Abstract
Scramblases çift yönlü bir ATP-bağımsız bir şekilde membran çift-tabakanın fosfolipidleri transloke. İlk scramblase tespit ve biyokimyasal, fotoreseptör rodopsin apoproteini opsin edilmiştir doğrulanmış olması. Rodopsin ışık algılama sorumludur retina çubuk fotoreseptör membranlarının lokalize bir G-protein bağlı reseptördür. Rodopsin adlı scramblase faaliyeti onun ligandı 11- sis -retinal, yani bağlı değildir, apoprotein opsin da bir scramblase olarak aktiftir. karıştırıcı konstitütif ve regüle fosfolipid hücre fizyolojisinde önemli rol oynamakla birlikte, sadece bir kaç fosfolipid scramblases kadar opsin yanında tespit edilmiştir. Burada opsin en scramblase aktivitesinin bir floresans bazlı analiz tarif eder. Opsin fosfatidilkolin, fosfatidilgliserol ve flüoresan NBD-etiketli bilgisayar (1-p izi miktardan oluşan büyük tek katmanlı lipozomlar içine kuruluralmitoyl-2- {6- [7-nitro-2-1,3-benzoksadiazol-4-il) amino] heksanoil} - sn -glisero-3-fosfokolin). Scramblase aktivitesi vezikül iç broşürde bulunan NBD-PC molekülleri floresans kimyasal membranını geçemediği için bir indirgeyici madde ile elimine edilir dış yaprakçık erişebilir ne ölçüde ölçülerek belirlenir. Bu tarif yöntemler genel olarak uygulanmaktadır ve diğer membran proteinleri scramblase aktivitelerini belirlemek ve karakterize etmek için kullanılabilir.
Introduction
Fotoreseptör rodopsin (referans 1, örneğin gözden) bir prototip G protein-eşli reseptör, tanımlanacak ilk fosfolipid scramblase ve biyokimyasal olarak 2,3 sunmaktadır. Scramblases transbilayer fosfolipid hareketin özünde yavaş oranını artırmak fosfolipid taşıyıcıları olan bir çift yönlü fizyolojik uygun seviyelere, ATP-bağımsız bir şekilde 4-6. Eylemlerinin örnekleri endoplazmik retikulum ve konstitütif karıştırıcı olarak glikosilasyon yolakları 5 çeşitli zar homeostaz ve büyüme için gerekli olan bakteriyel sitoplazmik membranda bulunur. Bu gibi etki ettiği Ayarlı fosfolipid apoptotik hücrelerin yüzeyi üzerinde fosfatidilserin (PS) ortaya çıkarmak için gerekli olan her karıştırma bir makrofaj 7 -Sinyal "me-yemeği" ve protein faktörü üretimini katalize aktive kan plateletleri üzerinde prokoagülan yüzey sağlarkan pıhtılaşması için gerekli s. Fotoreseptör disk membranlarda, rodopsin en çabalıyorlar faaliyeti ATP-bağımlı, tek yönlü lipid tarafından oluşturulan iki tabakalı iki zar broşürleri arasındaki fosfolipid dengesizliği ortadan kaldırmak için önerilen ABCA4 4,8,9 10-12 Flippase edilmiştir.
Rodopsin plazma membranında PS maruz için gereken 2 + -bağımlı scramblases (referans 2, TMEM16 protein ailesinin üyeleri, Ca olarak tanımlanmıştır fotoreseptör diskleri bir scramblase olarak rapor kadar scramblases fizyolojik önemine rağmen, kimlik elde edilememiştir 13) ve bir lipid II peptidoglikan sentezinin 14 için gerekli olan scramblase gibi bakteriyel protein FtsW önerilmiştir. Bu keşifler yöntem describ Oluşan proteoliposomes lipozomlarda saflaştırılmış proteinlerin yeniden oluşturulması ve scramblase etkinliğinin gösterilmesi dayanmaktadırBurada ed. Diğer potansiyel scramblases 15-21 - peptidoglikan biyosentezinde rol MurJ ve Amj proteinleri, WzxE ve ilgili proteinler O-antijeni öncüleri karıştırıcı karışmış, MprF proteini, bakteriyel sitoplazma zarından olarak amino fosfatidilgliserol yerini değiştirmek için gerekli olan ve Xkr8 aile üyeleri önerilmiştir bu apoptotik hücre yüzeyi üzerinde PS maruz - biyokimyasal test edilmesi gerekmektedir. Bu tespit ve scramblase etkinliğini karakterize etmek sağlam bir testin önemini vurgulamaktadır.
Burada, bir floresans bazlı deney kullanılarak elde edilen proteoliposomes büyük tek tabakalı veziküller (luvs) saflaştırılmış opsin tekrar oluşturulmasını, fotoreseptör rodopsin apoprotein ve scramblase aktivitesi daha sonra analiz tarif eder. heterolog ifade ve opsin saflaştırılması için literatürde mevcut birkaç iyi tanımlanmış protokoller bu nedenle olmaz, vardırBu protokolde tarif; yaklaşık 100 ng FLAG etiketli, ısı ayarlı opsin verir Goren ve ark. 3'te tarif protokollerini kullanan /% 0.1 ul (ağırlık / hacim) dodecylmaltoside (DCM).
Sulandırma şişmeyen fakat çözünmez olduğu için, yeterli deterjan ile luvs muamele edilmesiyle elde edilmektedir. Bu koşullar altında, bir membran proteini - protein deterjan miseller halinde temin - lipozomlar entegre ve proteoliposomes sonuçlanan deterjanın alınması üzerine lipozom zarı içine yeniden hale gelir. (% 0.1 (ağırlık / hacim) DCM içinde saflaştırılmış proteini olarak elde edilmiştir) opsin tekrar oluşturmak için, LUVler POPC (1-palmitoil-2-oleoil sn -glisero-3-fosfokolin) ve POPG karışımı (1-hazırlanır palmitoil-2-oleoil sn -glisero-3- [fosfo-rak- (1-gliserol)]) ve opsin ve NBD-PC eklemeden önce DDM ile doyuruldu. Deterjan daha sonra polistiren boncuklar ile örnek muamele etmek suretiyle uzaklaştırılır.
lass = "jove_content"> floresans bazlı analiz temel ilkesi Şekil 1B 'de gösterilmiştir. Luvs simetrik NBD-PC veya diğer NBD etiketli floresan fosfolipid muhabiri (Şekil 1A) bir eser miktarı ile yeniden edilmektedir. ditionit ilave üzerinde NBD nitro grubu gibi bir zar geçirgenliği olmayan dianyon, luvs dış broşürde NBD-PC molekülleri işlenen floresan olmayan bir floresan olmayan amino grubuna indirgenir. de NBD-PC molekülleri de ditiyonit deneyi (<10 dakika), zaman ölçeğinde membran hareket mümkün olduğundan, bu floresan sinyalin% 50 azalma ile sonuçlanır. Lipozomlar, bir scramblase ile yeniden Ancak, eğer, iç yaprakçıkta NBD-PC moleküller azaltılır dış hızla karıştırmak olabilir. Bu ideal bir durumda (Şekil 1C) floresans toplam kayıp ile sonuçlanır.
