Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for time-lapse imaging using transmitted light and fluorescence microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique1 that allows for the culturing of chick embryos fully-submerged in a liquid culture medium.
Благодаря своей доступности, низкой стоимости, плоская геометрия, и прозрачность, экс ово куриного эмбриона стала одной из основных модели позвоночных животных для изучения морфогенетических событий, таких как гаструляцией 2, нейруляция 3 – 5, сомитогенез 6, сердце изгиб 7, 8, и мозг образование 9 – 13, во время раннего эмбриогенеза. Ключ к пониманию морфогенетических процессов должен следовать их динамически покадровой обработки изображений. Приобретение покадровой фильмов цыпленка эмбриогенез экс ово было ограничено либо коротких временных окон или необходимости инкубатор для контроля температуры и влажности воздуха вокруг эмбриона 14. Здесь мы представляем новую технику к культуре куриных эмбрионов экс ово для высокого разрешения покадровой визуализации с помощью микроскопии в проходящем свете. Погружной сэндвич бумажный фильтр представляет собой вариант хорошо налаженной фильтра технич бумажный носительIQUE (ИС-культура) 1 и позволяет культивировании эмбрионов кур без потребности в климатической камере. Эмбрион зажатой между двумя идентичными бумажных носителей фильтра и хранится полностью погружен в простой, контролируемой температурой среды, покрытой слоем светлых нефтепродуктов. Начиная с примитивной стадии полоски (Hamburger-Hamilton стадии 5, HH5) 15 до по крайней мере 28-сомитов (HH16) 15, эмбрионы могут быть выращены либо с их вентральной или спинной стороной вверх. Это позволяет приобретение покадровой фильмов, охватывающих около 30 ч эмбрионального развития. Представительные время покадровой кадров и фильмы показаны. Эмбрионы сравнивают морфологически эмбриону культивировали в стандартной EC-культуры.
Погружной сэндвич фильтровальной бумаги обеспечивает стабильную среду для изучения ранней спинной и брюшной морфогенетические процессы. Он также позволяет живой флуоресцентной визуализации и микроманипуляций, такие как микрохирургия, шарик импlantation, микроинъекции, ген глушителей, и электропорации, и имеет сильный потенциал, который будет сочетаться с целями погружения для лазерной основе изображений (в том числе световой микроскопии листа).
Эмбриогенез очаровал человек с самого начала истории. Как структура и морфология эмбриона развиваются в таком хорошо определенной временной и пространственной форме? Куриного эмбриона стал одним из классических позвоночных животных моделей для эмбриогенеза по нескольким причинам: Он легко доступен, недорог, прозрачная на ранних стадиях, и доступны для экспериментальных манипуляций, так как она развивается вне матери. Кроме того, он имеет почти плоскую геометрию во время ранних морфогенетических событий, таких как сердце и формирование мозга, гаструляции, нейруляции и сомитогенеза 15.
Морфогенетические процессы могут быть поняты лучше, если они изучаются динамически, например, за счет приобретения покадровой изображений. Куриного эмбриона могут быть визуализированы в яйце 16 , но с низкой доступностью для экспериментальных манипуляций и ограниченной видимости для работы с изображениями светопропускание микроскопии. Поэтому разрыватьAl методы были предложены к культуре куриных эмбрионов бывших ово, либо в целых систем желток культуры 13,17 – 19 или в качестве эксплантов культур 1,20 – 23. В целом системы желток культуры, зародыш остается в верхней части неповрежденной желток, и все содержимое яйца переносят в другой контейнер для инкубации. Этот контейнер может быть суррогатной скорлупа 17, чашку Петри 19 или гамак из пластмассы цепляются обертка 13,18. Эмбрионы в целом желтка культур может идеально быть выращены до вылупления и доступны для микроманипуляций. Эти методы особенно полезны для изучения развития эмбрионов после начала кровообращения (что повышает контраст), в то время как более молодые эмбрионы остаются трудно представить. Эти ранние эмбрионы могут быть отображены лучше всего, если они вырезают из желтка и культивируют в качестве эксплантов в пробирке. Эксплантаты легко доступны для экспериментааль манипуляциями