Summary
אינטראקציות חלבון הן בלב של התפקוד של תא. טכניקות קלוריות ספקטרוסקופיות משמשות בדרך כלל כדי לאפיין אותם. כאן אנו מתארים אנאיזוטרופיה הקרינה ככלי לחקור את האינטראקציה בין החלבון מוטציה של תסמונת שווקמן-יהלום (SBDS) לבין הגורם דמוי התארכות 1 GTPase (EFL1).
Abstract
אינטראקציות בין חלבונים ממלאים תפקיד חיוני בתפקוד של אורגניזם חי. לאחר אינטראקציה זוהתה ומאומתים יש צורך לאפיין אותה ברמה המבנית מכניסטית. שיטות ביוכימיות biophysical קיימות מספר למטרה זו. ביניהם, אנאיזוטרופיה הקרינה היא טכניקה רבת עוצמה המשמש במיוחד כאשר עוצמת הקרינה של חלבון שכותרתו fluorophore נשאר קבוע על אינטראקציה בין חלבונים. בטכניקה זו, חלבון שכותרתו fluorophore הוא נרגש עם אור מקוטב האנכי של אורך גל מתאים באופן סלקטיבי שמרגש משנה של fluorophores לפי נטיותיהם היחסיות עם אלומת האור הנכנסת. פליטת וכתוצאה מכך יש גם כיווניות שהיחסים המוקדמים ב המטוסים אנכיים ואופקיים מגדיר אנאיזוטרופיה (r) כדלקמן: r = (אני VV -אני VH) / (אני VV + 2I VH), שבו אני VV ואני
Introduction
תאים מכילים שפע של Biomacromolecules המגיבה כל זמן אחד עם השני. קשר זה מעורר מתחמי כי להשתתף מסלולים הסלולר אחראי לתפקוד שלהם הולכת אותות, בקרת גנים ואת נדידת תאים בין היתר. כל האינטראקציות בין החלבונים המתרחשות בתא יוצרי רשת המכונית interactome. בשנת שמר האפייה יותר מ -70% מחלבוני הוכחו יש אינטראקציה 1 שותפים. הבנת interactome של התא ואת תפקידיהם לספק מידע רלוונטי על המורכבות והמגוון של יצורים חיים. מתודולוגיות מספר תוארו לזהות ולאפיין אינטראקציות חלבון-חלבון. שונות גבוהה באמצעות שיטות לשים כגון שני היברידית שמרים 2, מבחני השלמה-מקטעי חלבון 3, טיהור זיקה 4 מצמידים ספקטרומטריית מסה microarra חלבוןys משמש לזהות אינטראקציה 5,6. לאחר הזיהוי, יש צורך לאמת את זה עשוי להשתנות על בסיס כל מקרה לגופו. בדרך כלל, ניסויים אלה כרוכים לשבש את האינטראקציה עצם ברמה של החברים הבודדים של זוג האינטראקציה, למשל, על ידי מחיקת גן או ביטוי יתר של אחד החלבונים, ולאחר מכן מחפשים שינויים במאפיינים או פונקציה של חבר האחר בבית ברמה התאית. בהמשך לכך, טכניקות biophysical 7 משמשות לאפיין את האינטראקציה בין החלבונים ברמה המולקולרית. לשם כך, המבנה של קומפלקסים חלבונים נקבעים על ידי קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן, תהודה מגנטית גרעינית במיקרוסקופ אלקטרונים cryo- בעוד calorimetry וספקטרוסקופיה הקרינה משמשים כמותית מכניסטי לתאר אותם.
בעבודה זו, אנאיזוטרופיה הקרינה שמשה כטכניקה לאפיין את האינטראקציה בין EFL1 GTPase ואת SBDחלבון S. חלבונים אלה משתתפים בבניית הסינתזה של הריבוזומים באמצעות קידום שחרורו של גורם ייזום איקריוטיים 6 מפני השטח של 60S 8 למקטע ריבוזומלי. החלבון SBDS עובר מוטציה במחלה המכונה 9 תסמונת שווקמן-יהלום ומעשי כגורם חילופי נוקלאוטיד גואנין עבור EFL1 יורדת הזיקה שלה עבור דיפוספט guanosine 10,11. מוטציות Disease in SBDS לבטל את האינטראקציה עם EFL1 ובכך למנוע הפעלה שלה.
אנאיזוטרופיה הקרינה הוא נפוץ יישומים ביולוגיים ללמוד אינטראקציות חלבון-פפטיד או חומצות גרעין-חלבון. היא מבוססת על העיקרון כי fluorophore נרגש עם תוצאות אור מקוטב פליטת מקוטב חלקית. אנאיזוטרופיה הקרינה מוגדרת על ידי משוואה 1:
איפה אני VV ואני VH הואעוצמות קרינה של אנכי (VV) ואופקי (VH) מקוטבות פליטה כאשר המדגם הוא נרגש עם מקוטב אנכי אור 12. אנאיזוטרופיה הקרינה היא רגישה לגורמים המשפיעים על השער של דיפוזיה הסיבוב של fluorophore ובכך תלויה בטמפרטורה, את הצמיגות של הפתרון ואת הגודל המולקולרי לכאורה של fluorophore. הגודל לכאורה של חלבון המכיל עליות fluorophore כאשר הוא מקיים אינטראקציה עם חלבון אחר שינוי כזה אז יכול להיות מוערך כשינוי אנאיזוטרופיה. באופן ספציפי יותר, fluorophore שמסתובבת לאט יחסית פתרון לכל חי הניאון שלה תהיה בערך VV אני גדול וערך לי VH קטן ולכן תפגין אנאיזוטרופיה גדול יחסית. עבור fluorophores כי נפילה ביחס במהירות לכל החיים הניאון שלהם, אני VV ואני VH יהיה דומה וערך אנאיזוטרופיה שלהם יהיה קטן 12 > (איור 1). בנוסף, עבור אות אנאיזוטרופיה טובה למדידת רעש, זה הכרחי כדי לקבל fluorophore עם חי שלמי קרינה דומים בפעם מתאם הסיבוב של המולקולה של עניין. אחרת, לא ניתן לרשום את ההבדל במדויק אנאיזוטרופיה בין חלבון חינם וכי במתחם. לדוגמא, אנאיזוטרופיה של בדיקת ניאון עם חיים שלמים קרובים ל -4 NSEC כגון והעמסה או rhodamine מצורפות תרכובת משקל מולקולרית נמוכה של 100 Da היא 0.05. כריכה למולקולה של 160 kDa יגדל ערך אנאיזוטרופיה שלה ל -0.29; הבדל כי ניתן למדוד באופן מדויק. לעומת זאת, באותה הבדיקה הניאון מעורבת תגובה מחייבת גידול אשר בגודל מולקולרי משתנה מ -65 ל 1,000 kDa תגרום רק שינוי אנאיזוטרופיה של 0.28 עד 0.3, שהוא קטן מכדי שיהיה אפשר למדוד במדויק. בתרחיש זה, בדיקה עם חיים שלמים של 400 NSEC תתאים יותר 12.
