא ו- R P עבור proteoliposomes המכיל opsin.
  2. קביעת המשקל המולקולרי של Scramblase מחדש מהבחינה התפקודית
    1. המרת נתוני הפחתת קרינה על פי המשוואה הבאה:
      p (≥1 scramblase) = (R P - R L) / (מקסימום R - R L) (משוואה 1)
      הערה: איפה מקסימום R הוא ההפחתה המקסימלי מתקבלת כאשר חלבון מספק מחדש כך שכל השלפוחית ​​במדגם להחזיק לפחות scramblase אחד פונקציונלי, p הוא ההסתברות כי שלפוחית ​​בפרט במדגם מורחב 'scramblase-אקטיבית " כלומר, הוא בעל לפחות scramblase אחד תפקודי. הערך עבור L R הוא בדרך כלל 45% 3 ואילו R מקסימום הוא בדרך כלל 82.5% 3, במקום (מקסימום R יכול להיקבע באופן ניסיוני עבור proteoliposomes opsin עם PPR של> 1 מ"ג / mmol) 100% צפוי. כפי R מקסימום <100% הנחה היא כי שלפוחית ​​תת-אוכלוסייה של הוא עקשן כינון מחדש. מקס R = 82.5%, את החלק היחסי של שלפוחית ​​כי אינה יכולה לקבל חלבון הוא 0.35.
    2. תאר את היחסים בין p (≥1 scramblase) ומקום מגורי הקבע (פוספוליפידים חלבון / מילימול מ"ג) על ידי הסטטיסטיקה פואסון כדלקמן:
      p (≥1 scramblase) = 1 - e הערה: כאשר m = מספר scramblases לכל שלפוחית ​​α =-מונו מעריכית מתמדת בכושר ביחידות של פוספוליפידים חלבון / מילימול מ"ג.
    3. כשבר של השלפוחית ​​אינו תורם ערבול אפילו PPR גבוה (ראה דיון), לשנות את המשוואה:
      p (≥1 scramblase) = 1 - exp (-PPR * / α) (משוואה 3)
      הערה: איפה PPR * = PPR / (1- ו), כאשר f הוא האוכלוסייה העקשנית של שלפוחית ​​או, במקרה זה, PPR * = PPR / 0.65 (משוואת 4).
      הערה: α הקבוע בכושר נקבע על ידי התאמת גרף של p (≥1 scramblase) לעומת PPR * עם פונקציה מונתה מעריכים. אם opsin (משקל מולקולרי 41.7 KDA) מבחינה תפקודית reconstitutes לתוך 175 ננומטר בקוטר שלפוחית ​​(לכל אחד מהם יש שלפוחית ​​280,000 פוספוליפידים 26) בתור מונומר, α = 0.187 מ"ג מילימול -1. אם opsin dimerizes לפני כינון 3 להניב שלפוחית ​​scramblase-פעיל, אז α= 0.37 מ"ג מילימול -1. אם PPR ולא PPR * היו לשמש לניתוח, לאחר מכן את הערכים α המתאים יהיה 0.122 ו 0.244 מ"ג מילימול -1. הערכים החזויים אלה עבור α להניח שכל מולקולות opsin מבחינה תפקודית המוסמכות. אם רק חלק קטן של המולקולות מוסמך לטרוף שומנים, לאחר מכן את הערכים המתאימים של α יהיו גדולים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אנו מתארים את הכינון מחדש של opsin לתוך חביבי לאפיין את פעילות scramblase שלה באמצעות assay המבוסס-קרינה. אנחנו מנתחים את התוצאות להציב גבול תחתון על השיעור של פוספוליפידים בתיווך opsin ערבול ולקבוע מדינת oligomeric שבו opsin reconstitutes תפקודי לתוך השלפוחית.

