Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for time-lapse imaging using transmitted light and fluorescence microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique1 that allows for the culturing of chick embryos fully-submerged in a liquid culture medium.
På grunn av sin tilgjengelighet, lave kostnader, flat geometri, og åpenhet, ex ovo kylling embryo har blitt en stor virveldyr dyremodell for studiet av morfogenetiske hendelser, for eksempel gastrulation 2, neurulation 3-5, somitogenesen 6, hjerte bøying 7, 8, og hjerne formasjon 9-13, i løpet av tidlig embryogenese. Nøkkelen til å forstå morfogenetiske prosesser er å følge dem dynamisk av time-lapse imaging. Oppkjøpet av tids-lapse filmer av dama embryogenese ex ovo har vært begrenset til enten å korte tidsvinduer eller til behovet for en kuvøse for å kontrollere temperaturen og luftfuktigheten rundt embryoet 14. Her presenterer vi en ny teknikk for å kultur kyllingfostre ex ovo for høy oppløsning time-lapse avbildning ved hjelp overført lys mikroskopi. Det nedsenkede filter papir sandwich er en variant av den veletablerte filter papir carrier technik (EC-kultur) 1 og gir mulighet for dyrkning av kyllingfoster uten behov for et klimakammer. Embryoet er klemt mellom to identiske filterpapirbærer og holdes helt nedsenket i en enkel, temperaturregulert medium dekket av et lag av lett mineralolje. Med start fra den primitive strek trinn (Hamburger-Hamilton trinnet 5, HH5) 15 opp til minst den 28-somitt trinn (HH16) 15, kan embryoene bli dyrket med enten deres baksiden eller ryggsiden opp. Dette gjør at oppkjøpet av tids-lapse filmer som dekker ca 30 timer av embryonal utvikling. Representative time-lapse rammer og filmer vises. Embryoer er sammenlignet morfologisk til et embryo dyrket i standard EC-kultur.
Det nedsenkede filter papir smørbrød gir et stabilt miljø for å studere tidlig rygg og ventral morfogenetiske prosesser. Den gjør det også for live fluorescens bildebehandling og micromanipulations, slik som mikrokirurgi, perle implantation, mikroinjeksjon, gene silencing, og elektroporering, og har et stort potensial til å bli kombinert med nedsenking mål for laserbaserte imaging (inkludert lys-ark mikroskopi).
Embryogenese har fascinert mennesket siden begynnelsen av historien. Hvordan struktur og morfologi av et foster utvikler seg i en slik veldefinert temporal og romlig måte? Den kyllingembryo har blitt en av de klassiske virveldyr dyremodeller for embryogenese av flere grunner: Det er lett tilgjengelig, billig, gjennomsiktig i en tidlig fase, og tilgjengelig for eksperimentelle manipulasjoner, som det utvikler seg utenfor moren. Dessuten har den en nesten flat geometri under tidlig morfogenetiske hendelser, slik som hjerte og hjerne formasjon, gastrulation, neurulation, og somitogenesen 15.
Morfogenetiske prosesser kan forstås best hvis de er studert dynamisk, for eksempel gjennom oppkjøpet av tids-lapse bilder. Den dama embryo kan visualiseres i ovo 16, men med dårlig tilgjengelighet for eksperimentelle manipulasjoner og begrenset sikt for overføring lysmikroskopi bildebehandling. Derfor several teknikker har blitt foreslått til kultur kyllingfoster ex ovo, enten i hele plomme kultursystemer 13,17 – 19, eller som eksplantering kulturer 1,20 – 23. I hel eggeplomme kultursystemer, forblir embryo på toppen av det intakte eggeplomme, og hele innholdet i egget blir overført til en annen beholder for inkubasjon. Denne beholderen kan være et surrogat egg skall 17, en petriskål 19, eller en hengekøye laget av plast seg vikle 13,18. Embryoer i hele plomme kulturer kan ideelt sett være kultivert til klekking og er tilgjengelig for micromanipulations. Disse teknikkene er spesielt nyttige for å studere utviklingen av embryoer etter initiering av blodsirkulasjon (som øker kontrasten), mens yngre embryoer forblir vanskelig å visualisere. Disse tidlige