Summary
Les interactions protéiques sont au cœur de la fonction d'une cellule. techniques calorimétriques et spectroscopiques sont couramment utilisés pour les caractériser. Nous décrivons ici anisotropie de fluorescence comme un outil pour étudier l'interaction entre la protéine mutée dans le syndrome de Shwachman-Diamond (SBDS) et le facteur Allongement-like 1 GTPase (EFL1).
Abstract
interactions protéine-protéine jouent un rôle essentiel dans le fonctionnement d'un organisme vivant. Une fois que l'interaction a été identifié et validé, il est nécessaire de caractériser au niveau structurel et mécaniste. Plusieurs méthodes biochimiques et biophysiques existent à cette fin. Parmi eux, l'anisotropie de fluorescence est une technique puissante utilisée notamment lorsque l'intensité de la fluorescence d'une protéine marqué par un fluorophore reste constant lors d'une interaction protéine-protéine. Dans cette technique, une protéine marqué par un fluorophore est excité avec une lumière polarisée verticalement, d'une longueur d'onde appropriée qui excite sélectivement un sous-ensemble des fluorophores en fonction de leur orientation par rapport au faisceau entrant. L'émission résultant a également une directivité dont la relation dans les plans verticaux et horizontaux définit anisotropie (r) comme suit: r = (I VV -I VH) / (I VV + 2I VH), où je VV et je
Introduction
Les cellules contiennent une multitude de macromolécules biologiques qui interagissent en permanence les uns avec les autres. Cette association donne naissance à des complexes qui participent aux mécanismes cellulaires responsables de leur fonctionnement dans la transduction du signal, la régulation de l'expression génique et la migration cellulaire, entre autres. Toutes les interactions protéine-protéine qui se produisent dans une cellule comprennent un réseau connu sous le nom intéractome. Dans Saccharomyces cerevisiae plus de 70% de ses protéines se sont révélées avoir des partenaires qui interagissent 1. Comprendre l'interactome d'une cellule et leurs fonctions de fournir des informations pertinentes sur la complexité et la diversité des organismes vivants. Plusieurs méthodes ont été décrites pour identifier et caractériser les interactions protéine-protéine. Différent haute grâce à des méthodes telles que mettre deux hybrides de levure 2, protéine fragment complémentation essais 3, la purification par affinité 4 couplée à la spectrométrie de masse et de protéines microarrays sont utilisés pour identifier une interaction 5,6. Une fois identifié, il est nécessaire de le valider et cela peut varier au cas par cas. En règle générale, ces essais impliquent perturber l'interaction elle - même au niveau des membres individuels de la paire d'interaction, par exemple par délétion du gène ou de la surexpression d'une des protéines, puis la recherche de changements dans les propriétés ou la fonction de l'autre élément à la niveau cellulaire. Par la suite, des techniques biophysiques 7 sont utilisées pour caractériser les interactions protéine-protéine au niveau moléculaire. A cet effet, la structure des complexes de protéines sont déterminées par cristallographie aux rayons X, la résonance magnétique nucléaire et de cryo-microscopie électronique tandis que la calorimétrie et la spectroscopie de fluorescence sont utilisés pour décrire quantitativement et mécaniquement entre eux.
Dans ce travail, l'anisotropie de fluorescence a été utilisé comme une technique pour caractériser l'interaction entre la GTPase EFL1 et le SBDprotéine S. Ces protéines participent à la synthèse des ribosomes en favorisant la libération du facteur d'initiation eucaryote 6 à partir de la surface de la sous - unité 60S du ribosome 8. La protéine SBDS est muté dans la maladie connue sous le nom maladie de shwachman 9 et agit comme un facteur d'échange de nucléotide guanine pour EFL1 diminuant son affinité pour le guanosine diphosphate 10,11. mutations de la maladie dans SBDS abolissent l'interaction avec EFL1 et empêchent ainsi son activation.