כדי לזהות תנאי כינון מחדש אופטימליים, יש צורך לקבוע באופן אמפירי את כמות חומר הניקוי כי יש להשתמש כדי להעשיר את חביבי, כך שהם פתוחים הרכבתן חלבון. ניסוי כזה מתואר באיור 2A. Aliquots של POPC: חביבי POPG מטופלים עם כמויות שונות של DDM עבור 3 שעות ואת הספיגה של המדגם הוא נמדד ב 540 ננומטר, מידה של עכירות ולכן גודל שלפוחית. הצפיפות האופטית נמדדה ב 540 ננומטר (OD 540) גרף מראה כי השלפוחית ​​להתנפח כמו DDM concentration הוא עלה מ 4-6 מ"מ, להגיע לנקודת רוויה בסביבות 7 מ"מ לפני שמתחילים solubilize (המקביל ל הפסד של עכירות אות OD 540) כמו DDM הוא גדל עוד יותר. NBD-PC מתווסף לאחר הטיפול החומר ניקוי דגימות מודגרת נוספת במשך שעה לפני מטופלת עם חרוזי פוליסטירן להסיר חומר ניקוי. חלוקת transbilayer של-PC NBD נקבעת על ידי מדידת הפסד קרינה לאחר הוספת dithionite אל השלפוחית ​​(כמתואר לעיל). לפיכך, NBD-PC מחדיר לתוך העלון החיצוני של שלפוחית ​​בהיעדר חומר הניקוי, שמסומן על ידי הנגישות המלאה שלה dithionite. עבור שלפוחית ​​שטופלו> 2 מ"מ DDM, NBD-PC הוא מסוגל להפיץ באופן סימטרי לשני עלונים כך שפעם מוסר DDM 50%-PC NBD מוגן מפני dithionite.

איור 2B מראה ניסוי יציבות-כינון מחדש דומה (מצויר מחדש מהתייחסות 2 </ Sup>), הפעם מעקב מחדש של opsin. בניסוי זה ניתן לראות כי 7 מ"מ DDM דרוש הכינון מחדש opsin כך NBD-המחשב הופך כמותית (> 80%) נגישים dithionite כתוצאה בתיווך opsin ערבול.

איור 2
איור 2:. הכינון של NBD-PC ו opsin לתוך שלפוחית-ערער דטרגנט (א) Aliquots של שלפוחית ​​מטופלים עם מגוון של ריכוזי חומר ניקוי (0-9 מ"מ) על ידי ערבוב הקצה מעל לקצה עבור 3 שעות בטמפרטורת החדר . בסוף התקופה הדגירה את הספיגה של הדגימות ב 540 ננומטר נמדדת (קו שחור). NBD-PC (מומס 0.1% w / v DDM) כך מוסיפים המדגם הוא מודגרות למשך שעה 1 נוספת בטמפרטורת החדר לפני דטרגנט הוסר על ידי טיפול חרוזי פוליסטירן. ליפוזומים כתוצאה מנותח על ידי פלואוריד assay הפחתת escent (קו אדום) כדי לקבוע את המידה שבה NBD-PC הוא מחדש באופן סימטרי. (ב) כבית ב (א) אלא שלפוחית ​​הניסוי הזה נוצר פוספוליפידים ביצה (PC ביצה / חומצה phosphatidic ביצה, 9: 1 mol / mol) מעורער עם DDM, ו opsin נוספה יחד עם PC-NBD, וכתוצאה מכך הפחתת הקרינה של כ -80% פעם החלבון מחדש ביעילות מסוגל להקל ערבול של-PC NBD (שונה מההתייחסות 2). למרות-PC NBD הוקמה מחדש באופן סימטרי ב -2 מ"מ DDM, תנאים אידיאליים reconstituting opsin נבחרו סביב הפסגה של ספיגת OD 540, כלומר, הנקודה שבה שלפוחית ​​היו נפוחות מאוד בשל חומר ניקוי intercalated אך טרם solubilized (מסומן על ידי חֵץ). לקבלת POPC / POPG (9: 1 mol / mol) שלפוחית, ריכוז DDM של 8 מ"מ נמצאה להיות אופטימלי עבור שני-PC NBD והרכבתה מחדש opsin./54635/54635fig2large.jpg "Target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

