Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for time-lapse imaging using transmitted light and fluorescence microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique1 that allows for the culturing of chick embryos fully-submerged in a liquid culture medium.
심장은 7 굽힘, 5, somitogenesis 6 – 그것의 가용성, 낮은 비용, 평면 구조, 투명성은 병아리 배아 비켜 전은 낭 배기 (2)와 같은 형태 형성 이벤트, 연구의 주요 척추 동물 모델, neurulation 3되고있다 초기 배 발생 동안 13 – 8, 뇌 형성 9. 형태 형성 과정을 이해의 핵심은 시간 경과 영상에 의해 동적으로 수행하는 것입니다. 병아리 배아의 예를 비켜의 시간 경과 영화의 획득은 배아 (14)의 주위 온도와 습도를 제어하는 인큐베이터에 대해 짧은 시간 창 또는 필요에를 제한하고있다. 여기서 우리는 문화 병아리에 새로운 기술이 투과광 현미경을 사용하여 고해상도 시간 경과 이미징을위한 전 비켜 배아 제시한다. 잠수 필터 종이 샌드위치는 잘 확립 된 필터 종이 캐리어 TECHN의 변형입니다개새끼 (EC 배양) (1)과는 기후 챔버 없이도 병아리 배아의 배양을 허용한다. 배아는 두 개의 동일한 여과지 캐리어 끼워 완전히 빛의 미네랄 오일 층에 의해 덮여 간단한 온도 제어 매질에 침지 유지된다. 적어도 28 체절 단계 (HH16) 15까지 원시적 인 행진 단계 (햄버거 – 해밀턴 단계 5, HH5) 15에서 시작, 배아 중 하나를 자신의 복부 또는 지느러미면을 위로하여 배양 할 수있다. 이 배아 발달의 30 시간을 포함 시간 경과 영화의 인수를 할 수 있습니다. 대표 저속 프레임과 동영상이 표시됩니다. 배아는 표준 EC-문화를 배양 배아에 형태 학적으로 비교된다.
잠수 필터 종이 샌드위치 초기 지느러미와 복부 형태 형성 과정을 연구 할 수있는 안정적인 환경을 제공합니다. 또한 이러한 미세 비드 IMP 같은 실시간 형광 이미징 micromanipulations 허용μM 농도로 배양액, 미세 주입, 유전자 침묵과 전기 및 강한 전위를 갖는다는 (밝은 장 현미경 포함) 레이저 기반 이미징을위한 침지 목적과 결합한다.
배아는 역사의 시작부터 사람을 매료했다. 방법 배아의 구조 및 형태는 잘 정의 된 시간적 및 공간적으로 발전 하는가? 병아리 배아는 여러 가지 이유로 배아에 대한 고전적인 척추 동물 모델 중 하나가되고있다 : 그것은 어머니 외부 개발로이 실험 조작에 대해 쉽게, 저렴하고, 사용 가능한 초기 단계에서 투명하고 액세스 할 수 있습니다. 또한, 심장 및 뇌 형성, 낭 배기, neurulation 및 somitogenesis 15 초기 형태 형성 이벤트 기간 동안 거의 평면 형상을 가지고있다.
그들은 이러한 경과 된 이미지의 획득을 같이 동적으로 조사되는 경우 형태 형성 공정은 가장 잘 이해 될 수있다. 병아리 배아는 비켜 16 만 실험 조작 및 투과광 현미경 이미징을위한 제한된 가시성 가난한 접근성 시각화 할 수 있습니다. 따라서, 절단19 이식편 문화 1,20로 – – 23 알의 기술이 전 비켜, 중 전체 노른자 문화 시스템 13, 17 문화 병아리 배아에 제안되었다. 전체 난황 배양 시스템에서, 배아는 그대로 노른자의 상부에 유지하고, 난자의 전체 콘텐츠는 배양 위해 다른 용기로 전달된다. 이 컨테이너는 대리 달걀 껍질 (17), 페트리 접시 (19), 또는 플라스틱 집착 랩 13,18 만든 해먹 될 수 있습니다. 전체 노른자 문화 배아는 이상적으로 부화 될 때까지 배양하고 micromanipulations에 액세스 할 수 있습니다. 