ES / ftp_upload / 54.635 / 54635fig1.jpg "/>
. Şekil 1: scramblase aktivite deneyinin şematik temsili tahlil, bir flüoresan NBD-etiketli raportör lipid kullanır; NBD-PC gösterilmiştir (A). Büyük tek tabakalı veziküller NBD-PC'nin eser miktarı ile tekrar kurulmuştur. Sulandırma dış ve iç broşürlerde eşit olarak dağıtılır NBD-PC ile, simetrik veziküller üretir. Ditiyonit (S2 O 4 2-) kimyasal olmayan bir floresan amino grubuna NBD nitro grubunu azaltır. Ditiyonit (B, yukarıda) ile birlikte protein içermeyen lipozomlar tedavisi azaltılır, dış sayfada tek NBD-PC moleküllerinin floresan bir% 50 azalmaya neden olan: ditiyonit negatif yüklü ve NBD-PC molekülleri ile tepkimeye zarı geçemez iç broşürde. Opsin içeren proteoliposomes (B, alt), bir ditiyonit tedavi, yani scramblase aktif proteoliposomes, f% 100 kaybına yol açaropsin olarak luorescence iç ve dış broşürde arasında NBD-PC hareketini kolaylaştırır. (C) ditionit ile protein içermeyen lipozomlar ve opsin içeren proteoliposomes tedavi elde edilen idealize floresan izlerini gösterir. floresans kaybı oranı ditionit ile NBD kimyasal indirgeme karıştırıcı kimyasal tepkime oranından daha büyük veya eşit bir hızda gerçekleşir, ve bu oran-sınırlayıcı olduğunu gösteren her iki durumda da aynıdır. Gerçek bir deneyde elde edilen izleri Şekil 3'te gösterilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Bu tarif yöntemleri diğer saflaştırılmış proteinleri, hem de deterjan 22 mikrozomları ekstre, örneğin, elde edilen zar proteinlerinin karışımlarını sulandırmak ve analiz etmek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Lipozomlar ve Proteoliposomes hazırlanması 1.
- Lipozom oluşumu
- Bir cam şırınga kullanılarak, POPC bir molar oranda 52.5 umol lipidler elde etmek için bir yuvarlak tabanlı şişeye kloroform (25 mg / ml) ve 160 ul POPG (kloroform içinde, 25 mg / ml) 1.435 ul POPC ekleyin: POPG = 9: 1 arasındadır.
- (Su banyosu çözücünün, bu hacim için gerekli olan) 145 rpm'lik bir dönme hızında bir döner buharlaştırıcı kullanılarak 30 dakika boyunca lipidleri Kuru, daha sonra oda sıcaklığında, gece boyunca en az 3 saat, ya da bir elektrikli desikatöre balona (RT).
- 50 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCI, 10 ml ile kurutuldu lipid filminin hidratlanması yavaşça homojen, bulanık bir süspansiyon elde edilene değin balon dönen tarafından (bundan sonra tampon A olarak ifade edilecektir);
NOT: Bu aşamada lipid konsantrasyonu hiçbir kayıp bugüne kadar meydana gelmiş gerektiği gibi 5.25 mM olması bekleniyor. - Bir frekans O, oda sıcaklığında 10 dakika için bir su banyosu içinde süspansiyon sonikasyonf 40 kHz. Çözelti biraz daha net görünecektir.
- Bir ekstrüder kullanılarak 200 nm gözenek boyutuna sahip bir zar boyunca 4 geçiş ekstruderden bir ikinci döngü ve ardından 400 nm gözenek büyüklüğü olan bir membrandan süspansiyon 10 kez geçer.
NOT: Elde edilen luvs ortalama çapı ~ 175 nm. Gerekirse, luvs büyüklüğü ve homojenliği, üreticinin talimatlarına uygun olarak dinamik ışık dağılımı ile kontrol edilebilir. - Bölüm 1.2'de anlatıldığı gibi) LUV süspansiyonun fosfolipid konsantrasyonu ölçmek.
NOT: ekstrüzyon sırasında kayıpların, konsantrasyon genelde yaklaşık 3.6 mM olduğu için. - Hemen kullanılmadığı takdirde, yaklaşık 2 hafta boyunca 4 ° C'de luvs saklayın.
- fosfolipid Niceleme
Not: fosfolipid Sulandırma için kullanılan LUV süspansiyon konsantrasyonu, hem de en sonunda üretilen proteoliposomes olduğu gibi belirlemek için, numunenin bir alikotu subje olanperklorik asit ile oksidasyonu cted. Bu prosedür daha sonra aykırı 23 ile karşılaştırıldığında kolorimetrik deneyi ile ölçülür, inorganik fosfat serbest bırakmak için fosfolipidleri parçalar.- Iyonu giderilmiş damıtma suyu içinde sodyum fosfat, 40 mM stok çözeltisi (Na 2 HPO 4) hazırlanması.
- 4 mM ve kalibrasyon standartları olarak görev yapacak çözümler çalışan 0.4 mM elde etmek için deiyonize distile su ile stok solüsyonu sulandırmak.
- Çalışma çözüm kullanılarak, 0 ila 50 ul'lik nihai bir hacimde 80 nmol sodyum fosfat kadar 13 x 100 mm 2 cam tüplerde standartlar hazırlandı.
- LUV ve proteoliposome numunelerin her sayısal olarak 10 ul alın ve 13 x 100 mm 2 cam tüplerde GKD 2 O 40 ul seyreltin.