class = "jove_content"> 
באיור 1. ייצוג סכמטי של ציוד המשמש למדידת אנאיזוטרופיה הקרינה ואת ההליך. ייצוג סכמטי של הציוד המשמש לביצוע אנאיזוטרופיה הקרינה מדידה אינטראקציה בין חלבונים הניסוי. Fluorophores כי נפילת אנאיזוטרופיה קטנה תצוגה מהר המגבירה על קשירת שותף אינטראקציה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
יישומי קרינה דורשים נוכחות של fluorophore בכל המולקולות למדו. כדי לחקור אינטראקציות חלבון-חלבון ישנם שלושה סוגי fluorophores: 1) שאריות טריפטופן נוכח החלבונים, 2) fluorophores מצורף כימי 3) שותפי היתוך ניאון כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) ו deriva שלהעזרי למידה. לרובם יש חלבוני שאריות טריפטופן על מבנו, ולכן הדרך הקלה למדוד אינטראקציה היא על ידי מעקב אחר השינויים בספקטרום הקרינה המקביל או על ידי ניטור שינויים בעוצמת הקרינה של שאריות טריפטופן. עם זאת, שאריות טריפטופן עשויות להיות נוכחות בשני החלבונים מסבכים את הניתוח. מצד שני, עבור fluorophore לשינוי תכונות ניאון שלה עקב אינטראקציה זה צריך להיות ממוקם על או ליד אתר הקישור וזה יכול להפריע לאינטראקציה עצמה. זה צריך תשומת לב מיוחדת בעת שימוש fluorophores המגושם כגון GFP. אם אף אחת fluorophores אלה יכולים לשמש למחקרים מחייב יש צורך, אם כן, להציג את fluorophores חיצונית לזו של חלבונים המעורבים. fluorophores רב מסונתזים כימי קיים והוא יכול להיות מחובר קוולנטית חלבונים באמצעות הקבוצות תגובתי שלהם כגון קבוצות האמינות (שרשרת צד של lysines או N- סופי) ואת קבוצות תיאול ב ציסטאין. Fנגזר luorophore עם אסטרים isothiocyanate ו succinimidyl להגיב עם קבוצות אמידות בעוד iodoacetamide ו maleimide קבוצות תיאול-reactive 13. הצבעים הנפוצים ביותר בשימוש ביישומי קרינה הם נגזרים של וההעמסה ואת צבע ירוק rhodamine, coumarins, fluorophores BODIPY וצבעי אלקסה פלואוריד. רשימה מפורטת של fluorophores זמינים מסחרית והשימוש בהם ניתן למצוא אזכור 14,15. עבור תיוג מוצלח, הקבוצה תגובתי חייבת להיחשף על פני השטח של החלבון, אך בשל המספר הגדול של קבוצות פונקציונליות תגובתי בדרך כלל נוכח פוליפפטידים קשה מאוד להשיג שינוי באתר ספציפי. החלבון של עניין במחקר זה, SBDS, מכיל 5 cysteines חינם ו -33 lysines שעלולים לגרום תיוג אתרים מרובים. תיוג לא אחיד עשוי להשפיע על המחייב יסבך ניתוח נתונים כמולקולות fluorophore שונים עשויות לעורר אותות בעצמת ניאון שונים על כריכה. כדי overcome בעיה זו, השתמשנו fluorophore פלאש, 4 ', 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-י.ל.) והעמסת לתווית באתר-ישיר החלבון SBDS. זהו צבע arsenoxide עם זיקה גבוהה במשך ארבע cysteines במרווחים מוטיב יודע כמו פלאש-תג המורכב של רצף CCXXCC כאשר X הוא כל חומצת אמינו מלבד ציסטאין 16,17. מוטיב tetracysteine זה מתווסף N- או C- הסופי של החלבון על ידי הנדסה גנטית יחד עם מקשר נאות כדי למנוע את השיבוש של הקפל הכללי של החלבון. הצמד המורכב לצבוע Flash ו- Flash תג תוכנן במקור לחלבוני תווית ספציפי לאתר בתאים חי 17 אבל זה יכול לשמש גם כדי לתייג חלבונים מטוהרים במבחנה כפי שהוא בא לידי ביטוי כאן. בנוסף, אסטרטגיות האנזימטית גם פותחו כדי לאפשר functionalization ספציפית לאתר של חלבונים 18.
בכתב היד הזה אנו מתארים את השימושיות של אנאיזוטרופיה קרינהכלי sa ללמוד אינטראקציות בין חלבונים. כריכה ניתן להעריך על ידי בדיקה פשוטה של הצורה העקומה מחייבת בעוד ניתן להשיג מידע כמוני מן ההתאמה של נתוני הניסוי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. SBDS-Flash ביטוי חלבון תג וטיהור
הערה: לקבלת ניסויי אנאיזוטרופיה, בזק-תג מתאים הרצף Cys-Cys-פרו-הגלאי-Cys-Cys נוסף C- הסופית של SBDS אדם קידוד רצף ידי PCR. מבנה זה היה subcloned לתוך וקטור ביטוי-A pRSET ו להפוך לתאי Escherichia coli C41 להביע חלבון קידוד תג hexahistidine N-terminal (התג-שלו), רצף קידוד SBDS האדם ותג פלאש C- סופי 10.