היקף הפחתת קרינה עולה עם כמות opsin המשמשת כינון מחדש. איור 3A מראה עקבות קרינה שהתקבלו על הוספת dithionite כדי NBD-PC-המכילים ליפוזומים חלבון ללא (זכר שחור) proteoliposomes מחדש עם opsin ב חלבון שונה יחסי פוספוליפידים (PPR, ביחידות של חלבון מ"ג פוספוליפידים מילימול, עקבות אדומות); העקבות כבר מנורמלות כך לכולם יש את אותה קרינה ראשונית (i F) וערך עבור להדמיה קלה. מתאים monoexponential של עקבות מצביעים קבועי הזמן דומה מאוד, הנעים בין 20-25 שניות; כמו שיעור ההפחתה NBD-PC בתיווך dithionite ב ליפוזומים ללא חלבון זהה של proteoliposomes, זה אפשרי רק למקום אומדן נמוך על שיעור של ערבול בתיווך opsin (ראה טקסt לפרטים נוספים). איור 3 ב מציג את הנתונים נותחו המתקבל מבחני הפחתת הקרינה להניב חלקות p (≥1) scramblase (ההסתברות של שלפוחית ​​שיש לפחות scramblase אחד) מול PPR נמדד בניסוי (הקשורים PPR * כפי שפורט לעיל). השוואת בכושר monoexponential של תוצאות הניסוי בהתקפים היפותטי המתאים opsin להיות מחדש כהצגת מונומר, דימר או tetramer כי opsin reconstitutes תפקודית כמו דימר.

איור 3
איור 3:. Scramblase פעילות של opsin (א) עקבות קרינה מתאימות dithionite לטיפול שלפוחית ​​מחדש עם NBD-PC וכמויות opsin הנעות בין 0-4.95 מיקרוגרם, שמסומן על ידי הטריז. הסכום הנמוך ביותר של opsin מחדש מקביל PPR של 0.21 מ"ג / מילימול, אתשני הסכום הגבוה ביותר כדי 0.43 מ"ג / מילימול ואת הסכום הגבוה ביותר ל -1.3 מ"ג / מילימול, או 10 opsins לכל שלפוחית ​​בממוצע. Dithionite נוספה ברגע המתאים (חץ) ואת הקרינה NBD היה פיקוח עבור sec 400 נוספים. במידה המרבית של הפחתת הקרינה לראות בניסוי זה היה 85% לעומת ממוצע של מעל ניסויים רבים הוא 82.5%. (ב) תלות חלבון של ערבול. נתונים מניסויים דומים פנל נותחו באמצעות סטטיסטיקת Poisson כדי ליצור גרף של ההסתברות של שלפוחית ​​שיש לפחות scramblase אחד (עמ '≥1 scramblase) לעומת חלבון יחס פוספוליפידים (PPR) של השלפוחית ​​(חלבון היה לכמת פוסט הכינון מחדש על ידי ניתוח כתם המערבי 3 ו פוספוליפידים נקבע על ידי מדידת פוספטים אנאורגניים שוחרר על הידרוליזה חומצית). הקו האדום מייצג בכושר מונה-ומהיר ל הנתונים; הקווים האפורים המקווקוים מייצגים מתאימים מוניו-ומהירים ל כינון מחדש של opsin לתוך 170 נ ננומטר בקוטרesicles כמו מונומרים, הדימרים מראש יצרו או tetramers בנוי מראש. כמו הציר x מייצג את PPR נמדד בניסוי (ולא PPR * (ראה טקסט ראשי)), הקבוע בכושר מתאים PPR ולא PPR * ערכים, כפי שפורט הטקסט הראשי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