L'anisotropie de fluorescence est couramment utilisé dans des applications biologiques pour étudier les interactions protéine-acide nucléique-protéine ou un peptide. Elle est basée sur le principe selon lequel un fluorophore excité avec les résultats de la lumière polarisée dans une émission polarisée partiellement. L'anisotropie de fluorescence est définie par l'équation 1:
où je VV et je VH sont laintensités de fluorescence de la verticale (VV) et horizontalement (VH) polarisés émission lorsque l'échantillon est excité par la lumière polarisée verticalement 12. L'anisotropie de fluorescence est sensible à des facteurs qui affectent la vitesse de diffusion du fluorophore de rotation et dépend de la température, la viscosité de la solution et la taille moléculaire apparent du fluorophore ainsi. La taille apparente d'une protéine contenant un fluorophore augmente quand il interagit avec une autre protéine et un tel changement peut alors être évalué en tant que changement dans l'anisotropie. Plus précisément, un fluorophore qui tourne lentement dans la solution par rapport à sa durée de vie de fluorescence aura une grande valeur I VV et une petite valeur I VH et ne seront donc présenter une anisotropie relativement importante. Pour fluorophores qui dégringolent rapidement par rapport à leur durée de vie de fluorescence, je VV et je VH serai semblable et leur valeur d'anisotropie sera faible 12 (Figure 1). En outre, pour un bon signal d'anisotropie à la mesure du bruit, il est nécessaire d'avoir un fluorophore avec une durée de vie de fluorescence similaire au temps de corrélation de rotation de la molécule d'intérêt. Dans le cas contraire, il est impossible d'enregistrer avec précision la différence entre l'anisotropie de la protéine libre et que, dans le complexe. Par exemple, l'anisotropie d'une sonde fluorescente à une durée de vie proche de 4 nsec tels que la fluorescéine ou la rhodamine attachés à un composé de faible masse moléculaire de 100 Da est de 0,05. La liaison à une molécule de 160 kDa va augmenter sa valeur d'anisotropie à 0,29; une différence qui peut être mesuré avec précision. En revanche, la même sonde fluorescente impliquée dans une réaction de liaison dont l'augmentation de la taille moléculaire varie de 65 à 1000 kDa ne permettra d'obtenir un changement d'anisotropie de 0,28 à 0,3, ce qui est trop faible pour être mesurée avec précision. Dans ce scénario, une sonde avec une durée de vie de 400 nanosecondes serait plus approprié 12.
Figure 1. Représentation schématique de l'équipement utilisé pour mesurer l' anisotropie de fluorescence et de la procédure. Représentation schématique de l'équipement utilisé pour effectuer une anisotropie de fluorescence expérience d'interaction protéine-protéine de mesure. Fluorophores qui dégringolent rapide petit écran anisotropie qui augmente lors de la liaison à un partenaire d'interaction. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
les applications de fluorescence nécessitent la présence d'un fluorophore dans une quelconque des molécules étudiées. Pour étudier les interactions protéine-protéine, il existe trois types de fluorophores: 1) les résidus tryptophane présents dans les protéines, 2) des fluorophores attachés chimiquement et 3) les partenaires de fusion fluorescentes telles que la protéine fluorescente verte (GFP) et ses derivatives. La plupart des protéines ont des résidus de tryptophane dans sa structure, donc la meilleure façon de mesurer l'interaction est en surveillant les changements dans les spectres de fluorescence correspondants ou par la surveillance des changements dans l'intensité de fluorescence des résidus tryptophane. Cependant, les résidus tryptophane peuvent être présents dans les deux protéines qui compliquent l'analyse. D'autre part, pour un fluorophore pour modifier ses propriétés de fluorescence due à une interaction dont il a besoin d'être situé sur ou à proximité du site de liaison et il pourrait interférer avec l'interaction elle-même. Cela nécessite une attention particulière lors de l'utilisation de fluorophores volumineux tels que la GFP. Si aucune de ces fluorophores peut être utilisé pour des études de liaison, il est donc nécessaire d'introduire des fluorophores extrinsèques à l'une des protéines impliquées. De nombreux fluorophores synthétisés chimiquement existent et peuvent être fixés de manière covalente à des protéines par l'intermédiaire de leurs groupes réactifs tels que les groupes amine (chaîne latérale de résidus lysine ou N-terminale) et les groupes thiol dans la cystéine. Fles dérivés de luorophore avec de l' isothiocyanate et des esters de succinimidyle réagissent avec des groupes amide tandis que l' iodoacétamide et le maléimide sont des groupes thiol réactifs 13. Les colorants les plus courants utilisés dans les applications de fluorescence sont des dérivés de la fluorescéine et les colorants verts rhodamine, les coumarines, les fluorophores BODIPY et colorants Alexa Fluor. Une liste détaillée des fluorophores disponibles dans le commerce et leur utilisation peut être trouvé dans les références 14,15. Pour le marquage avec succès, le groupe réactif doit être exposée sur la surface de la protéine, mais en raison du grand nombre de groupes fonctionnels réactifs présents dans les polypeptides en général, il est très difficile d'obtenir une modification spécifique d'un site. La protéine d'intérêt dans cette étude, SBDS, contient 5 cysteines libres et 33 lysines qui peuvent résulter dans l'étiquetage des sites multiples. étiquetage non uniforme peut affecter la liaison et va compliquer l'analyse des données différentes molécules fluorophores peuvent provoquer différents signaux d'intensité fluorescente lors de la liaison. Pour overcome ce problème, nous avons utilisé le fluorophore FlAsH, 4 ', 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescéine à l'étiquette du site directement la protéine SBDS. Ceci est un colorant arsenoxide avec une forte affinité pour les quatre cysteines espacées dans un motif connu sous Flash tag comprenant le CCXXCC de séquence où X est un acide aminé autre que la cystéine 16,17. Ce motif tétracystéine est ajouté à l'extrémité N- ou C-terminale de la protéine par génie génétique conjointement avec un agent de liaison approprié pour empêcher la rupture du pli général de la protéine. La paire composée de FlAsH colorant et FlAsH-tag a été initialement conçu pour les protéines d'étiquettes spécifiques au site dans les cellules 17 vivant , mais il peut aussi être utilisé pour marquer des protéines purifiées in vitro comme il est illustré ici. En outre, les stratégies enzymatiques ont également été mis au point pour permettre la fonctionnalisation spécifique au site des protéines 18.