- ביטוי חלבון SBDS-Flash
- Transform E. המוסמכת תאי C41 coli עם הפלסמיד pRSET-HisSBDS-Flash באמצעות פרוטוקול הלם חום תקן 19. פלייט תאי תקשורת המוצקה לוריא- Bertani (LB) השלימה עם 100 מיקרוגרם / מיליליטר אמפיצילין. הרכב מוצק מדיה LB מורכב מ 10 גרם NaCl, תמצית שמרים 5 גרם, 10 גרם tryptone ו -20 אגר גרם במשך נפח 1 ליטר.
- חיידקים שינו תרבות ב 37 מעלות צלזיוס עדספיגה ב 600 ננומטר (600) מגיעה 0.5-0.7 ב 1 ליטר של תקשורת הנוזלת LB בתוספת אמפיצילין 100 מיקרוגרם / מיליליטר.
- להשרות ביטוי החלבון על ידי הוספת איזופרופיל 0.5 מ"מ β-D-1-thiogalactopyranoside לתרבות ולהמשיך את הדגירה של שעה 5 נוספים.
- אסוף את ההשעיה חיידקי ידי צנטריפוגה ב 3800 XG במשך 10 דקות ב 4 °. הסר את supernatant. בשלב זה, או לאחסן את התא גלולה ב -20 ° C או להשתמש מיד לטיהור חלבון.
- טיהור חלבונים SBDS-Flash
הערה: כל צעדי chromatographic מבוצעים באמצעות חלבון מהיר כרומטוגרפיה נוזלית (FPLC) מערכת או משאבה peristaltic. כרומטוגרפיה -affinity Ni 2 + משתמשת טור זרימה מהירה 5 מ"ל. כרומטוגרפיה החליפין anionic משתמשת טור מחליף חזק 5 מ"ל sulfopropyl קטיון. קצב הזרימה של 3 מ"ל / דקה שימש את כל השלבים chromatographic.- Resuspend התאים 35 מ"ל של SBDS תמוגה בuffer (7.5 pH חיץ פוספט 50 מ"מ, 300 מ"מ NaCl, 20 imidazole מ"מ) בתוספת 1 מ"מ פלואוריד phenylmethylsulfonyl (PMSF) ו lyse ידי sonication במשך זמן כולל של 4 דקות באמצעות מחזורים של 10 שניות על 30 שניות OFF, ב 4 מעלות צלזיוס.
- צנטריפוגה מדגם ב 9,000 XG במשך 50 דקות ב 4 °.
- שמור את supernatant וזורקים את הכדור כדי להסיר פסולת הסלולר.
- לאזן את עמודת זיקת Ni 2 + עם 3 כרכי עמודה (CV) של חיץ תמוגה SBDS ולהציג את כולו בהיר supernatant על הטור.
- הסר חלבון מאוגד על ידי שטיפה עם 3 קורות חיים של חיץ תמוגה SBDS ו elute עם 3 קורות חיים של חיץ SBDS Elution (50 מ"מ פוספט חיץ pH 7.5, 300 מ"מ NaCl, 250 מ"מ imidazole).
- לדלל את חלבון 6 פי eluted עם 50 מ"מ חיץ פוספט pH 6.5 ולהסיר אגרגטים אפשריים על ידי סינון דרך קרום תאי 0.22 מיקרומטר.
- לאזן את העמודה המחליפה קטיון sulfopropyl עם 3 קורות חיים של עמודת S מלח הנמוךחיץ (חיץ פוספט 50 מ"מ pH 6.5, 50 mM NaCl) ולהציג את המדגם חלבון מהשלב הקודם.
- חומר מאוגד לשטוף עם 3 קורות חיים של חיץ טור נמוך מלח S ו elute החלבון בצעד אחד עם 50 מ"מ חיץ פוספט pH 6.5, 1 M NaCl.
- לדלל את 3.3 פי חלבון eluted עם 50 מ"מ pH חיץ פוספט 6.5. לרכז את החלבון עם מכשירי אולטרה סינון על ידי צנטריפוגה ב 3800 XG במשך 15 דקות. פלאש להקפיא את החלבון בחנקן נוזלי ולאחסן אותו ב -80 ° C עד לשימוש נוסף.
- בדוק את הטוהר של החלבון על ידי ניתוח SDS-PAGE ו Coomassie מכתים 20.
2. EFL1 ביטוי חלבון וטיהור
הערה: EFL1 התבטא לפי התקנה של האמרגן מסתעף גל 1/10 21 ואת 3'UTR מחצלת שמר האפייה ב pRS426 הווקטור. חלבון רקומביננטי מקודד איזופורם האדם EFL1 1 התמזגו פרוטאז וירוס Etch טבק (TEV) אתר הכרה ותג hexahistidine בבית הסופית- C.
- ביטוי חלבון EFL1
- Transform ס cerevisiae BCY123 תאים עם פלסמיד pRS426-EFL1TevHis באמצעות פרוטוקול אצטט ליתיום סטנדרטית 22. פלייט כל התאים טרנספורמציה ירידה סינתטי החוצה התקשורת בלי אורציל (SD-URA) בתוספת 2% (w / v) גלוקוז. הרכב של התקשורת SD-URA מורכב בסיס חנקן שמרים 8 גרם ללא חומצות אמינו, 11 גרם חומצות casamino, 55 מ"ג סולפט אדנין, טירוזין 55 מ"ג, 60 מ"ג ו -60 לאוצין טריפטופן מ"ג 1 נפח L.