את assay פעילות scramblase אפשרה לנו במקור לקבוע opsin שיש לו פעילות פוספוליפידים scramblase 2. את assay גם אפשר לנו לאפיין את פעילות scramblase של opsin ידי בדיקה סגולית (השתמשנו במגוון של שומנים כתב שכותרתו NBD כגון NBD-phosphatidylethanolamine, שכותרתו עם NBD על שרשרת acyl כפי שמוצג על-PC NBD באיור 1 א ', או על headgroup,-ספינגומיילין NBD או NBD- phosphatidylserine 2), את ההשפעה של הרכב השומנים שלפוחית ​​(למשל, כולסטרול בסכומים שונים כמרכיב שלפוחית), והאם מדינות קונפורמציה שונה של opsin ו rhodopsin כל פעילות scramblase התערוכה. ניתוחים אלה עולים כי פעילות scramblase של rhodopsin היא מהירה מאוד (> 10,000 פוספוליפידים לכל שניות), הלא ספציפי עבור פוספוליפידים ועצמאי של המדינה קונפורמציה של rhodopsin או אם הוא מכיל כרומופור שלה ברשתית 2,3. כאן,הצגנו שיטה מפורטת כדי ליצור proteoliposomes המכיל opsin והראה איך לבחון את ההכנות הללו לפעילות scramblase פוספוליפידים.

פרוטוקול הכינון מחדש תאר מותאם במיוחד עבור רכב השומנים הנתון מחדש של opsin לאחר מטוהר על ידי כרומטוגרפיה זיקה באמצעות DDM חומרי ניקוי solubilizing. הרכב השומנים וכן חומר הניקוי ניתן לשנות בהתאם לצרכים של הנסיין, למרות שהתנאים הכינון מחדש אידיאלי בנסיבות משתנות צריך להיקבע על ידי ביצוע "הניסוי נפיחות" כמתואר באיור 2. DDM הוא אמפירי מתאים היטב לשמירת opsin במצב יציב ופעיל. עם זאת, ודטרגנטים אחרים כגון octyl-β-glucoside, בחורים או טריטון X-100 ניתן להשתמש באי פרוטוקולים דומים. טריטון X-100 הוא חומר ניקוי בשימוש נרחב עבור בנייה מחדש של מובילי קלטת מחייב ATP (מובילי ABC) כמו efficie שלהncy בתיווך הכינון מחדש קרום גבוה של דטרגנטים אחרים וזה גם לוקח פחות זמן לאזן עם ליפוזומים preformed 24.

אפשר לקבוע את המדינה oligomeric של opsin מחדש מבחינה תפקודית אם היקף הפחתת פלורסנט מתקבל עבור דגימות מחדש עם כמויות שונות של opsin, כלומר, על פני טווח של חלבון כדי יחסי פוספוליפידים (PPRs). על מנת לעשות זאת, מקום מגורי הקבע של השלפוחית ​​מחדש חייבים להימדד במפורש התאוששות של חלבון פוספוליפידים עשויים להשתנות. ניתן לקבוע התאוששות פוספוליפידים ידי assay פוספט בסעיף 1.2, תוך התאוששות חלבון יכולה להיות מוערכת על ידי ניתוח כמוני הכתם המערבי שבו החלבונים המטוהרים המשמשים reconstitutions משמשים ליצירת עקומת כיול המאפשרת השוואה להתאוששות של דגימות מחדש על פני בטווח PPR נבדק (כפי שיפורט בהתייחס 3).

את assay פעילות scramblase בנויה על ההנחה כי dithionite לא מחלחל לתוך השלפוחית. נקודה זו ניתן לאמת על ידי לכידה עיתונאית מסיס שכותרתו NBD בתוך השלפוחית ​​ולקבוע אם זה יכול להיות מופחת על ידי dithionite. לשם כך, גלוקוז NBD (12.6 מיקרומטר שנוספו לאחר יציבות שלפוחית) משמש במקום-PC NBD. מסיסים במים מולקולה זו היא לכודה בתוך proteoliposomes פעם השלפוחית ​​נסגרת ולכן צריך להיות מוגנת מפני dithionite. כדי להפוך את הגלוקוז NBD נגיש לחלוטין עבור הפחתה, טריטון X-100 ניתן להוסיף (1% w / v) אשר יגרום לאחר מכן 100% הפחתת 3,27.