Not: luvs ve proteoliposomes lipid konsantrasyon aralığında olduğu 2.5-5 uM, örnek 10 ul 25-50 nmol yağ fosfor içermelidir. - bir ısıtma bloğu içinde 145 ° C de 1 saat süre ile standart ve numuneleri ve ısı her 300 ul perklorik asit ekleyin. buharlaşmasını önlemek için tüplerde mermerleri koyun.
- Tüpler oda sıcaklığında soğumaya bırakılmıştır ve GKD 2 O 1 ml ekle
- Yeni hazırlanmış 12 g / L amonyum molibdat ve 50 g / L sodyum askorbat ve vorteks her karıştırmak için 400 ul ekle.
- tüpler üzerine mermer ile 100 ° C 'de 10 dakika süre ile ısı. ısıtma bloğu tüpleri çıkarın ve oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin.
- 797 nm'lik bir dalga boyunda bir spektrometre ile boş (0 nmol sodyum fosfat ihtiva eden standart bir örnek) karşı örneklerin absorbansı ölçülür.
- Kalibrasyon standart bir eğriye karşı örneklerin fosfat içeriğini belirlemek.
- Opsin şifreden
Not: deterjan doğasına bağlı, hem de yeniden oluşturma için en uygun şişme koşulların belirlenmesi için gerekli olanLuvs lipit bileşimi ve konsantrasyonu. Luvs süreci şişme kendi ışık saçılması özelliklerini değiştirmek olarak Rigaud ve Levy 24 ve Geertsma ve ark., 25 tarafından gözden absorbansı (Şekil 2) ölçerek izlenebilir.- Pipet luvs 800 ul (bölüm 1.1, ekstrüzyondan sonra lipit geri kazanımı% 70 olarak, luvs beklenen konsantrasyonu 3.6 mM fosfolipiddir) 2 ml mikrofüj tüpüne.
- DCM tampon A içinde çözülmüştür (w / v) Tampon A 5.3 ul% 10 34.7 ul ekle
- sonu aşırı uç karıştırma ile, oda sıcaklığında 3 saat süreyle inkübe edilir.
- Bu arada polistiren taneler hazırlamak:
- örnek başına boncuk 400 mg kullanın ve bir cam beher tartılır.
- su ile, metanol ile iki kez, üç kez yıkayın ve bir kez tampon A ile her bir yıkama adımı kullanım için 5 ml sıvı, 10 dakika boyunca yavaşça karıştırın.
NOT: polistiren hazırlamak için tavsiye edilirörneğin aynı anda birden fazla numune için boncuklardan 6 g tartın ve sıvının 75 ml ile yıkanır. Aşırı boncuklar birkaç gün boyunca buzdolabında saklanır.
- Numune başına, 0.4 mol% sonuçta NBD-PC 9.5 ul (1 mg / kloroform içinde mi,: vezikül destabilizasyonu son 30 dakika boyunca bir vida kapaklı bir cam tüp içinde NBD-etiketli fosfolipid ( 'sulandırma cam tüp') kuru Toplam fosfolipid) bir cam tüp içinde bir azot akımı altında kurutulur ve daha sonra,% 0.1, 45 ul (tampon a içinde ağırlık / hacim) DDM içinde çözüldü
- Vezikül destabilizasyonu 3 saat 1 ml nihai hacim% 0.36 içeren bir örneğin çözündürüldü-NBD-etiketli fosfolipid DCM çözülmüş protein ekleyin ve tamponlar (a / h), yani, 7 mM, DCM.
- Bu nedenle, (% 0.1 DDM içinde çözülmüş) NBD-PC'nin 45 ul,% 0.1 DDM 60 ul tampon A 55 ul (bir kontrol numunesi olarak kullanılan) proteinsiz lipozomları üretmek için; proteoliposomes için Sınava eklemekple,% 0.1 DDM (~ 110 ng / | il tipik bir stok çözeltiden), proteinin 40 ul, NBD-PC'nin 45 ul,% 0.1 DDM 20 ul ve tampon 55 ul (% 0.1 DDM içinde çözülmüş) .
NOT: Ayrıca sırası olarak listelenmiş olmalıdır.
- Bu nedenle, (% 0.1 DDM içinde çözülmüş) NBD-PC'nin 45 ul,% 0.1 DDM 60 ul tampon A 55 ul (bir kontrol numunesi olarak kullanılan) proteinsiz lipozomları üretmek için; proteoliposomes için Sınava eklemekple,% 0.1 DDM (~ 110 ng / | il tipik bir stok çözeltiden), proteinin 40 ul, NBD-PC'nin 45 ul,% 0.1 DDM 20 ul ve tampon 55 ul (% 0.1 DDM içinde çözülmüş) .
- Oda sıcaklığında sonuna göre ek bir saat sonu için örnek karıştırın.
- Hazırlanan polistiren boncuklar 80 mg ekleme ve son aşırı uç oda sıcaklığında 1 saat karıştırılarak, örnek inkübe edin.
- Sonraki polistiren boncuklar ilave 160 mg ekleme ve son aşırı uç oda sıcaklığında ilave bir 2 saat boyunca karıştırılarak inkübe edilir.
- Taze polistiren boncuklar 160 mg ihtiva eden bir cam vida kapaklı tüp örnek (arkasına harcanan polistiren boncuklar bırakarak) aktarın ve 4 ° C'de bir gece karıştırılır.
NOT: örnek aktarmak ve boncuk emme kadar önlemenin en kolay yolu biraz pozitif basınç ile cam tüpün dibine itilir Pasteur pipeti kullanmaktır. pipet ucu sıkıca bir kezTüpün alt, daha sonra örnek bir boncuk müdahalesi olmaksızın kolayca çekilebilir. - Ertesi sabah, scramblase aktivite deneyi için hazırlık olarak buz üzerinde boncuklar ve yeri üzerinde taşıyan olmayan bir mikrofüj tüpüne örnek aktarmak.
2. Scramblase Aktivite Deneyi
Not: tampon A ile seyreltilmiştir lipozomlar veya proteoliposomes floresans yoğunluğu bir floresan spektrometresinde ditionit ilave edildikten sonra zaman içinde izlenir. istikrarlı başlangıç yoğunluğu elde etmek için, floresans sürekli karıştırılan örnek ditionit ilave edilmeden önce en az 50 saniye (ya da sabit bir sinyal elde edilene kadar) için kaydedilir ve daha sonra ditionit ilave sonra en az 500 saniye boyunca takip edilir.
