Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for time-lapse imaging using transmitted light and fluorescence microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique1 that allows for the culturing of chick embryos fully-submerged in a liquid culture medium.
由于其可用性,费用低,平坦几何形状和透明度, 前卵鸡胚已成为形态发生的事件,例如原肠胚形成2的研究的主要脊椎动物动物模型,神经胚3 – 5,体节形成6,心脏弯曲7, 8,和大脑的形成9 – 13,早期胚胎发育过程中。关键是理解形态发生过程是通过时间推移成像动态地跟随他们。的小鸡胚胎发生前卵的时间推移电影捕获已被限于任一短的时间窗或需要进行培养箱来控制温度和湿度的周围的胚14。在这里,我们提出了一种新的技术来培养鸡胚使用透射光显微术高分辨率时间推移成像前OVO。浸没滤纸夹层是行之有效的滤纸载体TECHN的变体神游(EC培养)1,并允许鸡胚而不需要一个气候室中培养。胚胎被夹在两个相同的滤纸载体之间,并且在由轻质矿物油的层覆盖的简单,温度控制介质保持完全浸没。从原条阶段(汉堡汉密尔顿阶段5,HH5)15开始直到至少28体节阶段(HH16)15,胚胎可以是与它们的腹或背侧进行培养。这使得收购占地约30小时的胚胎发育时间推移电影。代表时间推移框架和电影中。胚形态相比,在标准EC-培养培养的胚胎。
浸没滤纸三明治提供一个稳定的环境,以研究早期背部和腹部的形态发生过程。它也允许对实时荧光成像和微操作,如显微珠小鬼lantation,显微注射,基因沉默,和电穿孔,并有很大的潜力,以与基于激光的成像(包括光片显微镜)浸入目标相结合。
由于历史的开端胚着迷的男人。怎样的胚的结构和形态在这种定义明确的时间和空间的方式发展?鸡胚已经成为经典脊椎动物模型胚胎发生有几个原因之一:这是容易获得的,价格低廉,在其早期阶段透明的,并且可访问的实验操作,因为它的发展母亲以外。此外,它具有在早期形态发生的事件,如心脏和大脑的形成,原肠胚形成,神经胚和体节形成15大致平坦的几何形状。
形态发生过程可以当它们被动态研究,如通过采集时间推移的图像得到最好的理解。鸡胚在卵 16但交通不便的实验操作和透射光显微成像有限的可见性可视化。因此,断绝人的技术已经被提出来培养鸡胚前卵 ,无论是在整个蛋黄培养系统13,17 – 19或作为外植体培养1,20 – 23。在整个蛋黄培养系统,胚胎保持在完好蛋黄的顶部,和蛋的整个内容转移到孵化另一个容器。此容器可以是一个替代蛋壳17,培养皿19中 ,或由塑料保鲜13,18的吊床。在整个蛋黄培养胚胎可以理想地,直到孵化培养,对微操作访问。这些技术可用于研究胚胎的发育血液循环(这增加了对比度)开始后,而年轻胚胎仍难以显现特别有用。如果它们从蛋黄切除并作为体外外植体培养的这些早期胚胎可以成像最好。该外植体实验方便人操作,并且需要用于培养更少的空间。多年来,通过新的丹尼斯在1955年及其变化首创的技术是对鸡胚植培养方法的黄金标准,从而使时间推移显微镜和显微外科干预20,21胚胎进行访问。尽管它的巨大成功,新的技术相对苛刻且费时。当卵黄膜,携带胚盘,围绕玻璃环拉伸以获得适当的张力1胚盘常分开。此外,胚胎只能用其腹侧培养。欧共体(早期小鸡)培养,通过查普曼和COLLIGNON 1开发了一种较近期的技术,通过使用滤纸载体具有中心孔绕过卵黄膜的拉伸。滤纸附着到卵黄膜,从而保持其自然的张力,并包围像画框1胚胎。胚胎然后培养在琼脂-蛋白底,通常与他们的腹侧。培养背侧在HH8 15岁以上的胚胎似乎是唯一可行的。许多团体已经适应滤纸载体自己的需要,例如通过与从外科缝合线的纤维24或涂覆的膜25胶原制成的支撑取代琼脂-蛋白底部。通常情况下,用新的技术或与欧盟文化培养的胚胎暴露,用自己的背或腹面空气,促进氧扩散1,20。这些外植体培养必须保持在湿润的气氛中,以避免介质的蒸发并防止胚胎干燥。这是通过孵育在含有湿润薄纸1较大培养皿外植体培养的培养皿来实现的。这些胚胎的时间推移图像的获取要求要么整个显微镜或脾气周围使用一个气候控制培养箱ATURE控制容器与加热盖以防止冷凝在光路14上 。然而,鸡胚还可以开发前卵在培养基中完全浸没滤纸培养25,夹在重矿物油和蛋白的一个层之间的新的技术2,21的adaptions,或如在“康沃尔粘稠培养折叠胚的外植体“23,26,不与空气直接接触。
浸没滤纸夹层是滤纸载体技术的新变体。通过对培养鸡胚前OVO结合前面的知识,它使气候控制孵化器和热盖可有可无。胚胎被夹在两个相同的(激光切割)滤纸载体24和培养的完全在一个简单的培养基(Pannett康普顿盐水27,28和薄蛋白在一个3:2的比例)浸没之间在控制含一温度呃。轻质矿物油浮在介质的顶部的层防止蒸发2,21和热量损失最小化到环境中。容器的底部有一个玻璃窗口,整个安装是在直立的长工作距离变倍显微镜进行。这种设置允许收购约30小时的胚胎发育的高分辨率明场和暗场时间推移电影,从早期的原条期至28体节期(相当于汉堡汉密尔顿阶段5至16日,HH5-16 )15。胚胎可以与他们的腹侧或背侧进行培养同样出色。因此,胚胎观察和腹侧( 例如,早期心脏7,8和体节形成6)和背侧的访问操作( 例如,在原肠胚后期2,神经管闭合3 – 5,和早期大脑9 – 13)发展。浸没滤纸三明治provides为显微珠注入,显微注射,基因沉默,和电穿孔研究的简单和稳定的环境。它的成像潜力可以通过使用基于激光的成像(包括光片镜)和浸泡的目标更进一步推。