Dans ce manuscrit, nous décrivons l'utilité de l'anisotropie de fluorescence d'unoutil sa pour étudier les interactions protéine-protéine. Reliure peut être évaluée par une simple inspection de la forme de liaison de la courbe tandis que l'information quantitative peut être obtenue à partir de l'ajustement des données expérimentales.
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Protocol
1. SBDS-Flash tag Protein Expression et purification
Remarque: Pour les expériences d'anisotropie, un flash-étiquette correspondant à la séquence Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys a été ajouté à l'extrémité C-terminale des séquences codantes humaines SBDS par PCR. Cette construction a été sous - cloné dans le vecteur d'expression présets-A et transformé en cellules C41 Escherichia coli pour exprimer une protéine codant pour une étiquette hexahistidine N-terminal (His-tag), les SBDS humaines séquence et une extrémité C-terminale ÉCLAIR étiquette 10 codage.
- SBDS-FlAsH expression de la protéine
- Transformer E. compétente cellules coli C41 avec le plasmide présets-HisSBDS-flash en utilisant un protocole de choc thermique standard 19. Plaque les cellules de Luria-Bertani (LB) milieu solide complété avec 100 pg / ml d'ampicilline. La composition des milieux LB solides est constituée de 10 g de NaCl, 5 g d'extrait de levure, 10 g de tryptone et 20 g d'agar à 1 L de volume.
- La culture des bactéries transformées à 37 ° C jusqu'à ce queabsorbance à 600 nm (600) atteint 0,5 à ,7 dans 1 L de milieu LB liquide additionné de 100 pg / ml d' ampicilline.
- Induire l'expression de la protéine en ajoutant 0,5 mM d'isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside à la culture et poursuivre l'incubation pendant encore 5 heures.
- Recueillir la suspension bactérienne par centrifugation à 3800 xg pendant 10 min à 4 ° C. Retirer le surnageant. A ce stade, soit stocker le culot cellulaire à -20 ° C ou à utiliser immédiatement pour la purification des protéines.
- SBDS-FlAsH purification des protéines
Remarque: Toutes les étapes chromatographiques sont effectuées à l'aide d'un système de chromatographie en phase liquide (FPLC), la protéine rapide ou une pompe péristaltique. La chromatographie de Ni 2+ utilise une colonne à écoulement rapide de 5 ml. chromatographie par échange anionique utilise une colonne échangeuse de cations sulfopropyl forte 5 ml. Un débit de 3 ml / min a été utilisé pour toutes les étapes chromatographiques.- Remettre en suspension les cellules dans 35 ml de SBDS b Lysisuffer (50 mM de phosphate tampon à pH 7,5, 300 mM de NaCl, 20 mM d'imidazole) supplémenté avec du fluorure 1 mM de phénylméthylsulfonyle (PMSF) et Lyse par sonification pendant une durée totale de 4 minutes en utilisant des cycles de 10 s ON et 30 s OFF à 4 ° C.
- Centrifuger l'échantillon à 9000 xg pendant 50 min à 4 ° C.
- Gardez le surnageant et jeter le culot pour éliminer les débris cellulaires.
- Equilibrer la colonne d'affinité Ni2 + avec 3 volumes de colonne (CV) de tampon de lyse SBDS et introduire l'ensemble de surnageant clarifié sur la colonne.
- Retirer la protéine non liée par lavage avec 3 CV de tampon Lysis SBDS et éluer avec 3 CV de tampon SBDS Elution (tampon phosphate 50 mM pH 7,5, 300 mM de NaCl, 250 mM imidazole).
- Diluer la protéine de 6 fois en éluant avec un tampon phosphate 50 mM pH 6,5 et éliminer les agrégats éventuels, par filtration à travers une membrane de 0,22 um de cellulose.
- Equilibrer la colonne échangeuse de cations de sulfopropyle avec 3 CV de faible sel S colonneun tampon (tampon phosphate 50 mM pH 6,5, NaCl 50 mM) et d'introduire l'échantillon de protéine à partir de l'étape précédente.