- mini karıştırma-bar içeren plastik küvete tampon A 1950 ul ekleyin.
- (Lipozomlar) hazırlanan Proteo 50 ul ekleyin ve örnek floresan spektrfotometrik dengeye izinBirkaç saniye sabit karıştırma ile ölçer.
- Bu arada, 0.5 M tamponlanmamış Tris (iki numune mikrofüj tüpüne ditiyonit 20 mg tartılır ve 114 içinde çözülür örneğin; 1 M ditionit ihtiva eden bir çözelti hazırlamak ul buz soğukluğunda doğrudan kullanımdan önce ve sonraki için buz üzerinde tutulur, 0.5 M Tris örnek).
Not: ditionit solüsyonu taze hazırlanmış olması ve hazırlandıktan sonra fazla 20 dakika kullanılmamalıdır; Birçok ölçümleri yapılacak olduğunda, ditiyonit alikotları önceden tartıldı ve hemen kullanım öncesi eritilebilir. - floresan izleme başlatın (uyarma 470 nm, emisyon 530 nm, genişliği 0.5 nm yarık).
- kayıt floresan (mümkünse küvet odasının kapağındaki septum kullanın) başladıktan sonra küvet 50 sn 1 M ditiyonit çözeltisi 40 ul ekleyin ve bir daha 400-600 saniye floresan kaydetmeye devam ediyor.
- Bölüm 3'te tarif edildiği gibi analiz edin.
3..Veri analizi
- Scrambling kinetiği
- Başlangıç floresans tanımlayarak scramblase aktivite deneyi ile elde edilen her bir numune floresans izleme karakterize, K i ditiyonit ekleme ve son-nokta floresan, K, ulaştığı öncesinde> 400 saniye sonra. F öncesinde ditiyonit ilavesinden 30 saniye süre ile floresans ortalama değer olarak, her bir örnek için tespit edildi.
- Floresan azalma ölçüde, R = 100 karşılık gelen uç nokta veri belirleme • F / F i. Biz opsin içeren proteoliposomes için protein içermeyen lipozomlar ve R P terimleri R L kullanın.
- Fonksiyonel Yeniden yapılandırılmış Scramblase molekül ağırlıklarının belirlenmesi
- aşağıdaki denkleme göre flüoresans indirgeme veri dönüştürme:
p (≥1 scramblase) = (R P - R L) / (R max - R L) (Denklem 1)
NOTR max yeterli protein örnekteki tüm veziküller en az bir işlevsel scramblase sahip olacak şekilde yeniden zaman elde edilen maksimum azalma ve p sulandırılmış bir numune içindeki özel bir vezikül 'scramblase aktif' olduğu olasılığı olduğu durumda, örneğin, en az bir işlevsel scramblase sahiptir. R max yerine beklenen% 100 (deneysel> 1 mg / mmol PPR ile opsin proteoliposomes için tespit edilebilir R max) ve tipik% 82.5 3 ise R L değeri tipik olarak 45% 3. R max olarak <% 100 veziküllerin bir alt popülasyonunun sulandırma dirençli olduğu varsayılmıştır. R max =% 82.5 için, protein kabul edemiyor veziküllerin kesir 0.35 olduğunu. - aşağıdaki gibi Poisson istatistiklerine göre p (≥1 scramblase) ve PPR (mg protein / mmol fosfolipid) arasındaki ilişkiyi açıklar:
e - p (≥1 scramblase) 1 = - veziküllerin bir kısmını (tartışma) bile yüksek ppr çabalıyorlar katkıda bulunmaz olarak, denklem için değiştirin:
p (≥1 scramblase) = 1 - exp (-PPR * / α) (Denklem 3)
NOT: Burada f, bu durumda, PPR * = PPR / 0.65 (Denklem 4) içinde, veziküllerin refrakter nüfusu veya PPR * = PPR / (1- f).
Not: uygun sabit bir α, bir mono- üstel fonksiyon PPR * karşı p (≥1 scramblase) 'in bir grafiğini uydurma ile belirlenir. Opsin (moleküler ağırlığı 41.7 kDa) işlevsel 175-nm çaplı veziküller içine yeniden oluşturulmasını Eğer bir monomer olarak, α = 0.187 mg mmol -1 (her vezikül 280.000 fosfolipid 26 vardır). Opsin dimerleşir Eğer önceden α sonra, scramblase aktif veziküller vermek üzere 3 sulandırma için= 0.37 mg mmol -1. PPR yerine PPR * analizi için kullanılacak olsaydı, o zaman gelen α değerleri 0.122 ve 0.244 mg mmol -1 olacaktır. a bu tahmin değerleri tüm opsin molekülleri fonksiyonel yetkili olduğunu varsayıyorum. moleküllerin yalnızca bir kısmını lipidler karıştırmak için yetkili ise, o a karşılık gelen değerleri daha büyük olacaktır.
- aşağıdaki denkleme göre flüoresans indirgeme veri dönüştürme:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bir flüoresan bazlı analiz kullanarak scramblase aktivitesinin karakterize edilmesi için luvs halinde opsin tekrar oluşturulmasını tarif eder. Biz çabalıyorlar opsin aracılı fosfolipid oranı üzerinde bir alt sınır koymak için ve opsin işlevsel veziküller içine yeniden oluşturulmasını hangi oligomerik durumunu belirlemek için sonuçları analiz.
uygun sulandırma koşullarını belirlemek için, deneysel da proteinin sokulmasından açık olacak şekilde luvs şişirmek için kullanılmalıdır deterjan miktarını belirlemek gereklidir. Böyle bir deney, Şekil 2A'da gösterilmiştir. POPC alikotları: POPG LUVler 3 saat DDM farklı miktarları ile tedavi edilir ve numunenin absorbansı 540 nm, dolayısıyla vesikül boyutta bir bulanıklık ölçümü ve ölçülür. 540 nm (OD 540) grafik ölçülen optik yoğunluk veziküller DDM concentr olarak şişer olduğunu gösterirasyon 4-6 mM'den artar, DCM yükseltilirken (bulanıklık kaybına ve OD 540 sinyale karşılık gelen) çözündürülmesi için başlamadan önce yaklaşık 7 mM bir doyma noktasına ulaşabilir. NBD-PC deterjan tedaviden sonra ilave edildi ve numuneler daha deterjanı çıkarmak için polistiren boncuklar ile muamele edilmeden önce bir saat boyunca inkübe edilir. (Yukarıda anlatıldığı gibi) NBD-PC'nin transbilayer dağılımı veziküllere ditionit ilave edildikten sonra flöresan kaybı ölçülerek belirlenir. Bu nedenle, NBD-PC ditiyonit için komple erişilebilirlik ile gösterilen deterjan yokluğunda, veziküller dış sayfada içine yerleştirir. > 2 mM DDM ile muamele veziküller NBD-PC DCM çıkartıldıktan sonra bu NBD-PC'nin 50% ditiyonit korunur, böylece her iki broşür içine simetrik olarak dağıtmak edebilmektedir.
