Abstract
وقد تم تجهيز جسم الثدييات مع طبقات مختلفة من الآليات التي تساعد على الدفاع عن نفسها من الغزوات الممرض. البالعات المهنية للنظام المناعي - مثل العدلات، والخلايا الجذعية، والضامة - تحتفظ القدرة الفطرية لكشف ومسح هذه الجراثيم الغازية من خلال البلعمة 1. تتضمن البلعمة الأحداث فشلت في إعادة تنظيم الغشاء وإعادة الأكتين على سطح الخلية 2 و 3. البالعات استيعاب بنجاح والقضاء على الجزيئات الغريبة فقط عندما يتم استيفاء جميع مراحل البلعمة. وتشمل هذه الخطوات الاعتراف وملزمة من مسببات المرض عن طريق مستقبلات التعرف على الأنماط (PRRs) المقيمين على سطح الخلية، وتشكيل كوب أكلة من خلال نتوءات غشائي التخصيب الأكتين (pseudopods) لتطويق الجسيمات، وانفصال من يبلوع تليها النضج يحلول يبلوعي أن النتائج فيمقتل الممرض 3 و 4.
التصوير النوعي والكمي لمراحل مختلفة من البلعمة هو أساسي لتوضيح الآليات الجزيئية لهذه العملية الخلوية. المخطوطة تقديم تقارير طرق لدراسة مختلف مراحل البلعمة. نحن تصف النهج القائم على المجهر لتصور وتحديد، تشكيل كوب أكلة ملزم، واستيعاب الجسيمات من قبل البالعات. كما تحدث البلعمة عندما مستقبلات الفطرية على الخلايا البلعمية تواجه بروابط على الجسيمات الهدف أكبر من 0.5 ميكرون، والمقايسات نقدم هنا تشمل استخدام الفطريات المسببة للأمراض المبيضات البيض وغيرها من الجسيمات مثل زيموزان وحبات مغلفة مفتش.
Introduction
وعلى الرغم من التعرض المستمر لمسببات الأمراض مثل البكتيريا والفيروسات والفطريات، وأجسامنا مجهزة تجهيزا جيدا مع الآلية المناعية التي توفر الحماية ضد العدوى. نظام المناعة الفطري هو خط الدفاع الأول ضد الجراثيم الغازية ويعتمد أساسا على الخلايا البلعمية التي تعترف واستيعاب اهداف اجنبية.
البلعمة هي عملية الخلوية الحفاظ تطويريا الذي يشمل ابتلاع الجسيمات غير المرغوب فيها أكبر من 0.5 ميكرون. الخلايا البلعمية تعبر عن مجموعة واسعة من مستقبلات المناعة (المعروف أيضا باسم مستقبلات التعرف على الأنماط، PRRs) على سطح الخلية التي تمكنهم من التعرف على الأنماط الجزيئية المرتبطة الممرض (PAMPs) موجودة على مسببات الأمراض قبل الغمر 3. الممرض ويتبع ملزمة من قبل تجمع مستقبلات على سطح الخلية ويطلق تشكيل كوب البلعمة. وهذا يؤدي إلى يحركها الأكتين يعيد الغشاء الذي يبرز حولالهدف، في نهاية المطاف يغلف ذلك ومعسر النعاس، لتشكل منفصلة phagosomal فجوة 2، 5. ويبلوع ثم ينضج والخواص الحمضية الانصهار لاحق مع أواخر الإندوسومات والجسيمات الحالة التي تشكل يحلول يبلوعي 6.
على الرغم من أن يوصف البلعمة كما بوساطة مستقبلات ويحركها الأكتين الحدث، وهذه العملية تعتمد أيضا على تعديل المكانية والزمانية من الدهون التي تشكل غشاء البلازما، مثل phosphoinositides (حزب القانون والعدالة)، والإسفنجية 7 و 8. في حين تمليه البلمرة أكتين من قبل تراكم المحلي phosphoinositol-4،5-biphosphate (PI (4،5) ف 2) في قاعدة الكأس أكلة، الأكتين التحلل يعتمد على تحويل (PI (4،5) ف 2 إلى كل من التعديلات phosphoinositol-3،4،5-biphosphate (PI (3،4،5) ف 3) 3 و 9.لا غنى عنها كما يؤدي السابقة للتمديد الناجح لpseudopods حول الهدف وهذا الأخير تمكن غرق الجزيئات في العصارة الخلوية للبلعمية 10.