- Lavage la matière non liée avec 3 CV de tampon de colonne S faible teneur en sel et éluer la protéine en une seule étape avec 50 mM de tampon phosphate pH 6,5, 1 M de NaCl.
- Diluer la protéine de 3,3 fois en éluant avec un tampon phosphate 50 mM pH 6,5. Concentrer la protéine avec des dispositifs d'ultrafiltration par centrifugation à 3 800 xg pendant 15 min. Flash geler la protéine dans de l'azote liquide et le stocker à -80 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.
- Vérifier la pureté de la protéine par l' analyse par SDS-PAGE et coloration au Coomassie 20.
2. EFL1 Protein Expression et purification
NOTE: EFL1 a été exprimée sous la régulation du Gal 1/10 promoteur divergent 21 et le Saccharomyces cerevisiae MAT A 3'UTR dans le pRS426 vectoriel. La protéine recombinante codant l'isoforme EFL1 humaine 1 fusionné à un virus protease Tobacco Etch (TEV) site de reconnaissance et d'une étiquette hexahistidine à l'extrémité C-terminale.
- EFL1 expression de la protéine
- Transformer S. cellules cerevisiae BCY123 avec le plasmide pRS426-EFL1TevHis en utilisant un protocole standard au lithium acétate 22. Plate toutes les cellules transformées dans des milieux à goutte synthétique sans uracile (URA SD) supplémenté avec 2% (p / v) de glucose. Composition du milieu SD-URA est composé de 8 g de base azotée de levure sans acides aminés, 11 g d'acides casamino, 55 mg de sulfate d'adénine, 55 mg de tyrosine, 60 mg de leucine et de tryptophane 60 mg pour 1 litre de volume.
- La culture de levure transformée à 30 ° C jusqu'à A600 atteint 1,8 dans 1 litre de milieu SD-URA supplémenté avec 0,5% (p / v) de glucose.
- Induire l'expression de protéine par addition de 2,8% (p / v) de galactose à la culture et poursuivre l'incubation pendant encore 18 heures à 30 ° C.
- Recueillir la suspension de levure par centrifugation à 3800 xg pendant 10 min à 4 ° C. Retirer le surnageant.A ce stade, soit stocker le culot cellulaire à -20 ° C ou à utiliser immédiatement pour la purification des protéines.
- EFL1 purification des protéines
Remarque: Toutes les étapes chromatographiques sont effectuées à l'aide d'un système FPLC ou une pompe péristaltique. La Chromatographie de Ni 2+ utilise une colonne à écoulement rapide de 5 ml à un débit de 3 ml / min de débit. Chromatographie d'exclusion de taille utilise une colonne de 125 ml préalablement garnie de résine Superdex 200 à un débit de 1 ml / min.- Remettre en suspension les cellules dans 50 ml de EFL1 de tampon de lyse (50 mM de Tris-HCl pH 8, 300 mM de NaCl, 20 mM d' imidazole, 5 mM de MgCl2, 10% de glycerol) supplémenté avec 1 mM de PMSF et 1 mM de benzamidine et de perturber les cellules par frottement sur un batteur à billes utilisant des billes de verre (Ø = 0,5 mm) pour une durée totale de 6 min à l'aide des cycles de 2 min et 15 min OFF, à 4 ° C.
- Centrifuger l'échantillon à 9000 xg pendant 50 min à 4 ° C.
- Gardez le surnageant et jeter le culot pour éliminer les débris cellulaires. Equilibrer la colonne d'affinité Ni2 + avec 3 CV de tampon Lysis EFL1 et introduire la totalité du surnageant clarifié sur la colonne.
- Éliminer la protéine non liée par lavage avec 3 CV de tampon de lyse EFL1 et éluer avec 3 CV de tampon d' élution EFL1 (50 mM de Tris-HCl , pH 8, NaCl 300 mM, imidazole 250 mM, MgCl2 5 mM, glycerol à 10%).
- Équilibrer la colonne d'exclusion de taille avec 1,5 CV de tampon d' anisotropie (Tris-HCl 50 mM , pH 7,5, 300 mM de NaCl, 5 mM de MgCl2, 10% de glycerol, 5 mM de β-mercaptoéthanol).
- On concentre à 1 ml de la protéine EFL1 élue de la colonne d'affinité Ni2 + avec des dispositifs d'ultrafiltration par centrifugation à 3 800 x g pour le volume désiré. Introduire l'échantillon sur la colonne d'exclusion de taille.
- Recueillir la protéine éluée et on concentre par ultrafiltration à une concentration finale d'environ 30 uM. Flash geler la protéine dans de l'azote liquide et conserver à -80 ° C jusqu'à utilisation ultérieure. Vérifiez ee pureté de la protéine par analyse SDS-PAGE et coloration au Coomassie 20.
