Summary
Eiwit interacties vormen de kern van de functie van een cel. Calorimetrische en spectroscopische technieken worden gewoonlijk gebruikt om ze te karakteriseren. Hier beschrijven we fluorescentie anisotropie als middel om de interactie tussen het eiwit gemuteerd in de Shwachman-Diamond Syndroom (SBDS) en elongatiefactor-1 achtige GTPase (EFL1) te bestuderen.
Abstract
Eiwit-eiwit interacties spelen een essentiële rol in de functie van een levend organisme. Zodra een interactie geïdentificeerd en gevalideerd moet worden karakteriseren de structurele en mechanistische niveau. Verschillende biochemische en biofysische methoden bestaan voor een dergelijk doel. Onder hen, fluorescentie anisotropie is een krachtige techniek bijzonder gebruikt wanneer de fluorescentie-intensiteit van een fluorofoor gemerkt eiwit constant op eiwit-eiwit interactie blijft. In deze techniek, een fluorofoor-gemerkte eiwit wordt geëxciteerd met verticaal gepolariseerde licht van een geschikte golflengte die selectief exciteert een deel van de fluoroforen volgens hun relatieve oriëntatie van de inkomende straal. De resulterende emissie heeft ook een richtingsgevoeligheid wiens relatie in de verticale en horizontale vlakken definieert anisotropie (r) als volgt: r = (I -I VV VH) / (I + 2I VV VH), waarin I en I VV
Introduction
Cellen een veelheid van biomacromoleculen die voortdurend met elkaar. Deze associatie ontstaat complexen die deelnemen aan de cellulaire routes die verantwoordelijk zijn voor hun functioneren in signaaltransductie, regulatie van genexpressie en celmigratie onder andere. Alle proteïne-proteïne interacties die optreden in een cel omvatten een netwerk, bekend als interactoom. In Saccharomyces cerevisiae is aangetoond dat meer dan 70% van de eiwitten interagerende partners 1 hebben. Inzicht in de interactoom van een cel en hun functies relevante informatie over de complexiteit en diversiteit van levende organismen. Verschillende methoden zijn beschreven geïdentificeerd en gekarakteriseerd eiwit-eiwit interacties. Verschillende hoog door te zetten methoden zoals gist two-hybrid 2, eiwit-fragment complementatie assays 3, affiniteitszuivering 4 gekoppeld aan massaspectrometrie en eiwitten microarrays worden gebruikt om een interactie 5,6 identificeren. Eenmaal geïdentificeerd, is het nodig om het te bevestigen en kan variëren van geval tot geval. Kenmerkend voor deze experimenten omvatten het verstoren van de interactie zelf op het niveau van de individuele leden van de interactie paar, bijvoorbeeld door gen deletie of overexpressie van één van de eiwitten, en vervolgens naar veranderingen in de eigenschappen of functie van het andere lid van het cellulair niveau. Vervolgens biofysische technieken 7 worden gebruikt om de eiwit-eiwit interactie te karakteriseren op moleculair niveau. Daartoe is de structuur van eiwitcomplexen worden bepaald door röntgenkristallografie, kernspinresonantie en cryo-elektronenmicroscopie terwijl calorimetrie en fluorescentie spectroscopie worden gebruikt om ze kwantitatief en mechanistisch beschrijven.
In dit werk werd fluorescentie anisotropie gebruikt als een techniek om de wisselwerking karakteriseren tussen de GTPase EFL1 en SBDS-eiwit. Deze eiwitten deel aan de synthese van ribosomen door het bevorderen van de afgifte van eukaryote initiatie factor 6 van het oppervlak van de 60S ribosomale subeenheid 8. De SBDS eiwit is gemuteerd in een ziekte bekend als de Shwachman-Diamond Syndroom 9 en fungeert als een guanine nucleotide exchange factor voor EFL1 verlagen van de affiniteit voor guanosinedifosfaat 10,11. Disease mutaties in SBDS afschaffing van de interactie met EFL1 en daarmee te voorkomen dat de activering.
Fluorescentie anisotropie wordt algemeen gebruikt in biologische toepassingen eiwit-peptide of eiwit-nucleïnezuur interacties te bestuderen. Het is gebaseerd op het principe dat een fluorofoor geëxciteerd met gepolariseerd licht resulteert in een gedeeltelijk gepolariseerde emissie. Fluorescentie anisotropie wordt gedefinieerd door Vergelijking 1:
waar ik vv en ik VH zijn defluorescentie-intensiteiten van de verticaal (VV) en horizontaal (VH) gepolariseerde emissie wanneer het monster is enthousiast met verticaal licht 12 gepolariseerd. Fluorescentie anisotropie is gevoelig voor factoren die de snelheid van de rotatiediffusie van de fluorofoor beïnvloeden en derhalve afhankelijk van de temperatuur, de viscositeit van de oplossing en de schijnbare molecuulgrootte van de fluorofoor. De schijnbare grootte van een eiwit dat een fluorofoor toeneemt bij interactie met een ander eiwit en dergelijke veranderingen kunnen vervolgens worden beoordeeld als een verandering van anisotropie. Meer specifiek zal een fluorofoor die langzaam roteert in oplossing ten opzichte van de fluorescentie levensduur grote I VV waarde en kleine ik VH waarde en dus een relatief grote anisotropie vertonen. Voor fluoroforen die snel in verhouding tot hun fluorescerende leven tuimelen, ik vv en ik VH zal vergelijkbaar zijn en hun anisotropie waarde klein zijn 12 (Figuur 1). Bovendien, voor een goede anisotropie signaal geluidsmeting, is het noodzakelijk om een fluorofoor een fluorescentie levensduur vergelijkbaar met de rotatiecorrelatietijd van het molecuul van belang hebben. Anders is het niet mogelijk om het verschil in anisotropie tussen vrij proteïne en dat in het complex een accurate. Bijvoorbeeld, de anisotropie van een fluorescerende probe met een levensduur bijna 4 nsec zoals fluoresceïne of rhodamine bevestigd aan een laag gewicht verbinding met 100 Da molecuulgewicht is 0,05. Binding aan een molecuul van 160 kDa zal de anisotropie waarde te verhogen tot 0,29; een verschil dat nauwkeurig kan worden gemeten. Daarentegen zullen dezelfde fluorescerende probe betrokken in een bindingsreactie waarvan de toename van moleculaire grootte varieert van 65 tot 1000 kDa alleen tot een verandering anisotropie van 0,28 tot 0,3, die te klein nauwkeurig te meten. In dit scenario zou een sonde met een levensduur van 400 nanoseconden meer geschikt 12 zijn.
