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Bioengineering

Aqueux gouttelettes servis de microréacteurs enzymatiques et leur déclenchement électromagnétique

doi: 10.3791/54643 Published: August 28, 2017

Summary

Réaction de Lab-in-a-goutte systèmes permettre la mise en oeuvre souple de réactions complexes dans une échelle de microfluidique. Une plate-forme de déclenchement automatisé consistant en une matrice de 3 x 3 des bobines électromagnétiques a été développée et utilisé avec succès pour fusionner deux 10 µL microréacteurs et ainsi initier une réaction enzymatique dans les marbres de liquides qui en résulte.

Abstract

Pour la mise en œuvre réussie des systèmes de réaction microfluidique, telles que la PCR et l’électrophorèse, la circulation des petits volumes de liquides est essentielle. Dans classiques-sur-une-puce-plates-formes lab, solvants et échantillons sont passés à travers des canaux microfluidiques définis avec les installations de contrôle de flux complexes. La plate-forme de manoeuvre de gouttelettes présentée ici est une alternative prometteuse. Avec elle, il est possible de déplacer une goutte de liquide (microréacteur) sur une surface plane d’une plate-forme de réaction (lab-dans-un-drop). L’actionnement de microréacteurs sur la surface hydrophobe de la plate-forme est basée sur l’utilisation des forces magnétiques agissant sur l’enveloppe extérieure, les gouttes de liquides qui est faite d’une fine couche de particules de magnétite SUPERHYDROPHOBE. La surface hydrophobe de la plate-forme est nécessaire pour éviter tout contact entre le noyau liquide et la surface pour permettre un mouvement sans heurt de la microréacteur. Sur la plate-forme, microréacteurs un ou plusieurs volumes de 10 µL peuvent être placées et déplacées en même temps. La plate-forme elle-même se compose d’une matrice 3 x 3 de bobines doubles électriques accueillir cœurs néodyme ou de fer. Les gradients de champ magnétique sont automatiquement contrôlés. Par la variation des gradients de champ magnétique, coquille hydrophobe magnétique des microréacteurs peut être manipulé automatiquement pour déplacer le microréacteur ou ouvrir le shell de façon réversible. Réactions des substrats et des enzymes correspondantes peuvent être initiées par la fusion des microréacteurs ou mettre en contact avec la surfaces immobilisées catalyseurs.

Introduction

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Applications techniques avec micro réactions sont principalement réalisées en jetons prédéfinis microchannel. Ces systèmes sont largement mis en place et complètement décrite dans la littérature (inter alia 1,2,3). En 2011, le chiffre d’affaires de technologies microfluidiques partout dans le monde ont totalisé 6,2 milliards euro 4. En revanche, l’utilisation des compartiments réacteur micro librement mobiles était auparavant seulement examinée et publiée dans une mesure limitée. La méthode la plus courante pour déplacer des gouttelettes micro aqueux est électromouillage 5. Autres méthodes pour la motion de gouttes sur des surfaces sont basées sur les champs électriques 6, force magnétique 7 ou déclenchement acoustique 8. Grâce à leur surface défavorable au rapport de volume, ces systèmes microréacteur axée sur les gouttelettes sont exposés aux effets de la forte évaporation. Ainsi, le mouvement de baisse est habituellement établi comme un système à deux phases liquid, où la phase supérieure a un point d’ébullition élevé, protégeant la phase aqueuse par évaporation. Néanmoins, cette approche implique un risque élevé de contamination de la gouttelette de réaction par diffusion incontrôlée. Il s’agit d’un obstacle de taille pour la mise en place technique des systèmes mentionnés.

Des travaux récents se préoccupe des transitions de phase liquide-solide non adhérents. Une approche très efficace est l’utilisation de surfaces superhydrophobes, permettant la formation de gouttelettes aqueuses sphériques. Une extension de ce concept de réaction est l’utilisation des compartiments de réaction micro pourvus d’une coquille, qui peut consister par exemple en polytétrafluoroéthylène (PTFE) particules 9ou SUPERHYDROPHOBE. Leurs angles de contact sur les surfaces sont généralement de l’ordre de 160° (en fonction de la rugosité de surface). Les compartiments sphériques ainsi fournissent une résistance minimale au mouvement sur une surface et en même temps une protection contre l’évaporation d’eau.