3. Étiquetage des SBDS-avec le flash Fluorescent Dye 4 ', 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescéine
- Mélanger 3 nmol de la protéine SBDS-FlAsH avec 3 nmol de la 4 ', 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescéine dans un volume de 5 pi de tampon anisotropie.
- Laissez la réaction se déroule pendant 8 heures à 4 ° C. Dialyser l'échantillon contre un tampon anisotropie pendant la nuit pour enlever le colorant libre.
- Utilisez la loi de Beer-Lambert pour quantifier le% de protéine marquée. Mesurer l'absorbance à 280 nm et 508 nm dans un spectrophotomètre en utilisant une cuvette en quartz de volume approprié. NOTE: Considérons les coefficients d'absorption molaires suivants (M -1 cm -1):
- Calculer la concentration de protéine marquée SBDS Flash en utilisant l'équation 2.
- Calculer la concentration de protéine totale SBDS en utilisant l' équation 3 en remplaçant la calculé C SBDS-FlAsH de l' étape précédente.
- Calculer le pourcentage de protéine marquée en utilisant l'équation 4.
4. Les expériences Fluorescence anisotropie
REMARQUE: Les expériences ont été effectuées d'anisotropie dans un spectrofluorimètre équipé d'un ensemble de boîtes à outils de polarisation et des données a été effectuée en utilisant le programme d'anisotropie fourni dans le logiciel de l'équipement. La longueur d'onde d'excitation a été réglée à 494 nm avec une largeur de bande spectrale de 8 nm et l'émission a été enregistrée à l'aide d'un filtre passe-bande de 530 ± 25 nm. Les mesures ont été effectuées à 25 ° C dans une cuvette de 200 ul d'une 5 mm de longueur de trajet 10.
- Dans une cuvette de fluorescence, placer 200 pi de 30 nM SBDS clignotements de tampon anisotropie et titrez 2 pl de 30 uM EFL1. Bien mélanger et laisser reposer la réaction pendant 3 minutes avant de mesurer la valeur d'anisotropie.
- Répétez l'étape 4.1 jusqu'à un volume total de 40 pi de EFL1 a été ajouté.
Analyse 5. Données
- Monter les données sur le modèle de liaison approprié à l'aide d'un algorithme non linéaire des moindres carrés de régression. Les équations pour les modèles de liaison les plus courants sont présentés dans le tableau 1.
- Évaluer le meilleur modèle qui décrit l'interaction entre les protéines en inspectant les résidus de l'ajustement 23. Soutenir le modèle choisi avec des expériences supplémentaires.
Tableau 1 : Modèles de liaison commun interaction protéine-protéine et des équations mathématiques qui les décrivent.0 / 54640table1large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette table. 
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Representative Results
Pour effectuer toutes les expériences d'anisotropie, il est important d'éliminer les fortes variations dans l'intensité de fluorescence du fluorophore étant donné que l'anisotropie observée d'un mélange d'espèces est représenté par l'équation 5:
où F i représente la fraction de fluorescence de chaque composant , et r i est l'anisotropie correspondant. La fluorescence de chaque composante fractionnaire dépend à la fois, de sa concentration et de sa fluorescence relative, qui est définie par l'équation 6:
où X i représente la fraction molaire du ièmee i ème espèce et Ø i est le rendement quantique de la i ème espèce.
Ainsi, si l'intensité de la fluorescence change radicalement le long du titrage, il est préférable de non plus de mesurer la formation du complexe en fonction de la variation du signal de fluorescence, et non du signal d'anisotropie, ou de corriger la valeur d'anisotropie observée en ajustant à la fois l'intensité de fluorescence et de l'anisotropie données. La fluorescence de SBDS-FlAsH ne change pas perceptible lors de la liaison à EFL1 (Figure 2) suggérant que l' anisotropie de fluorescence est adéquate pour mesurer la liaison entre les deux protéines.
Figure 2. L' émission de fluorescence de SBDS-FlAsH lors de la titration de concentrations croissantes de EFL1. Les changements dans l'émission de fluorescence du fluorophore sont negligible et aléatoire le long de la titration. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Un exemple de la fluorescence de la courbe obtenue à partir du titrage de EFL1 TGC-flash de liaison anisotropie est représentée sur la figure 3. Qualitativement, la forme du graphique montre clairement que les deux protéines interagissent en évidence par une augmentation du signal d'anisotropie lors de l' addition de EFL1. En outre, les valeurs d'anisotropie ont atteint un plateau qui suggère que, à la fin du titrage toutes les protéines SBDS-FlAsH était présent dans un complexe avec EFL1. Il est donc possible, pour décrire quantitativement l'interaction entre ces protéines et ajuster les données en utilisant non linéaire régression des moindres carrés à un modèle de liaison présumée et obtenir la dissociation correspondante constante d'équilibre. Montage à un seul modèle site de liaison n'a pas approdécrire diatement les données expérimentales (Figure 3A). Cela est évident non seulement à partir du tracé de montage de la courbe de liaison, mais aussi des écarts des résidus de l'ajustement (la différence entre les données théoriques et expérimentales) qui sont appréciables et non aléatoire. Cela correspond bien au fait qu'un seul modèle de site de liaison est décrit mathématiquement par une courbe hyperbolique plutôt que d' une courbe sigmoïde que celle observée pour les données expérimentales présentées dans la figure 3. D'autre part, des modèles tels que les deux identiques ou deux de liaison différent les sites décrivent mieux les données expérimentales et les résidus de l'exposition en forme aucune dérogation systématique soutenant un modèle d'association à deux sites (figure 3B-C). En l'absence de toute autre information expérimentale est difficile d'établir lequel des deux modèles correspondent au mécanisme de liaison entre EFL1 et SBDS. Néanmoins, SBDS et EFL1 sont les deux protéines monomères, il est donc difficult d'envisager deux identiques modèle de sites de liaison.