Şekil 2B referans 2 yeniden çizilmesi benzer istikrarsızlık-sulandırma deney (gösterir </ Sup>), opsin tekrar oluşturulmasını takip bu sefer. Bu deneyde, 7 mM DCM erişilebilir NBD-PC niceliksel hale gelir (>% 80) bu tür opsin aracılı sinyal karıştırıcı sonucu ditiyonit için opsin sulandırma için gerekli olduğu görülmektedir.
Şekil 2:. Deterjan destabilize vezikülleri içine NBD-PC ve opsin yeniden oluşturulması (A) veziküllerin alikoları, oda sıcaklığında 3 saat boyunca sonu aşırı uç karıştırılarak deterjan konsantrasyonları (0-9 mM) bir dizi ile muamele edilir . 540 nm'de numunelerin absorbans ölçülür inkübasyon süresi (siyah çizgi) sonunda. (DDM a / h% 0.1 içinde çözülmüş) NBD-PC ilave edilir ve deterjan polistiren taneleri işlenerek çıkartılır önce örnek oda sıcaklığında 1 saat daha inkübe edilir. Elde edilen lipozomlar, flor ile analiz edilir escent azaltma deneyi (kırmızı çizgi) NBD-PC simetrik yeniden edildiği kapsamını belirlemek için. (A) 'daki gibi, (B), fakat yumurta fosfolipidlerinin oluşturulan bu deney veziküllerinde a sonuçlanan DDM ile destabilize edildi ve opsin NBD-PC ile birlikte ilave edildi (yumurta PC / yumurta fosfatidik asit, 9, 1 mol / mol), yaklaşık% 80 floresans azaltılması proteini bu tekrar oluşturulmuş ve NBD-PC'nin sinyal karıştırıcı kolaylaştırmak mümkün sonra (referans 2 değiştirilmiş). NBD-PC simetrik 2 mM DDM de yeniden rağmen, opsin yeniden oluşturulması için ideal koşullar OD 540 absorbans, yani gösterilen veziküllerin nedeniyle interkalar deterjan oldukça şişmiş ama henüz çözülmüş değil noktasının (zirve etrafında seçildi ok). POPC / POPG (9: 1 mol / mol) için veziküller, 8 mM bir DCM konsantrasyonu NBD-PC ve opsin sulandırma hem de uygun olduğu tespit edilmiştir./54635/54635fig2large.jpg "Target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Floresan azalmanın büyüklüğü Sulandırma için kullanılan opsin miktarı artar. Şekil 3A (mmol fosfolipid başına mg protein, kırmızı izleri biriminde PPR) fosfolipid oranları farklı protein de opsin ile yeniden protein içermeyen lipozomlar (siyah iz) ve proteoliposomes-NBD-PC içeren için ditiyonit ekleyerek elde edilen floresan izlerini gösterir; hepsi daha kolay görselleştirme için aynı başlangıç floresans (F i) bir değere sahip olduğunu, böylece izleri normalize edilmiştir. izleri monoexponential uyan 20-25 sn arasında değişen çok benzer zaman sabitleri göstermektedir; proteinsiz lipozomlar içinde ditiyonit aracılı NBD-PC azalma oranı proteoliposomes aynıdır olarak, (tex bakınız opsin aracılı sinyal karıştırıcı hızı üzerinde daha düşük bir tahmin yerleştirmek mümkündürDaha fazla bilgi için t). Şekil 3B * flüoresan azalması deneyden elde edilen analiz verileri p (≥1) scramblase (en az bir scramblase sahip olan bir vesikül olasılığı) deneysel olarak ölçülmüş PPR karşı (PPR ilişkin araziler vermek üzere gösterir gibi), yukarıda açıklanan. opsin tekabül varsayımsal uyan deneysel sonuçların monoexponential uyum karşılaştırması opsin bir dimer olarak işlevsel yeniden oluşturulmasını bir monomer, dimer ya da tetramerdir gösterisi olarak yeniden edilir.
