Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for time-lapse imaging using transmitted light and fluorescence microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique1 that allows for the culturing of chick embryos fully-submerged in a liquid culture medium.
En raison de sa disponibilité, à faible coût, la géométrie plane, et la transparence, l'ex ovo embryon de poulet est devenu un modèle majeur des animaux vertébrés pour l'étude des événements morphogénétiques, tels que gastrulation 2, neurulation 3-5, somitogenèse 6, coeur de pliage 7, 8, et le cerveau formation 9-13, au cours de l' embryogenèse précoce. La clé de la compréhension des processus morphogénétiques est de les suivre dynamiquement par imagerie time-lapse. L'acquisition de films time-lapse de poussin embryogenèse ex ovo a été limitée soit à court fenêtres de temps ou à la nécessité d'un incubateur pour contrôler la température et l' humidité autour de l'embryon 14. Ici, nous présentons une nouvelle technique pour la culture embryons de poulet ex ovo pour imagerie à haute résolution time-lapse en utilisant la microscopie lumière transmise. Le sandwich de papier filtre immergé est une variante du filtre support papier techn bien établieique (EC-culture) 1 et permet la mise en culture des embryons de poulet sans la nécessité d'une chambre climatique. L'embryon est prise en sandwich entre deux supports en papier filtre identique et est maintenu totalement immergé dans un milieu simple, à température contrôlée recouverte par une couche d'huile minérale légère. A partir de la scène primitive de série (stade Hamburger-Hamilton 5, HH5) 15 jusqu'à au moins le stade 28 somites (HH16) 15, les embryons peuvent être cultivées avec soit leur ventrale ou dorsale vers le haut. Cela permet à l'acquisition de films time-lapse couvrant environ 30 h du développement embryonnaire. Représentant des cadres et des films time-lapse sont présentés. Embryons sont comparés morphologiquement à un embryon cultivé dans les CE-culture standard.
Le sandwich de papier filtre immergé fournit un environnement stable à l'étude dorsale précoce et les processus morphogénétiques ventrales. Il permet également d'imagerie et micromanipulations de fluorescence en direct, tels que la microchirurgie, perle implantation, microinjection, silençage génique, et l'électroporation, et a un fort potentiel pour être combinés avec des objectifs d'immersion pour l'imagerie à base de laser (y compris la lumière de la fiche microscopie).
Embryogenèse a fasciné l'homme depuis le début de l'histoire. Comment la structure et la morphologie de l'embryon se développent de manière spatiale et temporelle bien définie? L'embryon de poulet est devenu l'un des modèles animaux vertébrés classiques pour embryogenèse pour plusieurs raisons: Il est facilement disponible, peu coûteux, transparent à ses débuts, et accessible pour des manipulations expérimentales, comme elle se développe en dehors de la mère. De plus, il a une géométrie presque plat lors d' événements morphogénétiques début, comme le cœur et la formation du cerveau, gastrulation, neurulation et somitogenèse 15.
processus morphogénétiques peuvent être comprises mieux si elles sont étudiées de manière dynamique, par exemple par l'acquisition d'images en accéléré. L'embryon de poulet peut être visualisé in ovo 16 mais avec une faible accessibilité pour les manipulations expérimentales et la visibilité limitée pour l' imagerie par microscopie optique de transmission. Par conséquent, several techniques ont été proposées pour la culture d' embryons de poulet ex ovo, que ce soit dans des systèmes de culture de 13,17 jaune d' oeuf entier – 19 ou sous forme de cultures d'explants 1,20 – 23. Dans les systèmes de culture de jaune d'oeuf entier, l'embryon reste au-dessus du jaune d'oeuf intact, et la totalité du contenu de l'œuf est transféré dans un autre récipient pour l'incubation. Ce conteneur peut être une coquille d'oeuf de substitution 17, une boîte de Pétri 19, ou un hamac en plastique étirable wrap 13,18. Embryons dans les cultures de jaune entières peuvent idéalement être cultivées jusqu'à l'éclosion et sont accessibles à micromanipulations. Ces techniques sont particulièrement utiles pour étudier le développement d'embryons après le début de la circulation sanguine (ce qui augmente le contraste), tandis que les jeunes embryons restent difficiles à visualiser. Ces embryons précoces peuvent être imagées mieux si elles sont excisées du jaune et cultivés comme explants in vitro. Les