. Figure 3. Fluorescence anisotropie isothermes de liaison de l'interaction entre EFL1 et SBDS-FlAsH La ligne continue dans chacune des parcelles supérieures correspond à l'ajustement des données à différents modèles de fixation: (A) seul site, (B) deux sites identiques et (C) , deux sites non identiques. Parcelles inférieures représentent les résidus de l'ajustement du modèle correspondant. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
La plupart des expériences biochimiques avec les protéines ne nécessitent pas de protéine pure, mais aussi de grandes quantités d'entre eux, quelle que soit la technique utilisée. Pour cette raison, les protéines utilisées pour ce type d'expériences sont obtenues par expression hétérologue, comme ce fut le cas présenté ici. La spectroscopie de fluorescence nécessite la présence d'un fluorophore dans la molécule étudiée. des résidus aromatiques constituent les fluorophores intrinsèques d'une protéine, toutefois, en utilisant leur signal pour étudier les interactions protéine-protéine complique l'analyse car ils sont communs à la plupart des protéines et seraient présents à la fois, la protéine du récepteur et du ligand. En outre, la durée de vie du tryptophane est trop court pour des expériences de fluorescence d'anisotropie. Pour cette raison, il est courant d'ajouter des fluorophores extrinsèques à l'une des protéines étudiées. A cette fin, un fluorophore a été ajouté à l'extrémité C-terminale des SMD, par une liaison de coordination entre le colorant 4 ', 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein avec un motif tétracystéine introduite dans la protéine par génie génétique. Le choix de la protéine qui met à nu le fluorophore est pas une question aléatoire. En raison de la taille des protéines étudiées ici (SBDS 29 kDa et EFL1 127 kDa), nous nous attendions à un plus grand changement dans anisotropie entre marqué libre-SBDS et que dans un complexe avec EFL1, par rapport à la variation attendue entre marqué libre-EFL1 et que lié à SBDS. Dans cet esprit, une balise FlAsH a été introduit dans SBDS plutôt que de EFL1. Un autre paramètre important à considérer lors de la mise en place d'une expérience de fluorescence d'anisotropie est l'absorption des solutions utilisées. La densité optique de la solution dans la cuvette ne doit pas être supérieure à 0,1 à la longueur d'onde d'excitation et d'émission, et doit rester constante sur toute la titration. Sinon, l'effet de filtre interne peut intervenir dans la mesure et doit être corrigée pour. Dans l'expérience présentée ici, les protéines étudiées n'absorbent à la longueur d'onde de excitation ou d'émission de la 4 ', 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescéine; ainsi l'effet de filtre interne ne pose pas de problème.
En ce qui concerne la collecte des données, et pour adapter ensuite correctement les données, il est nécessaire d'avoir bien défini les lignes de base inférieures et supérieures avec plusieurs points de données à travers la transition le long de la courbe de liaison. Dans le cas contraire, le montage des données sont inexactes et des informations concernant le mode de liaison peut être perdu. Pour décrire une courbe de liaison convenable, il est nécessaire que la concentration de ligand libre diffère par deux unités logarithmiques ci-dessous et au-dessus de la constante de dissociation, cependant, expérimentalement cela peut être difficile à réaliser. Dans la limite inférieure, des problèmes avec la sensibilité de l'appareil peuvent se présenter notamment lorsque l'affinité entre les protéines est très élevé, tandis que de grandes concentrations peuvent ne pas être réalisable en raison de problèmes de solubilité du ligand. Ceci a été clairement illustré lors du test de l'interaction entre le SBDSS143L mutant de la maladie et EFL1. Ce mutant a perturbé la liaison à EFL1 à tel point qu'il n'a pas été possible d'obtenir une courbe de liaison correcte puisque EFL1 ne peut être concentré jusqu'à 70 uM et la protéine est dilué ≈ 5 fois au cours du titrage 10. Ainsi, il est nécessaire d'avoir une estimation grossière de l'affinité pour optimiser le système de titrage et faire en sorte que les sauts de la concentration de ligand ne se produisent pas à des positions qui provoquerait un ajustement moins précis. Par exemple, manquant les points initiaux de la courbe de liaison présentée dans la figure 3 va la faire ressembler à une hyperbole tromper le chercheur vers un modèle unique de site de liaison.