이러한 기술은 이하 배아 시각화 하드 유지하면서 (콘트라스트를 증가시킨다), 혈액 순환 개시 후 배아의 개발 연구에 유용하다. 그들은 노른자에서 절제 및 체외 외식으로 배양하는 경우 이러한 초기 배아는 최고의 이미징 할 수있다. 외식 실험에 대한 접근이 용이알 조작 및 배양 적은 공간을 필요로합니다. 몇 년 동안 1955 년과 그 변화에 데니스 새로운 개척하는 기술하여 시간 경과 현미경과 미세 수술 개입 (20, 21)의 배아 액세스 할 수 있도록, 병아리 배아에 대한 절편 배양 방법의 황금 표준이었다. 가장 큰 성공에도 불구하고, 새의 기술은 상대적으로 까다 롭고 시간이 소요됩니다. 배반 엽 담 난황 막은, 적당한 장력 하나를 달성하기 위해, 유리 링 주위 연신 때 종종 분리 배반. 또한, 배아의 복부 쪽이 위로 만 배양 할 수 있습니다. EC는 (초기 병아리) 문화 및 채프 COLLIGNON 하나에 의해 개발 된 최신 기술은 중앙 개구와 여과지 캐리어를 사용하여 난황 막 연신을 우회. 여과지함으로써 자연 장력을 유지 난황 막에 부착하고, 화상 프레임 (1)과 같은 배아를 둘러싼 다.배아는 보통 복부 쪽이 위로, 한천 – 알부민 바닥에 배양 있습니다. 지느러미 쪽을 배양하는 것은 HH8 15 세 이상에서 배아 만 가능한 것 같다. 대부분의 그룹은 외과 용 봉합 섬유 (24) 또는 박막 (25) 코팅 된 콜라겐으로 이루어지는 지지체와 한천 알부민 바닥을 대체하여 그들의 요구에 여과지 캐리어를 적응시켰다. 종종, 새의 기술과 또는 EC 문화 배양 배아는 산소 확산 1,20을 용이하게하기 위해 공기에 자신의 지느러미 또는 복부 표면으로 노출되어있다. 이 체외 이식편은 배양 배지의 증발을 방지하고 건조되는 배아를 방지하는 가습 분위기에서 보관해야한다. 이 젖은 휴지 하나를 함유하는 큰 페트리 접시 이식편 배양 접시와 배양함으로써 달성된다. 이 배아의 시간 경과 이미지의 인수는 전체 현미경 또는 성질 주변의 기후 제어 인큐베이터의 사용 중 하나가 필요합니다ature 제어식 광로 (14)의 응축을 방지하기 위해 가열 뚜껑 용기. 완전히 여과지 배양 물 (25) 배양액에 잠긴 뉴의 기술 2,21의 adaptions 무거운 광유 및 알부민의 층 사이에 개재하거나, "콘월어 창백한 문화 절첩 배반 이식편으로 비켜하지만, 병아리 배아는 예를 개발할 수 "23,26, 공기와 직접 접촉하지 않고.
잠수 여과지 샌드위치 여과지 캐리어 기술의 새로운 변종이다. 병아리 태아에게 전 비켜 배양에 앞서 지식을 결합함으로써, 기후 제어 인큐베이터 및 폐기 가능 가열 뚜껑을 수 있습니다. 포함 제어되는 온도 : 배아는 두 개의 동일한 (레이저 컷) 필터 종이 캐리어 (24)와 배양 완전히 (2 비율 3에 Pannett – 콤프 턴 식염수 27, 28 얇은 알부민) 간단한 배지에 잠긴 사이에 끼워어. 배지 위에 떠 라이트 미네랄 오일 층이 증착 2,21 방지 및 환경의 열 손실을 최소화한다. 용기의 바닥 유리 창을 갖고, 전체 셋업은 긴 작동 거리 직립 크게 현미경 수행된다. 햄버거 해밀턴이 설정은 28 체절 단계로 초기의 원시적 인 행진 단계에 이르기까지, 배아 발달의 약 30 시간의 고해상도 시야 및 암시 야 시간 경과 영화의 인수를 할 수 있습니다 (해당하는 16, HH5-16 5 스테이지 ) 15. 태아는 복부 또는 지느러미 쪽이 위로 동일하게 배양 할 수있다. (- 5, 초기 뇌 9-13 예를 들어, 후반 낭 배기 2, 신경관 폐쇄 3) 개발 따라서 배아는 관찰과 복부 (예를 들어, 초기 심장 7,8 및 somitogenesis 6)과 등쪽의 조작에 액세스 할 수 있습니다. 잠수 필터 종이 샌드위치 페이지미세 비드 주입, 미세 주입, 유전자 침묵 및 전기 연구를위한 단순하고 안정적인 환경을 rovides. 이미징 전위는 침지 목표 (밝은 장 현미경 포함) 레이저 기반 이미징을 사용하여 훨씬 더 가압 할 수있다.