الخلايا التي لديها القدرة في phagocytose إما البالعات المهنية، مثل الضامة / حيدات، والمحببة / العدلات، والخلايا الجذعية (DCS) أو البالعات غير مهني، مثل الخلايا الليفية والخلايا الظهارية 11. البلعمة التي يقوم بها كل البالعات تلعب دورا مركزيا في صيانة الأنسجة وإعادة عرض، في حين البلعمة التي يقوم بها البالعات المهنية هي المسؤولة عن تنسيق الاستجابة المناعية الفطرية والتكيفية ضد مسببات الأمراض. البالعات المهنية لا فقط يغمر وقتل الممرض، ولكن أيضا المستضدات الموجودة على الخلايا اللمفاوية في الجهاز المناعي التكيفي. هذا يساهم في الإفراج عن السيتوكينات الموالية للالتهابات وإلى إشراك الخلايا اللمفاوية، وبالتالي يؤدي إلىالحصار الناجح لإصابة 12.
وقد تقنيات الكيمياء الحيوية التقليدية دورا أساسيا في اكتساب المعرفة حول الآلية الجزيئية من العمليات الخلوية المختلفة خلال البلعمة، مثل التعديلات بعد متعدية ومختلف الجمعيات عالية تقارب بين البروتينات. ومع ذلك، فمن الصعب الحصول على معلومات بشأن ديناميات المكانية والزمانية لأحداث أكلة باستخدام الطرق الكيميائية الحيوية التقليدية. الخلية الحية التصوير ليس فقط يسمح لنا لرصد الأحداث الخلوية بطريقة حساسة الوقت ولكن أيضا تمكننا من الحصول على معلومات على مستوى خلية واحدة. نحن هنا تصف طريقة للتحقيق في مراحل مختلفة من البلعمة، وكذلك لتحليل العملية برمتها spatiotemporally باستخدام متحد البؤر المجهري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد خطوط 264.7 خلية DC2.4 و RAW
ملاحظة: خط الخلية مثل بلعم RAW 264.7 وشجيري DC2.4 خط الخلية على حد سواء أصل الفئران، واستخدمت الشروط التالية لزراعة الخلايا.
- تنمو الخام 264.7 الخلايا في DMEM (الحد الأدنى المتوسطة النسر Dulbecco و) تستكمل مع 10٪ المعطل الجنين مصل بقري (FBS) عند 37 درجة مئوية في حاضنة ترطيب مع 5٪ CO 2.
- زراعة خلايا DC2.4 في ظروف مماثلة مع أن من الخام 264.7 الخلايا، باستثناء استخدام المتوسطة RPMI (معهد روزويل بارك التذكاري) تستكمل مع L-الجلوتامين بدلا من DMEM.
2. إعداد نيون مترافق الجسيمات: الخرز جيم البيض، زيموزان، مفتش المغلفة
- تزايد المبيضات البيض
- تطعيم C. المبيضة البيضاء سلالة SC5314 من المخزون الجلسرين المجمدة في 25 مل من YPD تستكمل مع أوري (2٪ Bacto-ببتون، 1٪خلاصة الخميرة، 2٪ الجلوكوز و 80 ميكروغرام / مل يوريدين) بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية.
ملاحظة: تجنب تنامي ثقافة المبيضات أكثر من OD 600 من 12. - خذ 1 مل من C. المبيضة البيضاء وتدور عليه في 2000 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- نضح طاف وإعادة تعليق بيليه مع 1 مل من برنامج تلفزيوني.
- جمع بيليه بواسطة الطرد المركزي في 2000 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- كرر الخطوة 2.1.4.
- حساب وافر من العدوى (وزارة الداخلية) من C. المبيضة البيضاء فيما يتعلق بعدد الخلايا البالعة والمضي قدما في فحص البلعمة كما هو موضح في القسم 3. إن OD 600 من 1 ما يعادل 2.5 × 10 7 المبيضات البيض في 1 مل.