Des gouttes aqueuses recouverts de micro particules PTFE tailles peuvent maintenir leur forme sphérique jusqu'à un diamètre d’environ 2 mm. À volume élevé, la coquille hydrophobe est généralement pas complètement fermée plus 10. L’influence des autres matériaux de la coque et l’élargissement du champ d’application du marbre liquide aux solvants non polaires a été mis en œuvre par Gao et McCarthy à l’aide de liquides ioniques 12. Jusqu'à présent pour la formation des coquilles d’axée sur les particules hydrophobes, les diamètres de particules dans les tailles de 10 nm à 30 µm ont été décrit 11,14,16. Nouvelles études montrent que les nanoparticules hydrophobes comme matériau sont d’utilisation encore meilleure que celle des microparticules 13. Premières études de stabilité a confirmé une augmentation dans la stabilité lorsque la taille des particules est ramenée de ca. 600 nm à env. 100 nm. Ce résulte probablement de la distribution des particules plus dense autour de la sphère aqueuse 15.

La protection des compartiments aqueux de réaction par une coquille hydrophobe et leur désignation comme marbres liquide a été décrite en 2001 par Aussillous et coll. et mamoune et al. 17 , 18. depuis lors, quelques applications de ces compartiments de réaction définies ont été décrits. Par exemple, un capteur de gaz issu des marbres liquide 19 et une méthode de détection de la contamination de l’eau basée sur une base qualitative optiquement ont été développés 20. Les auteurs distinguent les avantages du taux de réaction élevé et la faible consommation de produits chimiques de leurs systèmes de réaction micro. Récentes publications traitent de la production de billes liquides sensibles au pH 16 ou la représentation de « Particules de Janus » avec deux différents revêtements de différentes fonctionnalités. Par exemple, Bormashenko et coll. pourrait synthétiser un microréacteur avec réservoirs sont construits en téflon et de noir de carbone semi-conducteurs 21. En outre, il a été démontré que les microréacteurs peuvent efficacement et commode synthétiser polyperoxides en absorbant l’oxygène extérieur comme comonomère par le biais de l' interface de gaz-liquide perméable 24. Dans une autre approche, la coquille de marbres liquide à base de particules de silice fournissent les surfaces réactives substrat pour réguler la réaction de miroir argenté classique 26. Les problèmes actuels de recherche et développement dans le domaine des gouttelettes hydrophile-core-hydrophobe-shell sont le réglage de taille de particules, la production reproductible de gouttelettes monodispersé, la mouillabilité des surfaces et l’effet d’une seconde hydrophile shell sur la réaction micro compartiments 22, mais aussi un meilleur contrôle des trajectoires gouttelettes, par exemple pour le développement de microPCR-systèmes continue 4.