explants sont facilement accessibles pour l'expériencemanipulations al et nécessitent moins d'espace pour la culture. Pendant de nombreuses années, une technique mise au point par Denis Nouvelle en 1955 et ses variations ont été les normes d' or des explants méthodes de culture pour les embryons de poulet, ce qui rend l'embryon accessible pour la microscopie time-lapse et les interventions de microchirurgie 20,21. Malgré son grand succès, la technique de la Nouvelle est relativement exigeante et prend du temps. Le blastoderm détache souvent lorsque la membrane vitelline, portant le blastoderme, est tendue autour d' un anneau de verre pour obtenir la bonne tension 1. En outre, l'embryon ne peut être mis en culture avec sa face ventrale vers le haut. La culture CE (Chick précoce), une technique plus récente développée par Chapman et Collignon 1, évite l'étirage de la membrane vitelline à l'aide d' un filtre papier support avec une ouverture centrale. Le papier filtre attache à la membrane vitelline, maintenant ainsi sa tension naturelle, et entoure l'embryon comme un cadre photo 1.Embryons sont ensuite cultivées sur un fond agar-albumen, généralement avec leur face ventrale. La culture dorsale vers le haut ne semble possible que pour les embryons à HH8 15 ans et plus. De nombreux groupes ont adapté le filtre papier support à leurs besoins, par exemple en remplaçant le fond d' agar-albumen avec un support en fibres de suture chirurgicale 24 ou un collagène enduit membrane 25. Souvent, les embryons cultivés avec la technique de nouvelles ou avec la culture CE sont exposés, avec leur dorsale ou surface ventrale à l' air pour faciliter la diffusion de l' oxygène 1,20. Ces cultures explants doivent être conservés dans une atmosphère humidifiée pour éviter l'évaporation du milieu et pour empêcher l'embryon de se dessécher. Ceci est réalisé en incubant le plat avec la culture d'expiant dans un plat plus grand de Pétri contenant du papier de soie humide 1. L'acquisition d'images en accéléré de ces embryons nécessite soit l'utilisation d'un incubateur à température contrôlée autour de l'ensemble microscope ou un tempéramentature contrôlé récipient avec un couvercle chauffé pour empêcher la condensation dans le trajet de la lumière 14. Cependant, les embryons de poulet peuvent également développer ex ovo complètement immergé dans un milieu de culture en tant que cultures de papier filtre 25, pris en sandwich entre une couche d'huile et de l' albumine de minéraux lourds dans adaptions de la technique de New 2,21, ou comme explants de blastoderme pliées dans le "Cornish Pasty Culture "23,26, sans contact direct avec l'air.
Le sandwich de papier filtre immergé est une nouvelle variante de la technique du papier filtre de support. En combinant la connaissance antérieure sur la culture des embryons de poulet ex ovo, il fait l'incubateur à température contrôlée et le couvercle chauffant dispensable. L'embryon est pris en sandwich entre deux supports de papier identique (découpé au laser) filtre 24 et cultivé entièrement immergé dans un milieu de culture simple (Pannett-Compton saline 27,28 et albumen minces dans un rapport de 3: 2) dans une température contrôlée contiennenter. Une couche de lumière de l' huile minérale flottant au – dessus du milieu empêche l' évaporation 2,21 et minimise la perte de chaleur dans l'environnement. Le fond du récipient a une fenêtre de verre, et l'ensemble du programme d'installation est effectuée sur une longue distance de travail zoom microscope droit. Cette configuration permet l'acquisition de haute résolution clair et darkfield time-lapse films d'environ 30 h du développement embryonnaire, allant du stade de la ligne primitive précoce au stade 28 somites (équivalent à Hamburger Hamilton stades 5 à 16, HH5-16 ) 15. Les embryons peuvent être cultivées aussi bien avec leur ventrale ou dorsale vers le haut. Par conséquent, les embryons sont accessibles à l' observation et la manipulation de ventral (par exemple, cardiaque précoce 7,8 et somitogenèse 6) et dorsale (par exemple, la fin de la gastrulation 2, le tube neural fermeture 3-5, et au début de cerveau 9-13) développement. Le filtre immergé papier sandwich à provides un environnement simple et stable pour la microchirurgie, perle implantation, microinjection, silençage génique, et les études d'électroporation. Son potentiel d'imagerie peut être poussé beaucoup plus loin en utilisant l'imagerie à base de laser (y compris la microscopie optique-feuille) et les objectifs d'immersion.