作为成熟的内皮细胞培养1的新变种,淹没滤纸三明治通过周围温度和湿度控制的孵化器有利于收购的早期鸡胚前的长期明场和暗场时间推移电影大毛显微镜可有可无。而不是在半固体琼脂 – 蛋白底部被培养后,将胚保持完全在由PC的盐水和薄蛋白的一个简单的培养基淹没。蒸发和热损失是由矿物油浮在培养基顶部的层最小化。胚胎可以很容易地培养,无论是背或腹侧,无质量明显差异。如这里所示,胚胎在浸没滤纸三明治是显微干预访问,等形态发生浸泡珠的应用程序。未来的应用包括实时荧光成像,显微注射和电穿孔和基因沉默马nipulate和腹侧(如早期的心脏和体节形成)和背侧( 例如,在原肠胚后期,神经管闭合和早期大脑)发育过程中研究了各种形态的事件。如果包含滤纸夹持培养皿被替换为灌注腔,使矿物油层下的培养基的交换的时间 – 依赖性药物治疗是可行的。浸没滤纸三明治将开发结合其全部潜力的成像与基于激光的成像(包括光片镜)和浸泡的目标。
与浸没滤纸三明治的制备一些困难将在下面的段落来解决。虽然它仅需要的训练适量从蛋黄转移胚胎成滤纸三明治,几个步骤仍可显著影响在培养的胚胎的质量。之前滤纸载体放置在蛋黄,围绕胚胎卵黄膜应从任何厚蛋白被释放。只有这样,滤纸和卵黄膜之间的连接是强大到足以承受PC-盐水洗涤。携带胚胎应越过液体/空气界面尽可能小的滤纸以最小化在膜上的张力。一旦带入PC-盐水洗涤,整个滤纸承运人必须完全保持在任何时候都淹没了。在PC-盐水浴中的时间必须限制在约30 – 60秒,如卵黄膜将开始从滤纸释放。仍然,胚胎的清洁应非常彻底执行,如蛋黄残余稍后将掩盖胚胎的图。洗涤时,从移液管流从来没有直接点到胚胎,但总是从其径向离开。从PC-盐水取出胚胎后,确保横握滤纸,以尽量减少紧张的胚胎膜。然后,稳定与第二滤纸载体的胚胎。一旦第二滤纸载体放置,避免产生任何横向张力,这可能会改变相对于彼此的滤纸载体和撕裂胚胎膜。当滤纸三明治被带入培养基,也应该越过空气/液体界面只有一次,以尽量减少在膜上的张力。第二对用于稳定从顶部滤纸夹层不锈钢环的应非常缓慢放置并没有任何压力,以最大限度地减少了胚胎膜的压缩。胚胎的面积opaca的小破裂培养的第一个小时期间通常愈合,但受损的胚胎可以并且应该总是由新的样本替换的培养基的顶部吸油层之前。
要像一个完整的胚胎或高分辨率定时短片多个样本,麦克风roscope必须配备一个摩托化的xy阶段,通过在显微镜软件控制。它是至关重要的,以与一最小速度在xy阶段移动,以避免在培养基中和油中的胚胎和紊流,这将降低图像质量的损害。用于采集这里介绍的时间推移的电影,机动化的xy级大约1.75毫米/秒的速度移动。在未来,成像可以进一步由第一移动台到所需位置和短间歇周期之后获取图像让振动和湍流消逝改善。
作为限制,如果使用没有浸没目标直立显微镜潜在用户应该知道必要的相对长的工作距离(约1厘米)对于该培养方法。这个工作距离的结果从介质层和矿物油的对胚胎的顶部。在6cm培养皿中,油层具有thicknes约1秒 – 1.5毫米,和胚胎浸没约4mm深的培养基中。根据物镜的直径,6cm培养皿中的上缘也可以限制进入胚胎。这可以通过使用一个更大的盘被规避。
从顶部的工作距离可通过最小化液体层的厚度会稍微减少。另外,从下面的工作距离可通过使胚胎进一步下降到培养皿的底部,并降低了加热烧杯的玻璃窗的厚度被最小化。虽然该协议进行了优化,以正直的长工作距离变倍显微镜的工作,它可以被安装到一个倒置显微镜,以及。未来用户应记住,在培养液中浸没胚胎太深可能导致O 2 -diffusion问题,尽管初步的实验表明,有限的扩散似乎并没有成为一个概率LEM,只要胚胎被充分大型贮存培养基并夹在滤纸包围未被按压到培养皿的底部。
另一个限制是在温度控制。通过调整控制器的温度下加热的烧杯至40℃,在培养基中的温度平衡到当介质覆盖有矿物油的胚胎周围37.5℃。这表明,一些能量被烧杯中,其中,在加热元件和温度传感器都位于底部,和胚胎的位置之间丢失。温度控制可以通过重新定位传感器和重新分配的加热元件被优化。
The authors have nothing to disclose.
作者承认从ZonMW-VICI资助918.11.635(荷兰)的资金支持。笔者想感谢阿姆斯特丹自由大学的工具店的实际建议和制造安装组件和卡尔蔡司荷兰亚诺Voortman对显微镜有益的建议。 Marjolein Blaauboer在对手稿几易其稿批判评论一个很大的支持。
Milli-Q Reference Water Purification System | Millipore | Z00QSV0WW | |
Duran laboratory bottles, with caps, 1L | Sigma-Aldrich/Duran | Z305200-10EA | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Solution A | |||