Şekil 3:. Opsin arasında Scramblase aktivitesi ug 0-4,95 arasında değişen NBD-PC ve opsin miktarları ile yeniden vesiküllerin tedavi ditiyonit tekabül eden (A) Floresans izleri, kama ile gösterilir. yeniden opsin en düşük miktarı 0.21 mg / mmol'lük bir PPR, tekabülİkinci 0.43 mg / mmol en yüksek miktarı ve 1.3 mg / mmol, ya da ortalama vezikül başına 10 opsins en yüksek miktar. Ditionit belirtilen zaman (ok) ilave edildi ve NBD floresans bir başka 400 saniye izlenmiştir. Birçok deney içinde ortalama% 82.5 iken bu deneyde görülen floresan azalma azami ölçüde% 85 idi. Çabalıyorlar (B) Protein bağımlılık. Panel A benzer deneylerden edinilen veriler (protein, tekrar- nicelleştirilmiştir veziküller fosfolipid oranı (PPR) protein karşı en az bir scramblase (s ≥1 scramblase) 'e sahip veziküller olasılık bir grafik oluşturmak için Poisson istatistiklerine kullanılarak analiz edildi Batı benek analizi 3 ve fosfolipid ile tekrar asit hidrolizi üzerine salınan inorganik fosfat) ölçülmesi ile belirlendi. kırmızı çizgi verileri için bir mono-üstel bir yerleşmeyi temsil etmektedir; kesik gri çizgiler 170 nm çaplı v içine opsin sulandırılması için mono-üstel uyuyor temsilmonomerlerin önceden oluşturulmuş dimer ya da önceden oluşturulmuş tetramerler olarak esicles. X ekseni deneysel ölçülen PPR temsil gibi, uygun sabitler yerine PPR * değerlerden daha, ana metinde açıklandığı gibi. PPR uygun (yerine PPR * den () ana metne bakın) daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız bu figür.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Scramblase etkinlik tahlili olduğu opsin fosfolipid scramblase aktivitesi 2 bulunmaktadır belirlemek için ilk olarak sağladı. Tahlil da bize özgüllük test ederek opsin en scramblase etkinliğini karakterize izin (biz böyle Şekil 1A NBD-PC için gösterilen, ya da gibi bir asil zinciri üzerindeki NBD ile etiketlenmiş NBD-fosfatidiletanolamin olarak NBD etiketli muhabiri lipidlerin çeşitli kullanılan ana grup, NBD-sfingomiyelin veya NBD- fosfatidilserin 2), vezikül lipit kompozisyonu (etkisi örneğin, vezikül bileşeni olarak farklı miktarlarda kolesterol) ve opsin ve tüm Serginin scramblase aktivite rodopsin farklı yapısal durumları belirler. Bu analizler fosfolipid için non-spesifik ve rodopsin en yapısal devletten bağımsız ya da 2,3 onun kromofor retina içerip içermediği (> saniyede 10.000 fosfolipidler), rodopsin en scramblase faaliyeti çok hızlı olduğunu ortaya koydu. İşte,Biz opsin içeren proteoliposomes oluşturmak için detaylı bir yöntem sundu ve fosfolipid scramblase faaliyeti için bu hazırlıkları tahlil nasıl gösterdi.
tarif edilen yeniden oluşturma protokolü verilen lipit bileşimi ve bunun için çözücü deterjanı DDM kullanılarak afinite kromatografisi ile arıtılmış, ardından opsin yeniden yapılandırmak için optimize edilmiştir. Değişen koşullar için ideal bir sulandırma koşulları Şekil 2'de anlatılan "şişme-deneyi" yapılarak belirlenecek olmasına rağmen lipid kompozisyonu yanı deterjan gibi, deneyci ihtiyaçlarına göre değiştirilebilir. DDM ampirik çok uygundur istikrarlı ve aktif durumda opsin korumak için. Bununla birlikte, bu oktil-β-glukozid'in, CHAPS veya Triton X-100 gibi diğer deterjanlar içindeki protokoller kullanılabilir. Triton X-100 olarak efficie ATP-bağlayıcı kaset taşıyıcılar (ABC taşıyıcıları) yeniden yapılandırmak için yaygın olarak kullanılan bir deterjanMembran sulandırma aracılık NCY diğer deterjanların daha yüksektir ve aynı zamanda önceden oluşturulmuş lipozomlar 24 ile dengelenmeye daha az zaman alır.
Floresan azalmanın büyüklüğü fosfolipid oranları (KTT'ler) proteinin aralığında, yani opsin farklı miktarlarda, ile yeniden örnekler için elde ise işlevsel yeniden opsin oligomerik durumunu belirlemek mümkündür. Bunu yapmak için, yeniden oluşturulmuş veziküllerin PPR açıkça değişebilir protein ve fosfolipid kurtarma gibi ölçülmelidir. Protein geri reconstitutions için kullanılan saflaştırılmış protein üzerinde yeniden örneklerin iyileşme karşılaştırma yapmayı da sağlayan bir kalibrasyon eğrisi oluşturmak için kullanıldığı niceliksel Western blot analizi ile tahmin edilebilir ise fosfolipid kurtarma, Bölüm 1.2'de tarif edilen fosfat deneyi ile belirlenebilir PPR aralığı (referans 3'de detaylı olarak açıklandığı gibi) test etti.
scramblase aktivitesi analizi veziküller içine nüfuz etmez ditiyonit varsayımı üzerine inşa edilmiştir. Bu nokta veziküller içinde çözülebilir NBD-etiketli muhabiri yakalama ve ditionit azaltılabilir olup olmadığını belirlemek suretiyle kontrol edilebilir. Bu amaçla, NBD-glükoz (vezikül destabilizasyonu sonra ilave 12.6 uM) kullanılarak NBD-PC'nin kullanılır. veziküller kapatılır ve bu nedenle ditiyonit korunmalıdır sonra bu, suda çözünür bir molekül proteoliposomes mesafede tutulur. Indirgeme NBD-glukoz tam erişilebilir yapmak için, Triton X-100 ilave edilebilir (% 1 a / h), daha sonra% 100 azalma 3,27 sonuçlanır.
proteoliposomes raportör lipid ve protein simetrik değildir bu sulandırma doğrulamak için karakterize edilebilir. ikinci AspN proteazı kullanan bir proteaz koruma stratejisi göre ise, eski iyodür iyonları ile çarpışma soğutma deneyleri ile elde edilmesidiropsin 3 C-ucuna yakın belirli bir yerinde keser.
Uç nokta floresan (F) scramblase aktivite deneyinde belirlenen ilk floresan (F i) geçişin karmaşık, ama bizim için makul bir tek eksponansiyel azalma yaklaşık olarak hesaplanabilir. üstel bozunma (20 saniye) ile ilişkili zaman sabiti yaklaşık karıştırıcı hızlı veya NBD flüorofor ditiyonit ile azaltılır hızına göre daha hızlı meydana geldiğini gösterir aktif olmayan lipozomlar ve aktif, opsin içeren proteoliposomes için aynıdır. Böylece scramblase aktivite deneyi şu anda sadece içine mutantların sınıflandırma izin (dithionite azalma kimyası ile sınırlı) kötü bir zaman çözünürlüğe sahip çok yavaş ya da inaktif aktif. Bu sınıflandırma, kalsiyum regüle scramblase TMEM16 27 görülebilirdi: Yüksek Ca 2 + seviyelerinde, floresan çürüme tha sürekli benzer bir zaman ortayat, oranın sınırlandığı aşama lipit karıştırıcı daha ditionit ile NBD-fluorofor kimyasal indirgeme olduğunu gösteren proteinsiz lipozomlar içinde görülen. Tam tersine, düşük Ca 2 + seviyelerde florasan redüksiyon kararlı durum iki kinetik parçaları, dış broşürün ditiyonit azaltılması atanandan ve maruz kalma yavaş bir ayırt etmek mümkün kılar, 900 saniye sonra ulaşılamamıştır dış, iç-broşür NBD-lipitlerin.