и требуют меньше места для культивирования. В течение многих лет методика впервые Денис Новое в 1955 году и его вариации были золотые стандарты методов культивирования эксплантов для куриных эмбрионов, таким образом делая эмбрион доступным для покадровой микроскопии и микрохирургических вмешательств 20,21. Несмотря на большой успех, техника новой является относительно сложным и требует много времени. Бластодерма часто отрывается , когда желточной оболочки, неся бластодерму, растягивается вокруг стеклянного кольца для достижения необходимого натяжения 1. К тому же, эмбрион можно культивировать только с его вентральной стороной вверх. EC (Early Chick) культура, более новый метод , разработанный Chapman и Collignon 1, обходит растяжению желточной оболочки с помощью фильтра бумажный носитель с центральным отверстием. Бумажный фильтр крепится к желточной оболочки, тем самым сохраняя его естественную напряженность, и окружает эмбрион как изображение кадра 1.Эмбрионы затем культивировали на агаровой-белково дно, как правило, с их вентральной стороной вверх. Культивирование спинной стороной вверх представляется возможным только для эмбрионов на HH8 15 лет и старше. Многие группы адаптировали фильтра бумажный носитель с их потребностями, например, путем замены агар-белковый дно с поддержкой сделанной из хирургических шовных волокон 24 или коллагена с покрытием мембраны 25. Часто, эмбрионы , культивированные с техникой новой или с культурой ЕС подвергаются с их спинном или вентральной воздуха для облегчения диффузии кислорода 1,20. Эти эксплантов культуры должны быть сохранены в увлажненной атмосфере, чтобы избежать испарения среды и предотвратить эмбрион от высыхания. Это достигается путем инкубирования блюдо с культурой эксплантов в большую чашку Петри , содержащую увлажненную папиросной бумаги 1. Приобретение покадровой изображений этих эмбрионов требует либо использование климат-контроля инкубатора вокруг всего микроскопа или сгорячаратура контролируемой емкости с нагретой крышкой для предотвращения образования конденсата на пути прохождения света 14. Тем не менее, куриные эмбрионы могут также развиться экс ово полностью погружен в культуральной среде в качестве фильтровальной бумаги культур 25, зажатой между слоем тяжелого минерального масла и белке в Адаптации техники New'S 2,21, или как сложенными бластодерму эксплантов в "Корниш пастообразных культуры "23,26, без непосредственного контакта с воздухом.
Погружной сэндвич фильтровальная бумага представляет собой новый вариант методики фильтровальной бумаги-носителя. Объединив ранее знания о культивировании эмбрионов кур ех ово, он делает климат-контролем инкубатор и нагретый крышку необязательным. Эмбрион зажатой между двумя идентичными (лазерной резкой) фильтровальной бумаги носителей 24 и культивировали полностью погруженных в простой питательной среде (Pannett-Комптона физиологический раствор 27,28 и тонких белке в соотношении 3: 2) в контролируемой температурой содержатьэ. Слой светлых нефтепродуктов , плавающей на поверхности среды предотвращает испарение 2,21 и сводит к минимуму потери тепла в окружающую среду. В нижней части контейнера имеет стеклянное окно, и вся установка выполняется на вертикальном большое рабочее расстояние трансфокатора микроскопа. Эта установка позволяет приобретение высокого разрешения Светлое и темнопольным покадровой фильмов около 30 часов эмбрионального развития, начиная от ранней стадии первичной полоски к 28-сомитов (эквивалентно Hamburger Гамильтон ступени от 5 до 16, HH5-16 ) 15. Эмбрионы можно культивировать одинаково хорошо с их вентральной или спинной стороной вверх. Таким образом, эмбрионы являются доступными для наблюдения и манипулирования вентральной (например, в начале сердца 7,8 и сомитогенез 6) и спинные (например, в конце гаструляция 2, закрытия нервной трубки 3 – 5, и в начале мозга 9 – 13) развития. Погружной бумажный фильтр сандвича рrovides простой и стабильной среды для микрохирургии, кромочная имплантации, микроинъекции, молчанием генов и исследований электропорации. Его потенциал формирования изображения может быть выдвинут гораздо дальше с помощью лазера на основе изображений (в том числе световой микроскопии листа) и целей погружения.