Un actionnement magnétique de ces microréacteurs offre l’avantage de gammes de mouvement relativement élevée et une bonne sélectivité de la force lors de l’utilisation dans les systèmes biochimiques. Lors de l’utilisation de particules de magnétite hydrophobes, ils remplissent la fonction de la transmission de la force magnétique à la circulation de la microréacteurs, tant que la fonction d’une coquille hydrophobe. La circulation magnétique des gouttelettes avec des particules magnétiques à l’intérieur d’une goutte a été postulée pour la première fois en 2006 par Lehmann et al. 23 et Shikida et al. 25, qui ont utilisé manuellement déplacés aimants permanents comme actionneurs pour la mobilisation d’une seule goutte. Une autre approche pour déplacer une petite quantité de liquide a été réalisée par Zhao et al., qui sert de réservoir magnétique particules hydrophobes Fe3O4 . La coque du marbre liquide magnétique a été ouverte sur la face supérieure de la goutte par un champ magnétique inverse vertical 27. Basé sur ce concept, Xue et coll. ont pu développer des particules qui forment un microréacteur ayant une tension superficielle de dyne 20,1 cm−1 28. Lin et coll. fabriqué roman cellulosique micro/nano hiérarchiques sphères avec superparamagnétique et superhydrophobicity qui prévoient des gouttelettes liquides magnétiques transport et la manipulation 31de stabilité de Dieu. C’est sorti jusqu’ici seulement comme une preuve de principe étudier et pas utilisé pour n’importe quelle application. Le contrôle magnétique et électrique des marbres du liquides est actuellement poursuivi en premières approches. Zhao et al. 2010 15 et Zhang et al. 2012 29 ont pu développer une manipulation de gouttelettes par la manœuvre manuelle (manuelle) d’un aimant permanent sous noyau-enveloppe gouttelettes. Bormashenko et al. 11 a obtenu l’accélération d’une bille liquide ferromagnétique jusqu'à une vitesse de 25 cm s-1 en approchant d’un aimant de néodyme. Le principe mentionné ci-dessus études ont été réalisées exclusivement par la manœuvre manuelle d’un petit aimant permanent. Comme une prochaine étape de développement, Zhao et coll. ont été récemment capable d’estimer la densité de flux magnétique nécessaire pour le transport du marbre liquide magnétique en variant la distance d’un aimant permanent de 30. Pour un contrôle de la réaction comparable à celle des systèmes communs de lab-on-a-chip, il semble inévitable de fournir les moyens de contrôle automatisé du liquide v discretolumes. Pour satisfaire ce besoin, nous avons développé un nouveau système de contrôle basé sur des gradients de champ variable se focaliser, déplacer et ouvrir des microréacteurs magnétique.

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Protocol

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1. hydrophobisation des nanoparticules magnétiques

  1. pour la synthèse des particules magnétiques hydrophobes, ajouter 0,85 g FeCl 3 hexahydrate (3,14 mmol) et 0,30 g FeCl 2 tétrahydraté (1,51 mmol) de 200 mL solution eau/éthanol (4:1 v/v).
  2. à ce mélange, ajouter 0,20 mL 1H, 1H, 2 H, 2H-Perfluorooctyltriethoxysilane (PFOTES) (5,23 mmol) avec un brassage vigoureux par un agitateur magnétique (500 tr/min). Réaliser la synthèse dans une atmosphère de gaz inerte (N 2) à l’aide d’un ballon à fond rond avec un bouchon de Liège afin d’éviter l’oxydation secondaire des particules de magnétite.
  3. Régler la goutte de la solution sage avec une solution d’hydroxyde d’ammonium (1,5 M) à un pH de 8 (pH déterminé par un pH-mètre). Agiter la solution pendant 24 h à l’aide d’un agitateur magnétique.
  4. Séparer les particules magnétiques de la solution en plaçant le ballon sur une barre aimant (adhésif de néodyme cuboïde aimant 40 x 20 x 10 mm, force 25 kg). Versez la solution tout en gardant l’aimant fixé au fond de la fiole.
  5. Laver les particules trois fois avec la solution eau/éthanol tout en utilisant une barre aimant comme décrit au point 1.4). Sécher les particules à 60 ° C pendant 24 h (rendement environ 0,43 g).
  6. Pour analyser les particules, utiliser un Microscope électronique à balayage selon fabricant ' instructions de s.

2. Fabrication de microréacteurs

  1. moudre toutes les particules séchées légèrement à l’aide d’un pilon de verre et par la suite tous les placer directement dans un plateau de pesage (46 x 46 x 8 mm, polystyrène).
  2. Pipette 10 µL de solution de réaction (composition comme décrit en 5.1) sur toutes les particules et déplacer la pesée pan légèrement de façon circulaire pour environ 10 s (masse des particules d’un microréacteur 10 µL : env. 3,2 x 10 -7 kg < sup Class = « xref » > 33). Stocker les particules restantes (particules qui ne pas s’auto-assembler autour de la solution de réaction) à température ambiante pendant plus de demandes.
  3. Pour mesurer l’angle de contact de la microréacteur, construire un microréacteur 5 µL d’eau comme décrit au point 2.2), placez-le sur un film de téflon et d’analyser l’angle de contact à l’aide d’un dispositif de mesure d’angle de contact optique selon fabricant ' s instructions de.