Une fois collectées, les données ont été ajustées à un modèle de liaison présumée. En comparaison avec la fluorescence de données, les données d'anisotropie peuvent être utilisées sans manipulation supplémentaire et ne nécessitent pas de correction des effets de dilution. Les équations présentées dans le tableau 1 estiment que [L] ≈[L] 0 à chaque point de la titration. Cela peut ne pas se produire lorsque l'affinité entre les protéines est très élevée telle que, dans les premiers points de l'épuisement du ligand de titrage se produit. Dans ce scénario, les équations du second degré plus complexes décrites ailleurs 23 sont nécessaires pour ajuster les données. Dans l'expérience décrite ici, le EFL1 ligand était toujours en grand excès par rapport à la concentration de SBDS-clignotera et le changement de la concentration EFL1 à chaque point du titrage peut être négligée. Tel que discuté dans la section des résultats, un modèle à deux sites de liaison non-identiques décrit le mieux les données expérimentales (figure 3C). informations biochimiques supplémentaires obtenues dans le groupe soutient l'idée que ceci est le bon modèle pour décrire l'interaction entre EFL1 et SBDS (données non présentées). Ce mode d'interaction est commun dans les protéines multi-domaines, tels que EFL1 et SMD, et plusieurs exemples existent dans la littérature 24-26. Cependant, il estLSO important d'exclure une interaction non spécifique qui peut apparaître comme un modèle d'interaction des sites de liaison distincts avec des affinités différentes pour leur ligand. À cette fin, un terrain de Scatchard est très utile. Par rapport aux autres techniques, le signal de fluorescence d'anisotropie indique la quantité de complexe formé et, par conséquent, il est possible de construire une représentation de Scatchard des données. Une courbe convexe Scatchard suggère un modèle à deux sites de liaison différents avec coopérativité négative ou une liaison non spécifique, tandis qu'un tracé concave de Scatchard implique un modèle à deux sites de liaison différents avec coopérativité positive ou ligand instabilité (Figure 4). L' analyse des données expérimentales ont montré une parcelle Scatchard avec une forme concave soutenant le modèle de deux sites de liaison indépendants pour EFL1 et SBDS (Figure 4D). En outre, coopérativité positive a été confirmée après avoir effectué une analyse Colline qui a abouti à une valeur de coefficient de Hill de 1,8 ± 0,02 (données non présentées).
Figure 4. parcelles Scatchard pour les modèles de liaison protéine-protéine différente. (A) site de liaison unique ou plusieurs sites identiques qui n'interagissent pas. (B) de sites de liaison différents multiples avec coopérativité négative ou une liaison non spécifique. (C) des sites de liaison différents multiples avec coopérativité positive ou ligand instabilité. Plot (D) de Scatchard résultant de l' analyse des données d'anisotropie expérimentales obtenues à partir de la titration de EFL1 à SBDS-FlAsH. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Fluorescence anisotropie est une vraie technique d'équilibre à base de solution qui nécessite les molécules étudiées pour rester en solution dans les conditions testées. Il peut être utilisé pour étudier pasly l'interaction entre les protéines de pleine longueur, mais aussi de l'interaction entre des domaines de protéines, des protéines mutantes ou même des peptides avec des modifications post-traductionnelles. Par ailleurs, l'anisotropie de fluorescence peut également être utilisé pour mesurer la liaison des protéines aux membranes lipidiques à l'aide de sondes fluorescentes membranes sensibles. Cette approche a été utilisée avec succès pour étudier l'effet que l' a-synucléine a sur vésicule synaptique emballage 27. L'un des principaux avantages de l'anisotropie de fluorescence est qu'il fournit des informations quantitatives sur la liaison des molécules étudiées telles que les vraies constantes de dissociation peuvent être obtenus avec des informations mécanistique. Bien que d'autres techniques biophysiques peuvent également être utilisées pour obtenir de telles informations, l'anisotropie de fluorescence nécessite de faibles quantités d'échantillon et peut être effectuée non seulement à l'équilibre, tel que présenté ici, mais en utilisant également une cinétique rapide, comme la fluorométrie stopped-flow, afin d'obtenir l'association et le taux de dissociationconstantes (k on et k off, respectivement) 28. Un tableau comparatif avec les avantages et les inconvénients de l' anisotropie de fluorescence par rapport aux autres techniques biophysiques est présenté dans le tableau 2. Toutes les méthodes décrites sont techniques vrai équilibre , car aucun d'entre eux comprennent un processus de séparation mécanique des fractions libres et liées. Comme mentionné dans la section des résultats, si l'intensité de la fluorescence d'une protéine marquée change en grande partie lors de l'interaction, cette propriété peut être utilisée pour quantifier l'affinité de la liaison. Cependant, les variations de l'intensité de la fluorescence résultant de l'interaction suggèrent une interférence possible du fluorophore extrinsèque sur l'interaction moléculaire elle-même; à savoir une éventuelle altération de la valeur constante de dissociation (Kd) des protéines non marquées correspondantes. A ce titre, l'anisotropie de fluorescence peut être considérée comme une technique moins invasive que chANGES intensité de fluorescence depuis l'ancien doit être appliqué lorsque l'intensité de fluorescence ne change pas lors de l'interaction. En ce sens, bien que de grandes quantités de la protéine sont nécessaires, Calorimétrie titration isotherme (ITC) peut fournir une valeur K d vrai de l'interaction moléculaire car il est une méthode sans étiquette. D'autre part, l' information mécanistique est pas obtenue , car les différences de chaleur rapportent uniquement sur l'enthalpie du processus et non pas la quantité de complexe formé 29.