Comme une nouvelle variante de la culture CE bien établie 1, le sandwich de papier filtre immergé facilite l'acquisition de fond clair et darkfield time-lapse films à long terme du début d' embryon de poulet ex ovo en faisant un température et humidité contrôlée incubateur autour le microscope dispensable. Plutôt que d'être cultivées sur un fond agar-albumen semi-solide, les embryons sont maintenus complètement immergés dans un milieu de culture simple constitué de PC-solution saline et albumen minces. L'évaporation et la perte de chaleur sont réduits au minimum par une couche d'huile minérale flottant au-dessus du milieu de culture. Les embryons peuvent être cultivées facilement, soit dorsale ou ventrale vers le haut, sans différences visibles dans la qualité. Comme le montre ici, les embryons dans le papier filtre en sandwich submergée sont accessibles à des interventions de microchirurgie, comme l'application de perles de morphogènes imbibés. Les applications futures comprennent la fluorescence en direct imagerie, microinjections et électroporation, et Gene Silencing à manipulate et étudier un large éventail d'événements morphogénétiques pendant ventral (par exemple, le cœur précoce et somitogenèse) et dorsale (par exemple, la fin de la gastrulation, la fermeture du tube neural, et au début du cerveau) développement. Un traitement médicamenteux en fonction du temps est possible si la boîte de Pétri contenant le sandwich papier-filtre est remplacée par une chambre de perfusion, permettant l'échange du milieu de culture en dessous de la couche d'huile minérale. Le papier filtre en sandwich submergé va développer son potentiel d'imagerie complète en combinaison avec l'imagerie à base de laser (y compris la lumière de la fiche microscopie) et les objectifs d'immersion.
Quelques difficultés avec la préparation du papier filtre en sandwich submergé seront abordés dans les paragraphes suivants. Bien qu'il ne nécessite qu'une quantité modérée de formation pour transférer un embryon à partir du jaune dans le papier filtre en sandwich, plusieurs étapes peuvent encore influencer de manière significative la qualité de l'embryon dans la culture. Avant que le support de papier filtre estplacé sur le jaune d'œuf, la membrane vitelline autour de l'embryon doit être libéré de toute albumen épais. Alors seulement, la connexion entre le papier filtre et la membrane vitelline être suffisamment solide pour résister à la laver dans PC-saline. Le papier filtre portant l'embryon doit traverser l'interface liquide / air aussi peu que possible pour réduire au minimum la tension sur les membranes. Une fois introduit dans le PC-solution saline pour le lavage, le filtre entier papier support doit rester complètement immergé en tout temps. Le temps dans le bain de PC-solution saline doit être limitée à environ 30 – 60 s, comme la membrane vitelline va commencer à libérer du papier filtre. Pourtant, le nettoyage de l'embryon doit être exécuté très soigneusement, comme les restes de jaune seront plus tard obscurcir la vue de l'embryon. Pendant le lavage, ne jamais pointer le courant de la pipette de transfert directement sur l'embryon, mais toujours radialement loin de lui. Après avoir retiré l'embryon à partir du PC-saline, assurez-vous de tenir le papier filtre horizontalement pour minimisertension sur les membranes embryonnaires. Ensuite, stabiliser l'embryon avec le second support de papier filtre. Une fois que le second support de papier filtre est placé, éviter de créer une tension latérale, ce qui peut décaler les supports de papier filtre par rapport à l'autre et déchirer les membranes embryonnaires. Lorsque le sandwich papier-filtre est introduit dans le milieu de culture, il faut aussi traverser l'interface air / liquide, une seule fois pour réduire la tension sur les membranes. La deuxième paire d'anneaux en acier inoxydable utilisés pour stabiliser le sandwich papier-filtre à partir de la partie supérieure doit être placé très lentement et sans aucune pression pour minimiser la compression des membranes embryonnaires. Les petites ruptures de la zone opaca de l'embryon guérissent habituellement pendant la première heure de la culture, mais un embryon endommagé peuvent et doivent toujours être remplacés par un nouvel échantillon avant que la couche d'huile est pipeté au-dessus du milieu de culture.
Pour l'image d'un embryon entier ou plusieurs échantillons pour haute résolution des films time-lapse, le microroscope doit être équipé d'un étage XY motorisé, commandé par le logiciel du microscope. Il est d'une importance cruciale pour que le mouvement xy-scène avec une vitesse minimale pour éviter d'endommager les embryons et les turbulences dans le milieu de la culture et de l'huile, ce qui va diminuer la qualité d'image. Pour l'acquisition des films time-lapse présentés ici, le xy-platine motorisée déplacé avec une vitesse d'environ 1,75 mm / sec. Dans l'avenir, l'imagerie pourrait être encore améliorée en premier déplacement de la platine à la position désirée et l'acquisition de l'image après une courte période de repos pour laisser les vibrations et les turbulences disparaissent.