- תרבות טרנספורמציה שמרים ב 30 מעלות צלזיוס עד 600 מגיע 1.8 ב 1 ליטר של מדיה SD-URA השלימו עם 0.5% (w / v) גלוקוז.
- להשרות ביטוי החלבון על ידי הוספת 2.8% (w / v) גלקטוז לתרבות ולהמשיך הדגירה במשך 18 שעות נוספות על 30 מעלות צלזיוס.
- אסוף את ההשעיה שמרים ידי צנטריפוגה ב 3800 XG במשך 10 דקות ב 4 °. הסר את supernatant.בשלב זה, או לאחסן את התא גלולה ב -20 ° C או להשתמש מיד לטיהור חלבון.
- טיהור חלבונים EFL1
הערה: כל הצעדים chromatographic מבוצעות באמצעות מערכת FPLC או משאבת peristaltic. כרומטוגרפיה -affinity Ni 2 + משתמשת טור זרימה מהירה 5 מ"ל בקצב זרימה של 3 מ"ל / דקה. גודל הדרה כרומטוגרפיה משתמש עמודה 125 מ"ל וגדוש מראש עם Superdex 200 שרף בקצב זרימה של 1 מ"ל / דקה.- Resuspend התאים 50 מ"ל של חיץ תמוגה EFL1 (50 mM Tris-HCl pH 8, 300 מ"מ NaCl, 20 imidazole מ"מ, 5 מ"מ MgCl 2, 10% גליצרול) בתוספת 1 מ"מ PMSF ו benzamidine 1 מ"מ ו לשבש את התאים על ידי חיכוך על מקצף חרוז באמצעות חרוזי זכוכית (מ = 0.5 מ"מ) למשך זמן כולל של מחזורי באמצעות 6 דקות של 2 דק 'ועוד 15 דק' OFF, ב 4 ° C..
- צנטריפוגה מדגם ב 9,000 XG במשך 50 דקות ב 4 °.
- שמור את supernatant וזורקים את הכדור כדי להסיר פסולת הסלולר. לאזן את עמודת זיקת Ni 2 + עם 3 קורות חיים של חיץ תמוגה EFL1 ולהציג כל supernatant הבהיר על הטור.
- הסר חלבון מאוגד על ידי שטיפה עם 3 קורות חיים של חיץ תמוגה EFL1 ו elute עם 3 קורות חיים של חיץ EFL1 Elution (50 mM Tris-HCl pH 8, 300 מ"מ NaCl, 250 imidazole מ"מ, 5 מ"מ MgCl 2, 10 גליצרול%).
- לאזן את העמודה הדרה גודל עם 1.5 קורות חיים של חיץ Anisotropy (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 300 מ"מ NaCl, 5 מ"מ MgCl 2, 10% גליצרול, 5 מ"מ β-mercaptoethanol).
- להתרכז כדי 1 מיליליטר חלבון EFL1 eluted מעמודת זיקת Ni 2 + עם מכשירי אולטרה סינון על ידי צנטריפוגה ב 3800 XG כדי בנפח הרצוי. הצג את המדגם על עמודת הדרת גודל.
- אסוף החלבון eluted ולהתרכז ידי אולטרה סינון לריכוז סופי של כ 30 מיקרומטר. פלאש להקפיא את החלבון בחנקן נוזל חנות ב -80 ° C עד לשימוש נוסף. ודא הטוהר הדואר של החלבון על ידי ניתוח SDS-PAGE ו Coomassie מכתים 20.
תיוג 3. SBDS-Flash עם פלורסנט פלאש דיי 4 ', 5'-Bis (1,3,2 dithioarsolan-2-י.ל.) והעמסת
- מערבבי 3 nmol של חלבון SBDS-פלאש עם 3 nmol של 4 ', 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-י.ל.) צבע פלואורסצנטי ב 5 נפח μl של חיץ אחיד.
- תנו התגובה להמשיך במשך 8 שעות ב 4 ° C. Dialyze המדגם נגד חיץ Anisotropy במשך הלילה כדי להסיר את צבען חינם.
- השתמש חוק למברט-באר לכמת את% של חלבון הנקרא. מדוד את הספיגה ב 280 ננומטר ו -508 ננומטר ספקטרופוטומטר באמצעות קובט קוורץ של נפח מתאים. הערה: קח למשל את מקדם הספיגה הטוחן הבא (M -1 cm -1):
- חשב את הריכוז של חלבון הנקרא SBDS-הבזק באמצעות משוואה 2.
- חשב את הריכוז של חלבון הכולל SBDS באמצעות משוואת 3 על ידי החלפת C SBDS-Flash שנמדדת בשלב קודם.
- חישוב אחוזי חלבון הנקרא באמצעות משוואת 4.
4. ניסויים Anisotropy הקרינה
הערה: ניסויי Anisotropy נעשו בתוך spectrofluorometer מצויד בארגז כלי קיטוב ואיסוף נתונים בוצע באמצעות תכנית אנאיזוטרופיה הניתנת בתוכנה של הציוד. אורך גל העירור נקבע ל 494 ננומטר עם רוחב פס רפאים של 8 ננומטר ואת הפליטה נרשמת באמצעות מסנן להקה עובר של 530 ± 25 ננומטר. מדידות נעשו ב 25 מעלות צלזיוס קובט 200 μl עם אורך 5 מ"מ נתיב 10.
- ב קובט הקרינה, להציב 200 μl של 30 ננומטר SBDS-Flash במאגר אנאיזוטרופיה ו לכיל 2 μl של 30 מיקרומטר EFL1. מערבבים היטב ולתת התגובה לעמוד במשך 3 דקות לפני מדידת ערך אנאיזוטרופיה.
- חזור על שלב 4.1 עד בהיקף כולל של 40 μl של EFL1 נוסף.
ניתוח 5. נתונים
- להתאים את הנתונים למודל מחייב המתאים באמצעות אלגוריתם רגרסיה ריבועים קוי לפחות. משוואות עבור דגמי מחייב הנפוצים ביותר מוצגות בלוח 1.