embryoer kan avbildes best hvis de er fjernet fra plommen og kultivert som in vitro explants. Eksplantatene er lett tilgjengelig for eksperimental manipulasjoner og krever mindre plass for dyrking. For mange år, en teknikk utviklet av Denis nytt i 1955 og dens varianter var de gylne standarder for eksplantering kultur metoder for kyllingfostre, og dermed gjøre embryo tilgjengelig for time-lapse mikroskopi og mikrokirurgisk inngrep 20,21. Til tross for sin store suksess, er New teknikk relativt krevende og tidkrevende. Den blastoderm løsner ofte når vitelline membran, bærer blastoderm, er strukket rundt en glassring for å oppnå riktig spenning en. Dessuten kan embryoet bare dyrkes med sin ventrale side opp. EC (Early Chick) kultur, en nyere teknikk utviklet av Chapman og Collignon 1, omgår strekking av vitelline membranen ved hjelp av en filterpapirbærer med en sentral åpning. Filterpapiret festes til vitelline membranen, og dermed opprettholde sin naturlige strekk, og omgir embryoet som en bilderamme 1.Embryoet blir deretter dyrket på en agar-albumen bunn, vanligvis med sin ventral siden opp. Dyrking dorsal side opp virker bare mulig for embryoer på HH8 15 og eldre. Mange grupper har tilpasset filterpapirbæreren til deres behov, for eksempel ved å erstatte den agar-eggehvitestoff bunn med en støtte laget av kirurgisk sutur fibre 24 eller en kollagenbelagt membran 25. Ofte er embryoer dyrket med New teknikk eller med EC kultur utsatt, med sin dorsal eller ventral overflaten til luft for å lette oksygen diffusjon 1,20. Disse eksplantering kulturer må holdes i en fuktig atmosfære for å unngå fordampning av mediet, og for å hindre at embryoet fra uttørking. Dette oppnås ved å inkubere fatet med eksplantatet kultur i et større petriskål som inneholdt fuktig silkepapir 1. Oppkjøpet av tids-lapse bilder av disse embryoer krever enten bruk av et klimakontrollert inkubator rundt hele mikroskop eller et temperamentperatur styrt beholder med et oppvarmet lokk for å unngå kondens i lysbanen 14. Imidlertid kan kyllingembryo også utvikle ex ovo helt nedsenket i dyrkingsmedium som filter papir kulturer 25, klemt mellom et lag med tung mineralolje og albumin i tilpasninger av New Teknikken 2,21, eller som brettes blastoderm explants i "Cornish Pasty Culture "23,26, uten direkte kontakt med luften.
Den neddykkede filterpapir sandwich er en ny variant av filterpapirbæreren teknikk. Ved å kombinere tidligere kunnskap om dyrking kyllingfoster ex ovo, gjør det klima-kontrollerte inkubator og det oppvarmede lokket unnværlig. Embryoet er klemt mellom to identiske (laserskåret) filterpapirbærer 24 og dyrket helt nedsenket i en enkel dyrkningsmedium (Pannett-Compton saltvann 27,28 og tynne eggehvitestoff i et 3: 2 forhold) i en temperaturregulert inneholdeer. Et lag av lett mineralolje som flyter på toppen av medium forhindrer fordampning 2,21 og minimerer varmetap til omgivelsene. Bunnen av beholderen har et glassvindu, og hele oppsettet er utført på en oppreist lang arbeidsavstand zoom mikroskop. Dette oppsettet gjør at oppkjøpet av høyoppløselige lysfelt og mørkefelt time-lapse filmer på ca 30 timer av embryoutvikling, som strekker seg fra tidlig primitive streak scenen til 28-somitt scenen (tilsvarer Hamburger Hamilton stadier 5-16, HH5-16 ) 15. Embryoet kan dyrkes like godt med sine ventral eller dorsal side opp. Derfor embryoer er tilgjengelige for observasjon og manipulering av ventral (f.eks tidlig hjerte 7,8 og somitogenesen 6) og rygg (f.eks sent gastrulation 2, neural tube nedleggelse 3-5, og tidlig hjerne 9-13) utvikling. Det nedsenkede filter papir smørbrød provides en enkel og stabilt miljø for mikrokirurgi, perle implantasjon, mikroinjeksjon, gene silencing, og electroporation studier. Imaging potensialet kan skyves mye ytterligere ved hjelp av laserbaserte imaging (inkludert lys-ark mikroskopi) og nedsenking mål.