Figuur 1. Schematische weergave van de gebruikte fluorescentie anisotropie en de procedure meetapparatuur. Schematische weergave van de gebruikte om een eiwit-eiwit interactie experiment meten van fluorescentie anisotropie te voeren apparatuur. Fluoroforen dat snelle weergave kleine anisotropie die toeneemt bij binding aan een interactie partner tuimelen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Fluorescentietoepassingen vereisen de aanwezigheid van een fluorofoor in elk van de moleculen bestudeerd. Bestuderen eiwit-eiwit interacties zijn er drie type fluoroforen: 1) het tryptofaan residuen in de eiwitten, 2) chemisch gebonden fluoroforen en 3) fluorescerende fusiepartners zoals groen fluorescent eiwit (GFP) en derivatieven. De meeste eiwitten hebben tryptofaan residuen van de structuur, waardoor de gemakkelijkste manier om een interactie te meten is door het bewaken van de veranderingen in de overeenkomstige fluorescentie spectra of door het bewaken veranderingen in de fluorescentie-intensiteit van het tryptofaan residuen. Evenwel tryptofaan residuen in beide eiwitten compliceert de analyse. Anderzijds, een fluorofoor de fluorescerende eigenschappen veranderen als gevolg van een interactie moet worden op of vlakbij de bindingsplaats en het kan interfereren met de interactie zelf. Dit heeft speciale aandacht nodig bij het gebruik van omvangrijke fluoroforen zoals GFP. Als geen van deze fluoroforen kunnen worden gebruikt voor bindingsstudies moet dan extrinsieke fluoroforen voeren aan die van de betrokken eiwitten. Vele chemisch gesynthetiseerde fluoroforen aanwezig en kunnen covalent worden gehecht aan proteïnen via hun reactieve groepen zoals aminogroepen (zijketen van lysines of N-terminus) en de thiolgroepen in cysteine. Fluorophore derivaten met isothiocyanaat en succinimidyl esters reageren met amidegroepen terwijl joodacetamide en maleimide zijn thiol-reactieve groepen 13. De meest voorkomende kleurstoffen in fluorescentietoepassingen zijn derivaten van de fluoresceïne en de rhodamine groene kleurstoffen, coumarines, BODIPY fluoroforen en Alexa Fluor kleurstoffen. Een gedetailleerde lijst van in de handel verkrijgbare fluoroforen en het gebruik ervan kan worden gevonden in de referenties 14,15. Voor succesvolle labeling, moet de reactieve groep wordt blootgesteld aan het oppervlak van het proteïne, maar door het grote aantal reactieve functionele groepen typisch in polypeptiden is het erg moeilijk om plaatsspecifieke modificatie krijgen. Het eiwit van belang in dit onderzoek SBDS bevat 5 cysteïnes vrij en 33 lysines die kunnen leiden tot multisite labeling. Niet-uniforme etikettering kan de binding beïnvloeden en zal data-analyse compliceren als verschillende fluorofoor moleculen verschillende fluorescentie-intensiteit signalen bij binding kan uitlokken. om overcome dit probleem, gebruikten we de flitser fluorofoor, 4 ', 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-vl) fluoresceïne aan de site-directe label de SBDS eiwit. Dit is een arseenoxide kleurstof met een hoge affiniteit voor vier cysteïnen gescheiden in een motief bekend als flash-tag bestaat uit de sequentie CCXXCC waarbij X elk aminozuur behalve cysteïne 16,17. Dit tetracysteine motief wordt toegevoegd aan de N- of C-terminus van het eiwit door genetische manipulatie met een geschikte linker aan de verstoring van de algehele vouw van het eiwit te voorkomen. Het paar bestaande uit Flash kleurstof en flash-tag werd oorspronkelijk ontworpen om plaatsspecifieke label eiwitten in levende cellen 17 maar het kan ook worden gebruikt om gezuiverde eiwitten in vitro labelen zoals hier toegelicht. Daarnaast zijn ook enzymatische strategieën ontwikkeld om plaatsspecifieke functionalisering van eiwitten 18 mogelijk.