3. 3D-impression des organes bobine

  1. concevoir les corps double bobine avec une hauteur de 16 mm (une chambre), un diamètre de 10 mm et un diamètre intérieur d' environ 4 mm en utilisant un logiciel de CAO selon fabricant ' s instructions de.
  2. Imprimer les corps de bobine avec une imprimante 3D selon le fabricant ' instructions de s en utilisant des matériaux tels que le filament de polylactide. Envelopper les corps avec un fil de cuivre de 0,08 mm pour atteindre 4 500 enroulements à l’aide d’une machine de bobinage avec ordinateur.

4. Fabrication de la plate-forme de commande

  1. Arrange le double bobines dans une matrice (par exemple 3 x 3) sur un tableau électrique avec un élément Peltier dessous, visser les bobines doubles et connectez-les à un contrôle via (câble) ruban la figure 3).
  2. Selon l’application désirée, ajouter un noyau de fer (hauteur 32 mm, 4 mm de diamètre) ou un aimant néodyme (hauteur 12,5 mm, 4 mm de diamètre, 1 035 kA m -1) à l’armature de la bobine pour obtenir un champ magnétique plus fort.
  3. Pour finir la plate-forme placer une plaque, de préférence le verre de quartz, d’une hauteur maximale de 1 mm sur la matrice de la bobine.
  4. Placer un microréacteur sur la surface de la plate-forme.
  5. Pour retirer les particules supérieures de la solution de la réaction et ainsi ouvrir un microréacteur active une bobine avec un aimant au néodyme à l’intérieur en utilisant le contrôle mentionné en 4.1). Pour fermer le microréacteur désactiver à nouveau la bobine.
  6. Pour fusionner deux microréacteurs qui sont d’abord vers séparés de 10 mm utilisez aimants de néodyme, comme décrit dans 4.2). Soulevez l’aimant dans les corps de bobine requis en activant des bobines de ca. 25 s pour ouvrir un microréacteur (distance requise entre microréacteur et l’aimant se trouve à environ 12 mm) et de passer d’un à la même position sur la plate-forme.
  7. Refroidir la réaction solution dans le microréacteur sur la surface de la plateforme et diminuer la température de la bobine a allumer l’élément Peltier positionné sous la matrice de la bobine comme décrit en 4.1).

5. Réaction enzymatique par fusion microréacteurs

  1. dissoudre la peroxydase de raifort à une concentration de 0,1 µg mL -1 dans le tampon de phosphate de potassium (0,1 M, pH 6,5). Diluer le substrat, 10-acétyl-3, 7-dihydroxyphenoxazine (10 mM dans le diméthylsulfoxyde (DMSO)) avec tampon de phosphate de potassium (0,1 M, pH 6,5) à une concentration de 200 µM.
  2. Utilisation 10 µL de chacune de ces solutions pour construire deux microréacteurs comme indiqué au point 2.2). Fusionner les deux microréacteurs par la moyenne des forces magnétiques (aimant en néodyme cylindre : 12,5 mm x 4 mm, 1 035 kA m -1) comme décrit dans 4,6) à 25 ° C.
  3. Détecter la réaction en plaçant une sonde de fluorescence (longueur d’onde excitation : 570 nm, longueur d’onde d’émission : 585 nm) env. 10 mm directement au-dessus d’un microréacteur ouvert avant la fusion.

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Representative Results

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Les coquille les particules ont un diamètre d’environ 640 nm. Les nanoparticules magnétisables enfermés dans cette fluorosilane les particules de shell ont des diamètres dans une fourchette comprise entre 22 nm et 37 nm. Un microréacteur 5 µL d’eau comme un noyau liquide avait un angle de contact d’autour de 160°.

La force nécessaire pour déplacer un microréacteur 10µl tel que décrit ci-dessus est 1.34 ± 0,08 µN. la Figure 1 illustre la force électromagnétique d’une bobine avec des enroulements de fil de cuivre et un noyau de fer interne alimenté avec 58 4 500 mA. La répartition de la force est estimée par un modèle éléments finis (MEF) pour déterminer les propriétés de bobine requis pour déplacer un microréacteur. Comme peut être vu dans la Figure 1, la force magnétique réalisée par la bobine décrite est assez forte pour passer un microréacteur à une distance plus loin que 10 mm du centre de la bobine.