잘 설립 된 EC 문화 (1)의 새로운 변종으로, 침수 필터 종이 샌드위치는 주위 온도 – 습도 조절 인큐베이터함으로써 초기 병아리 배아 전의 장기적인 시야 및 암시 야 시간 경과 영화의 인수를 비켜 용이 비용 소비 현미경. 오히려 반고체 한천 알부민 바닥 배양보다 배아 완전히 PC-식염수 얇은 알부민 이루어진 간단한 배양액에 잠긴 상태로 유지된다. 증발 및 열 손실이 배지 위에 떠있는 미네랄 오일 층이 최소화된다. 배아는 품질에서 볼 수 차이없이 쉽게 지느러미 또는 복부 쪽이 위를 배양 할 수있다. 여기에 도시 된 바와 같이, 침수 필터 종이 샌드위치 배아는 morphogen 젖은 구슬의 응용 프로그램과 마찬가지로, 미세 수술 개입에 액세스 할 수 있습니다. 미래의 응용 프로그램은 엄마에 침묵 실시간 형광 이미징, microinjections 및 전기, 유전자를 포함nipulate 및 복부 (예를 들어, 초기의 마음과 somitogenesis)와 지느러미 (예를 들어, 후반 낭 배기, 신경관 폐쇄, 초기 뇌) 개발 과정에서 형태 발생 이벤트의 넓은 범위를 공부합니다. 여과지 샌드위치를 포함하는 페트리 접시는 미네랄 오일 층 아래의 배양액의 교환을 허용하는 관류 챔버로 교체 할 경우 시간 의존적 약물 치료가 가능하다. 잠수 필터 종이 샌드위치와 침지 목표 (빛 시트 현미경 포함) 레이저 기반 이미징와 조합의 전체 이미지 잠재력을 개발할 것입니다.
잠수 필터 종이 샌드위치의 제조에 일부 어려움이 다음 단락에서 해결 될 것입니다. 이 여과지를 샌드위치로 난황에서 배아를 전송할 트레이닝의 적당한 양이 필요하지만, 여러 단계가 여전히 상당히 배양에서 배아의 품질에 영향을 미칠 수있다. 여과지 캐리어 전에노른자에 배치, 배아 주위에 난황 막는 두꺼운 알부민에서 해방되어야한다. 그런 다음에야 여과지와 난황 막 사이의 연결은 PC-식염수 세척을 견딜 수있을 정도로 견고합니다. 가능한 한 작은 액체 / 공기 계면을 교차한다 배아를 운반 여과지 멤브레인의 장력을 최소화한다. 세정 용 PC-식염수하게되면 전체 여과지 캐리어 완전히 잠긴 항상 유지한다. 난황 막 필터 종이에서 방출 시작되는 바와 같이, 60 초 – PC의 식염 욕에서 시간은 약 30으로 제한한다. 노른자 나머지는 나중에 배아의보기를 모호하므로 여전히 배아의 청소는 매우 철저하게 실행해야한다. 세척하는 동안, 반경 방향으로 멀리에서 항상 직접 배아에 전송 피펫에서 스트림을 지적, 그러나 결코. PC의-식염수에서 배아를 제거한 후, 최소화하기 위해 수평 필터 종이를 유지해야합니다배아 세포막에 긴장. 그리고, 제 2 필터 종이 캐리어 배아 안정화. 제 2 필터 종이 캐리어가 배치되면, 서로에 대해 여과지 캐리어를 이동시키고 배아 세포막을 파열시킬 수있는 횡 장력을 만들지 않도록. 여과지 샌드위치가 배지하게되면, 또한 막에 장력을 최소화 번만 공기 / 액체 계면을 교차한다. 상단에서 여과지 샌드위치를 안정화하는 데 스테인리스 제 2 쌍의 링들에 아주 천천히 넣고 배아 막의 압축을 최소화하기 위해 임의의 압력없이한다. 배아의 면적 opaca 작은 파열은 보통 배양의 첫번째 시간 동안 치료하지만, 오일 층이 배지 위에 피펫 팅되기 전에 손상 배아 항상 새로운 샘플로 대체되어야 할 수있다.