In dit manuscript beschrijven we de bruikbaarheid van een fluorescentie anisotropiesa instrument om eiwit-eiwitinteracties. Binding kan worden beoordeeld door een eenvoudige inspectie van de binding curve vorm, terwijl kwantitatieve informatie kan worden verkregen bij de pasvorm van de experimentele gegevens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. SBDS-flash Tag Protein Expressie en zuivering
OPMERKING: Bij de experimenten anisotropie, een FLASH-tag die overeenkomt met de sequentie Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys werd aan de C-terminus van de menselijke SBDS coderende sequentie met PCR toegevoegd. Dit construct werd gesubkloneerd in de expressievector pRSET-A en getransformeerd in Escherichia coli C41 cellen aan een eiwit dat codeert voor een N-eindstandig hexahistidine tag (His-tag) expressie, het humane SBDS coderende sequentie en een C-terminus Flash tag 10.
- SBDS-flash eiwitexpressie
- Transformeer competente E. coli C41 cellen met het plasmide pRSET-HisSBDS-flitser met een standaard heat shock-protocol 19. Plaat de cellen in vaste Luria-Bertani (LB) medium aangevuld met 100 ug / ml ampicilline. LB vaste media samenstelling bestaat uit 10 g NaCl, 5 g gistextract, 10 g trypton en 20 g agar voor 1 L volume.
- Cultuur getransformeerde bacteriën bij 37 ° C totabsorptie bij 600 nm (600 A) bereikt 0,5-0,7 in 1 L LB vloeibaar medium aangevuld met 100 ug / ml ampicilline.
- Eiwitexpressie induceren door toevoeging van 0,5 mM isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside 1 aan de kweek en de incubatie voort gedurende nog 5 uur.
- Verzamel de bacteriële suspensie door centrifugeren bij 3800 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant. Op dit punt, hetzij slaan de celpellet bij -20 ° C of het gebruik ervan voor eiwitzuivering.
- SBDS-flash eiwitzuivering
Opmerking: Alle chromatografische stappen worden uitgevoerd met een snelle proteïne vloeistofchromatografie (FPLC) -systeem of een peristaltische pomp. Ni 2+ Affiniteit chromatografie maakt gebruik van een 5 ml snelle doorstroming kolom. Anionische uitwisselingschromatografie maakt gebruik van een 5 ml sterke sulfopropyl kationenwisselaar kolom. Een stroomsnelheid van 3 ml / min werd gebruikt voor alle chromatografische stappen.- Resuspendeer de cellen in 35 ml Lysis b SBDSUffer (50 mM fosfaatbuffer pH 7,5, 300 mM NaCl, 20 mM imidazool) aangevuld met 1 mM fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) en lyseren door sonicatie gedurende een totale tijdsduur van 4 min met cycli van 10 seconden aan en 30 seconden uit, bij 4 ° C.
- Centrifugeer het monster bij 9000 xg gedurende 50 min bij 4 ° C.
- Houd de bovenstaande vloeistof en gooi de pellet om cellulaire vuil te verwijderen.
- Evenwicht van de Ni 2+ affiniteitskolom met 3 kolomvolumes (CV) van SBDS lysisbuffer en de hele geklaarde supernatant op de kolom te introduceren.
- Verwijder ongebonden eiwit door wassen met 3 CV van SBDS Lysis buffer en geëlueerd met 3 CV van SBDS elutiebuffer (50 mM fosfaatbuffer pH 7,5, 300 mM NaCl, 250 mM imidazool).
- Verdun het geëlueerde eiwit 6-maal met 50 mM fosfaatbuffer pH 6,5 en verwijder eventuele aggregaten door filtratie door een 0,22 urn cellulose membraan.
- Evenwicht de sulfopropyl kationenwisselaar kolom met 3 CV van Low zout S kolombuffer (50 mM fosfaatbuffer pH 6,5, 50 mM NaCl) en het eiwit introduceren monster van de vorige stap.
- Wassen van ongebonden materiaal met 3 CV van buffer Zoutarme S kolom en elueer het eiwit in één stap met 50 mM fosfaatbuffer pH 6,5, 1 M NaCl.
- Verdun het geëlueerde eiwit 3,3-voudig met 50 mM fosfaatbuffer pH 6,5. Concentreer het eiwit met ultrafiltratie inrichtingen door centrifugeren bij 3800 xg gedurende 15 min. Flash bevriezen het eiwit in vloeibare stikstof en het op -80 ° C tot verder gebruik.
- Controleer de zuiverheid van het eiwit door SDS-PAGE-analyse en Coomassie kleuring 20.
2. EFL1 Protein Expressie en zuivering
LET OP: EFL1 werd tot expressie gebracht onder de regulering van de Gal 1/10 divergente promotor 21 en de Saccharomyces cerevisiae MAT Een 3'UTR in de vector pRS426. Het recombinante eiwit codeert het humane isovorm EFL1 1 gefuseerd aan een Tobacco Etch Virus protease (TEV) herkenningsplaats en een hexahistidine tag aan het C-terminus.
- EFL1 eiwitexpressie
- Transformeer S. BCY123 cerevisiae cellen met het plasmide pRS426-EFL1TevHis met een standaard lithium acetate protocol 22. Plaat alle getransformeerde cellen synthetische uitval medium zonder uracil (SD-URA) aangevuld met 2% (w / v) glucose. Samenstelling van het SD-URA media bestaat uit 8 g gist stikstofbase zonder aminozuren, 11 g casaminozuren, 55 mg adenine sulfaat, 55 mg tyrosine, leucine en 60 mg 60 mg tryptofaan 1 L volume.
- Kweken van de getransformeerde gisten bij 30 ° C tot 600 A 1,8 in 1 liter SD-URA medium aangevuld met 0,5% (w / v) glucose bereikt.