Proteoliposomes ניתן לאפיין לאמת כינון מחדש כי הן של שומני הכתב והחלבון הם סימטריים. לשעבר היא מושגת על ידי ניסויים מרווה collisional באמצעות יונים יודיד בעוד האחרונה מבוססת על אסטרטגיה הגנה פרוטאז באמצעות פרוטאז AspN כיחותך באתר ספציפי ליד C- הסופי של opsin 3.

המעבר מן הקרינה הראשונית (i F) שנקבעה assay פעילות scramblase אל קרינת נקודת סיום (F) הוא מורכב, אבל לעניין זה יכול להיות מקורב באופן סביר על ידי פונקצית דעיכה מעריכית יחידה. קבוע הזמן קשור הדעיכה מעריכית (20 שניות) הוא בערך אותו הדבר עבור ליפוזומים פעיל ופעיל, proteoliposomes המכיל opsin המציין ערבול מתרחש מהר, או מהר יותר מאשר הקצב שבו fluorophore NBD הוא מופחת על ידי dithionite. לפיכך assay פעילות scramblase בעל רזולוציה עניה זמן (המוגבלת dithionite כימית הפחתה) אשר כיום רק מתירה סיווג המוטציות לתוך פעיל, מאוד איטי או לא פעיל. סיווג זה ניתן היה לראות על scramblase מוסדר בסידן TMEM16 27: ברמות גבוהות Ca 2+, דעיכת הקרינה חשפה זמן קבוע דומה thaלא ראיתי ב ליפוזומים חלבון ללא, המציין כי שיעור הגבלת הצעד היא הפחתה הכימי של fluorophore-NBD ידי dithionite מ השומנים ערבול. נהפוך הוא, ברמות נמוכות Ca 2+ המצב היציב של הפחתת ניאון לא הושג לאחר 900 שניות, מה שהופך אותו ניתן להבחין בין שני מרכיבים קינטית, אחד שהוקצה הפחתת dithionite של העלון החיצוני ואת אחד איטי לחשיפה של שומני NBD הפנימיים-עלון מבחוץ.

הפער בין פסד 100% חזה של קרינה על dithionite לטיפול השלפוחית ​​מוכנה עם גבוה PPR (תרשים 1C) אל מול מציאות הניסיון שבו קשה לחרוג ~ 85% הפחתה (איור 3 א) עולה כי חלק קטן של השלפוחית ​​הוא עקשן כדי כינון מחדש. חלק זה יכול מתאים שלפוחית ​​חותמת כי מוקדם במהלך הליך הכינון מחדש כמו דטרגנט הוא adsorbed על חרוזי הקלקר והםולכן כבר לא מסוגל לקבל חלבון. לניתוח שתואר בסעיף 3, הנחנו כי אוכלוסייה עקשנית זו תואמת את שבריר f של השלפוחית ​​הכוללת. אם נניח כי מחצית המולקולות-PC NBD (בברכה של-PC NBD בעלון החיצוני) של השלפוחית ​​העקשנית זמין עבור dithionite ירידה, אז אנו מעריכים f = 2 • (1 - R מקסימום / 100), או 0.35 כאשר R מקסימום = 82.5%.