В новом варианте хорошо налаженной культуры EC 1, погружной сэндвич фильтровальной бумаги облегчает приобретение долгосрочных Светлое и темнопольный покадровой фильмов раннего эмбриона цыпленка экс ово, делая температурно-влажностный управляемый инкубатор вокруг микроскоп необязательной. Вместо того, чтобы культивировать на полутвердой агар-белковины дно, эмбрионы всегда полностью погружена в простой питательной среде, состоящей из PC-солевого раствора и тонких белке. Испарение и потери тепла сведены к минимуму с помощью слоя минерального масла плавающим на поверхности питательной среды. Эмбрионы можно культивировать легко, либо спинной или вентральной стороной вверх, без видимых различий в качестве. Как показано здесь, эмбрионы в подводном бумаги сэндвича фильтра доступны для микрохирургических вмешательств, как применение морфогенов пропитанной бисера. Будущие приложения включают в себя живой флуоресцентных изображений, микроинъекции и электропорации и молчанием генов в маnipulate и изучить широкий спектр морфогенетических событий во время развития вентральной (например, раннее сердце и сомитогенез) и спинные (например, в конце гаструляции, закрытие нервной трубки, и ранний мозг). Зависимое от времени медикаментозное лечение является возможным, если чашку Петри, содержащую сандвич фильтровальную бумагу заменяют перфузионной камеры, что позволяет обмен культуральной среды под слоем минерального масла. Погружной сэндвич бумажный фильтр будет развивать свой потенциал формирования изображения в сочетании с лазером на основе изображений (в том числе световой микроскопии листа) и целей погружения.
Некоторые трудности с подготовкой погруженной бумажного фильтра бутерброда будут рассмотрены в следующих параграфах. Несмотря на то, что требуется только умеренное количество тренировок для передачи эмбриона из желтка в бумажный сэндвич фильтра, несколько шагов, которые могут по-прежнему существенно влияют на качество эмбриона в культуре. Перед тем как носитель фильтровальная бумагапомещается на желтке, желточной оболочки вокруг зародыша должны быть освобождены от любых толстых белке. Только тогда связь между фильтровальной бумагой и желточной мембраны быть достаточно прочным, чтобы выдерживать стирку в PC-солевой раствор. Фильтровальная бумага, несущий эмбрион пересекает границу раздела / воздуха жидкость как можно меньше, чтобы свести к минимуму напряжение на мембранах. После того, как приведено в РС-солевой раствор для промывания, весь фильтр бумажный носитель должен оставаться полностью погружен во все времена. Время в PC-солевой ванне должна быть ограничена примерно до 30 – 60 секунд, в качестве желточной оболочки начнет выпускать из фильтровальной бумаги. Тем не менее, чистка эмбриона должна быть выполнена очень тщательно, поскольку остатки желтка позже заслонять вид эмбриона. Во время стирки, никогда не направляйте поток из пипетки передачи непосредственно на эмбрион, но всегда в радиальном направлении от него. После удаления эмбриона из PC-солевого раствора, убедитесь, чтобы удерживать фильтровальную бумагу по горизонтали, чтобы свести к минимумунатяжение на зародышевых оболочек. Затем, стабилизировать зародыш со вторым фильтром бумажном носителе. После того, как второй носитель из фильтровальной бумаги помещают, не создавать каких-либо боковое натяжение, которое может сместить фильтровальной бумаги носителей относительно друг друга и разрывают эмбриональные мембраны. Когда сэндвич из фильтровальной бумаги приводится в культуральную среду, она должна также пересекает границу раздела воздух / жидкость только один раз, чтобы свести к минимуму напряжение на мембранах. Вторая пара колец из нержавеющей стали, используемых для стабилизации сэндвич фильтровальной бумаги сверху должны быть размещены очень медленно и без какого-либо давления, чтобы минимизировать сжатие эмбриональных мембран. Небольшие разрывы площади opaca эмбриона обычно заживают в течение первого часа культуры, но поврежденный эмбрион может и должен всегда быть заменен новым образцом до того, как слой масла пипеткой на верхней части культуральной среды.
Для изображения весь эмбрион или несколько образцов для фильмов покадровой высокого разрешения, микрофонroscope должен быть оснащен моторизованным ХУ стадии, управляемый программным обеспечением микроскопа. Это имеет решающее значение, чтобы иметь ху-ступенчатый ход с минимальной скоростью, чтобы избежать повреждения эмбрионов и волнении в культуральной среде и масла, что приведет к снижению качества изображения. Для приобретения покадровой фильмов, представленных здесь, моторизованный ху ступени двигался с скоростью приблизительно 1,75 мм / сек. В будущем, визуализация может быть дополнительно улучшена за счет первого этапа перемещения в нужное положение и приобретает изображение после короткого периода покоя, чтобы колебания и завихрения исчезают.