- Eiwitexpressie induceren door toevoeging van 2,8% (w / v) galactose aan de kweek en de incubatie gedurende nog 18 uur voortgezet bij 30 ° C.
- Verzamel de gistsuspensie door centrifugeren bij 3800 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.Op dit punt, hetzij slaan de celpellet bij -20 ° C of het gebruik ervan voor eiwitzuivering.
- EFL1 eiwitzuivering
Opmerking: Alle chromatografische stappen worden uitgevoerd met een FPLC-systeem of een peristaltische pomp. Ni2 + Affiniteit chromatografie maakt gebruik van een 5 ml Fast Flow kolom bij een stroomsnelheid van 3 ml / min. Gelpermeatiechromatografie gebruikt een 125 ml kolom vooraf gepakt met Superdex 200 hars bij een stroomsnelheid van 1 ml / min.- Resuspendeer de cellen in 50 ml EFL1 Lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 8, 300 mM NaCl, 20 mM imidazool, 5 mM MgCl2, 10% glycerol) aangevuld met 1 mM PMSF en 1 mM benzamidine en verstoren de cellen door wrijving op een bead beater gebruikt glasparels (Ø = 0,5 mm) voor een totale tijd van 6 min met cycli van 2 minuten aan en 15 minuten uit, bij 4 ° C.
- Centrifugeer het monster bij 9000 xg gedurende 50 min bij 4 ° C.
- Houd de bovenstaande vloeistof en gooi de pellet om cellulaire vuil te verwijderen. Equilibreren de affiniteitskolom Ni2 + met 3 CV van EFL1 lysisbuffer en voeren alle geklaarde supernatant op de kolom.
- Verwijder ongebonden eiwit door wassen met 3 CV van EFL1 Lysis buffer en geëlueerd met 3 CV van EFL1 elutiebuffer (50 mM Tris-HCl pH 8, 300 mM NaCl, 250 mM imidazool, 5 mM MgCl2, 10% glycerol).
- Equilibreren de gelfiltratiekolom met 1,5 CV anisotropie buffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 300 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 10% glycerol, 5 mM β-mercaptoethanol).
- Concentreren 1 ml EFL1 het eiwit geëlueerd uit de Ni2 + affiniteitskolom met ultrafiltratie inrichtingen door centrifugatie bij 3800 xg om het gewenste volume. Voeren het monster op de gelfiltratiekolom.
- Verzamel de geëlueerde eiwit en concentreren door ultrafiltratie tot een uiteindelijke concentratie van ongeveer 30 uM. Flash bevriezen het eiwit in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 ° C tot verder gebruik. Controleer the zuiverheid van het eiwit door SDS-PAGE-analyse en Coomassie kleuring 20.
3. Etikettering van SBDS-flitser met de Flash-fluorescerende kleurstof 4 ', 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-vl) Fluoresceïne
- Meng 3 nmol van de SBDS-FLASH eiwit met 3 nmol van de 4 ', 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluoresceïne kleurstof in 5 ui volume anisotropie buffer.
- Laat de reactie verlopen gedurende 8 uur bij 4 ° C. Dialyseren het monster tegen Anisotropy buffer 's nachts naar de vrije kleurstof te verwijderen.
- Gebruik de Lambert-Beer wet om het% van gemerkt eiwit te kwantificeren. Meet de absorptie bij 280 nm en 508 nm in een spectrofotometer met een kwarts cuvet van passende omvang. LET OP: Houd rekening met de volgende molaire absorptie coëfficiënten (M -1 cm -1):
- Bereken de concentratie van gelabeld SBDS-flash-eiwit met behulp van Vergelijking 2.
- Bereken de concentratie van de totale SBDS eiwit met behulp van Vergelijking 3 door het vervangen van de berekende C SBDS-flits van vorige stap.
- Bereken het percentage gemerkte eiwitten met behulp van vergelijking 4.
4. Fluorescentie anisotropie Experimenten
OPMERKING: Anisotropie experimenten werden uitgevoerd in een spectrofluorometer uitgerust met een polarisatie toolbox en gegevensverzameling werd uitgevoerd met het programma anisotropie verschaft in de software van de apparatuur. De excitatiegolflengte werd ingesteld op 494 nm met een spectrale bandbreedte van 8 nm en de emissie werd opgenomen met een banddoorlaatfilter van 530 ± 25 nm. Metingen werden uitgevoerd bij 25 ° C in 200 gl cuvet met een lengte 5 mm pad 10.
- In een fluorescentie cuvette, plaats 200 ul 30 nM SBDS-flitser in de anisotropie buffer en titreer 2 pl 30 uM EFL1. Meng goed en laat de reactie staan voor 3 minuten voor het meten van de anisotropie waarde.
- Herhaal stap 4,1 tot een totaal volume van 40 gl EFL1 toegevoegd.
5. Data Analysis
- Bij de data op de juiste binding model met behulp van een lineaire kleinste kwadraten regressie algoritme. Vergelijkingen voor de meest voorkomende bindingsmodellen worden in tabel 1.
- Evalueer het beste model dat de interactie tussen de eiwitten beschreven door inspectie van de residuen van de pasvorm 23. Ondersteuning van het gekozen model met extra experimenten.