Comme une limitation, les utilisateurs potentiels doivent être conscients de la distance relativement longue de travail (environ 1 cm) nécessaire pour cette méthode de culture si un microscope droit sans objectifs d'immersion est utilisé. Cette distance de travail résulte de la couche de support et d'huile minérale au-dessus de l'embryon. Dans la boîte de Petri de 6 cm, la couche d'huile a une epaisseurs d'environ 1 à 1,5 mm, et l'embryon est submergée d'environ 4 mm de profondeur dans le milieu de culture. En fonction du diamètre de l'objectif, le bord supérieur de la boîte de Petri de 6 cm pourrait également limiter l'accès à l'embryon. Cela pourrait être contourné en utilisant un plat plus grand.
La distance de travail du haut pourrait être légèrement réduite en minimisant les épaisseurs des couches liquides. En outre, la distance de travail du bas peut être réduite au minimum en mettant l'embryon plus bas au fond de la boîte de Petri et en réduisant l'épaisseur de la fenêtre en verre du récipient chauffé. Alors que le protocole a été optimisé pour fonctionner avec une longue travail zoom à distance microscope droit, il pourrait être monté sur un microscope inversé ainsi. Les futurs utilisateurs doivent garder à l' esprit que submergeant l'embryon trop profondément dans le milieu de culture pourrait conduire à O 2 -Diffusion problèmes, bien que des expériences préliminaires suggèrent que la diffusion limitée ne semble pas être un problem, aussi longtemps que l'embryon est entouré d'un nombre suffisamment grand-réservoir de milieu de culture et le papier filtre pris en sandwich n'a pas été pressée sur le fond de la boîte de Petri.
Une autre limitation est le contrôle de la température. En réglant la température du dispositif de commande pour le récipient chauffé à 40 ° C, la température dans le milieu équilibrant à 37,5 ° C autour des embryons lorsque le support est recouvert d'une huile minérale. Cela montre qu'une certaine perte d'énergie entre le fond du récipient, dans lequel se trouvent les éléments de chauffage et le capteur de température, et l'emplacement des embryons. Le contrôle de la température pourrait être optimisée en déplaçant le capteur et redistribuant les éléments chauffants.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs reconnaissent le soutien financier d'une subvention ZonMW-VICI 918.11.635 (Pays-Bas). Les auteurs tiennent à remercier le magasin d'outils de la Vrije Universiteit Amsterdam pour leurs suggestions pratiques et pour la fabrication des composants d'installation et Jarno Voortman de Carl Zeiss Pays-Bas pour des conseils utiles sur la microscopie. Marjolein Blaauboer était d'un grand soutien en commentant de façon critique sur plusieurs versions du manuscrit.
Milli-Q Reference Water Purification System | Millipore | Z00QSV0WW | |
Duran laboratory bottles, with caps, 1L | Sigma-Aldrich/Duran | Z305200-10EA | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Solution A | |||
NaCl | Merck Millipore | 1064041000 | |
KCl | Merck Millipore | 1049361000 | |
CaCl2 H2O | Merck Millipore | 1023821000 | |
MgCl2.6H2O | Merck/Sigma-Aldrich | 13152-1KG-D | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Solution B | |||
Na2HPO4.2H2O | Merck | 1065801000 | |
NaH2PO4.2H2O | Merck | 1063420250 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Whatman qualitative filter paper, Grade 595 | Sigma-Aldrich | 10311611 | |
Laser cutting machine MLS-90120-C130, CO2-laser, 130W, wavelength 10.6 µm | Micro Lasersystems | ||
Tork Extra Soft Facial Tissues | Tork | 140280 | |
Latex gloves | Sigma-Aldrich | Z645613 | |
EMDAMED | EMDA 300.131 | ||
Transfer pipettes | Sigma-Aldrich | Z350613 | |
VWR | WITG5.480.003 | ||