Veziküllerin bir kısmı dirençli olduğu zordur deney gerçekte karşı yüksek PPR (Şekil 1C) ile hazırlanan vesiküllerin ditiyonit tedavi floresans tahmin% 100 kaybı arasındaki fark ~% 85 azalma (Şekil 3A) üzerinde anlaşılacağı üzere yeniden-teşekkül ettirilmeden. Bu fraksiyon deterjan polistiren boncuklar adsorbe olarak sulandırma işlemi sırasında erken o mühür veziküllerin karşılık ve vardır olabilirprotein almak için bu nedenle artık mümkün. 3. bölümde açıklanan analizi için, biz bu refrakter nüfusunun toplam veziküllerin f bir kısmını karşılık geldiği varsayılmıştır. Biz refrakter veziküller içinde NBD-PC moleküllerinin yarısının (dış broşürde NBD-PC havuz) kabul edersek o zaman tahmin dithionite azaltılması için kullanılabilir f = 2 • (1 - R max / 100) veya 0.35 iken R max =% 82.5.
bir mono-ussel denkleme uygulanması * Veri PPR opsin bir monomer veya dimer veya daha yüksek dereceli multimerlerinin dahil bir karışımı gibi işlevsel yeniden oluşturulmasını belirlemek mümkündür olan uygun sabit bir a, içerir karşı p (≥1 scramblase) takılması . opsin moleküllerinin bir kısmını çabalıyorlar işlev olamaz eğer bu sonuçların yorumlanması karmaşık hale gelir. Bu istenmeyen bir onun G proteininin tüm korur garanti opsin saflaştırılır koşulları verilmiştir birliktereseptör aktiviteleri, dimerlerin fonksiyonel sokulması karşılık gelen a değeri de yarı proteinleri scramblases etkin değildir opsin bir preparatından monomerlerin fonksiyonel ekleme olarak yorumlanabilir. dikkate ek nokta, mevcut analiz Sulandırma için kullanılan veziküller boyutu homojen olduğunu varsayar. Gerçekte, veziküller, standart sapma, ortalama çapı yaklaşık olarak üçte birine karşılık gelen bir Gauss bağılımı ile karakterize edilen bir çap aralığı vardır. Neyse ki, PPR * verilerine karşı p (≥1 scramblase) analizi sonucu önemli ölçüde vezikül heterojenite göz ve verileri tanımlamak için yeterlidir sunulan çok basit analizi ile etkilenmez.
Bu tarif edilen yöntemlerin önemli bir dezavantaj iş yoğun bir prosedür izin vermez bir numune çok sayıda yüksek verimlilik ölçümlerind o vezikül heterojenite okuma rahatsız olabilir. İlk sorun scramblase tahlili için, bir mikro titer plaka formatı kullanılarak aşılabilir olabilir; İkinci TIRF mikroskopi kullanılarak tek vezikül tahlilleri ile gelecekte çözülebilir.
bozulması ve yeniden oluşturma işlemleri kurulmuş bir kez scramblase aktivitesini ölçmek için ditiyonit tahlili, çok güvenilir ve sağlam olarak kabul edilebilir. Alternatif bir yaklaşım, ditiyonit deneyinde elde edilen sonuçlara doğrulanması sağlar fosfolipid zar taşıma, ölçmek için, yağ asidi-içermeyen sığır serumu albümini ile 22 veziküllerin dış sayfada kısa zincirli NBD-lipitlerin arka çekilmesidir. Back-çıkarma yanı sıra ditiyonit tahlil de karakterize ve P4 tipi ATPazların ve ABC taşıyıcıların 28-33 arasında flippases tanımlamak için kullanılmıştır.
Burada yer alan araçları kolayca differe göre uyarlanabilir gibint açıklanan prosedürler çok yönlü ve belirlenmesi ve gelecekte fosfolipid scramblases karakterize yardımcı olacaktır ihtiyacı var. hücre büyümesi sırasında biyojenik membran genişlemesi için gerekli olan scramblase da dahil olmak üzere, bunların pek çoğu kimliğini öğrenme büyük fizyolojik öneme sahiptir.
Ek bilgi ve veri analizi ayrıntılı bilgi için, okuyucuların laboratuvarımızda 2-4,27 yanı sıra diğer 22,25,28,30 önceki yayınlara adlandırılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850457C | POPC |
| 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt) | Avanti Polar Lipids | 840457C | POPG |
| 1-palmitoyl-2-{6-[7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]hexanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 810130C | NBD-PC |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid | VWR Scientific | EM-5330 | HEPES |
| NaCl | Sigma | S7653-1KG | NaCl |
| Dodecyl-β-D-maltoside | Anatrace | D310 5 GM | DDM |
| Fluorimeter cuvettes | sigma | C0918-100EA | cuvettes |
| Spectrofluorometer | Photon Technology International, Inc. | fluorimeter | |
| Sodium hydrosulfite technical grade, 85% | Sigma | 157953-5G | dithionite |
| GraphPad Prism 5 software | Prism | ||
| Tris Base | VWR | JTX171-3 | Tris |
| LIPEX 10 ml extruder | Northern Lipids, Inc. | Extruder | |
| Whatman, Drain disc, PE, 25 mm | Sigma | 28156-243 | Disc support |
| Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes, 0.4 µm, 25 mm diameter | Sigma | WHA110607 | 400 nm membrane |
| Whatman Nucleopore Track-Etched Membranes, 0.2 µm, 25 mm diameter | Sigma | WHA110606 | 200 nm membrane |
| sodium phosphate | Sigma | S3264-500G | |
| VWR Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass, 13 x 100 mm | VWR Scientific | 47729-572 | glass tubes |
| Perchloric acid | Sigma | 30755-500ML | |
| Ammonium Molybdate Tetrahydrate | Sigma | A-7302 | ammonium molybdate |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma | A7631-25G | sodium ascorbate |
| Bio-Beads SM2 adsorbents | Bio Rad | 1523920 | polystyrene beads |
| 2.0 ml Microtubes clear | VWR Scientific | 10011-742 | Reconstitution tubes |
| Reconstitution glass tube | VWR Scientific | 53283-800 | Reconstitution glass tubes |
| Zetasizer | Malvern | DLS |
References
- Ernst, O. P., et al. Microbial and animal rhodopsins: structures, functions, and molecular mechanisms. Chem. Rev. 114, 126-163 (2014).