Tabel 1. Gemeenschappelijke eiwit-eiwit interactie binding modellen en de wiskundige vergelijkingen die ze beschrijven.0 / 54640table1large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze tabel te bekijken. 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om anisotropie experiment uitvoert is het belangrijk uit te sluiten grote veranderingen in de fluorescentie-intensiteit van de fluorofoor aangezien de waargenomen anisotropie van een mengsel van species wordt vertegenwoordigd door Vergelijking 5:
waarin F i de fractionele fluorescentie van elke component en r i de overeenkomstige anisotropie. De fractionele fluorescentie van elk bestanddeel hangt af van zowel de concentratie en de relatieve fluorescentie, die wordt gedefinieerd door Vergelijking 6:
waarbij X i de molfractie the i-de specie en Ø i is de quantum opbrengst van de i-de specie.
Dus als fluorescentie-intensiteit drastisch verandert langs de titratie is het beter om ofwel meten complexvorming als functie van de verandering in fluorescentie signaal en geen van de anisotropie signaal, of verbeteren de waargenomen anisotropie waarde aanbrengen zowel de fluorescentie-intensiteit en de anisotropie gegevens. De fluorescentie van SBDS Flash niet waarneembaar bij binding aan EFL1 (figuur 2) suggereert dat fluorescentie anisotropie geschikt zijn om de binding tussen de twee eiwitten.
Figuur 2. Fluorescentie-emissie van SBDS-flitser na titratie van toenemende concentraties van EFL1. Veranderingen in de fluorescentie-emissie van de fluorofoor zijn negligible en willekeurige langs de titratie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Een voorbeeld van de fluorescentie anisotropie bindingscurve verkregen door titratie van EFL1 tot SBDS-Flash is getoond in figuur 3. Kwalitatief gezien de vorm van de grafiek blijkt duidelijk dat de twee eiwitten interageren zoals blijkt uit een toename van de anisotropie signaal na toevoeging van EFL1. Bovendien anisotropie waarden bereikte een plateau suggereert dat eind van de titratie aanwezig in een complex met EFL1 was de SBDS FLASH-eiwit. Het is dan mogelijk, kwantitatief beschrijven de interactie tussen deze eiwitten en bij de data via lineaire kleinste kwadraten regressie tot een verwachte bindend model en het verkrijgen van de overeenkomstige dissociatie evenwichtsconstante. Montage van een één bindingsplaats model niet approprilijk beschrijven de experimentele data (figuur 3A). Dit blijkt niet alleen uit de fitting spoor in de bindingscurve maar ook de afwijkingen van de residuen van de pasvorm (het verschil tussen de theoretische en experimentele gegevens) die aanzienlijke en nonrandom zijn. Dit komt goed overeen met het feit dat een enkele bindingsplaats model mathematisch wordt beschreven door een hyperbolische curve in plaats van een sigmoïdale curve als deze waargenomen voor de experimentele gegevens die in Figuur 3. Anderzijds, modellen bijvoorbeeld twee dezelfde of twee verschillende bindende verwijzingen beschrijven beter de experimentele gegevens en de residuen van de passing vertonen geen systematische afwijking ondersteunt twee ter associatiemodel (figuur 3B-C). Aangezien alle andere experimentele gegevens is moeilijk om een van de twee modellen corresponderen met het bindingsmechanisme tussen EFL1 en SBDS. Toch SBDS en EFL1 zijn beide monomere eiwitten, dus het is difficult een twee identieke bindingsplaatsen model overwegen.
. Figuur 3. Fluorescentie anisotropie binding isotherm van de interactie tussen EFL1 en SBDS-flash de doorlopende lijn in elk van de bovenste percelen correspondeert met de passing van de gegevens naar verschillende bindende modellen: (A) één locatie (B) twee identieke plaatsen en (C) twee niet-identieke plaatsen. Lagere plots vertegenwoordigen de residuen van de fit aan het desbetreffende model. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De meeste biochemische experimenten eiwitten vereisen niet alleen zuivere eiwit, maar ook grote hoeveelheden daarvan, ongeacht de gebruikte techniek. Daarom worden de voor dit type experimenten eiwitten verkregen door heterologe expressie, zoals het geval was gepresenteerd. Fluorescentie spectroscopie vereist de aanwezigheid van een fluorofoor in het onderzochte molecuul. Aromatische resten vormen de intrinsieke fluoroforen van een eiwit, maar met behulp van hun signaal eiwit-eiwitinteracties compliceert de analyse omdat ze voor de meeste eiwitten en zouden aanwezig zijn in beide, de receptor eiwit en het ligand. Bovendien is de levensduur van tryptofaan zodanig korte fluorescentie anisotropie experimenten. Daarom is het gebruikelijk om extrinsieke fluoroforen aan één van de onderzochte proteïnen. Hiertoe werd een fluorofoor aan de C-terminus van SBDS toegevoegd via een coördinatiebinding tussen de kleurstof 4 ', 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein met tetracysteine motief geïntroduceerd in het eiwit door genetische manipulatie. Het kiezen van de proteïne die de fluorofoor ontbloot is niet willekeurig kwestie. Vanwege de grootte van het proteïne, onderzocht (SBDS 29 kDa en EFL1 127 kDa), verwachtten we een grotere verandering van anisotropie tussen vrije gelabelde SBDS en in complex met EFL1, vergeleken met de verandering verwacht tussen vrije gelabelde EFL1 en gebonden aan SBDS. Met dit in het achterhoofd, werd een flash-tag geïntroduceerd in SBDS in plaats van aan EFL1. Een andere parameter belangrijk om te overwegen bij het opzetten van een fluorescentie anisotropie experiment is de absorptie van de gebruikte oplossingen. De extinctie van de oplossing in de cuvet mag niet groter zijn dan 0,1 bij de golflengte excitatie en emissie zijn en moet constant blijven over de gehele titratie. Anders kan innerlijke filter effect mengen in de meet- en moeten worden gecorrigeerd voor. In het experiment hier gepresenteerde hebben de eiwitten bestudeerd niet absorberen bij de golflengte van excitation of emissie van de 4 ', 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluoresceïne kleurstof; dus innerlijke filter effect geen probleem vormen.