ووصف جيل من المبيضات، حزب الحرية، في اشارة 13: ملاحظة.
- تطعيم C. المبيضة البيضاء سلالة SC5314 من المخزون الجلسرين المجمدة في 25 مل من YPD تستكمل مع أوري (2٪ Bacto-ببتون، 1٪خلاصة الخميرة، 2٪ الجلوكوز و 80 ميكروغرام / مل يوريدين) بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية.
- إعداد زيموزان والخرز المغلفة مفتش-
ملاحظة: زيموزان هو β-جلوكان التي تحتوي علىالفطرية إعداد الكربوهيدرات الجسيمات تلك المستمدة من خميرة الخباز. ومن المعروف زيموزان لاستحضار إشارات التهاب في الضامة والخلايا الجذعية، واستخدمت على نطاق واسع في الدراسات البلعمة 13 و 14 و 15.- لفترة وجيزة دوامة الأنبوب الذي يحتوي على جسيمات، وقسامة، وهو مبلغ كاف لتجربة في أنبوب 1.5 مل.
ملاحظة: عادة نستخدم 01:10 نسبة (لخلية واحدة، إضافة 10 الجسيمات زيموزان أو حبات مغلفة مفتش). - إضافة 1 مل من الجليد PBS الباردة، وجمع الجزيئات بواسطة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 10000 ز س.
- نضح طاف و resuspend بيليه في برنامج تلفزيوني 1 مل الجليد الباردة.
- كرر الخطوات 2.2.2-2.2.3
ملاحظة: انتقل إلى الخطوة 2.2.5 أو تخزين أنبوب في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام. - يصوتن الجسيمات لمدة 10 ثانية في sonicator حمام بالموجات فوق الصوتية (120 V، 50-60 كيلو هرتز) وذلك لتجنبنيويورك الجسيمات التجميع.
- لفترة وجيزة دوامة الأنبوب الذي يحتوي على جسيمات، وقسامة، وهو مبلغ كاف لتجربة في أنبوب 1.5 مل.
3. البلعمة
ملاحظة: البلعمة هي عملية معقدة تبدأ مع ربط جزيئات على سطح خلية من الخلايا البالعة من خلال تفاعل PRRs مع بروابط على سطح الجسيمات. ويتبع ملزمة من قبل الجمعية العامة للالأكتين والبروتينات المرتبطة بها في موقع التماس، وتشكيل كوب البلعمة. يحدث التفكيك الأكتين لاحق في يبلوع والنتائج في الإحاطة الكاملة للجسيمات. أدناه وصفنا مختلف مراحل البلعمة.
- ملزمة الفحص
ملاحظة: إن الغرض من هذه التجربة لمراقبة الخطوة الأولى من البلعمة التي تنطوي على التفاعل بين بروابط على الجزيئات المستهدفة والمستقبلات على البالعات.- البذور حوالي 5 × 10 4 خلايا في شريحة الغرفة بحيث تكون 60-70٪ متكدسة في وقت التجربة. Alternatively، وخلايا لوحة على زلات غطاء (في 24- أو شكل 12 أيضا) أو لوحات 96-جيدا أسفل الزجاج. احتضان خلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية حاضنة ترطيب مع 5٪ CO 2.
يمكن عدها الخلايا باستخدام عدادة الكريات أو تقنية مشابهة: ملاحظة. - ضع الشريحة الغرفة (أو لوحة) في 10 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
- إزالة بلطف المتوسطة من كل بئر باستخدام ماصة أو الشافطة.
تنبيه: تنفيذ هذه الخطوة بعناية حيث أن كل بئر من نظام ساترة غرف صغيرة. فمن السهل أن التشويش على الخلايا مع غيض من ماصة أو تيار قوي من الشافطة. - مزيج من الجسيمات fluorescently المسمى مع خلية ثقافة المتوسط (أعد كما هو موضح أعلاه). إضافة المبيضات -BFP (في وزارة الداخلية من 10)، fluorescently مترافق-زيموزان أو اللاتكس الخرز أرنب مفتش-FITC (10 جسيمات لكل خلية) إلى الخلايا. استخدام الحجم النهائي من 200 ميكرولتر وسائل الاعلام لغرفة واحدة كذلك لضمان تغطية جميع الخلايا.