La force magnétique pour ouvrir un microréacteur est égal à 0,85 mN ± 0,05 qui est beaucoup plus élevée que la force nécessaire pour déplacer la goutte. La force magnétique induite par la bobine avec le noyau de fer intérieur (Figure 1) n’est pas assez forte pour ouvrir un microréacteur, un aimant de néodyme a été utilisé dans les bobines. En alimentant les bobines doubles dans le sens de débit de courant alternatif, l’aimant permanent peut être déplacé rapprochent ou s’éloignent de la plate-forme. Ainsi, le microréacteur peut être ouverts ou fermé par magnétisme. Si deux microréacteurs avec une coque entièrement intacte se trouvent côte à côte ils fusionner pas car la tension de surface inhibe leur fusion. Par conséquent, au moins un doit être ouvert.

La figure 2 illustre la cinétique de Michaelis-Menten résultant de fusions un microréacteur 10 µL contenant peroxydase avec un autre 10 µL microréacteur contenant le substrat correspondant (n = 3). Par la valeurm de Lineweaver-Burk linéarisation le K calculée pour la réaction au sein de la microréacteur est 86.85 µM ± 10,95 µM, la valeurmax v se trouve à 378.8 nmol L-1 s-1 ± 115,6 nmol L-1 s-1. Comme la valeur dem K est dans la bonne correspondance avec celle donnée dans la littérature, 81 de 3 µM ± 32, on peut supposer que la réaction enzymatique dans le microréacteur à petite échelle avec le matériau hydrophobe n’est pas influencée pour ce qui est affinité.

Figure 1
Figure 1 : Électromagnétiques forcer la simulation d’une bobine avec 58 mA et 4 500 enroulements de cuivre fil en fonction de la distance de la microréacteur vers le centre de la bobine déterminé par FEM. Le diamètre de la bobine est de 10 mm, le diamètre du noyau métallique est 4 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Cinétique de Michaelis-Menten de peroxydase mesurée en fusionnant deux 10 µL microréacteurs. La température est de 25 ° C et la mémoire tampon utilisée est le phosphate de potassium (0,1 M) avec un pH de 6,5. Trois répétitions ont été menées.

Figure 3
Figure 3 : Plate-forme d’actionnement. La plate-forme de commande se compose d’une matrice 3 x 3 de bobines doubles. Une bobine a 4 500 enroulements, une hauteur de 16 mm (une chambre), un diamètre de 10 mm et un diamètre intérieur d’environ 4 mm. La hauteur des bobines est prédéfinie par la hauteur de l’aimant de néodyme utilisé de cylindre. Le diamètre a été choisi parce que des études antérieures ont montré qu’il s’agit d’une distance raisonnable pour déplacer un microréacteur avec ce type d’aimant. Le nombre d’enroulements et le courant a été déterminé par FEM. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

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Pour l’utilisation efficace des technologies de la microfluidique, il est important de déplacer le volume réactionnel correspondant aux exigences de la synthèse biotechnologique et les analyses. La plate-forme de manoeuvre présentée ici permet de déplacer des gouttelettes de microfluidique par force magnétique. Le mouvement peut être effectué librement en deux dimensions sur une surface plane d’une plate-forme de réaction en enfermant la goutte liquide avec une coque SUPERHYDROPHOBE magnétique. Ainsi un système alternatif aux canaux microfluidiques prédéfinis avec les installations de contrôle d’écoulement complexe, tel qu’utilisé dans les systèmes microfluidiques classiques, pour passer de solvants et échantillons est introduite. L’actionnement automatique de gouttelettes de petite réaction est donc une simplification importante des plateformes connues de lab-on-a-chip. En outre, la plate-forme rend possible d’ouvrir réversiblement un microréacteur pour ajouter et supprimer des échantillons de la réaction. En combinaison avec un système de distributeur, cela peut se traduire par un degré élevé de contrôle de la réaction automatique et constitue la première étape pour silico microreactions concevable dans une virtual lab-en-a-goutte. La principale limite de cette technique est que les microréacteurs ne peut se construire avec petits volumes (jusqu'à env. 30 µL). Une étape cruciale dans le protocole est la détection de la réaction enzymatique à l’intérieur de la microréacteurs car la sonde de fluorescence doit être ajusté correctement. Une autre possibilité de détection peut être spectroscopie ultraviolet-visible.