accu-jet pro Pipette Controller | BrandTech Scientific | 26332 | |
Serological plastic pipettes, 25mL | Sigma-Aldrich | CLS4251 | |
Plastic document sleeves | |||
Egg incubator – Incubator mod. Cip Cip 40 | Fiem | ||
Fertilized chicken eggs (Gallus gallus) | Drost BV (Loosdrecht, NL) | ||
10 cm Tissue culture dishes | Sigma-Aldrich | P5731 | |
Greiner Bio-one | 664160 | ||
6 cm Petri dishes | Sigma-Aldrich | P5481 | |
50ml Centrifuge tubes , Greiner centrifuge tubes or Cellstar tubes | Sigma-Aldrich | T2318 | |
greiner bio-one | 227261 | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Stainless steel rings, custom-made | |||
Large rings, 30 mm outer diameter, 4 mm in height, 1.5 mm wall thickness | |||
Small rings, 20 mm outer diameter, 4 mm in height, 1.5 mm wall thickness, 6.5 mm gap in the ring | |||
Nail scissors | |||
Forceps, Dumont #5, Inox | Fine Science Tools , F.S.T. | 11251-20 | |
Fine, really sharp scissors for cutting filter paper | VWR | 21-102 | |
M3516 Sigma-Aldrich Mineral Oil | Sigma-Aldrich | CAS Number 8042-47-5 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Agar bottoms for EC culture | |||
Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 SIGMA | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 SIGMA-ALDRICH | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Microbead implantation | |||
Polybead Sampler Kit III (45 µm beads were used) | Polysciences, Inc. | 16905-1 | |
Accupuncture needles: type J, No.02, 0.12x30mm | SEIRIN | type J, No.02, 0.12x30mm | |
PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Temperature controlled beaker | |||
RTD Temperature Sensor with M4 Threaded Housing RTD-850M | Omega | RTD-850M | |
Hermetically Sealed RTD Sensors HSRTD-3-100-A-3M | Omega | HSRTD-3-100-A-1M | |
Thermistor and RTD Extension Wire EXTT-3CU-26S-50 | Omega | EXTT-3CU-26S-50 | |
3-Pin Mini Connectors for Thermocouples, 3-Wire RTD's and Thermistors MTP-U-M | Omega | MTP-U-M | |
Kapton (Polyimide Film) Insulated Flexible Heaters KHLV-103/(10)-P | Omega | KHLV-103/(10)-P | |
Temperature/Process Controller CNi16D24-C4EIT-DC | Omega | CNi16D24-C4EIT-DC | |
Custom-made aluminium beaker, isolated with polyacetal (drawings see sheet 2) | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Microscope setup | |||
Axio Zoom.V16 with ApoTome.2 ZEN | Carl Zeiss AG | 495010-0009-000 | |
Objective PlanNeoFluar Z 1.0x/0.25 FWD 56mm | Carl Zeiss AG | 435281-9100-000 | |
Manual Rotary Control MARC | Carl Zeiss AG | 435604-0000-000 | |
Transillumination top 450 mot | Carl Zeiss AG | 435500-9000-000 | |
Motorized measuring stage S 150×100 mot; CAN (D) | Carl Zeiss AG | 435465-9020-000 | |
Insert plate S, glass 237x157x3mm (D) | Carl Zeiss AG | 435465-9053-000 | |
Controller EMS 3 | Carl Zeiss AG | 435610-9010-000 | |
System Control Panel SYCOP 3 | Carl Zeiss AG | 435611-9010-000 | |
Hamamatsu ORCA Flash 4.0 camera | Hamamatsu | C11440-22CU | |
Microscopy High-End Workstation Xeon Quad-Core mulitlingual | Carl Zeiss AG | 490004-0025-000 | |
Language Package Windows 7 x64 Ultimate English US | Carl Zeiss AG | 410373-0200-000 | |
LCD TFT Monitor HP ZR2440w 24" | Carl Zeiss AG | 410350-2403-000 | not available anymore |
ZEN pro 2012 Hardware License key | Carl Zeiss AG | 410135-1002-120 | not available anymore |
ZEN Software Driver Hamamatsu Cameras Hardware License Key | Carl Zeiss AG | 410136-1045-110 | |
ZEN module Z Stack | Carl Zeiss AG | 410136-0030-110 | |
ZEN Module Tiles/ Positions | Carl Zeiss AG | 410136-1025-110 | |
ZEN Module Time Lapse | Carl Zeiss AG | 410136-1031-110 | |
ZEN Module Experiment Designer | Carl Zeiss AG | 410136-1022-110 | |
ZEN Desk 2012 Hardware License Key | Carl Zeiss AG | 410135-1004-120 | not available anymore |