이미지 전체 배아 또는 고해상도 시간 경과 영화에 대한 여러 샘플, 마이크roscope은 현미경 소프트웨어에 의해 제어되는 전동 XY 스테이지, 장착되어 있어야합니다. 이는 화질을 감소 배지 오일에서 배아 및 난류, 손상을 방지하기위한 최소한의 속도로 XY 스테이지의 움직임을 가지고 매우 중요하다. 여기에 제시된 시간 경과 영화의 인수를 들어, 전동 XY 스테이지는 약 1.75 mm / sec의 속도로 움직였다. 앞으로 영상은 더 먼저 원하는 위치로 무대를 이동하고 진동과 난류가 사라질 수 있도록 짧은 휴식 기간 후에 이미지를 획득함으로써 향상 될 수있다.
침지 목적없이 직립 현미경을 사용하는 경우의 제한으로, 잠재적 인 사용자는이 배양 방법에 필요로하는 비교적 긴 작동 거리 (약 1cm)을 알고 있어야한다. 배아의 상단에 매체의 층에서 미네랄 오일이 작동 거리 결과. 6cm 페트리 접시에, 오일 층은 thicknes있다약 1의 (S) – 1.5 mm, 및 배아는 배양 배지에 깊이 약 4mm 침수된다. 목표의 직경에 따라, 6cm 페트리 접시의 상단은 태아에 대한 액세스를 제한 할 수있다. 이것은 큰 접시를 사용함으로써 회피 될 수있다.
정상으로부터의 작동 거리가 약간 액체 층의 두께를 최소화함으로써 감소 될 수있다. 또한, 아래에서 작동 거리가 더 아래 페트리 접시의 바닥 배아를 가져오고, 가열 비커 유리창의 두께를 감소시킴으로써 최소화 될 수있다. 프로토콜이 직립 긴 작동 거리를 크게 현미경으로 작동하도록 최적화되어 있지만, 그것은도 거꾸로 현미경에 장착 될 수있다. 예비 실험이 제한 확산이 확률값 될 것 같지 않습니다 것을 제안하지만, 미래의 사용자는, 배양 배지에 너무 깊이 배아를 침지하는 O 2 -diffusion 문제를 초래할 수 있음을 유의하십시오LEM는 한 배아를 배양 배지와 끼워 여과지 충분히 대형 저장 둘러싸여로서 배양 접시의 바닥에 가압되지 않는다.
또 다른 한계는 온도 조절된다. 40 ° C로 가열 된 비이커에 대한 제어기의 온도를 조정함으로써, 배지 중의 온도는 매체 광유 덮여 배아 약 37.5 ° C로 평형화. 이는 어떤 에너지 발열체, 온도 센서가있는 비커의 바닥 및 태아의 위치 사이에서 손실되는 것을 나타낸다. 온도 제어 센서 색 및 가열 소자를 재분배함으로써 최적화 될 수있다.
The authors have nothing to disclose.
저자는 ZonMW-VICI 부여 918.11.635 (네덜란드)에서 재정 지원을 인정합니다. 저자는 자신의 실질적인 제안과 현미경에 도움이되는 조언을 설치 구성 요소와 칼 자이스 네덜란드의 르노 Voortman의 제조 브리 예 대학교 암스테르담의 도구 상점에게 감사의 말씀을 전합니다. Marjolein Blaauboer 비판적 원고의 몇 초안에 코멘트에 큰 지원이었다.
