Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for time-lapse imaging using transmitted light and fluorescence microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique1 that allows for the culturing of chick embryos fully-submerged in a liquid culture medium.
På grund av sin tillgänglighet, låg kostnad, platt geometri, och transparens, ex ovo kycklingembryo har blivit en stor ryggradsdjur modell för studier av morfogenetiska händelser, såsom gastrulation 2, neurulation 3-5, somitogenesis 6, hjärta bock 7, 8 och hjärna bildning 9-13, under tidig embryogenes. Nyckeln till att förstå morfogenetiska processer är att följa dem dynamiskt av time-lapse avbildning. Förvärvet av tidsförlopp filmer av chick embryo ex ovo har begränsats antingen korta tidsfönster eller behovet av en inkubator för att styra temperatur och fuktighet runt embryot 14. Här presenterar vi en ny teknik för att kultur kycklingembryon ex ovo för högupplöst time-lapse avbildning genomfallande ljusmikroskop. Nedsänkt filterpapper sandwich är en variant av den väletablerade filterpapper bärare teknique (EG-kultur) 1 och medger odling av kycklingembryon utan behov av en klimatkammare. Embryot är inklämd mellan två identiska filterpappersbärare och hålls helt nedsänkt i en enkel, temperaturstyrd mediet som täcks av ett skikt av lätt mineralolja. Med utgångspunkt från primitivstrimman stadiet (Hamburger-Hamilton steget 5, HH5) 15 upp till åtminstone 28-somit stadium (HH16) 15, kan embryon odlas med antingen deras ventrala eller ryggsidan uppåt. Detta möjliggör förvärv av tidsförlopp filmer som omfattar cirka 30 timmar av embryonal utveckling. Representativa time-lapse ramar och filmer visas. Embryon jämförs morfologiskt till ett embryo odlas i standard EG-kultur.
Nedsänkt filterpapper sandwich ger en stabil miljö för att studera tidig dorsala och ventrala morfogenetiska processer. Det möjliggör också för levande fluorescens avbildning och micromanipulations, såsom mikro, pärla implantation, mikroinjektion, geners uttryck, och elektroporering, och har en stor potential att kombineras med dopp mål för laserbaserad avbildning (inklusive ljus ark mikroskopi).
Embryogenes har fascinerat människan sedan början av historien. Hur ser strukturen och morfologin hos ett embryo utvecklas på ett sådant väldefinierad tids- och rums sätt? Kycklingembryo har blivit en av de klassiska ryggradsdjur djurmodeller för embryogenes av flera skäl: Det är lätt tillgänglig, billig, transparent i sin linda, och tillgängligt för experimentella manipulationer, eftersom den utvecklas utanför modern. Dessutom har det en nästan platt geometri under tidiga morfogenetiska händelser, såsom hjärta och hjärna bildning, gastrulation, neurulation och somitogenesis 15.
Morfogenetiska processer kan förstås bäst om de studeras dynamiskt, till exempel genom förvärv av tidsförlopp bilder. Kycklingembryo kan visualiseras i ovo 16 men med dålig tillgänglighet för experimentella manipulationer och begränsad sikt för överföring ljusmikroskop avbildning. Därför avskiljaal tekniker har föreslagits till kultur kycklingembryon ex ovo, antingen i hela gulan odlingssystem 13,17 – 19 eller som Explantation kulturer 1,20 – 23. I hela äggula odlingssystem förblir embryot på toppen av den intakta äggula och hela innehållet i ägget överförs till en annan behållare för inkubation. Denna behållare kan vara ett surrogat äggskal 17, en petriskål 19, eller en hängmatta av plast klänga wrap 13,18. Embryon i hela äggula kulturer kan idealt odlas tills kläckning och är tillgängliga för micromanipulations. Dessa tekniker är särskilt användbara för att studera utvecklingen av embryon efter initieringen av blodcirkulationen (vilket ökar kontrasten), medan yngre embryon förblir svåra att visualisera. Dessa tidiga embryon kan avbildas bäst om de skärs ut från gulan och odlades