NaCl | Merck Millipore | 1064041000 | |
KCl | Merck Millipore | 1049361000 | |
CaCl2 H2O | Merck Millipore | 1023821000 | |
MgCl2.6H2O | Merck/Sigma-Aldrich | 13152-1KG-D | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Solution B | |||
Na2HPO4.2H2O | Merck | 1065801000 | |
NaH2PO4.2H2O | Merck | 1063420250 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Whatman qualitative filter paper, Grade 595 | Sigma-Aldrich | 10311611 | |
Laser cutting machine MLS-90120-C130, CO2-laser, 130W, wavelength 10.6 µm | Micro Lasersystems | ||
Tork Extra Soft Facial Tissues | Tork | 140280 | |
Latex gloves | Sigma-Aldrich | Z645613 | |
EMDAMED | EMDA 300.131 | ||
Transfer pipettes | Sigma-Aldrich | Z350613 | |
VWR | WITG5.480.003 | ||
accu-jet pro Pipette Controller | BrandTech Scientific | 26332 | |
Serological plastic pipettes, 25mL | Sigma-Aldrich | CLS4251 | |
Plastic document sleeves | |||
Egg incubator – Incubator mod. Cip Cip 40 | Fiem | ||
Fertilized chicken eggs (Gallus gallus) | Drost BV (Loosdrecht, NL) | ||
10 cm Tissue culture dishes | Sigma-Aldrich | P5731 | |
Greiner Bio-one | 664160 | ||
6 cm Petri dishes | Sigma-Aldrich | P5481 | |
50ml Centrifuge tubes , Greiner centrifuge tubes or Cellstar tubes | Sigma-Aldrich | T2318 | |
greiner bio-one | 227261 | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Stainless steel rings, custom-made | |||
Large rings, 30 mm outer diameter, 4 mm in height, 1.5 mm wall thickness | |||
Small rings, 20 mm outer diameter, 4 mm in height, 1.5 mm wall thickness, 6.5 mm gap in the ring | |||
Nail scissors | |||
Forceps, Dumont #5, Inox | Fine Science Tools , F.S.T. | 11251-20 | |
Fine, really sharp scissors for cutting filter paper | VWR | 21-102 | |
M3516 Sigma-Aldrich Mineral Oil | Sigma-Aldrich | CAS Number 8042-47-5 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Agar bottoms for EC culture | |||
Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 SIGMA | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 SIGMA-ALDRICH | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Microbead implantation | |||
Polybead Sampler Kit III (45 µm beads were used) | Polysciences, Inc. | 16905-1 | |
Accupuncture needles: type J, No.02, 0.12x30mm | SEIRIN | type J, No.02, 0.12x30mm | |
PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Temperature controlled beaker | |||
RTD Temperature Sensor with M4 Threaded Housing RTD-850M | Omega | RTD-850M | |
Hermetically Sealed RTD Sensors HSRTD-3-100-A-3M | Omega | HSRTD-3-100-A-1M | |
Thermistor and RTD Extension Wire EXTT-3CU-26S-50 | Omega | EXTT-3CU-26S-50 | |
3-Pin Mini Connectors for Thermocouples, 3-Wire RTD's and Thermistors MTP-U-M | Omega | MTP-U-M | |
Kapton (Polyimide Film) Insulated Flexible Heaters KHLV-103/(10)-P | Omega | KHLV-103/(10)-P | |
Temperature/Process Controller CNi16D24-C4EIT-DC | Omega | CNi16D24-C4EIT-DC | |
Custom-made aluminium beaker, isolated with polyacetal (drawings see sheet 2) | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Microscope setup | |||
Axio Zoom.V16 with ApoTome.2 ZEN | Carl Zeiss AG | 495010-0009-000 | |
Objective PlanNeoFluar Z 1.0x/0.25 FWD 56mm | Carl Zeiss AG | 435281-9100-000 | |
Manual Rotary Control MARC | Carl Zeiss AG | 435604-0000-000 | |
Transillumination top 450 mot | Carl Zeiss AG | 435500-9000-000 | |
Motorized measuring stage S 150×100 mot; CAN (D) | Carl Zeiss AG | 435465-9020-000 | |
Insert plate S, glass 237x157x3mm (D) | Carl Zeiss AG | 435465-9053-000 | |
Controller EMS 3 | Carl Zeiss AG | 435610-9010-000 | |
System Control Panel SYCOP 3 | Carl Zeiss AG | 435611-9010-000 | |
Hamamatsu ORCA Flash 4.0 camera | Hamamatsu | C11440-22CU | |
Microscopy High-End Workstation Xeon Quad-Core mulitlingual | Carl Zeiss AG | 490004-0025-000 | |
Language Package Windows 7 x64 Ultimate English US | Carl Zeiss AG | 410373-0200-000 | |
LCD TFT Monitor HP ZR2440w 24" | Carl Zeiss AG | 410350-2403-000 | not available anymore |
ZEN pro 2012 Hardware License key | Carl Zeiss AG | 410135-1002-120 | not available anymore |
ZEN Software Driver Hamamatsu Cameras Hardware License Key | Carl Zeiss AG | 410136-1045-110 | |
ZEN module Z Stack | Carl Zeiss AG | 410136-0030-110 | |
ZEN Module Tiles/ Positions | Carl Zeiss AG | 410136-1025-110 | |
ZEN Module Time Lapse | Carl Zeiss AG | 410136-1031-110 | |
ZEN Module Experiment Designer | Carl Zeiss AG | 410136-1022-110 | |
ZEN Desk 2012 Hardware License Key | Carl Zeiss AG | 410135-1004-120 | not available anymore |