Som en ny variant av den veletablerte EC kultur 1, forenkler nedsenket filterpapiret smørbrød kjøp av langsiktige lysfelt og mørkefelt time-lapse filmer fra tidlig kylling embryo ex ovo ved å lage en temperatur- og fuktighetsstyrt inkubator rundt mikroskop unnværlig. Snarere enn å være dyrket på et halvfast agar-albumen bunn, blir embryoene holdes helt nedsenket i en enkel dyrkingsmedium bestående av PC-saltløsning og tynne albumen. Fordampning og varmetapet blir minimalisert ved et lag av mineralsk olje som flyter på toppen av kulturmediet. Embryoet kan dyrkes lett, enten dorsal eller ventral siden opp, uten synlige forskjeller i kvalitet. Som vist her, embryoer i neddykket filterpapiret smørbrød er tilgjengelig for mikrokirurgisk inngrep, som bruk av morfogen-gjennomvåt perler. Fremtidige bruksområder er levende fluorescens bildebehandling, microinjections og electroporation, og genet Slå til manipulate og studere et bredt spekter av morfogenetiske hendelser under ventral (f.eks tidlig hjerte og somitogenesen) og rygg (f.eks sent gastrulation, nevralrøret nedleggelse, og tidlig hjernen) utvikling. En tidsavhengig medikamentbehandling er mulig hvis petriskål inneholdende filterpapir-sandwich er erstattet med en perfusjon kammer, slik at utveksling av kulturmediet under den mineralolje lag. Det nedsenkede filter papir smørbrød vil utvikle sitt fulle bildebehandling potensial i kombinasjon med laser-baserte imaging (inkludert lys-ark mikroskopi) og nedsenking mål.
Noen problemer med utarbeidelsen av den nedsenkede filter papir smørbrød vil bli behandlet i de følgende avsnittene. Selv om det krever bare en moderat mengde trening for å overføre et embryo fra plommen til filterpapiret sandwich, kan flere trinn fortsatt betydelig innvirkning på kvaliteten av embryoet i kultur. Før filterpapiret bærerenplasseres på eggeplomme, bør vitelline membranen rundt embryoet bli frigjort fra eventuelle tykke albumen. Først da vil forbindelsen mellom filterpapiret og vitelline membranen være sterk nok til å motstå vasking i PC-saltløsning. Filterpapiret som bærer embryoet skal krysse væske / luft-grenseflaten så lite som mulig for å minimalisere strekk på membranene. Når brakt inn i PC-saltvann for vask, må hele filterpapiret bærer være helt under vann til enhver tid. Tiden i PC-saltvann bad må begrenses til ca 30 – 60 sekunder, som vitelline membranen vil begynne å slippe fra filterpapiret. Likevel bør rengjøring av embryo bli gjennomført veldig grundig, så plomme rester vil senere skjule visningen av embryoet. Under vasking, aldri peke strømmen fra overføringspipetten direkte på fosteret, men alltid radialt bort fra det. Etter fjerning av embryo fra PC-saltvann, sørg for å holde filterpapiret horisontalt for å minimerespenning på embryonale membraner. Deretter stabil embryoet med den andre filterpapirbæreren. Når den andre filterpapirbæreren er plassert, unngå å skape en hvilken som helst lateral spenning, noe som kunne skifte filterpapiret bærere i forhold til hverandre og rive de embryoniske membranene. Når filterpapiret-sandwich bringes i kulturmediet, bør det også krysse luft / væske-grensesnittet bare en gang for å redusere spenningen på membranene. Det andre paret av rustfrie stålringer som brukes til å stabilisere filterpapiret sandwich fra toppen må plasseres meget langsomt og uten noe trykk for å minimere sammentrykking av embryoniske membranene. Små brudd i området opaca av embryoet helbrede vanligvis i løpet av den første timen av kulturen, men en skadet embryo kan og bør alltid erstattes av en ny prøve før oljelaget blir pipettert på toppen av kulturmediet.
Til bilde en hel embryo eller flere prøver for høy oppløsning time-lapse filmer, microscope må være utstyrt med en motorisert xy-stadium, styres av programvare mikroskop. Det er av avgjørende betydning å ha xy-scenen farten med en minimal hastighet for å unngå skade på befruktede egg og turbulens i kulturmedium og olje, noe som vil redusere bildekvaliteten. For kjøp av time-lapse filmer som presenteres her, flyttet den motoriserte xy-scenen med en hastighet på ca. 1,75 mm / sek. I fremtiden kan bildebehandling bli ytterligere forbedret ved først å flytte scenen til ønsket posisjon og henting av bildet etter en kort hvileperiode for å la vibrasjoner og turbulenser visne bort.