- להעריך את המודל הטוב ביותר המתאר את האינטראקציה בין החלבונים באמצעות בדיקת השאריות של 23 בכושר. תמיכת המודל שנבחר עם ניסויים נוספים.
טבלה 1. אינטראקציה בין חלבונים נפוצות מודלים מחייבים ואת המשוואות המתמטיות המתארות אותם.0 / 54640table1large.jpg "target =" _ blank "> אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של השולחן הזה. 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי לבצע כל ניסוי אנאיזוטרופיה חשוב לשלול שינויים גדולים בעוצמת הקרינה של fluorophore מאז אנאיזוטרופיה הנצפית של תערובת של מינים מיוצגות על ידי משוואה 5:
כאשר F אני מייצג את הקרינה השבר של כל רכיב r i הוא אנאיזוטרופיה המקביל. קרינת השבר של כל רכיב תלויה בשני, הריכוז ואת הקרינה היחסית שלה, אשר מוגדר על ידי משוואה 6:
כאשר X אני מייצג את החלק היחסי שומה של הדואר אני th מצלצלים ו Ø אני נקבע בהתאם לתשואה הקוונטי של i ה מצלצלים.
לכן, אם עוצמת הקרינה משתנה באופן דרמטי לאורך טיטרציה עדיף, או למדוד היווצרות קומפלקס כפונקציה של שינוי אותות הקרינה ולא של האות אנאיזוטרופיה, או לתקן את ערך אנאיזוטרופיה נצפתה על ידי התאמת שני את עוצמת הקרינה ואת אנאיזוטרופיה נתונים. הקרינה של SBDS-Flash עושה שינוי ניכר ולא על קשירת EFL1 (איור 2) דבר המצביע על כך אנאיזוטרופיה הקרינה היא נאותה למדידת המחייב בין שני החלבונים.
פליטת קרינת איור 2. SBDS-ויטיל טיטרציה של ריכוז גדל והולך של EFL1. שינויי פליטת הקרינה של fluorophore הם negligiblדואר ואקראי לאורך טיטרציה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
דוגמא של אנאיזוטרופיה הקרינה מחייבת עקום המתקבלות טיטרציה של EFL1 כדי SBDS-Flash מוצגת באיור 3. איכותי, את הצורה של הגרף מראה בבירור כי שני חלבוני האינטראקציה כפי שמעידים גידול האות אנאיזוטרופיה על תוספת של EFL1. יתר על כן, ערכי אנאיזוטרופיה קפאו דבר המצביע על כך בסוף טיטרציה כל חלבון SBDS-Flash נכח במתחם עם EFL1. זה אפשרי אז, כדי לתאר את האינטראקציה כמותית בין החלבונים האלה להתאים את הנתונים באמצעות רגרסיה ריבועים קוית לפחות מודל מחייב חזק ולקבל את דיסוציאציה המקביל קבוע שיווי המשקל. התאמת מודל אחד מחייב אתר לא נאותהately לתאר את נתוני הניסוי (איור 3 א). זה בא לידי ביטוי לא רק מהעקב הולם בעקום מחייב אלא גם מסטיות של השאריות של הישר (ההבדל בין נתונים תיאורטיים וניסיוניים) כי הם ניכר ואת אקראי. זה מסכים גם עם העובדה כי מודל אתר קישור יחיד מתואר באופן מתמטי על ידי עקומת היפרבולית ולא עקומת sigmoidal כפי שנצפה עבור נתוני הניסוי המוצג באיור 3. מצד שני, דגמים כמו שני זהה או שניים שונים מחייב אתרים לתאר טובים יותר את נתוני ניסוי ואת השאריות של המופע בכושר חריג שיטתי תמיכת מודל עמותה שני אתרים (איור 3 ב-ג). בהעדר כל מידע ניסיוני אחר קשה לקבוע איזו משני הדגמים מתאימים מנגנון המחייב בין EFL1 ו SBDS. אף על פי כן, SBDS ו EFL1 הם חלבוני monomeric, כך שזה difficult לדמיין מודל שני אתרי קישור זהה.
. איור 3. הקרינה אנאיזוטרופיה האיזותרמה מחייב של האינטראקציה בין EFL1 ו SBDS-פלאש הקו הרציף בכל המגרשים העליונים תואם את ההתאמה של הנתונים למודלים מחייבים שונים: (א) יחיד אתר, (ב) שני אתרים זהים ו- (ג) שני אתרים שאינם זהים. מגרשים תחתונים מייצגים את השאריות לנכונות המודל המקביל. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
רוב הניסויים ביוכימיים עם חלבונים דורשים לא רק חלבון טהור אלא גם כמויות גדולות מהם, ללא קשר הטכניקה המשמשת. מסיבה זו, החלבונים משמשים עבור סוג זה של ניסויים מתקבלים על ידי ביטוי Heterologous, כפי שהיה במקרה המוצג כאן. ספקטרוסקופיה בתפרחת מחייבת הנוכחות של fluorophore במולקולה למדה. שאריות ארומטיים מהוות את fluorophores הפנימי של חלבון, עם זאת, באמצעות האות שלהם ללמוד אינטראקציות בין חלבונים מסבכת את הניתוח מכיוון שהם נפוצים ברוב החלבונים יהיה נוכח בשני, חלבון קולטן ו ליגנד. בנוסף, את חייו של טריפטופן הוא קצר מדי לניסויים אנאיזוטרופיה הקרינה. מסיבה זו, מקובל להוסיף fluorophores חיצוני לאחד החלבונים למד. לשם זה, fluorophore נוספה C- הסופית של SBDS באמצעים קשר ותיאום בין לצבוע 4 ', 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-י.ל.) fluorescein עם מוטיב tetracysteine הציג את החלבון על ידי הנדסה גנטית. בחירת החלבון חושף fluorophore אינה עניין אקראי. בשל גודלו של חלבונים למד כאן (SBDS 29 kDa ו EFL1 127 KDA), ציפינו לשינוי גדול יותר אנאיזוטרופיה בין SBDS שכותרתו חינם וכי בקומפלקס עם EFL1, לעומת השינוי הצפוי בין-EFL1 שכותרתו חינם וכי כבול SBDS. נושא זה בחשבון, תג פלאש הוכנס SBDS ולא EFL1. פרמטר נוסף חשוב לקחת בחשבון בעת הגדרת ניסוי אנאיזוטרופיה קרינה היא הקליטה הפתרונים בשימוש. הצפיפות האופטית של הפתרון קובט לא צריכה להיות גדולה מ -0.1 באורך גל העירור ופליטה, וצריכה נשארת קבוע לאורך טיטרציה כולו. אחרת, אפקט מסנן פנימי יכול להתערב המדידה חייב להיות מתוקן עבור. בניסוי המוצג כאן, החלבונים למדו לא לספוג באורך הגל של excitatיון או פליטה של 4 ', 5'-bis צבע פלואורסצנטי (1,3,2 dithioarsolan-2-י.ל.); ובכך אפקט לסנן פנימי אינו מהווה בעיה.