- تدور باستمرار الشريحة غرفة في 277x ج لمدة 3 دقائق في 10 درجة مئوية.
ملاحظة: هذه الخطوة الطرد المركزي يساعد على زيادة الاتصال بين الجسيمات والخلايا، وذلك بالتزامن عملية الربط. - على الفور نقل الشريحة غرفة إلى حاضنة ترطيب 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 لمدة 5 دقائق.
- إزالة الشريحة الغرفة من الحاضنة ونضح وسائل الإعلام.
- غسل الخلايا 3X مع الثلج الباردة برنامج تلفزيوني.
ملاحظة: تحقق من وجود جزيئات غير منضم مع مجهر الضوء وغسل أكثر من مرة مع برنامج تلفزيوني إذا لزم الأمر. ومن الضروري إزالة الجزيئات غير منضم من البئر للحد من الضوضاء الخلفية أثناء التحليل. - إصلاح الخلايا بإضافة 500 ميكرولتر بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) المخفف في برنامج تلفزيوني التي يحتضنها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
تنبيه: هذه الخطوة يتطلب استخدام PFA 4٪ وهي عالية السمية، تآكل، ومادة مسرطنة محتملة. وينبغي اتخاذ الحذر المناسب عند استخدام هذا السائل. أيضا، حماية عينات من الضوء. - كرر 3.1.9 الخطوة مرتين.
ملاحظة: في هذه الخطوة، إعادة ملء القنينة الواحدة فورا بعد إزالة برنامج تلفزيوني السابق. - وقف التثبيت التي يحتضنها مع 500 ميكرولتر من 50 ملي NH 4 الكلورين في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة.
- غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني كما هو موضح في الخطوة 3.1.10.
- Permeabilize الخلايا بإضافة 250 ميكرولتر العازلة ملزمة (0.1٪ سابونين، 0.2٪ في جيش صرب البوسنة PBS) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- وصمة عار F-الأكتين عن طريق إضافة phalloidin مترافق fluorescently (المخفف 1: 500 في المخزن ملزمة). احتضان الخلايا لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- غسل خلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني كما هو موضح في الخطوة 3.1.10.
- التقاط الصور باستخدام المجهر متحد البؤر (الهدف 63X، و 402 نانومتر و 488 نانومتر ليزر) وتحليل الصور باستخدام يماغيج 16.
ملاحظة: الجسيمات الناجح يتميز ملزمة من قبل وجود مكعب أكلةp في الموقع حيث الاتصال الجسيمات الخلية البلعمية (الشكل 1). راجع الخطوة 3.2.5.
- البذور حوالي 5 × 10 4 خلايا في شريحة الغرفة بحيث تكون 60-70٪ متكدسة في وقت التجربة. Alternatively، وخلايا لوحة على زلات غطاء (في 24- أو شكل 12 أيضا) أو لوحات 96-جيدا أسفل الزجاج. احتضان خلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية حاضنة ترطيب مع 5٪ CO 2.
- البلعمة امتصاص الفحص
ملاحظة: تم تصميم هذه التجربة لمراقبة استيعاب كامل من الجسيمات التي fluorescently المسمى البالعات باستخدام المجهر متحد البؤر (الشكل 2).- البذور حوالي 5 × 10 4 خلايا في شريحة الغرفة بحيث تكون 60-70٪ متكدسة في وقت التجربة. بدلا من ذلك، وخلايا لوحة على زلات غطاء (في 24- أو شكل 12 أيضا) أو لوحات 96-جيدا أسفل الزجاج. احتضان خلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية حاضنة ترطيب مع 5٪ CO 2.