Som en begrensning, bør potensielle brukere være klar over den relativt lange arbeids avstand (ca. 1 cm) som er nødvendig for denne dyrkningsmetode hvis en oppreist mikroskop uten nedsenking mål er brukt. Denne arbeidsavstand resultater fra lag av mediet og mineralolje på toppen av embryoet. I 6 cm petriskål, har oljelaget a thickness på omtrent 1 til 1,5 mm, og embryoet er nedsenket omtrent 4 mm dypt i kulturmediet. Avhengig av diameteren av målet, kan den øvre kant av 6 cm petriskål også begrense tilgangen til embryoet. Dette kan omgås ved å bruke en større tallerken.
Arbeids avstanden fra toppen kan bli noe redusert ved å minimalisere tykkelsen av de flytende sjikt. I tillegg kan arbeidsavstanden fra nedenfor bli minimalisert ved å bringe den embryo videre ned til bunnen av petriskålen, og redusere tykkelsen av den glassvinduet fra den oppvarmede begerglass. Mens protokollen ble optimalisert for å fungere sammen med en opprettstående lang arbeidsavstand zoom mikroskop, kan det være montert et invertert mikroskop i tillegg. Fremtidige brukere bør huske på at å senke fosteret for dypt i kulturmediet kan føre til O 2 -diffusion problemer, selv om foreløpige forsøkene tyder på at begrenset spredning ikke synes å være et problem, så lenge fosteret er omgitt av en tilstrekkelig stor reservoar av kulturmedium, og filterpapiret inneklemt ikke er trykket mot bunnen av petriskålen.
En annen begrensning er temperaturkontroll. Ved å justere temperaturen i styreenheten for den oppvarmede begerglass til 40 ° C, temperaturen i mediet likevekt til 37,5 ° C rundt embryoene når mediet er dekket med mineralolje. Dette viser at noe energi går tapt mellom bunnen av begerglasset, hvor varmeelementene og temperatursensoren er plassert, og at plasseringen av embryoene. Temperaturkontrollen kan optimaliseres ved å flytte sensoren og redistribuere varmeelementene.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne erkjenner økonomisk støtte fra en ZonMW-vici stipend 918.11.635 (Nederland). Forfatterne ønsker å takke verktøyet butikken av Vrije Universiteit Amsterdam for sine praktiske forslag og for produksjon oppsetts komponenter og Jarno Voortman av Carl Zeiss Nederland for nyttige råd om mikroskopi. Marjolein Blaauboer var en stor støtte i kritisk kommenterer flere utkast av manuskriptet.
Milli-Q Reference Water Purification System | Millipore | Z00QSV0WW | |
Duran laboratory bottles, with caps, 1L | Sigma-Aldrich/Duran | Z305200-10EA | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Solution A | |||
NaCl | Merck Millipore | 1064041000 | |
KCl | Merck Millipore | 1049361000 | |
CaCl2 H2O | Merck Millipore | 1023821000 | |
MgCl2.6H2O | Merck/Sigma-Aldrich | 13152-1KG-D | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Solution B | |||
Na2HPO4.2H2O | Merck | 1065801000 | |
NaH2PO4.2H2O | Merck | 1063420250 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Whatman qualitative filter paper, Grade 595 | Sigma-Aldrich | 10311611 | |
Laser cutting machine MLS-90120-C130, CO2-laser, 130W, wavelength 10.6 µm | Micro Lasersystems | ||
Tork Extra Soft Facial Tissues | Tork | 140280 | |
Latex gloves | Sigma-Aldrich | Z645613 | |
EMDAMED | EMDA 300.131 | ||
Transfer pipettes | Sigma-Aldrich | Z350613 | |
VWR | WITG5.480.003 | ||
accu-jet pro Pipette Controller | BrandTech Scientific | 26332 | |
Serological plastic pipettes, 25mL | Sigma-Aldrich | CLS4251 | |
Plastic document sleeves | |||
Egg incubator – Incubator mod. Cip Cip 40 | Fiem | ||