לגבי איסוף נתונים, ולאחר מכן להתאים את הנתונים באופן תקין, יש צורך יש מוגדר היטב ערכי בסיס תחתונים ועליונים עם נקודות נתונים כמה דרך המעבר לאורך עקום המחייב. אחרת, ראוי הנתונים אינו מדויק, וכן מידע לגבי מצב המחייב עלול ללכת לאיבוד. כדי לתאר עקומת מחייב הגונה יש צורך כי הריכוז ליגנד החופשי שונה על ידי שתי יחידות לוגריתמים מעל ומתחת דיסוציאציה הקבוע, לעומת זאת, באופן ניסיוני זה עלול להיות קשה להשיג. בשנת לגבול התחתון, בעיות עם הרגישות של הציוד עלולות להתעורר במיוחד כאשר הזיקה בין החלבונים גבוהה מאוד, תוך ריכוזים גדולים ייתכן שלא יוכלו להגיע בשל בעיות מסיסות של ליגנד. זה בא לידי ביטוי באופן ברור כאשר בודקים את האינטראקציה בין SBDSS143L מוטציה מחלות EFL1. מוטציה זו שייבשה את קשירת EFL1 עד כדי כך שזה לא ניתן היה לקבל עקומת מחייב נכונה מאז EFL1 יכול להיות מרוכז רק עד 70 מיקרומטר ואת החלבון מקבל בדילול ≈ 5 לקפל במהלך טיטרציה 10. לכן, זה הכרחי כדי לקבל הערכה גסה של הזיקה כדי לייעל את ערכת טיטרציה ולוודא שקופץ בריכוז ליגנד אינו מתרחשים עמדות שיגרום בכושר פחות מדויק. לדוגמה, חסר הנקודות הראשונות של עקומת מחייב מוצג באיור 3 יהיה לגרום לזה להיראות כמו היפרבולה מטעה החוקר לעבר מודל אתר קישור יחיד.
לאחר שנאסף, נתונים הותאמו מודל מחייב משוער. לשם השוואה הקרינה נתונים, נתונים אנאיזוטרופיה ניתן להשתמש ללא מניפולציה נוספת ולא צריך תיקון עבור תופעות דילול. המשוואות מוצגים בלוח 1 בחשבון כי [L] ≈[יב] 0 בכל נקודה של טיטרציה. זה לא יכול לקרות כאשר הזיקה בין החלבונים גבוהה מאוד, כך שבחלק הנקודות הראשונות של הדלדול ליגנד טיטרציה מתרחש. בתרחיש זה, משוואות ריבועיות מורכבות יותר תארו במקום 23 יש צורך להתאים את הנתונים. בניסוי המתואר כאן, EFL1 ליגנד היה תמיד עודף גדול לעומת ריכוז SBDS-Flash ואת שינוי בריכוז EFL1 בכל נקודה של טיטרציה ניתן להתעלם. כפי שהוזכר בסעיף התוצאות, מודל אתרי קישור שני לא זהים הכי תיאר את נתוני הניסוי (איור 3 ג). מידע ביוכימי נוסף שהושג בקבוצת תומך ברעיון הזה הוא המודל הנכון כדי לתאר את האינטראקציה בין EFL1 ו SBDS (מידע לא מוצג). מצב של אינטראקציה זו הוא נפוץ חלבונים מרובים תחומים, כגון EFL1 ו SBDS הם, וכמה דוגמאות קיימות בספרות 24-26. עם זאת, הוא סימפוני חשוב לשלול אינטראקציה הלא ספציפית שיכול להופיע בתור מודל אינטראקציה של אתרי קישור מובהקים עם זיקות שונות ליגנד שלהם. לשם כך, מגרש Scatchard הוא מאוד שימושי. לעומת טכניקות אחרות, אות אנאיזוטרופיה הקרינה מדווחת בסך של מורכבות הנוצרות וכך אפשר לבנות מגרש Scatchard עם הנתונים. עקומה הקמורה Scatchard מציעה שני מודל אתרי קישור שונים עם cooperativity השלילי או חייב הלא ספציפי, בעוד מגרש הקעור Scatchard מרמז על שני מודל אתרי קישור שונים עם cooperativity החיובית או חוסר יציבות ליגנד (איור 4). ניתוח של נתוני הניסוי הראה מגרש Scatchard עם צורה קעורה תומכת במודל של שני אתרי קישור עצמאיים EFL1 ו SBDS (איור 4D). יתר על כן, cooperativity החיובית אושר לאחר ביצוע ניתוח היל שהסתיים ערך מקדם היל של 1.8 ± 0.02 (מידע לא מוצג).