В качестве ограничения, потенциальные пользователи должны быть осведомлены относительно большим рабочим расстоянием (около 1 см), необходимых для этого способа культивирования, если прямой микроскоп без целей погружения используется. Это рабочее расстояние является результатом слоя среды и минерального масла в верхней части эмбриона. В 6 см чашку Петри, слой масла имеет Thicknesс приблизительно 1 – 1,5 мм, и эмбрион погружают приблизительно 4 мм в глубину в культуральной среде. В зависимости от диаметра объектива, верхний край 6 см чашки Петри может также ограничить доступ к эмбриону. Это можно было бы обойти, используя большее блюдо.
Рабочее расстояние от вершины может быть несколько снижена за счет минимизации толщины слоев жидкости. Кроме того, рабочее расстояние снизу может быть сведено к минимуму путем приведения эмбриона дальше вниз на дно чашки Петри и уменьшая толщину стеклянного окна стакана с подогревом. В то время как протокол был оптимизирован для работы с вертикально длиннее расстояние трансфокатора микроскопа, он может быть установлен на инвертированный микроскоп, а также. Будущие пользователи должны иметь в виду , что погружая зародыш слишком глубоко в культуральной среде может привести к O 2 проблемы – диффузии, хотя предварительные эксперименты позволяют предположить , что ограниченная диффузия не кажутся ProbЛем, до тех пор, как зародыш окружен достаточно большим резервуаром-культуральной среды и фильтровальную бумагу, зажатой не прижата к нижней части чашки Петри.
Другим ограничением является регулирование температуры. Регулируя температуру контроллера для стакана нагретой до 40 ° С, температура в среде уравновешивается до 37,5 ° C вокруг эмбрионов, когда среда покрыта минеральным маслом. Это показывает, что некоторое количество энергии теряется между дном стакана, где нагревательные элементы и датчик температуры расположены, и расположение эмбрионов. Регулирование температуры может быть оптимизировано путем перемещения датчика и перераспределении нагревательных элементов.
The authors have nothing to disclose.
Авторы признают финансовую поддержку от гранта ZonMw-VICI 918.11.635 (Нидерланды). Авторы хотели бы поблагодарить инструментальный цех Врийе Universiteit Амстердам за свои практические предложения и для изготовления компонентов установки и Ярно Voortman от Carl Zeiss Нидерландов за полезные советы по микроскопии. Marjolein Blaauboer была большая поддержка в критически комментируя несколько вариантов рукописи.
Milli-Q Reference Water Purification System | Millipore | Z00QSV0WW | |
Duran laboratory bottles, with caps, 1L | Sigma-Aldrich/Duran | Z305200-10EA | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Solution A | |||
NaCl | Merck Millipore | 1064041000 | |
KCl | Merck Millipore | 1049361000 | |
CaCl2 H2O | Merck Millipore | 1023821000 | |
MgCl2.6H2O | Merck/Sigma-Aldrich | 13152-1KG-D | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Solution B | |||
Na2HPO4.2H2O | Merck | 1065801000 | |
NaH2PO4.2H2O | Merck | 1063420250 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Whatman qualitative filter paper, Grade 595 | Sigma-Aldrich | 10311611 | |
Laser cutting machine MLS-90120-C130, CO2-laser, 130W, wavelength 10.6 µm | Micro Lasersystems | ||
Tork Extra Soft Facial Tissues | Tork | 140280 | |
Latex gloves | Sigma-Aldrich | Z645613 | |
EMDAMED | EMDA 300.131 | ||
Transfer pipettes | Sigma-Aldrich | Z350613 | |
VWR | WITG5.480.003 | ||
accu-jet pro Pipette Controller | BrandTech Scientific | 26332 | |
Serological plastic pipettes, 25mL | Sigma-Aldrich | CLS4251 | |
Plastic document sleeves | |||