Milli-Q Reference Water Purification System | Millipore | Z00QSV0WW | |
Duran laboratory bottles, with caps, 1L | Sigma-Aldrich/Duran | Z305200-10EA | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Solution A | |||
NaCl | Merck Millipore | 1064041000 | |
KCl | Merck Millipore | 1049361000 | |
CaCl2 H2O | Merck Millipore | 1023821000 | |
MgCl2.6H2O | Merck/Sigma-Aldrich | 13152-1KG-D | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Solution B | |||
Na2HPO4.2H2O | Merck | 1065801000 | |
NaH2PO4.2H2O | Merck | 1063420250 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Whatman qualitative filter paper, Grade 595 | Sigma-Aldrich | 10311611 | |
Laser cutting machine MLS-90120-C130, CO2-laser, 130W, wavelength 10.6 µm | Micro Lasersystems | ||
Tork Extra Soft Facial Tissues | Tork | 140280 | |
Latex gloves | Sigma-Aldrich | Z645613 | |
EMDAMED | EMDA 300.131 | ||
Transfer pipettes | Sigma-Aldrich | Z350613 | |
VWR | WITG5.480.003 | ||
accu-jet pro Pipette Controller | BrandTech Scientific | 26332 | |
Serological plastic pipettes, 25mL | Sigma-Aldrich | CLS4251 | |
Plastic document sleeves | |||
Egg incubator – Incubator mod. Cip Cip 40 | Fiem | ||
Fertilized chicken eggs (Gallus gallus) | Drost BV (Loosdrecht, NL) | ||
10 cm Tissue culture dishes | Sigma-Aldrich | P5731 | |
Greiner Bio-one | 664160 | ||
6 cm Petri dishes | Sigma-Aldrich | P5481 | |
50ml Centrifuge tubes , Greiner centrifuge tubes or Cellstar tubes | Sigma-Aldrich | T2318 | |
greiner bio-one | 227261 | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Stainless steel rings, custom-made | |||
Large rings, 30 mm outer diameter, 4 mm in height, 1.5 mm wall thickness | |||
Small rings, 20 mm outer diameter, 4 mm in height, 1.5 mm wall thickness, 6.5 mm gap in the ring | |||
Nail scissors | |||
Forceps, Dumont #5, Inox | Fine Science Tools , F.S.T. | 11251-20 | |
Fine, really sharp scissors for cutting filter paper | VWR | 21-102 | |
M3516 Sigma-Aldrich Mineral Oil | Sigma-Aldrich | CAS Number 8042-47-5 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Agar bottoms for EC culture | |||
Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 SIGMA | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 SIGMA-ALDRICH | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Microbead implantation | |||
Polybead Sampler Kit III (45 µm beads were used) | Polysciences, Inc. | 16905-1 | |
Accupuncture needles: type J, No.02, 0.12x30mm | SEIRIN | type J, No.02, 0.12x30mm | |
PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Temperature controlled beaker | |||
RTD Temperature Sensor with M4 Threaded Housing RTD-850M | Omega | RTD-850M | |
Hermetically Sealed RTD Sensors HSRTD-3-100-A-3M | Omega | HSRTD-3-100-A-1M | |
Thermistor and RTD Extension Wire EXTT-3CU-26S-50 | Omega | EXTT-3CU-26S-50 | |
3-Pin Mini Connectors for Thermocouples, 3-Wire RTD's and Thermistors MTP-U-M | Omega | MTP-U-M | |
Kapton (Polyimide Film) Insulated Flexible Heaters KHLV-103/(10)-P | Omega | KHLV-103/(10)-P | |
Temperature/Process Controller CNi16D24-C4EIT-DC | Omega | CNi16D24-C4EIT-DC | |
Custom-made aluminium beaker, isolated with polyacetal (drawings see sheet 2) | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Microscope setup | |||
Axio Zoom.V16 with ApoTome.2 ZEN | Carl Zeiss AG | 495010-0009-000 | |
Objective PlanNeoFluar Z 1.0x/0.25 FWD 56mm | Carl Zeiss AG | 435281-9100-000 | |
Manual Rotary Control MARC | Carl Zeiss AG | 435604-0000-000 | |
Transillumination top 450 mot | Carl Zeiss AG | 435500-9000-000 | |
Motorized measuring stage S 150×100 mot; CAN (D) | Carl Zeiss AG | 435465-9020-000 | |
Insert plate S, glass 237x157x3mm (D) | Carl Zeiss AG | 435465-9053-000 | |
Controller EMS 3 | Carl Zeiss AG | 435610-9010-000 | |
System Control Panel SYCOP 3 | Carl Zeiss AG | 435611-9010-000 | |
Hamamatsu ORCA Flash 4.0 camera | Hamamatsu | C11440-22CU | |
Microscopy High-End Workstation Xeon Quad-Core mulitlingual | Carl Zeiss AG | 490004-0025-000 | |
Language Package Windows 7 x64 Ultimate English US | Carl Zeiss AG | 410373-0200-000 | |
LCD TFT Monitor HP ZR2440w 24" | Carl Zeiss AG | 410350-2403-000 | not available anymore |
ZEN pro 2012 Hardware License key | Carl Zeiss AG | 410135-1002-120 | not available anymore |
ZEN Software Driver Hamamatsu Cameras Hardware License Key | Carl Zeiss AG | 410136-1045-110 | |
ZEN module Z Stack | Carl Zeiss AG | 410136-0030-110 | |
ZEN Module Tiles/ Positions | Carl Zeiss AG | 410136-1025-110 | |
ZEN Module Time Lapse | Carl Zeiss AG | 410136-1031-110 | |
ZEN Module Experiment Designer | Carl Zeiss AG | 410136-1022-110 | |
ZEN Desk 2012 Hardware License Key | Carl Zeiss AG | 410135-1004-120 | not available anymore |