som in vitro explantaten. Explantaten är lättillgängliga för experimental manipulationer och kräver mindre utrymme för odling. Under många år, en teknik uppfunnen av Denis Nytt i 1955 och dess variationer var gyllene standarder för Explantation odlingsmetoder för kycklingembryon, vilket gör embryot tillgänglig för time-lapse mikroskopi och mikro insatser 20,21. Trots sin stora framgång, är New teknik relativt krävande och tidskrävande. Den BLASTODERM ofta lossnar när vitellinmembranet, bärande den BLASTODERM, sträcks runt en glasring för att uppnå den rätta spänningen 1. Dessutom kan embryot endast odlas med dess ventrala sida upp. EG (Early Chick) kultur, en teknik senare utvecklats av Chapman och Collignon 1, kringgår den sträckning av vitellinmembranet genom användning av ett filterpappersbärare med en central öppning. Filterpapper fäster vitellinmembranet, och därigenom bibehålla dess naturliga spänning, och omger embryot som en tavelram en.Embryon odlas därefter på ett agar-äggvita botten, vanligen med sin ventrala sidan uppåt. Odling ryggsidan uppåt verkar bara möjligt för embryon vid HH8 15 och äldre. Många grupper har anpassat filterpapper bäraren till deras behov, till exempel genom att ersätta den agar-albumin botten med ett stöd gjord av kirurgiska sutur fibrer 24 eller en kollagenbelagd membran 25. Ofta är embryon odlade med nya teknik eller med EG-kulturen utsätts, med sin rygg eller ventrala yta för luft för att underlätta syrediffusion 1,20. Dessa Explantation kulturer måste hållas i en fuktig atmosfär för att undvika avdunstning av mediet och för att förhindra att embryot inte torkar ut. Detta uppnås genom att inkubera plattan med explantatet kultur i en större petriskål med fuktat mjukpapper 1. Förvärvet av tidsförlopp bilder av dessa embryon kräver antingen användning av en klimatkontrollerad inkubator runt hela mikroskop eller ett temperamentratur styrd behållare med en uppvärmd lock för att förhindra kondens i ljusvägen 14. Däremot kan kycklingembryon också utveckla ex ovo helt nedsänkt i odlingsmedium som filterpapper kulturer 25, inklämt mellan ett skikt av tung mineralolja och äggvita i anpassningar i New teknik 2,21, eller som vikta BLASTODERM explantat i "Cornish Pasty kultur "23,26, utan direkt kontakt med luften.
Nedsänkt filterpapper sandwich är en ny variant av filterpappersbärare teknik. Genom att kombinera tidigare kunskap om odling kycklingembryon ex ovo, det gör klimatkontrollerade inkubator och uppvärmt lock onödigt. Embryot är inklämd mellan två identiska (laserskurna) filterpappersbärare 24 och odlas helt nedsänkta i en enkel odlingsmedium (Pannett-Compton saltlösning 27,28 och tunna äggvita i en 3: 2-förhållande) i en temperaturstyrd innehållerer. Ett skikt av lätt mineralolja flyter på toppen av mediet förhindrar avdunstning 2,21 och minimerar värmeförlust till omgivningen. Den nedre delen av behållaren har ett glasfönster, och hela installationen utförs på en upprätt långa arbetsavstånd zoom mikroskop. Denna inställning gör det möjligt förvärv av högupplösta ljusfält och mörkfälts time-lapse filmer på cirka 30 timmar av embryonal utveckling, från tidig primitivstrimman stadiet till 28-somit steget (motsvarande Hamburger Hamilton steg 5-16, HH5-16 ) 15. Embryon kan odlas lika bra med sin ventrala eller ryggsidan uppåt. Därför embryon är tillgängliga för observation och manipulering av ventrala (t ex tidigt hjärta 7,8 och somitogenesis 6) och rygg (t.ex. sen gastrulation 2, neuralrörsdefekter stängning 3-5, och hjärnans tidiga 9-13) utveckling. Nedsänkt filterpapper smörgås provides en enkel och stabil miljö för mikro, pärla implantation, mikroinjektion, geners uttryck, och elektroporering studier. Dess imaging potential kan skjutas mycket längre genom att använda laserbaserad avbildning (inklusive ljus ark mikroskopi) och dopp mål.