Betreffende gegevensverzameling, en vervolgens goed past de gegevens, is het noodzakelijk om goed gedefinieerde onderste en bovenste baselines met verscheidene gegevenspunten zijn door de overgang langs de bindingscurve. Anders, montage van de gegevens is onjuist en informatie met betrekking tot de binding mode kunnen verloren gaan. Om een goede binding curve noodzakelijk dat de concentratie van vrije ligand verschilt door twee logaritmische eenheden onder en boven de dissociatieconstante is beschreven, echter experimenteel kan moeilijk te bereiken. In de ondergrens, kan problemen de gevoeligheid van de apparatuur in het bijzonder voordoen wanneer de affiniteit tussen de eiwitten is zeer hoog, terwijl grote concentraties niet haalbaar kan het gevolg oplosbaarheidsproblemen van het ligand. Dit werd duidelijk geïllustreerd bij het testen van de interactie tussen de SBDSS143L ziekte mutant en EFL1. Deze mutant verstoorde de binding aan EFL1 zodanig dat het niet mogelijk was om een geschikte bindende kromme worden omdat EFL1 kunnen alleen tot 70 uM geconcentreerd en het eiwit wordt verdund ≈ 5 maal tijdens de titratie 10. Derhalve is het noodzakelijk om een ruwe schatting van de affiniteit voor het titratieschema optimaliseren en zorgen dat springt in ligand concentratie niet voor op plaatsen waar een minder nauwkeurige pasvorm zou veroorzaken. Bijvoorbeeld, het missen van de eerste punten van de binding curve weergegeven in figuur 3 zal het eruit zien als een hyperbool misleiding van de onderzoeker naar één bindingsplaats model.
Eenmaal verzameld, werden gegevens gemonteerd op een veronderstelde bindend model. In vergelijking met gegevens fluorescentie kan anisotropie data worden gebruikt zonder verdere manipulatie en geen correctie voor verdunning die niet nodig. De vergelijkingen in tabel 1 mening dat [L] ≈[L] 0 op elk punt van de titratie. Dit kan niet gebeuren als de affiniteit tussen de eiwitten zeer hoog zodanig dat in de eerste punten van de titratie ligand depletie optreedt. In dit scenario beschreven complexere kwadratische vergelijkingen elders 23 nodig zijn gegevens aanpassen. In het hier beschreven experiment werd de ligand EFL1 altijd in grote overmaat vergeleken met de concentratie van SBDS-flash en de verandering in EFL1 concentratie op elk punt van de titratie kan worden genegeerd. Zoals besproken in de sectie resultaten, twee niet-identieke bindingsplaatsen model het best te omschrijven de experimentele data (Figuur 3C). Aanvullende biochemische gegevens die bij de fractie steunt het idee dat dit het juiste model om de interactie tussen EFL1 en SBDS beschrijven (gegevens niet getoond). Deze wijze van interactie vaak in multi-domein eiwitten, zoals EFL1 en SBDS zijn, en verscheidene voorbeelden zijn in de literatuur 24-26. Het is echter eenLSO belangrijk om uit te sluiten een niet-specifieke interactie die kan worden weergegeven als een interactie model van de verschillende bindingsplaatsen met verschillende affiniteiten voor hun ligand. Daartoe een Scatchard-grafiek is zeer nuttig. Vergeleken met andere technieken, fluorescentie anisotropie signaal meldt de hoeveelheid gevormd complex en daardoor is het mogelijk om een Scatchard-grafiek van de gegevens te bouwen. Een Scatchard convexe curve suggereert Twee verschillende bindingsplaatsen coöperatief model negatief of aspecifieke binding, terwijl een concaaf Scatchard plot impliceert twee verschillende bindingsplaatsen model met positieve coöperativiteit of ligand instabiliteit (figuur 4). Analyse van de experimentele gegevens bleek een Scatchard plot met een holle vorm ter ondersteuning van het model van twee onafhankelijke bindingsplaatsen voor EFL1 en SBDS (figuur 4D). Bovendien werd positief coöperativiteit bevestigd na het uitvoeren van een Hill analyse die resulteerde in een Hill-coëfficiënt van 1,8 ± 0,02 (gegevens niet getoond).