- Menon, I., et al. Opsin is a phospholipid flippase. Curr. Biol. CB. 21, 149-153 (2011).
- Goren, M. A., et al. Constitutive phospholipid scramblase activity of a G protein-coupled receptor. Nat. Commun. 5, 5115 (2014).
- Ernst, O. P., Menon, A. K. Phospholipid scrambling by rhodopsin. Photochem. Photobiol. Sci. Off. J. Eur. Photochem. Assoc. Eur. Soc. Photobiol. , (2015).
- Sanyal, S., Menon, A. K. Flipping lipids: why an' what's the reason for? ACS Chem. Biol. 4, 895-909 (2009).
- Bevers, E. M., Williamson, P. L. Phospholipid scramblase: an update. FEBS Lett. 584, 2724-2730 (2010).
- Leventis, P. A., Grinstein, S. The distribution and function of phosphatidylserine in cellular membranes. Annu. Rev. Biophys. 39, 407-427 (2010).
- Quazi, F., Lenevich, S., Molday, R. S. ABCA4 is an N-retinylidene-phosphatidylethanolamine and phosphatidylethanolamine importer. Nat. Commun. 3, 925 (2012).
- Quazi, F., Molday, R. S. ATP-binding cassette transporter ABCA4 and chemical isomerization protect photoreceptor cells from the toxic accumulation of excess 11-cis-retinal. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 5024-5029 (2014).
- Ben-Shabat, S., et al. Formation of a nonaoxirane from A2E, a lipofuscin fluorophore related to macular degeneration, and evidence of singlet oxygen involvement. Angew. Chem. Int. Ed Engl. 41, 814-817 (2002).
- Sparrow, J. R., Wu, Y., Kim, C. Y., Zhou, J. Phospholipid meets all-trans-retinal: the making of RPE bisretinoids. J. Lipid Res. 51 (2010), 247-261 (2010).
- Schütt, F., Davies, S., Kopitz, J., Holz, F. G., Boulton, M. E. Photodamage to human RPE cells by A2-E, a retinoid component of lipofuscin. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41, 2303-2308 (2000).
- Picollo, A., Malvezzi, M., Accardi, A. TMEM16 proteins: unknown structure and confusing functions. J. Mol. Biol. 427, 94-105 (2015).
- Mohammadi, T., et al. Identification of FtsW as a transporter of lipid-linked cell wall precursors across the membrane. EMBO J. 30, 1425-1432 (2011).
- Meeske, A. J., et al. MurJ and a novel lipid II flippase are required for cell wall biogenesis in Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 6437-6442 (2015).
- Ruiz, N. Lipid Flippases for Bacterial Peptidoglycan Biosynthesis. Lipid Insights. 8, 21-31 (2015).
- Rick, P. D., et al. Evidence that the wzxE gene of Escherichia coli K-12 encodes a protein involved in the transbilayer movement of a trisaccharide-lipid intermediate in the assembly of enterobacterial common antigen. J. Biol. Chem. 278, 16534-16542 (2003).
- Suzuki, J., Imanishi, E., Nagata, S. Exposure of phosphatidylserine by Xk-related protein family members during apoptosis. J. Biol. Chem. 289, 30257-30267 (2014).
- Suzuki, J., Nagata, S. Phospholipid scrambling on the plasma membrane. Methods Enzymol. 544, 381-393 (2014).
- Alaimo, C., et al. Two distinct but interchangeable mechanisms for flipping of lipid-linked oligosaccharides. EMBO J. 25, 967-976 (2006).
- Ernst, C. M., Peschel, A. Broad-spectrum antimicrobial peptide restistance by MprF-mediated aminoacylation and flipping of phospholipids. Mol. Microbial. 80 (2), 290-299 (2011).
- Vehring, S., et al. Flip-flop of fluorescently labeled phospholipids in proteoliposomes reconstituted with Saccharomyces cerevisiae microsomal proteins. Eukaryot. Cell. 6, 1625-1634 (2007).
- Rouser, G., et al. Two dimensional then [sic] layer chromatographic separation of polar lipids and determination of phospholipids by phosphorus analysis of spots. Lipids. 5, 494-496 (1970).
- Rigaud, J. -L., Lévy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes. Methods Enzymol. 372, 65-86 (2003).
- Geertsma, E. R., Nik Mahmood, N. A. B., Schuurman-Wolters, G. K., Poolman, B. Membrane reconstitution of ABC transporters and assays of translocator function. Nat. Protoc. 3, 256-266 (2008).
- Mimms, L. T., Zampighi, G., Nozaki, Y., Tanford, C., Reynolds, J. A. Phospholipid vesicle formation and transmembrane protein incorporation using octyl glucoside. Biochemistry. 20, 833-840 (1981).
- Malvezzi, M., et al. Ca2+-dependent phospholipid scrambling by a reconstituted TMEM16 ion channel. Nat. Commun. 4, 2367 (2013).
- Eckford, P. D. W., Sharom, F. J. The reconstituted P-glycoprotein multidrug transporter is a flippase for glucosylceramide and other simple glycosphingolipids. Biochem. J. 389, 517-526 (2005).
- Marek, M., Günther-Pomorski, T. Assay of Flippase Activity in Proteoliposomes Using Fluorescent Lipid Derivatives. Methods Mol. Biol. 1377, 181-191 (2016).
- Coleman, J. A., Kwok, M. C. M., Molday, R. S. Localization purification, and functional reconstitution of the P4-ATPase Atp8a2, a phosphatidylserine flippase in photoreceptor disc membranes. J. Biol. Chem. 284, 32670-32679 (2009).
- Coleman, J. A., Quazi, F., Molday, R. S. Mammalian P4-ATPases and ABC transporters and their role in phospholipid transport. Biochim. Biophys. Acta. 1831, 555-574 (2013).
- Romsicki, Y., Sharom, F. J. Phospholipid flippase activity of the reconstituted P-glycoprotein multidrug transporter. Biochemistry. 40, 6937-6947 (2001).
- Zhou, X., Graham, T. R. Reconstitution of phospholipid translocase activity with purified Drs2p, a type-IV P-type ATPase from budding yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 16586-16591 (2009).