התאמה של p (≥1 scramblase) לעומת PPR * נתונים עם משוואה מונתה מעריכים מספק את α קבוע בכושר, שממנו אפשר לקבוע אם opsin reconstitutes תפקודי כמו מונומר או דימר, או תערובת של מדינות כולל multimers מסדר גבוה . הפרשנות של התוצאות הללו הופך מסובך אם שבריר של מולקולות opsin לא יכול לתפקד ערבול. בעוד זה לא סביר לאור התנאים שבהם opsin מטוהרים אשר מבטיח כי הוא שומר על כל חלבון G שלהפעילויות קולטן, ערך של α המתאים יותר להחדרה התפקודית של הדימרים יכול גם להתפרש ההחדרה התפקודית של מונומרים מתוך הכנת opsin שמחצית החלבונים אינם פעילים כמו scramblases. נקודה נוספת שיש לקחת בחשבון היא כי הניתוח זה אנו מציגים מניח כי השלפוחית ​​המשמשת כינון מחדש הם הומוגניים בגודל. במציאות, יש שלפוחית ​​מגוון של קטרים ​​מאופיין הפצה גאוס עם סטיית תקן מקביל לכשליש של הקוטר הממוצע. למרבה המזל, התוצאה של הניתוח של p (≥1 scramblase) לעומת נתוני PPR * אינה מושפעת באופן משמעותי על ידי שיקול של ההטרוגניות שלפוחית ​​ולכן הניתוח פשוט שהצגנו מספיקה כדי לתאר את הנתונים.

מגבלת פוטנציאל השיטות שתארנו היא כי נוהל העבודה אינטנסיבית אינו מאפשר מדידות תפוקה גבוהה של מספר גבוה מאוד של דגימותnd כי ההטרוגניות שלפוחית ​​עלולות להפריע את ההודעה. הבעיה הראשונה עלול להיות להתגבר באמצעות פורמט microtiter צלחת עבור assay scramblase; השני יכול להיפתר בעתיד על ידי מבחני שלפוחית ​​יחידים באמצעות מיקרוסקופ TIRF.

את assay dithionite למדידת פעילות scramblase יכול להיחשב מאוד אמין ויציב פעם נהלים יציבות והרכבתה מחדש מבוססים. גישה חלופית לכמת תחבורה הטרנסממברני של פוספוליפידים, כי גם מאפשרת אימות התוצאות שהתקבלו assay dithionite, היא חזרה השאיבה של שומני NBD קצר שרשרת מן העלון החיצוני של השלפוחית ​​באמצעות אלבומין בסרום שור שומן ללא חומצה 22. חזרה שאיבה וכן assay dithionite גם להיות מועסק לאפיין ולזהות flippases של ATPases P4-סוג מובילי ABC 28-33.

כמו כלים המוצגים כאן ניתן להתאים בקלות על פי differeNT צריך ההליכים המתוארים הם מגוונים וכן יסייעו בזיהוי ואפיון scramblases פוספוליפידים בעתיד. לימוד הזהות של רבים מהם, כולל זה של scramblase ההכרחי להרחבת ממברנות ביוגני במהלך צמיחת תאים הוא בעלת חשיבות עליונה פיזיולוגית.