Fertilized chicken eggs (Gallus gallus) | Drost BV (Loosdrecht, NL) | ||
10 cm Tissue culture dishes | Sigma-Aldrich | P5731 | |
Greiner Bio-one | 664160 | ||
6 cm Petri dishes | Sigma-Aldrich | P5481 | |
50ml Centrifuge tubes , Greiner centrifuge tubes or Cellstar tubes | Sigma-Aldrich | T2318 | |
greiner bio-one | 227261 | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Stainless steel rings, custom-made | |||
Large rings, 30 mm outer diameter, 4 mm in height, 1.5 mm wall thickness | |||
Small rings, 20 mm outer diameter, 4 mm in height, 1.5 mm wall thickness, 6.5 mm gap in the ring | |||
Nail scissors | |||
Forceps, Dumont #5, Inox | Fine Science Tools , F.S.T. | 11251-20 | |
Fine, really sharp scissors for cutting filter paper | VWR | 21-102 | |
M3516 Sigma-Aldrich Mineral Oil | Sigma-Aldrich | CAS Number 8042-47-5 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Agar bottoms for EC culture | |||
Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 SIGMA | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 SIGMA-ALDRICH | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Microbead implantation | |||
Polybead Sampler Kit III (45 µm beads were used) | Polysciences, Inc. | 16905-1 | |
Accupuncture needles: type J, No.02, 0.12x30mm | SEIRIN | type J, No.02, 0.12x30mm | |
PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Temperature controlled beaker | |||
RTD Temperature Sensor with M4 Threaded Housing RTD-850M | Omega | RTD-850M | |
Hermetically Sealed RTD Sensors HSRTD-3-100-A-3M | Omega | HSRTD-3-100-A-1M | |
Thermistor and RTD Extension Wire EXTT-3CU-26S-50 | Omega | EXTT-3CU-26S-50 | |
3-Pin Mini Connectors for Thermocouples, 3-Wire RTD's and Thermistors MTP-U-M | Omega | MTP-U-M | |
Kapton (Polyimide Film) Insulated Flexible Heaters KHLV-103/(10)-P | Omega | KHLV-103/(10)-P | |
Temperature/Process Controller CNi16D24-C4EIT-DC | Omega | CNi16D24-C4EIT-DC | |
Custom-made aluminium beaker, isolated with polyacetal (drawings see sheet 2) | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Microscope setup | |||
Axio Zoom.V16 with ApoTome.2 ZEN | Carl Zeiss AG | 495010-0009-000 | |
Objective PlanNeoFluar Z 1.0x/0.25 FWD 56mm | Carl Zeiss AG | 435281-9100-000 | |
Manual Rotary Control MARC | Carl Zeiss AG | 435604-0000-000 | |
Transillumination top 450 mot | Carl Zeiss AG | 435500-9000-000 | |
Motorized measuring stage S 150×100 mot; CAN (D) | Carl Zeiss AG | 435465-9020-000 | |
Insert plate S, glass 237x157x3mm (D) | Carl Zeiss AG | 435465-9053-000 | |
Controller EMS 3 | Carl Zeiss AG | 435610-9010-000 | |
System Control Panel SYCOP 3 | Carl Zeiss AG | 435611-9010-000 | |
Hamamatsu ORCA Flash 4.0 camera | Hamamatsu | C11440-22CU | |
Microscopy High-End Workstation Xeon Quad-Core mulitlingual | Carl Zeiss AG | 490004-0025-000 | |
Language Package Windows 7 x64 Ultimate English US | Carl Zeiss AG | 410373-0200-000 | |
LCD TFT Monitor HP ZR2440w 24" | Carl Zeiss AG | 410350-2403-000 | not available anymore |
ZEN pro 2012 Hardware License key | Carl Zeiss AG | 410135-1002-120 | not available anymore |
ZEN Software Driver Hamamatsu Cameras Hardware License Key | Carl Zeiss AG | 410136-1045-110 | |
ZEN module Z Stack | Carl Zeiss AG | 410136-0030-110 | |
ZEN Module Tiles/ Positions | Carl Zeiss AG | 410136-1025-110 | |
ZEN Module Time Lapse | Carl Zeiss AG | 410136-1031-110 | |
ZEN Module Experiment Designer | Carl Zeiss AG | 410136-1022-110 | |
ZEN Desk 2012 Hardware License Key | Carl Zeiss AG | 410135-1004-120 | not available anymore |