Som en ny variant av den väletablerade EG kultur en underlättar den nedsänkta filterpapper smörgås förvärv av långsiktiga bright och mörkfält time-lapse filmer i början kycklingembryo ex ovo genom att göra en temperatur- och fuktighetskontrollerad inkubator runt mikroskopet onödigt. Snarare än att vara odlade på ett halvfast agar-äggviteämne botten, är embryona hålls helt nedsänkt i en enkel odlingsmedium bestående av PC-saltlösning och tunna äggvita. Indunstning och värmeförluster minimeras genom ett lager av mineralolja som flyter på toppen av odlingsmediet. Embryon kan odlas lätt, antingen rygg eller ventrala sidan uppåt, utan synliga skillnader i kvalitet. Som visas här, embryon i den nedsänkta filterpapper sandwich är tillgängliga för mikro insatser, liksom tillämpningen av morfogen-indränkt pärlor. Framtida tillämpningar inkluderar levande fluorescens avbildning, microinjections och elektroporering och geners uttryck till manipulate och studera ett brett spektrum av morfogenetiska händelser under ventrala (t.ex. tidigt hjärta och somitogenesis) och rygg (t.ex. sen gastrulation, neuralrörsdefekter stängning, och hjärnans tidiga) utveckling. En tidsberoende drogbehandling är möjlig om petriskålen innehållande filterpapper sandwich är ersatt med en perfusionskammaren, vilket tillåter utbyte av odlingsmediet under mineraloljeskiktet. Nedsänkt filterpapper smörgås kommer att utveckla sin fulla imaging potential i kombination med laserbaserad avbildning (inklusive ljus ark mikroskopi) och dopp mål.
Vissa svårigheter med beredningen av den nedsänkta filterpapper smörgås kommer att tas upp i följande punkter. Även om det kräver endast en måttlig mängd träning för att överföra ett embryo från gule in i filterpapper sandwich, kan flera steg fortfarande betydligt påverka kvaliteten av embryot i kultur. Innan filterpappersbäraren ärplaceras på äggulan, bör vitellinmembranet runt embryot befrias från alla tjocka äggvita. Först då kommer anslutningen mellan filterpapper och vitellinmembranet vara stark nog att stå emot tvättning i PC-saltlösning. Filterpappersbärande embryot bör korsa den vätska / luftgränssnittet så lite som möjligt för att minimera spänningen på membranen. När förs in i PC-saltlösning för tvättning, måste hela filterpapper bärare vistelse helt nedsänkt vid alla tidpunkter. Tiden i PC-saltbad måste begränsas till omkring 30-60 sek, som vitellinmembranet börjar släppa från filterpapper. Ändå bör rengöring av embryot köras mycket noggrant, eftersom äggula rester kommer senare skymma sikten av embryot. Under tvättning, aldrig peka strömmen från överföringspipetten direkt på embryot, men alltid radiellt bort från den. Efter avlägsnande av embryot från PC-saltlösning, se till att hålla filterpapper horisontellt för att minimeraspänning på de embryonala membranen. Då, stabilisera embryo med den andra filterpappersbärare. När den andra filterpappershållaren placeras, undvika att skapa någon lateral spänning, som skulle kunna förskjuta filterpappersbärare i förhållande till varandra och riva de embryonala membranen. När filterpapper sandwich bringas i odlingsmediet, bör det också korsa luft / vätskegränsytan endast en gång för att minimera spänningar på membranen. Det andra paret av ringar av rostfritt stål som används för att stabilisera filterpapper sandwich från toppen bör placeras mycket långsamt och utan något tryck för att minimera komprimering av de embryonala membranen. Små sprickor i området opaca av embryot vanligtvis läka under den första timmen av kultur, men en skadad embryo kan och bör alltid ersättas med ett nytt prov innan oljeskiktet pipetteras ovanpå odlingsmediet.
Till bilden en hel embryo eller flera prover för högupplösta time-lapse filmer, microscope måste vara utrustad med en motordriven xy-stadium, som kontrolleras av mikroskop programvara. Det är av avgörande betydelse att ha xy-scenen flytta med en minimal hastighet för att undvika skador på embryon och turbulens i odlingsmediet och oljan, som kommer att minska bildkvaliteten. För förvärvet av tidsförlopp filmer som presenteras här, flyttade motoriserade xy-scenen med en hastighet av ungefär 1,75 mm / sek. I framtiden kan avbildning förbättras ytterligare genom att först flytta scenen till önskad position och skaffa bilden efter en kort viloperiod för att låta vibrationer och turbulens blekna bort.