Egg incubator – Incubator mod. Cip Cip 40 | Fiem | ||
Fertilized chicken eggs (Gallus gallus) | Drost BV (Loosdrecht, NL) | ||
10 cm Tissue culture dishes | Sigma-Aldrich | P5731 | |
Greiner Bio-one | 664160 | ||
6 cm Petri dishes | Sigma-Aldrich | P5481 | |
50ml Centrifuge tubes , Greiner centrifuge tubes or Cellstar tubes | Sigma-Aldrich | T2318 | |
greiner bio-one | 227261 | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Stainless steel rings, custom-made | |||
Large rings, 30 mm outer diameter, 4 mm in height, 1.5 mm wall thickness | |||
Small rings, 20 mm outer diameter, 4 mm in height, 1.5 mm wall thickness, 6.5 mm gap in the ring | |||
Nail scissors | |||
Forceps, Dumont #5, Inox | Fine Science Tools , F.S.T. | 11251-20 | |
Fine, really sharp scissors for cutting filter paper | VWR | 21-102 | |
M3516 Sigma-Aldrich Mineral Oil | Sigma-Aldrich | CAS Number 8042-47-5 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Agar bottoms for EC culture | |||
Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 SIGMA | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 SIGMA-ALDRICH | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Microbead implantation | |||
Polybead Sampler Kit III (45 µm beads were used) | Polysciences, Inc. | 16905-1 | |
Accupuncture needles: type J, No.02, 0.12x30mm | SEIRIN | type J, No.02, 0.12x30mm | |
PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Temperature controlled beaker | |||
RTD Temperature Sensor with M4 Threaded Housing RTD-850M | Omega | RTD-850M | |
Hermetically Sealed RTD Sensors HSRTD-3-100-A-3M | Omega | HSRTD-3-100-A-1M | |
Thermistor and RTD Extension Wire EXTT-3CU-26S-50 | Omega | EXTT-3CU-26S-50 | |
3-Pin Mini Connectors for Thermocouples, 3-Wire RTD's and Thermistors MTP-U-M | Omega | MTP-U-M | |
Kapton (Polyimide Film) Insulated Flexible Heaters KHLV-103/(10)-P | Omega | KHLV-103/(10)-P | |
Temperature/Process Controller CNi16D24-C4EIT-DC | Omega | CNi16D24-C4EIT-DC | |
Custom-made aluminium beaker, isolated with polyacetal (drawings see sheet 2) | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Microscope setup | |||
Axio Zoom.V16 with ApoTome.2 ZEN | Carl Zeiss AG | 495010-0009-000 | |
Objective PlanNeoFluar Z 1.0x/0.25 FWD 56mm | Carl Zeiss AG | 435281-9100-000 | |
Manual Rotary Control MARC | Carl Zeiss AG | 435604-0000-000 | |
Transillumination top 450 mot | Carl Zeiss AG | 435500-9000-000 | |
Motorized measuring stage S 150×100 mot; CAN (D) | Carl Zeiss AG | 435465-9020-000 | |
Insert plate S, glass 237x157x3mm (D) | Carl Zeiss AG | 435465-9053-000 | |
Controller EMS 3 | Carl Zeiss AG | 435610-9010-000 | |
System Control Panel SYCOP 3 | Carl Zeiss AG | 435611-9010-000 | |
Hamamatsu ORCA Flash 4.0 camera | Hamamatsu | C11440-22CU | |
Microscopy High-End Workstation Xeon Quad-Core mulitlingual | Carl Zeiss AG | 490004-0025-000 | |
Language Package Windows 7 x64 Ultimate English US | Carl Zeiss AG | 410373-0200-000 | |
LCD TFT Monitor HP ZR2440w 24" | Carl Zeiss AG | 410350-2403-000 | not available anymore |
ZEN pro 2012 Hardware License key | Carl Zeiss AG | 410135-1002-120 | not available anymore |
ZEN Software Driver Hamamatsu Cameras Hardware License Key | Carl Zeiss AG | 410136-1045-110 | |
ZEN module Z Stack | Carl Zeiss AG | 410136-0030-110 | |
ZEN Module Tiles/ Positions | Carl Zeiss AG | 410136-1025-110 | |
ZEN Module Time Lapse | Carl Zeiss AG | 410136-1031-110 | |
ZEN Module Experiment Designer | Carl Zeiss AG | 410136-1022-110 | |
ZEN Desk 2012 Hardware License Key | Carl Zeiss AG | 410135-1004-120 | not available anymore |