Figuur 4. Scatchard plots voor verschillende eiwit-eiwit binding modellen. (A) Single bindingsplaats of meerdere identieke sites die niet op elkaar inwerken. (B) meerdere verschillende bindingsplaatsen coöperatief vermogen negatief of aspecifieke binding. (C) meerdere verschillende bindingsplaatsen met positieve coöperativiteit of ligand instabiliteit. (D) Scatchard plot die voortvloeien uit de analyse van de experimentele anisotropie data verkregen uit de titratie van EFL1 om SBDS-flitser. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Fluorescentie anisotropie is een oplossing gebaseerde, true-evenwicht techniek die de onderzochte moleculen nodig oplossing bij de geteste omstandigheden blijven. Het kan worden gebruikt voor onderzoek niet oply de interactie tussen volledige-lengte eiwitten, maar ook de interactie tussen eiwitdomeinen, mutante eiwitten of peptiden met post-translationele modificaties. Bovendien kan fluorescentie anisotropie ook worden gebruikt om de binding van eiwitten meten lipide membranen met fluorescerende probes gevoelige membranen. Deze aanpak is met succes gebruikt om het effect dat a-synucleïne heeft op synaptische blaasjes verpakking 27 te bestuderen. Een van de belangrijkste voordelen van fluorescentie anisotropie is dat het kwantitatieve informatie over de binding van de onderzochte moleculen die ware dissociatieconstanten samen verkrijgbaar mechanistische informatie. Hoewel andere biofysische technieken ook kunnen worden gebruikt om dergelijke informatie te verkrijgen, fluorescentie anisotropie moeten kleine hoeveelheden monster en kan niet alleen uitgevoerd worden in evenwicht, zoals hier voorgesteld, maar ook met behulp van snelle kinetiek, zoals gestopte stroming fluorometrie, is bij krijgen en dissociatiesnelheidconstanten (k op en k off, respectievelijk) 28. Een vergelijkende tabel met de voor- en nadelen van de fluorescentie anisotropie met betrekking tot andere biofysische technieken wordt weergegeven in tabel 2. Alle beschreven methoden zijn true-evenwicht technieken omdat geen van hen zijn onder andere een proces van mechanische scheiding van de vrije en gebonden fracties. Zoals vermeld in de sectie resultaten, indien de fluorescentie-intensiteit van een gemerkt eiwit grotendeels verandert na interactie Deze eigenschap kan gebruikt worden om de affiniteit van de binding te kwantificeren. Veranderingen in fluorescentie-intensiteit als gevolg van de wisselwerking suggereren een mogelijke interferentie van de extrinsieke fluorofoor de moleculaire interactie zelf; namelijk een eventuele verstoring van de dissociatieconstante (Kd) waarde van de overeenkomstige niet-gelabelde eiwitten. Als zodanig kan fluorescentie anisotropie worden beschouwd een minder invasieve techniek dan changes in fluorescentie-intensiteit aangezien de eerste worden toegepast bij fluorescentie-intensiteit verandert niet na interactie. In die zin, hoewel grote hoeveelheden van het eiwit vereist, Isotherme Titratie Calorimetrie (ITC) een werkelijke Kd waarde van de moleculaire interactie verschaffen omdat het label een vrij methode. Anderzijds wordt mechanistische informatie niet verkregen vanwege verschillen in warmte alleen gegevens over de enthalpie van het proces en niet de hoeveelheid gevormde complex 29.
Ter vergelijking, in vivo zoals gist twee-hybride of fragment complementatie bepalingen vereisen geen gezuiverde eiwitten, maar ze alleen semi-kwantitatieve informatie over de wijze van binding. Hoewel in de gist twee-hybride techniek is het mogelijk om de sterkte van de binding met behulp Miller eenheden uitdrukken, dit geen echte evenwichtsconstante en vele factoren buiten de controle van de onderzoeker kan veranderen.
Tabel 2. Voor- en nadelen van de meest gebruikte biofysische technieken die worden gebruikt om eiwit-eiwit interacties te bestuderen. Klik hier om een grotere versie van deze tabel te bekijken. 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mm Glass beads | Biospec Products | 11079105 | |
| Tris Base | Formedium | TRIS01 | Ultra pure |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| dye 4’,5’-bis(1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein | ThermoFischer Scientific | LC6090 | This kit contains the dye to label a FlAsH tag |
| Ampiciline | IBI Shelton Scientific, Inc | IB02040 | |
| D(+)-Glucose Anhydrous | Formedium | GLU03 | |
| D(+)-Galactose | Formedium | GAL03 | |
| L-Leucine | Formedium | DOC0157 | |
| L-Tryptofan | Formedium | DOC0189 | |
| Bezamidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | B6506-5G | |
| PMSF | Gold Biotechnology, Inc | P-470-25 | Phenylmethylsulfonyl fluoride |
| NaCl | Formedium | NAC02 | Sodium Chloride |
| Glycerol | Tecsiquim, S.A. de C.V. | GT1980-6 | |
| MgCl2 | Merck Millipore Corporation | 1725711000 | Magnesium Chloride |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399-500G | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786-500G | Potassium phosphate dibasic |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S3139-500G | Sodium phosphate monobasic |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0410 | |
| Yeast extract | Formedium | YEM03 | Micro Granulated |
| L-Tyroisne | Formedium | DOC0193 | |
| Adenine sulphate | Formedium | DOC0230 | |
| Casamino acids | Formedium | CAS03 | |
| Tryptone | IBI Shelton Scientific, Inc | IB49182 | |
| IPTG | Formedium | IPTG025 | |
| Filtration units | Merck Millipore Corporation | UFC901096 | Amicon Ultra-15, membrana PLGC Ultracel-PL, 10 kDa |
| Membrane Filter | Merck Millipore Corporation | GSWP04700 | Membrane Filter, mixed cellulose esters, Hydrophilic, 0.22 µm, 47 mm, white, plain |
| Ni2+ affinity column | QIAGEN | 30760 | Cartridge pre-filled with 5 ml Ni-NTA Superflow |
| Strong Sulfopropyl cation exchanger column | GE Healthcare Life Science | 17-5157-01 | HiTrap SP Sepharose FF 5 ml |
| Size Exclusion column | GE Healthcare Life Science | 28989335 | HiLoad 16/600 Superdex 200 PG |
| Fluorescence cell | Hellma Analytics | 111-057-40 | |
| Spectrophotometer | Agilent Technologies | G6860AA | Cary 60 UV-Vis |
| Shaker | ThermoFischer Scientific | SHKA4000-7 | MaxQ 4000 Benchtop temperature range Ambient-15° to 60°C |
| Centrifuge | ThermoFischer Scientific | 75004271 | Heraeus Megafuge 16R |
| FPLC | Pharmacia Biotech | Discontinued | FPLC system conductivity UV-MM II monitor P500 pump fraction |
| Spectrofluorometer | Olis | No applicable | Olis DM 45 with Polarization Toolbox |
References
- Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440 (7084), 637-643 (2006).
- Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340, 245-246 (1989).
- Michnick, S. W., Hien Ear, P., Landry, C., Malleshaiah, M. K., Messier, V. A toolkit of protein-fragment complementation assays for studying and dissecting large-scale and dynamic protein-protein interactions in living cells. Methods in Enzymology. 470, 336-366 (2010).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
- Dwane, S., Kiely, P. A. Tools used to study how protein complexes are assembled in signaling cascades. Bioeng Bugs. 2 (5), 247-259 (2011).
- Snider, J., et al. Fundamentals of protein interaction network mapping. Mol Syst Biol. 11 (12), 848 (2015).
- Fersht, A. Structure and mechanism in protein science: a guide to enzyme catalysis and protein folding. Baldwin, R. L. , W. H. Freeman and Company. 191-214 (2002).
- Menne, T. F., et al. The Shwachman-Bodian-Diamond syndrome protein mediates translational activation of ribosomes in yeast. Nat Genet. 39 (4), 486-495 (2007).
- Boocock, G. R., et al. Mutations in SBDS are associated with Shwachman-Diamond syndrome. Nat Genet. 33 (1), 97-101 (2003).
- Garcia-Marquez, A., Gijsbers, A., de la Mora, E., Sanchez-Puig, N. Defective Guanine Nucleotide Exchange in the Elongation Factor-like 1 (EFL1) GTPase by Mutations in the Shwachman-Diamond Syndrome Protein. J Biol Chem. 290 (29), 17669-17678 (2015).
- Gijsbers, A., Garcia-Marquez, A., Luviano, A., Sanchez-Puig, N. Guanine nucleotide exchange in the ribosomal GTPase EFL1 is modulated by the protein mutated in the Shwachman-Diamond syndrome. Biochem Biophys Res Commun. 437 (3), 349-354 (2013).
- Lakowicz, J. R. Principles of fluorescence spectroscopy. , Third, Springer US. (2010).
- Nishigaki, T., Treviño, C. L. Tools to understand protein-protein interactions. Gòmez, I. 37, Transworld Research Network. 1-14 (2012).
- Johnson, I. The Molecular Probes Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. , 11th, Life Technologies Corporation. (2010).
- Sabnis, R. W. Handbook of Fluorescent Dyes and Probes. , Wiley. (2015).
- Adams, S. R., et al. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: synthesis and biological applications. J Am Chem Soc. 124 (21), 6063-6076 (2002).
- Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281 (5374), 269-272 (1998).
- Rashidian, M., Dozier, J. K., Distefano, M. D. Enzymatic labeling of proteins: techniques and approaches. Bioconjug Chem. 24 (8), 1277-1294 (2013).
- Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. Molecular cloning: A laboratory manual. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
- Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250. Electrophoresis. 9 (6), 255-262 (1988).
- West, R. W. Jr, Chen, S. M., Putz, H., Butler, G., Banerjee, M. GAL1-GAL10 divergent promoter region of Saccharomyces cerevisiae contains negative control elements in addition to functionally separate and possibly overlapping upstream activating sequences. Genes Dev. 1 (10), 1118-1131 (1987).
- Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J Bacteriol. 153 (1), 163-168 (1983).
- Eftink, M. R. Fluorescence methods for studying equilibrium macromolecule-ligand interactions. Methods Enzymol. 278, 221-257 (1997).
- Han, H., et al. Binding of Substrates to the Central Pore of the Vps4 ATPase Is Autoinhibited by the Microtubule Interacting and Trafficking (MIT) Domain and Activated by MIT Interacting Motifs (MIMs). J Biol Chem. 290 (21), 13490-13499 (2015).
- Sanchez-Puig, N., Veprintsev, D. B., Fersht, A. R. Binding of natively unfolded HIF-1alpha ODD domain to p53. Mol Cell. 17 (1), 11-21 (2005).
- Trusch, F., et al. The N-terminal Region of the Ubiquitin Regulatory X (UBX) Domain-containing Protein 1 (UBXD1) Modulates Interdomain Communication within the Valosin-containing Protein p97. J Biol Chem. 290 (49), 29414-29427 (2015).
- Kamp, F., Beyer, K. Binding of alpha-synuclein affects the lipid packing in bilayers of small vesicles. The Journal of Biological Chemsitry. 281, 9251-9259 (2006).
- Bujalowski, W. M., Jezewska, M. J. Fluorescence Intensity, Anisotropy, and Transient Dynamic Quenching Stopped-Flow Kinetics. Spectroscopic Methods of Analysis. 875, 105-133 (2012).
- Asano, N., et al. Direct interaction between EFL1 and SBDS is mediated by an intrinsically disordered insertion domain. Biochem Biophys Res Commun. 443 (4), 1251-1256 (2014).