Som en begränsning, bör potentiella användare vara medvetna om den relativt långa arbetsavstånd (ca 1 cm) är nödvändiga för denna odlingsmetod om en upprätt mikroskop utan nedsänkning mål används. Detta arbetsavståndsresultat från skiktet av mediet och mineralolja på toppen av embryot. I 6 cm Petriskål, har oljeskiktet en tjocklekars av ungefär 1-1,5 mm, och embryot är nedsänkt ungefär 4 mm djupa i odlingsmediet. Beroende på diametern av målet, kan den övre kanten av den 6 cm petriskål även begränsa tillgången till embryot. Detta kan kringgås genom användning av en större antenn.
Arbetsavståndet från toppen skulle kunna minskas något genom att minimera tjockleken hos vätskeskikt. Dessutom kan arbetsavståndet underifrån minimeras genom att embryot längre ned till botten av petriskålen och minska tjockleken på glasfönstret hos den uppvärmda bägaren. Medan protokollet optimerad för att fungera med en upprätt långa arbetsavstånd zoom mikroskop, kan det monteras på ett inverterat mikroskop också. Framtida användare bör ha i åtanke att dränka embryot alltför djupt i odlingsmediet kan leda till O 2 -diffusion problem, även om preliminära experiment tyder på att begränsad diffusion inte verkar vara en problem, så länge som embryot är omgiven av en tillräckligt-stor reservoar av odlingsmedium och filterpapperet inklämt inte trycks till botten av petriskålen.
En annan begränsning är temperaturstyrningen. Genom att justera temperaturen hos styrenheten för den uppvärmda bägaren till 40 ° C, temperaturen i mediet i jämvikt till 37,5 ° C runt embryona när mediet är täckt med mineralolja. Detta visar att en del energi går förlorad mellan bägarens botten, där värmeelementen och temperatursensorn är belägna, och platsen för embryona. Kontrolltemperaturen kunde optimeras genom att flytta sensorn och omfördelning av värmeelementen.
The authors have nothing to disclose.
Författarna erkänner ekonomiskt stöd från en ZonMW-VICI bidrag 918.11.635 (Nederländerna). Författarna vill tacka verktygsverkstad i Vrije Universiteit Amsterdam för sina praktiska förslag och för tillverkning av installationskomponenter och Jarno Voortman av Carl Zeiss Nederländerna för användbara råd om mikroskopi. Marjolein Blaauboer var ett stort stöd i kritiskt kommentera flera utkast av manuskriptet.
Milli-Q Reference Water Purification System | Millipore | Z00QSV0WW | |
Duran laboratory bottles, with caps, 1L | Sigma-Aldrich/Duran | Z305200-10EA | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Solution A | |||
NaCl | Merck Millipore | 1064041000 | |
KCl | Merck Millipore | 1049361000 | |
CaCl2 H2O | Merck Millipore | 1023821000 | |
MgCl2.6H2O | Merck/Sigma-Aldrich | 13152-1KG-D | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Solution B | |||
Na2HPO4.2H2O | Merck | 1065801000 | |
NaH2PO4.2H2O | Merck | 1063420250 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Whatman qualitative filter paper, Grade 595 | Sigma-Aldrich | 10311611 | |
Laser cutting machine MLS-90120-C130, CO2-laser, 130W, wavelength 10.6 µm | Micro Lasersystems | ||
Tork Extra Soft Facial Tissues | Tork | 140280 | |
Latex gloves | Sigma-Aldrich | Z645613 | |
EMDAMED | EMDA 300.131 | ||
Transfer pipettes | Sigma-Aldrich | Z350613 | |
VWR | WITG5.480.003 | ||
accu-jet pro Pipette Controller | BrandTech Scientific | 26332 | |
Serological plastic pipettes, 25mL | Sigma-Aldrich | CLS4251 | |
Plastic document sleeves | |||
Egg incubator – Incubator mod. Cip Cip 40 | Fiem | ||