לקבלת מידע נוסף ותיאור מפורט של ניתוח נתונים, הקוראים מופנים בפרסומים קודמים מהמעבדה שלנו 2-4,27 כמו גם אחרים 22,25,28,30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים אין לי מה לחשוף.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850457C POPC
1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt) Avanti Polar Lipids 840457C POPG
1-palmitoyl-2-{6-[7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]hexanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 810130C NBD-PC
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid VWR Scientific EM-5330 HEPES
NaCl Sigma S7653-1KG NaCl
Dodecyl-β-D-maltoside Anatrace D310 5 GM DDM
Fluorimeter cuvettes sigma C0918-100EA cuvettes
Spectrofluorometer Photon Technology International, Inc. fluorimeter
Sodium hydrosulfite technical grade, 85% Sigma 157953-5G dithionite
GraphPad Prism 5 software Prism
Tris Base VWR JTX171-3 Tris
LIPEX 10 ml extruder  Northern Lipids, Inc. Extruder
Whatman, Drain disc, PE, 25 mm Sigma 28156-243 Disc support
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes, 0.4 µm, 25 mm diameter Sigma WHA110607 400 nm membrane
Whatman Nucleopore Track-Etched Membranes, 0.2 µm, 25 mm diameter Sigma WHA110606 200 nm membrane
sodium phosphate Sigma S3264-500G
VWR Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass, 13 x 100 mm VWR Scientific 47729-572 glass tubes
Perchloric acid Sigma 30755-500ML
Ammonium Molybdate Tetrahydrate Sigma A-7302 ammonium molybdate
(+)-Sodium L-ascorbate Sigma A7631-25G sodium ascorbate
Bio-Beads SM2 adsorbents Bio Rad 1523920 polystyrene beads
 2.0 ml Microtubes clear VWR Scientific 10011-742 Reconstitution tubes
Reconstitution glass tube VWR Scientific 53283-800 Reconstitution glass tubes
Zetasizer  Malvern  DLS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ernst, O. P., et al. Microbial and animal rhodopsins: structures, functions, and molecular mechanisms. Chem. Rev. 114, 126-163 (2014).
  2. Menon, I., et al. Opsin is a phospholipid flippase. Curr. Biol. CB. 21, 149-153 (2011).
  3. Goren, M. A., et al. Constitutive phospholipid scramblase activity of a G protein-coupled receptor. Nat. Commun. 5, 5115 (2014).
  4. Ernst, O. P., Menon, A. K. Phospholipid scrambling by rhodopsin. Photochem. Photobiol. Sci. Off. J. Eur. Photochem. Assoc. Eur. Soc. Photobiol. , (2015).
  5. Sanyal, S., Menon, A. K. Flipping lipids: why an' what's the reason for? ACS Chem. Biol. 4, 895-909 (2009).
  6. Bevers, E. M., Williamson, P. L. Phospholipid scramblase: an update. FEBS Lett. 584, 2724-2730 (2010).
  7. Leventis, P. A., Grinstein, S. The distribution and function of phosphatidylserine in cellular membranes. Annu. Rev. Biophys. 39, 407-427 (2010).
  8. Quazi, F., Lenevich, S., Molday, R. S. ABCA4 is an N-retinylidene-phosphatidylethanolamine and phosphatidylethanolamine importer. Nat. Commun. 3, 925 (2012).
  9. Quazi, F., Molday, R. S. ATP-binding cassette transporter ABCA4 and chemical isomerization protect photoreceptor cells from the toxic accumulation of excess 11-cis-retinal. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 5024-5029 (2014).
  10. Ben-Shabat, S., et al. Formation of a nonaoxirane from A2E, a lipofuscin fluorophore related to macular degeneration, and evidence of singlet oxygen involvement. Angew. Chem. Int. Ed Engl. 41, 814-817 (2002).
  11. Sparrow, J. R., Wu, Y., Kim, C. Y., Zhou, J. Phospholipid meets all-trans-retinal: the making of RPE bisretinoids. J. Lipid Res. 51 (2010), 247-261 (2010).
  12. Schütt, F., Davies, S., Kopitz, J., Holz, F. G., Boulton, M. E. Photodamage to human RPE cells by A2-E, a retinoid component of lipofuscin. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41, 2303-2308 (2000).
  13. Picollo, A., Malvezzi, M., Accardi, A. TMEM16 proteins: unknown structure and confusing functions. J. Mol. Biol. 427, 94-105 (2015).
  14. Mohammadi, T., et al. Identification of FtsW as a transporter of lipid-linked cell wall precursors across the membrane. EMBO J. 30, 1425-1432 (2011).