Le processus de développement de la plate-forme a montré qu’une bobine électromagnétique d’un diamètre de 10 mm est suffisante pour le mouvement de la gouttelette. En revanche, une bobine double remplie d’air ou un noyau de fer n’est pas capable d’induire la force magnétique qui est nécessaire pour ouvrir un shell microréacteur. Par conséquent, carottes de néodyme ont été choisis dans les bobines pour effectuer cette tâche. Les gradients de champ magnétique qui en résulte peuvent varier encore par mouvement électromagnétique de l’aimant vertical à la plate-forme de la réaction. La superficie de la plate-forme est seulement limité par le contrôle. Le contrôle déjà existant et le logiciel est conçu et prêt à l’emploi pour une matrice de 10 x 10. L’élément Peltier n’est pas nécessaire pour les applications décrites mais peut-être être nécessaire lorsque le microréacteur a fixé pour un temps plus long et il permettra de refroidir le mélange réactionnel au-dessus de la surface de la plate-forme.

À l’avenir, la combinaison de la plate-forme de manoeuvre avec les marbres liquides peut fonctionner comme flexibles-en-a-goutte-systèmes de laboratoire pour la mise en œuvre de projections, analyses optiques rapide et réactions de cascade enzymatique complexe avec des volumes de réaction très faible. En outre, la plate-forme peut être utilisée pour (bio-) des analyses chimiques telles que la PCR, électrophorèse ou ELISA. En outre, la projection de nouvelles enzymes pertinentes industrielles et aptamère amplifications est possibilités prometteuses.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs aimerait remercier la DFG pour le soutien.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D-printer FelixPrinters Pro1
10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine (Amplex Red) Life Technologies A12222
Ammonium hydroxide TU-KL 1072
CAD software Siemens Soled edge
Contact angle measuring device Dataphysics OCA 20
Cylinder magnet Webcraft GmbH S-04-13-N https://www.supermagnete.de/stabmagnete-neodym-rund/stabmagnet-durchmesser-4mm-hoehe-12.5mm-neodym-n42-vernickelt_S-04-13-N
Dipotassium phosphate Bernd Kraft 7758-11
Drying oven Binder FD 115
Ethanol Sigma-Aldrich 68-17-5
FeCl2 tetrahydrate TU-KL 1625
FeCl3 hexahydrate TU-KL 1622
Fluorescence probe PerkinElmer LS 55
Horseradish peroxidase Carl Roth 9003-99-0
Hydrogen peroxide Th.Geyer GmbH & Co 7722-84-1
Monopotassium phosphate Bernd Kraft 7778-77-0
Peltier element Conrad  193569
Perfluoroctyltriethoxysilane Sigma-Aldrich 51851-37-7
Scanning Electron Microscope FEI Helios NanoLab 650 DualBeam
Separation bar magnet Webcraft GmbH Q-40-20-10-N
Winding machine IWT GmbH FW122

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Aqueux gouttelettes servis de microréacteurs enzymatiques et leur déclenchement électromagnétique
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Al-Kaidy, H., Kuthan, K., Hering, T., Tippkötter, N. Aqueous Droplets Used as Enzymatic Microreactors and Their Electromagnetic Actuation. J. Vis. Exp. (126), e54643, doi:10.3791/54643 (2017).More

Al-Kaidy, H., Kuthan, K., Hering, T., Tippkötter, N. Aqueous Droplets Used as Enzymatic Microreactors and Their Electromagnetic Actuation. J. Vis. Exp. (126), e54643, doi:10.3791/54643 (2017).

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