En comparaison, les procédés in vivo tels que les levures à deux hybrides ou un fragment de complémentation essais ne nécessitent pas de protéines purifiées mais elles ne fournissent que des informations semi-quantitative sur le mode de liaison. Malgré le fait que dans la technique à deux hybrides de levure est possible d'exprimer la force des unités en utilisant Miller liaison, ce n'est pas un véritable équilibre des facteurs constants et bien hors du contrôle du chercheur peut le modifier.
Tableau 2. Avantages et inconvénients des techniques biophysiques couramment utilisées utilisées pour étudier les interactions protéine-protéine. S'il vous plaît , cliquez ici pour voir une version plus grande de cette table. 
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mm Glass beads | Biospec Products | 11079105 | |
| Tris Base | Formedium | TRIS01 | Ultra pure |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| dye 4’,5’-bis(1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein | ThermoFischer Scientific | LC6090 | This kit contains the dye to label a FlAsH tag |
| Ampiciline | IBI Shelton Scientific, Inc | IB02040 | |
| D(+)-Glucose Anhydrous | Formedium | GLU03 | |
| D(+)-Galactose | Formedium | GAL03 | |
| L-Leucine | Formedium | DOC0157 | |
| L-Tryptofan | Formedium | DOC0189 | |
| Bezamidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | B6506-5G | |
| PMSF | Gold Biotechnology, Inc | P-470-25 | Phenylmethylsulfonyl fluoride |
| NaCl | Formedium | NAC02 | Sodium Chloride |
| Glycerol | Tecsiquim, S.A. de C.V. | GT1980-6 | |
| MgCl2 | Merck Millipore Corporation | 1725711000 | Magnesium Chloride |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399-500G | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786-500G | Potassium phosphate dibasic |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S3139-500G | Sodium phosphate monobasic |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0410 | |
| Yeast extract | Formedium | YEM03 | Micro Granulated |
| L-Tyroisne | Formedium | DOC0193 | |
| Adenine sulphate | Formedium | DOC0230 | |
| Casamino acids | Formedium | CAS03 | |
| Tryptone | IBI Shelton Scientific, Inc | IB49182 | |
| IPTG | Formedium | IPTG025 | |
| Filtration units | Merck Millipore Corporation | UFC901096 | Amicon Ultra-15, membrana PLGC Ultracel-PL, 10 kDa |
| Membrane Filter | Merck Millipore Corporation | GSWP04700 | Membrane Filter, mixed cellulose esters, Hydrophilic, 0.22 µm, 47 mm, white, plain |
| Ni2+ affinity column | QIAGEN | 30760 | Cartridge pre-filled with 5 ml Ni-NTA Superflow |
| Strong Sulfopropyl cation exchanger column | GE Healthcare Life Science | 17-5157-01 | HiTrap SP Sepharose FF 5 ml |
| Size Exclusion column | GE Healthcare Life Science | 28989335 | HiLoad 16/600 Superdex 200 PG |
| Fluorescence cell | Hellma Analytics | 111-057-40 | |
| Spectrophotometer | Agilent Technologies | G6860AA | Cary 60 UV-Vis |
| Shaker | ThermoFischer Scientific | SHKA4000-7 | MaxQ 4000 Benchtop temperature range Ambient-15° to 60°C |
| Centrifuge | ThermoFischer Scientific | 75004271 | Heraeus Megafuge 16R |
| FPLC | Pharmacia Biotech | Discontinued | FPLC system conductivity UV-MM II monitor P500 pump fraction |
| Spectrofluorometer | Olis | No applicable | Olis DM 45 with Polarization Toolbox |
References
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