ss = "jove_content"> 
איור 4. מגרשי Scatchard לדגמי חלבונים מחייבים שונים. (א) אתר קישור יחיד או אתרים זהים מרובים שאינו אינטראקציה. (ב) אתרי קישור שונים מרובים עם cooperativity השלילי או חייב הלא ספציפי. (ג) אתרי קישור שונים מרובים עם cooperativity חיובית או חוסר יציבות ליגנד. (ד) Scatchard העלילה הנובעות מניתוח הנתונים אנאיזוטרופיה ניסיוני המתקבל טיטרציה של EFL1 כדי SBDS-Flash. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
אנאיזוטרופיה הקרינה הוא מבוסס-פתרון, טכניקה נכון שיווי משקל הדורש מולקולות למדו להישאר פתרון על התנאים שנבדקו. זה יכול לשמש כדי לחקור לא עלly האינטראקציה בין חלבונים באורך מלא, אלא גם את האינטראקציה בין תחומי חלבון, חלבוני מוטציה או אפילו פפטידים עם שלאחר translational שינויים. יתר על כן, אנאיזוטרופיה הקרינה יכולה לשמש גם כדי למדוד את הכריכה של חלבוני ממברנות שומנים באמצעות בדיקות ממברנות רגישות ניאון. גישה זו שימשה בהצלחה כדי לחקור את ההשפעה כי אלפא-synuclein יש על שלפוחית סינפטית אריזה 27. אחד היתרונות העיקריים של אנאיזוטרופיה הקרינה הוא בכך שהוא מספק מידע כמוני על הכריכה של המולקולות לומדים כך קבוע דיסוציאציה נכון ניתן להשיג יחד עם מידע מכניסטית. למרות ששיטות biophysical אחרות יכולות לשמש גם כדי להשיג מידע כזה, אנאיזוטרופיה הקרינה דורשת כמויות קטנות של מדגם וניתן לבצעו לא רק בשיווי משקל, כפי שהוצגה כאן, אלא גם באמצעות קינטיקה מהירה, כגון פסיקת הזרימה fluorometry, כדי להשיג את הקשר ו דיסוציאציה שיעורקבוע (k על ו k off, בהתאמה) 28. טבלה השוואתית עם היתרונות וחסרונות של אנאיזוטרופיה קרינה ביחס לטכניקות biophysical אחרות מובאת בלוח 2. כל השיטות שתוארו הן טכניקות נכונות שיווי משקל מאז אף אחד מהם לא כולל את תהליך ההיפרדות מכאנית של שברים חינם וכרוכים. כאמור בסעיף התוצאות, אם עוצמת הקרינה של חלבון שכותרתו במידה רבה משנה על אינטראקציה, נכס זה לאחר מכן ניתן להשתמש כדי לכמת את הזיקה של הכריכה. עם זאת, שינויים בעוצמת קרינה הנובעות האינטראקציה להציע התערבות אפשרית של fluorophore החיצוני על האינטראקציה המולקולרית עצמו; כלומר שינוי אפשרי של ערך דיסוציאציה קבוע (K ד) של חלבונים שאינם שכותרתו המקבילה. ככזה, אנאיזוטרופיה הקרינה יכולה להיחשב טכניקה פולשנית פחות מ changes בעוצמת הקרינה מאז לשעבר צריך להיות מיושם כאשר עוצמת הקרינה אינה משנה על האינטראקציה. במובן זה, אם כי כמויות גדולות של החלבון נדרשים, טיטרציה Calorimetry איזו תרמים (ITC) יכול לספק ערך ד K נכון המולקולרית של האינטראקציה מאז הוא שיטה חינם תווית. מצד השני, מידע מכניסטית לא מתקבל בגלל הבדלי חום רק לדווח על אנתלפיה של התהליך ולא את הכמות מורכבת נוצרה 29.
לשם השוואה, בשנת שיטות vivo כגון שמרים שני היברידית או מבחני השלמה שבר אינם דורשים חלבונים מטוהרים אבל הם מספקים רק מידע וכמותיות על מצב הכריכה. למרות העובדה כי הטכניקה השנייה ההיברידית שהמרים ניתן לבטא את עוצמת יחידות מילר באמצעות מחייב, זה לא שיווי משקל אמיתי גורמים קבועים ורבים יצאו מכלל השליטה של החוקר יכולים לשנות את זה.
טבלה 2. יתרונות וחסרונות של טכניקות biophysical נפוצות בשימוש ללמוד אינטראקציות בין חלבונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של השולחן הזה. 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mm Glass beads | Biospec Products | 11079105 | |
| Tris Base | Formedium | TRIS01 | Ultra pure |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| dye 4’,5’-bis(1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein | ThermoFischer Scientific | LC6090 | This kit contains the dye to label a FlAsH tag |
| Ampiciline | IBI Shelton Scientific, Inc | IB02040 | |
| D(+)-Glucose Anhydrous | Formedium | GLU03 | |
| D(+)-Galactose | Formedium | GAL03 | |
| L-Leucine | Formedium | DOC0157 | |
| L-Tryptofan | Formedium | DOC0189 | |
| Bezamidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | B6506-5G | |
| PMSF | Gold Biotechnology, Inc | P-470-25 | Phenylmethylsulfonyl fluoride |
| NaCl | Formedium | NAC02 | Sodium Chloride |
| Glycerol | Tecsiquim, S.A. de C.V. | GT1980-6 | |
| MgCl2 | Merck Millipore Corporation | 1725711000 | Magnesium Chloride |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399-500G | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786-500G | Potassium phosphate dibasic |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S3139-500G | Sodium phosphate monobasic |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0410 | |
| Yeast extract | Formedium | YEM03 | Micro Granulated |
| L-Tyroisne | Formedium | DOC0193 | |
| Adenine sulphate | Formedium | DOC0230 | |
| Casamino acids | Formedium | CAS03 | |
| Tryptone | IBI Shelton Scientific, Inc | IB49182 | |
| IPTG | Formedium | IPTG025 | |
| Filtration units | Merck Millipore Corporation | UFC901096 | Amicon Ultra-15, membrana PLGC Ultracel-PL, 10 kDa |
| Membrane Filter | Merck Millipore Corporation | GSWP04700 | Membrane Filter, mixed cellulose esters, Hydrophilic, 0.22 µm, 47 mm, white, plain |
| Ni2+ affinity column | QIAGEN | 30760 | Cartridge pre-filled with 5 ml Ni-NTA Superflow |
| Strong Sulfopropyl cation exchanger column | GE Healthcare Life Science | 17-5157-01 | HiTrap SP Sepharose FF 5 ml |
| Size Exclusion column | GE Healthcare Life Science | 28989335 | HiLoad 16/600 Superdex 200 PG |
| Fluorescence cell | Hellma Analytics | 111-057-40 | |
| Spectrophotometer | Agilent Technologies | G6860AA | Cary 60 UV-Vis |
| Shaker | ThermoFischer Scientific | SHKA4000-7 | MaxQ 4000 Benchtop temperature range Ambient-15° to 60°C |
| Centrifuge | ThermoFischer Scientific | 75004271 | Heraeus Megafuge 16R |
| FPLC | Pharmacia Biotech | Discontinued | FPLC system conductivity UV-MM II monitor P500 pump fraction |
| Spectrofluorometer | Olis | No applicable | Olis DM 45 with Polarization Toolbox |
References
- Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440 (7084), 637-643 (2006).
- Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340, 245-246 (1989).
- Michnick, S. W., Hien Ear, P., Landry, C., Malleshaiah, M. K., Messier, V. A toolkit of protein-fragment complementation assays for studying and dissecting large-scale and dynamic protein-protein interactions in living cells. Methods in Enzymology. 470, 336-366 (2010).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
- Dwane, S., Kiely, P. A. Tools used to study how protein complexes are assembled in signaling cascades. Bioeng Bugs. 2 (5), 247-259 (2011).
- Snider, J., et al. Fundamentals of protein interaction network mapping. Mol Syst Biol. 11 (12), 848 (2015).
- Fersht, A. Structure and mechanism in protein science: a guide to enzyme catalysis and protein folding. Baldwin, R. L. , W. H. Freeman and Company. 191-214 (2002).
- Menne, T. F., et al. The Shwachman-Bodian-Diamond syndrome protein mediates translational activation of ribosomes in yeast. Nat Genet. 39 (4), 486-495 (2007).
- Boocock, G. R., et al. Mutations in SBDS are associated with Shwachman-Diamond syndrome. Nat Genet. 33 (1), 97-101 (2003).
- Garcia-Marquez, A., Gijsbers, A., de la Mora, E., Sanchez-Puig, N. Defective Guanine Nucleotide Exchange in the Elongation Factor-like 1 (EFL1) GTPase by Mutations in the Shwachman-Diamond Syndrome Protein. J Biol Chem. 290 (29), 17669-17678 (2015).
- Gijsbers, A., Garcia-Marquez, A., Luviano, A., Sanchez-Puig, N. Guanine nucleotide exchange in the ribosomal GTPase EFL1 is modulated by the protein mutated in the Shwachman-Diamond syndrome. Biochem Biophys Res Commun. 437 (3), 349-354 (2013).
- Lakowicz, J. R. Principles of fluorescence spectroscopy. , Third, Springer US. (2010).
- Nishigaki, T., Treviño, C. L. Tools to understand protein-protein interactions. Gòmez, I. 37, Transworld Research Network. 1-14 (2012).
- Johnson, I. The Molecular Probes Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. , 11th, Life Technologies Corporation. (2010).
- Sabnis, R. W. Handbook of Fluorescent Dyes and Probes. , Wiley. (2015).
- Adams, S. R., et al. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: synthesis and biological applications. J Am Chem Soc. 124 (21), 6063-6076 (2002).
- Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281 (5374), 269-272 (1998).
- Rashidian, M., Dozier, J. K., Distefano, M. D. Enzymatic labeling of proteins: techniques and approaches. Bioconjug Chem. 24 (8), 1277-1294 (2013).
- Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. Molecular cloning: A laboratory manual. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
- Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250. Electrophoresis. 9 (6), 255-262 (1988).
- West, R. W. Jr, Chen, S. M., Putz, H., Butler, G., Banerjee, M. GAL1-GAL10 divergent promoter region of Saccharomyces cerevisiae contains negative control elements in addition to functionally separate and possibly overlapping upstream activating sequences. Genes Dev. 1 (10), 1118-1131 (1987).
- Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J Bacteriol. 153 (1), 163-168 (1983).
- Eftink, M. R. Fluorescence methods for studying equilibrium macromolecule-ligand interactions. Methods Enzymol. 278, 221-257 (1997).
- Han, H., et al. Binding of Substrates to the Central Pore of the Vps4 ATPase Is Autoinhibited by the Microtubule Interacting and Trafficking (MIT) Domain and Activated by MIT Interacting Motifs (MIMs). J Biol Chem. 290 (21), 13490-13499 (2015).
- Sanchez-Puig, N., Veprintsev, D. B., Fersht, A. R. Binding of natively unfolded HIF-1alpha ODD domain to p53. Mol Cell. 17 (1), 11-21 (2005).
- Trusch, F., et al. The N-terminal Region of the Ubiquitin Regulatory X (UBX) Domain-containing Protein 1 (UBXD1) Modulates Interdomain Communication within the Valosin-containing Protein p97. J Biol Chem. 290 (49), 29414-29427 (2015).
- Kamp, F., Beyer, K. Binding of alpha-synuclein affects the lipid packing in bilayers of small vesicles. The Journal of Biological Chemsitry. 281, 9251-9259 (2006).
- Bujalowski, W. M., Jezewska, M. J. Fluorescence Intensity, Anisotropy, and Transient Dynamic Quenching Stopped-Flow Kinetics. Spectroscopic Methods of Analysis. 875, 105-133 (2012).
- Asano, N., et al. Direct interaction between EFL1 and SBDS is mediated by an intrinsically disordered insertion domain. Biochem Biophys Res Commun. 443 (4), 1251-1256 (2014).