Fertilized chicken eggs (Gallus gallus) | Drost BV (Loosdrecht, NL) | ||
10 cm Tissue culture dishes | Sigma-Aldrich | P5731 | |
Greiner Bio-one | 664160 | ||
6 cm Petri dishes | Sigma-Aldrich | P5481 | |
50ml Centrifuge tubes , Greiner centrifuge tubes or Cellstar tubes | Sigma-Aldrich | T2318 | |
greiner bio-one | 227261 | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Stainless steel rings, custom-made | |||
Large rings, 30 mm outer diameter, 4 mm in height, 1.5 mm wall thickness | |||
Small rings, 20 mm outer diameter, 4 mm in height, 1.5 mm wall thickness, 6.5 mm gap in the ring | |||
Nail scissors | |||
Forceps, Dumont #5, Inox | Fine Science Tools , F.S.T. | 11251-20 | |
Fine, really sharp scissors for cutting filter paper | VWR | 21-102 | |
M3516 Sigma-Aldrich Mineral Oil | Sigma-Aldrich | CAS Number 8042-47-5 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Agar bottoms for EC culture | |||
Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 SIGMA | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 SIGMA-ALDRICH | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Microbead implantation | |||
Polybead Sampler Kit III (45 µm beads were used) | Polysciences, Inc. | 16905-1 | |
Accupuncture needles: type J, No.02, 0.12x30mm | SEIRIN | type J, No.02, 0.12x30mm | |
PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Temperature controlled beaker | |||
RTD Temperature Sensor with M4 Threaded Housing RTD-850M | Omega | RTD-850M | |
Hermetically Sealed RTD Sensors HSRTD-3-100-A-3M | Omega | HSRTD-3-100-A-1M | |
Thermistor and RTD Extension Wire EXTT-3CU-26S-50 | Omega | EXTT-3CU-26S-50 | |
3-Pin Mini Connectors for Thermocouples, 3-Wire RTD's and Thermistors MTP-U-M | Omega | MTP-U-M | |
Kapton (Polyimide Film) Insulated Flexible Heaters KHLV-103/(10)-P | Omega | KHLV-103/(10)-P | |
Temperature/Process Controller CNi16D24-C4EIT-DC | Omega | CNi16D24-C4EIT-DC | |
Custom-made aluminium beaker, isolated with polyacetal (drawings see sheet 2) | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Microscope setup | |||
Axio Zoom.V16 with ApoTome.2 ZEN | Carl Zeiss AG | 495010-0009-000 | |
Objective PlanNeoFluar Z 1.0x/0.25 FWD 56mm | Carl Zeiss AG | 435281-9100-000 | |
Manual Rotary Control MARC | Carl Zeiss AG | 435604-0000-000 | |
Transillumination top 450 mot | Carl Zeiss AG | 435500-9000-000 | |
Motorized measuring stage S 150×100 mot; CAN (D) | Carl Zeiss AG | 435465-9020-000 | |
Insert plate S, glass 237x157x3mm (D) | Carl Zeiss AG | 435465-9053-000 | |
Controller EMS 3 | Carl Zeiss AG | 435610-9010-000 | |
System Control Panel SYCOP 3 | Carl Zeiss AG | 435611-9010-000 | |
Hamamatsu ORCA Flash 4.0 camera | Hamamatsu | C11440-22CU | |
Microscopy High-End Workstation Xeon Quad-Core mulitlingual | Carl Zeiss AG | 490004-0025-000 | |
Language Package Windows 7 x64 Ultimate English US | Carl Zeiss AG | 410373-0200-000 | |
LCD TFT Monitor HP ZR2440w 24" | Carl Zeiss AG | 410350-2403-000 | not available anymore |
ZEN pro 2012 Hardware License key | Carl Zeiss AG | 410135-1002-120 | not available anymore |
ZEN Software Driver Hamamatsu Cameras Hardware License Key | Carl Zeiss AG | 410136-1045-110 | |
ZEN module Z Stack | Carl Zeiss AG | 410136-0030-110 | |
ZEN Module Tiles/ Positions | Carl Zeiss AG | 410136-1025-110 | |
ZEN Module Time Lapse | Carl Zeiss AG | 410136-1031-110 | |
ZEN Module Experiment Designer | Carl Zeiss AG | 410136-1022-110 | |
ZEN Desk 2012 Hardware License Key | Carl Zeiss AG | 410135-1004-120 | not available anymore |