  15. Meeske, A. J., et al. MurJ and a novel lipid II flippase are required for cell wall biogenesis in Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 6437-6442 (2015).
  16. Ruiz, N. Lipid Flippases for Bacterial Peptidoglycan Biosynthesis. Lipid Insights. 8, 21-31 (2015).
  17. Rick, P. D., et al. Evidence that the wzxE gene of Escherichia coli K-12 encodes a protein involved in the transbilayer movement of a trisaccharide-lipid intermediate in the assembly of enterobacterial common antigen. J. Biol. Chem. 278, 16534-16542 (2003).
  18. Suzuki, J., Imanishi, E., Nagata, S. Exposure of phosphatidylserine by Xk-related protein family members during apoptosis. J. Biol. Chem. 289, 30257-30267 (2014).
  19. Suzuki, J., Nagata, S. Phospholipid scrambling on the plasma membrane. Methods Enzymol. 544, 381-393 (2014).
  20. Alaimo, C., et al. Two distinct but interchangeable mechanisms for flipping of lipid-linked oligosaccharides. EMBO J. 25, 967-976 (2006).
  21. Ernst, C. M., Peschel, A. Broad-spectrum antimicrobial peptide restistance by MprF-mediated aminoacylation and flipping of phospholipids. Mol. Microbial. 80 (2), 290-299 (2011).
  22. Vehring, S., et al. Flip-flop of fluorescently labeled phospholipids in proteoliposomes reconstituted with Saccharomyces cerevisiae microsomal proteins. Eukaryot. Cell. 6, 1625-1634 (2007).
  23. Rouser, G., et al. Two dimensional then [sic] layer chromatographic separation of polar lipids and determination of phospholipids by phosphorus analysis of spots. Lipids. 5, 494-496 (1970).
  24. Rigaud, J. -L., Lévy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes. Methods Enzymol. 372, 65-86 (2003).
  25. Geertsma, E. R., Nik Mahmood, N. A. B., Schuurman-Wolters, G. K., Poolman, B. Membrane reconstitution of ABC transporters and assays of translocator function. Nat. Protoc. 3, 256-266 (2008).
  26. Mimms, L. T., Zampighi, G., Nozaki, Y., Tanford, C., Reynolds, J. A. Phospholipid vesicle formation and transmembrane protein incorporation using octyl glucoside. Biochemistry. 20, 833-840 (1981).
  27. Malvezzi, M., et al. Ca2+-dependent phospholipid scrambling by a reconstituted TMEM16 ion channel. Nat. Commun. 4, 2367 (2013).
  28. Eckford, P. D. W., Sharom, F. J. The reconstituted P-glycoprotein multidrug transporter is a flippase for glucosylceramide and other simple glycosphingolipids. Biochem. J. 389, 517-526 (2005).
  29. Marek, M., Günther-Pomorski, T. Assay of Flippase Activity in Proteoliposomes Using Fluorescent Lipid Derivatives. Methods Mol. Biol. 1377, 181-191 (2016).
  30. Coleman, J. A., Kwok, M. C. M., Molday, R. S. Localization purification, and functional reconstitution of the P4-ATPase Atp8a2, a phosphatidylserine flippase in photoreceptor disc membranes. J. Biol. Chem. 284, 32670-32679 (2009).
  31. Coleman, J. A., Quazi, F., Molday, R. S. Mammalian P4-ATPases and ABC transporters and their role in phospholipid transport. Biochim. Biophys. Acta. 1831, 555-574 (2013).
  32. Romsicki, Y., Sharom, F. J. Phospholipid flippase activity of the reconstituted P-glycoprotein multidrug transporter. Biochemistry. 40, 6937-6947 (2001).
  33. Zhou, X., Graham, T. R. Reconstitution of phospholipid translocase activity with purified Drs2p, a type-IV P-type ATPase from budding yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 16586-16591 (2009).

Tags

ביוכימיה גיליון 115 ביוכימיה גיליון חרוזי פוליסטירן חומרי ניקוי flippase GPCR ליפוזומים פוספוליפידים סטטיסטיקה פואסון proteoliposomes הכינון מחדש rhodopsin scramblase חלבון הממברנה
Assay מבוסס-הקרינה של פעילות פוספוליפידים Scramblase
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ploier, B., Menon, A. K. A… More

Ploier, B., Menon, A. K. A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity. J. Vis. Exp. (115), e54635, doi:10.3791/54635 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter