Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for time-lapse imaging using transmitted light and fluorescence microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique1 that allows for the culturing of chick embryos fully-submerged in a liquid culture medium.
På grund af dets tilgængelighed, lave omkostninger, flad geometri, og gennemsigtighed, ex ovo chick embryo er blevet en vigtig hvirveldyr model for studiet af morfogenetiske begivenheder, såsom gastrulation 2, neurulation 3 – 5, somitogenesis 6, hjerte bøjning 7, 8, og hjerne formation 9 – 13, under tidlig embryogenese. Nøglen til at forstå morfogenetiske processer er at følge dem dynamisk ved time-lapse billeddannelse. Købet af time-lapse film af chick embryogenese ex ovo har været begrænset til enten korte tidsvinduer eller til behovet for en inkubator for at styre temperatur og fugtighed omkring embryo 14. Her præsenteres en ny teknik til kultur kyllingefostre ex ovo til høj opløsning time-lapse billeddannelse ved hjælp transmitteret lysmikroskopi. Den neddykkede filtrerpapir sandwich er en variant af den veletablerede filterpapir carrier technique (EF-kultur) 1 og tillader dyrkning af kyllingefostre uden behov for et klimakammer. Embryoet er klemt inde mellem to identiske filtrerpapir bærere og holdes fuldt neddykket i en enkel, temperaturstyret medium dækket af et lag af let mineralolie. Begyndende fra primitivstriberne etape (Hamburger-Hamilton etape 5, HH5) 15 op til mindst den 28-somit trin (HH16) 15, kan embryoner dyrkes med enten deres bug- eller dorsale side op. Dette giver mulighed for erhvervelse af time-lapse film, der dækker omkring 30 timers af fosterudviklingen. Repræsentative time-lapse rammer og film vises. Embryoner sammenlignes morfologisk til et embryo dyrket i standard EF-kultur.
Den undersøiske filtrerpapir sandwich giver et stabilt miljø at studere tidlig dorsale og ventrale morfogenetiske processer. Det giver også mulighed for levende fluorescensafbildning og micromanipulations, såsom mikrokirurgi, bead implantation, mikroinjektion, gendæmpning og elektroporation, og har et stort potentiale til at blive kombineret med nedsænkning mål for laser-baserede imaging (herunder lys ark mikroskopi).
Embryogenese har fascineret mennesket siden begyndelsen af historien. Hvordan strukturen og morfologi af et embryo udvikle sig i sådan en veldefineret tidsmæssige og rumlige måde? Den chick embryo er blevet en af de klassiske hvirveldyr modeller for embryogenese af flere grunde: Det er let tilgængelige, billige, gennemsigtige i sin vorden, og tilgængelige for eksperimentelle manipulationer, som det udvikler sig uden moderen. Desuden har den en næsten flad geometri i den tidlige morfogenetiske begivenheder, såsom hjerte og hjerne dannelse, gastrulation, neurulation, og somitogenesis 15.
Morfogenetiske processer kan forstås bedst, hvis de er undersøgt dynamisk, såsom gennem opkøb af time-lapse billeder. Den chick embryo kan visualiseres i ovo 16, men med dårlig tilgængelighed til forsøg manipulationer og begrænset synlighed for transmission lysmikroskopi billeddannelse. Derfor several teknikker er blevet foreslået til kultur chick embryoner ex ovo, enten i hele æggeblomme dyrkningssystemer 13,17 – 19 eller som eksplantatkulturer 1,20 – 23. I hele blommen dyrkningssystemer, embryonet forbliver på toppen af den intakte blomme, og hele indholdet af ægget overføres til en anden beholder til inkubation. Denne beholder kan være et surrogat æg shell 17, en petriskål 19, eller en hængekøje fremstillet af plast plastfilm 13,18. Embryoner i hele æggeblomme kulturer kan ideelt set dyrkes indtil klækning og er tilgængelige for micromanipulations. Disse teknikker er særligt nyttige til at studere udviklingen af embryoner efter indledningen af blodcirkulationen (hvilket øger kontrasten), mens de yngre fostre forbliver svært at visualisere. Disse tidlige embryoer kan afbildes bedst, hvis de udskæres fra blommen og dyrkes som in vitro eksplantater. Eksplantaterne er let tilgængelige for eksperimental manipulationer og kræver mindre plads til dyrkning. I mange år, en teknik udviklet af Denis Nyt i 1955, og dens variationer var de gyldne standarder for eksplantatpartikler dyrkningsmetoder til chick embryoner, hvorved embryoet tilgængeligt for time-lapse mikroskopi og mikrokirurgiske indgreb 20,21. Trods sin store succes, New teknik er relativt krævende og tidskrævende. Blastoderm løsriver ofte når vitellinmembranen, der bærer blastoderm, strækkes omkring et glas ring for at opnå den rette spænding 1. Desuden kan embryoet kun dyrkes med sin ventrale side op. EF (Early Chick) kultur, en nyere teknik udviklet af Chapman og Collignon 1, omgår strækning af vitellinmembranen ved anvendelse af et filtrerpapir bærer med en central åbning. Filtrerpapiret tillægger vitellinmembranen, dermed sin naturlige spænding vedligeholde, og omgiver fosteret som en billedramme 1.Embryoner dyrkes derefter på en agar-æggehvidestof bund, normalt med deres ventrale side op. Dyrkning dorsale side op synes kun muligt for embryoner på HH8 15 og ældre. Mange grupper har tilpasset filtrerpapiret luftfartsselskab til deres behov, såsom ved at erstatte den agar-æggehvide bunden med en støtte lavet af kirurgisk sutur fibre 24 eller en kollagen coatet membran 25. Ofte er embryoner dyrket med New teknik eller med EF kultur eksponeret, med deres dorsale eller ventrale overflade til luft for at lette iltdiffusion 1,20. Disse eksplantatkulturer skal opbevares i en fugtig atmosfære for at undgå fordampning af medium og forhindre embryo tørrer ud. Dette opnås ved at inkubere skål med eksplantatet kultur i et større petriskål indeholdende fugtet tissuepapir 1. Købet af time-lapse billeder af disse embryoer kræver enten brug af et klima-kontrollerede inkubator omkring hele mikroskop eller et temperamentstemet-styret beholder med et opvarmet låg for at forhindre kondens i strålegangen 14. Imidlertid kan kyllingefostre også udvikle ex ovo helt neddykket i dyrkningsmedium som filterpapir kulturer 25, indlagt mellem et lag svær mineralolie og æggehvide i tilpasninger af New teknik 2,21, eller som foldede blastoderm eksplantater i "Cornish Pasty Culture "23,26, uden direkte kontakt med luften.
Den neddykkede filtrerpapir sandwich er en ny variant af filtrerpapiret carrier teknik. Ved at kombinere tidligere viden om dyrkning kyllingefostre ex ovo, det gør klimastyret inkubator og det opvarmede låg undværes. Embryoet er klemt inde mellem to identiske (laserskåret) filtrerpapir bærere 24 og dyrket fuldt nedsænket i en enkel dyrkningsmedium (Pannett-Compton saltvand 27,28 og tynde æggehvide i en 3: 2-forhold) i et temperaturstyret indeholdeis. Et lag af let mineralolie flyder oven på mediet forhindrer fordampning 2,21 og minimerer varmetab til omgivelserne. Bunden af beholderen har et glas vindue, og hele opsætningen udføres på en opretstående lang arbejdsafstand zoom mikroskop. Denne opsætning giver mulighed for erhvervelse af høj opløsning lysfelt og Darkfield time-lapse film på omkring 30 timer af embryonale udvikling, lige fra den tidlige primitivstriberne fase til den 28 somit fase (svarende til Hamburger Hamilton iscenesætter 5-16, HH5-16 ) 15. Embryoner kan dyrkes lige godt med deres ventrale eller dorsale side op. Derfor embryoner er tilgængelige for observation og manipulation af ventrale (f.eks tidlig hjerte 7,8 og somitogenesis 6) og dorsal (fx sen gastrulation 2, neuralrøret lukning 3 – 5, og tidlig hjerne 9-13) udvikling. Den neddykkede filtrerpapir sandwich provides en enkel og stabilt klima for mikrokirurgi, perle implantation, mikroinjektion, gendæmpning, og elektroporation studier. Dens imaging potentiale kan skubbes meget længere ved hjælp af laser-baserede imaging (herunder lys ark mikroskopi) og nedsænkning mål.
Som en ny variant af den veletablerede EF-kultur 1, den undersøiske filtrerpapir sandwich fremmer tilegnelsen af langsigtede lysfelt og mørkefelt time-lapse film af den tidlige chick embryo ex ovo ved at lave en temperatur- og luftfugtighed-kontrollerede inkubator rundt mikroskopet undværes. Snarere end at være dyrket på et halvfast agar-æggehvidestof bund, er embryonerne holdt fuldt neddykket i en enkel dyrkningsmedium bestående af PC-saltvand og tynde æggehvide. Inddampning og varmetab minimeres af et lag af mineralsk olie flydende på toppen af dyrkningsmediet. Embryoner kan dyrkes let, enten dorsale eller ventrale side op, uden synlige forskelle i kvalitet. Som vist her, embryoner i den neddykkede filtrerpapir sandwich er tilgængelige for mikrokirurgiske indgreb, ligesom anvendelsen af morfogen-gennemblødt perler. Fremtidige applikationer omfatter levende fluorescens billeddannelse, mikroinjektioner og elektroporation og gendæmpning til manipulate og studere en bred vifte af morfogenetiske hændelser under ventrale (fx tidlig hjerte og somitogenesis) og dorsal (fx sen gastrulation, neuralrøret lukning, og tidlig hjernen) udvikling. En tidsafhængig lægemiddelbehandling er mulig, hvis petriskålen indeholdende filtrerpapiret sandwich er erstattet med en perfusion kammer, hvilket tillader udvekslingen af dyrkningsmediet under mineralolie lag. Den undersøiske filtrerpapir sandwich vil udvikle sit fulde billedbehandling potentiale i kombination med laser-baserede imaging (herunder lys ark mikroskopi) og nedsænkning mål.
Nogle problemer med udarbejdelsen af den neddykkede filtrerpapir sandwich vil blive behandlet i de følgende afsnit. Selvom det kræver kun en moderat mængde træning til at overføre et embryon fra blommen i filtrerpapiret sandwich, kan flere trin stadig betydeligt påvirke kvaliteten af embryoet i kultur. Før filterpapiret bærer eranbringes på blommen, bør vitellinmembranen omkring embryo blive befriet fra eventuelle tykke æggehvide. Først da vil forbindelsen mellem filterpapiret og vitellinmembranen være stærk nok til at modstå vask i PC-saltvand. Filterpapiret bærer embryo skal krydse væske / luft-grænsefladen så lidt som muligt for at minimere spændingen på membranerne. Når bragt ind i PC-saltvand til vask, skal hele filterpapir bærer forblive fuldstændig neddykket på alle tidspunkter. Tiden i PC-saltvand bad skal være begrænset til omkring 30 – 60 sek, som vitellinmembranen vil begynde at frigive fra filtrerpapiret. Alligevel bør rengøring af embryo udføres meget grundigt, da æggeblomme resterne senere vil forstyrre udsynet af embryoet. Under vask, aldrig peger strømmen fra overførselspipetten direkte på embryoet, men altid radialt væk fra det. Efter fjernelse af embryo fra PC-saltvand, skal du sørge for at holde filtrerpapiret vandret for at minimerespænding på de embryonale membraner. Derefter stabilisere embryo med det andet filter papir bærer. Når den anden filterpapir bærer er placeret, undgå at skabe lateral spænding, som kunne forskyde filtrerpapiret bærere i forhold til hinanden og rive embryonale membraner. Når filtrerpapir sandwich bringes i dyrkningsmediet, bør det også krydse luft / væske-grænsefladen én gang for at minimere spændingen på membranerne. Det andet par af ringe af rustfrit stål anvendes til stabilisering filtrerpapiret sandwich fra toppen skal placeres meget langsomt og uden pres for at minimere komprimering af embryonale membraner. Små bristninger i området opaca af embryoet sædvanligvis heler i den første time af kultur, men en beskadiget embryo kan og bør altid erstattes af en ny prøve før olielaget pipetteres ovenpå dyrkningsmediet.
Til billedet et helt embryo eller flere prøver til høj opløsning time-lapse film, mikrofonenroscope skal være udstyret med et motoriseret XY-scene, der kontrolleres af mikroskopet software. Det er af afgørende betydning at have xy-scenen farten med en minimal hastighed for at undgå skader på fostre og uro på dyrkningsmediet og olien, der vil falde billedkvaliteten. Ved køb af time-lapse film præsenteres her, den motoriserede xy-scenen flyttet med en hastighed på ca. 1,75 mm / sek. I fremtiden kunne imaging forbedres yderligere ved først at flytte scenen til den ønskede position og erhverve billedet efter en kort hvileperiode for at lade vibrationer og turbulenser blegne.
Som en begrænsning, bør potentielle brugere være opmærksomme på den relativt lange afstand (ca. 1 cm) er nødvendige til denne kultur metode, hvis der anvendes en opretstående mikroskop uden immersionsobjektiver. Denne arbejdsgruppe afstand resultater fra det lag af mellemstore og mineralsk olie på toppen af embryoet. I 6 cm petriskål, olielaget har en thickness på ca. 1 – 1,5 mm, og embryoet er nedsænket ca. 4 mm dybt i dyrkningsmediet. Afhængigt af diameteren af det formål, kunne den øvre kant af den 6 cm petriskål også begrænse adgangen til embryoet. Dette kunne omgås ved anvendelse af en større skål.
Arbejdsmiljøet afstanden fra toppen kunne blive reduceret en smule ved at minimere tykkelsen af de flydende lag. Desuden kunne den arbejdsafstand nedefra minimeres ved at bringe embryo længere ned til bunden af petriskålen og reducere tykkelsen af glasset vindue af den opvarmede bægerglas. Mens protokollen blev optimeret til at virke med en opretstående lang arbejdsafstand zoom mikroskop, kunne det være forsynet med et inverteret mikroskop samt. Fremtidige brugere bør huske på, at nedsænke foster for dybt i dyrkningsmediet kan føre til O 2 -diffusion problemer, selvom indledende forsøg tyder på, at begrænset diffusion ikke synes at være en sandsynlighedlem, så længe embryoet er omgivet af en tilstrækkeligt-stort reservoir af dyrkningsmedium og filtrerpapiret klemt ikke trykkes til bunden af petriskålen.
En anden begrænsning er den temperatur kontrol. Ved at justere temperaturen af styreenhed til den opvarmede bægerglas til 40 ° C, temperaturen i mediet i ligevægt til 37,5 ° C omkring embryonerne når mediet er dækket med mineralsk olie. Dette viser, at noget energi går tabt mellem bunden af bægerglasset, hvor varmelegemerne og temperaturføleren er placeret, og placeringen af embryonerne. kontrol Temperaturen kan optimeres ved at flytte sensoren og omfordele varmelegemerne.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne for finansiel støtte fra en ZonMw-VICI tilskud 918.11.635 (Holland). Forfatterne vil gerne takke værktøj shop af Vrije Universiteit Amsterdam for deres praktiske forslag og til fremstilling setup komponenter og Jarno Voortman Carl Zeiss Nederlandene for nyttige råd om mikroskopi. Marjolein Blaauboer var en stor støtte i kritisk kommentere flere udkast af manuskriptet.
Milli-Q Reference Water Purification System | Millipore | Z00QSV0WW | |
Duran laboratory bottles, with caps, 1L | Sigma-Aldrich/Duran | Z305200-10EA | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Solution A | |||
NaCl | Merck Millipore | 1064041000 | |
KCl | Merck Millipore | 1049361000 | |
CaCl2 H2O | Merck Millipore | 1023821000 | |
MgCl2.6H2O | Merck/Sigma-Aldrich | 13152-1KG-D | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Solution B | |||
Na2HPO4.2H2O | Merck | 1065801000 | |
NaH2PO4.2H2O | Merck | 1063420250 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Whatman qualitative filter paper, Grade 595 | Sigma-Aldrich | 10311611 | |
Laser cutting machine MLS-90120-C130, CO2-laser, 130W, wavelength 10.6 µm | Micro Lasersystems | ||
Tork Extra Soft Facial Tissues | Tork | 140280 | |
Latex gloves | Sigma-Aldrich | Z645613 | |
EMDAMED | EMDA 300.131 | ||
Transfer pipettes | Sigma-Aldrich | Z350613 | |
VWR | WITG5.480.003 | ||
accu-jet pro Pipette Controller | BrandTech Scientific | 26332 | |
Serological plastic pipettes, 25mL | Sigma-Aldrich | CLS4251 | |
Plastic document sleeves | |||
Egg incubator – Incubator mod. Cip Cip 40 | Fiem | ||
Fertilized chicken eggs (Gallus gallus) | Drost BV (Loosdrecht, NL) | ||
10 cm Tissue culture dishes | Sigma-Aldrich | P5731 | |
Greiner Bio-one | 664160 | ||
6 cm Petri dishes | Sigma-Aldrich | P5481 | |
50ml Centrifuge tubes , Greiner centrifuge tubes or Cellstar tubes | Sigma-Aldrich | T2318 | |
greiner bio-one | 227261 | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Stainless steel rings, custom-made | |||
Large rings, 30 mm outer diameter, 4 mm in height, 1.5 mm wall thickness | |||
Small rings, 20 mm outer diameter, 4 mm in height, 1.5 mm wall thickness, 6.5 mm gap in the ring | |||
Nail scissors | |||
Forceps, Dumont #5, Inox | Fine Science Tools , F.S.T. | 11251-20 | |
Fine, really sharp scissors for cutting filter paper | VWR | 21-102 | |
M3516 Sigma-Aldrich Mineral Oil | Sigma-Aldrich | CAS Number 8042-47-5 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Agar bottoms for EC culture | |||
Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 SIGMA | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 SIGMA-ALDRICH | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Microbead implantation | |||
Polybead Sampler Kit III (45 µm beads were used) | Polysciences, Inc. | 16905-1 | |
Accupuncture needles: type J, No.02, 0.12x30mm | SEIRIN | type J, No.02, 0.12x30mm | |
PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Temperature controlled beaker | |||
RTD Temperature Sensor with M4 Threaded Housing RTD-850M | Omega | RTD-850M | |
Hermetically Sealed RTD Sensors HSRTD-3-100-A-3M | Omega | HSRTD-3-100-A-1M | |
Thermistor and RTD Extension Wire EXTT-3CU-26S-50 | Omega | EXTT-3CU-26S-50 | |
3-Pin Mini Connectors for Thermocouples, 3-Wire RTD's and Thermistors MTP-U-M | Omega | MTP-U-M | |
Kapton (Polyimide Film) Insulated Flexible Heaters KHLV-103/(10)-P | Omega | KHLV-103/(10)-P | |
Temperature/Process Controller CNi16D24-C4EIT-DC | Omega | CNi16D24-C4EIT-DC | |
Custom-made aluminium beaker, isolated with polyacetal (drawings see sheet 2) | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Microscope setup | |||
Axio Zoom.V16 with ApoTome.2 ZEN | Carl Zeiss AG | 495010-0009-000 | |
Objective PlanNeoFluar Z 1.0x/0.25 FWD 56mm | Carl Zeiss AG | 435281-9100-000 | |
Manual Rotary Control MARC | Carl Zeiss AG | 435604-0000-000 | |
Transillumination top 450 mot | Carl Zeiss AG | 435500-9000-000 | |
Motorized measuring stage S 150×100 mot; CAN (D) | Carl Zeiss AG | 435465-9020-000 | |
Insert plate S, glass 237x157x3mm (D) | Carl Zeiss AG | 435465-9053-000 | |
Controller EMS 3 | Carl Zeiss AG | 435610-9010-000 | |
System Control Panel SYCOP 3 | Carl Zeiss AG | 435611-9010-000 | |
Hamamatsu ORCA Flash 4.0 camera | Hamamatsu | C11440-22CU | |
Microscopy High-End Workstation Xeon Quad-Core mulitlingual | Carl Zeiss AG | 490004-0025-000 | |
Language Package Windows 7 x64 Ultimate English US | Carl Zeiss AG | 410373-0200-000 | |
LCD TFT Monitor HP ZR2440w 24" | Carl Zeiss AG | 410350-2403-000 | not available anymore |
ZEN pro 2012 Hardware License key | Carl Zeiss AG | 410135-1002-120 | not available anymore |
ZEN Software Driver Hamamatsu Cameras Hardware License Key | Carl Zeiss AG | 410136-1045-110 | |
ZEN module Z Stack | Carl Zeiss AG | 410136-0030-110 | |
ZEN Module Tiles/ Positions | Carl Zeiss AG | 410136-1025-110 | |
ZEN Module Time Lapse | Carl Zeiss AG | 410136-1031-110 | |
ZEN Module Experiment Designer | Carl Zeiss AG | 410136-1022-110 | |
ZEN Desk 2012 Hardware License Key | Carl Zeiss AG | 410135-1004-120 | not available anymore |