يمكن عدها الخلايا باستخدام عدادة الكريات أو تقنية مشابهة: ملاحظة. - الحفاظ على الشرائح غرفة (أو لوحة) في 10 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
ملاحظة: التبريد هو ضروري من أجل منع الإلتقام وكذلك البلعمة غير المرغوب فيها، وبعد ذلك الحصول على البلعمة متزامنة. - الأداء الإقتصادي الأداءخطوات مكتب إدارة السجلات من 3.1.3 إلى 3.1.5
- نقل الشريحة الغرفة إلى 37 درجة مئوية حاضنة ترطيب مع 5٪ CO 2، واحتضان للحصول على نقاط زمنية مختلفة. إصلاح الخلايا بعد الإصابة 30، 60 و 90 دقيقة بعد. مراقبة جيم البيض تبدأ في تشكيل خيوط في آخر إصابة 60 دقيقة. تبدأ الخلايا البالعة لإظهار موت الخلايا (pyroptosis) بعد 90 دقيقة 8.
ملاحظة: هذا هو التوصية، والأمثل هو ضروري اعتمادا على نوع من الخلايا والجسيمات المستخدمة. - تنفيذ الخطوات من 3.1.7 إلى 3.1.15. تحليل الصور باستخدام يماغيج 16.
ملاحظة: تتميز امتصاص الناجحة التي قام بها لاستيعاب كامل من الجسيمات داخل السيتوبلازم من بلعمية (الشكل 2). تلطيخ الخلايا البالعة مع علامة سطح الخلية مثل phalloidin يساعد على رسم كفاف من الخلايا. ومن الضروري لأداء ض أكوام من أجل أيضا لتحديد ما إذا كان لا بد من الجسيمات إلى سطح الخلية أو مجمعات للالمنضوية etely.
- البذور حوالي 5 × 10 4 خلايا في شريحة الغرفة بحيث تكون 60-70٪ متكدسة في وقت التجربة. بدلا من ذلك، وخلايا لوحة على زلات غطاء (في 24- أو شكل 12 أيضا) أو لوحات 96-جيدا أسفل الزجاج. احتضان خلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية حاضنة ترطيب مع 5٪ CO 2.
- تصوير لايف البلعمة
ملاحظة: في هذا البروتوكول وصفنا استخدام الميكروسكوب متحد البؤر لالتقاط مختلف مراحل البلعمة باستخدام زيموزان مترافق fluorescently. نحن نستخدم خط الخلية شجيري DC2.4 التي تعبر عن مستقر الموسومة mCherry-F-الأكتين 8، جهاز الاستشعار البيولوجي الذي يظهر توزيع الأكتين الخيطية في الخلايا الحية. منذ البلعمة هي عملية يحركها الأكتين والتصوير الحي في هذه الخلية تمكن ليس فقط لنا لالتقاط حركة وديناميكية الشبكة F-أكتين، ولكن أيضا لتصور أحداث مختلفة أكلة داخل الخلايا الحية (الشكل 3، فيلم 1).- البذور حوالي 5 × 10 4 خلايا في شريحة غرفة بتركيز بحيث تكون 60-70٪ متكدسة في وقت التجربة. احتضان خلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية حاضنة ترطيب مع 5٪ CO 2.
يمكن عدها الخلايا باستخدام عدادة الكريات أو ملاحظة:تقنية مماثلة. - الحفاظ على الشرائح غرفة على الجليد لمدة 10 دقيقة.
ملاحظة: التبريد هو ضروري من أجل منع امتصاص غير المرغوب فيها، والحصول على البلعمة متزامنة. - تنفيذ الخطوات من 3.1.3 إلى 3.1.5
- قبل تدفئة المرحلة المجهر إلى 37 درجة مئوية، وتتوازن الغرفة مع 5٪ CO 2. الانتظار 30-45 دقيقة لدرجة الحرارة وثاني أكسيد الكربون 2 في الاستقرار قبل بدء التصوير.
ملاحظة: منذ CO 2 ودرجة الحرارة مستويات بالغة الأهمية بالنسبة لالبلعمة، فمن المهم لتشغيل سخان المجهر قبل التجربة لكي تتوازن الغرفة البيئية. - ضع الشريحة غرفة تحتوي على خلايا في العلبة المجهر حاضنة معايرتها عند 37 درجة مئوية وCO 2 5٪.
- أداء التصوير الحي 17 و 18.
ملاحظة: إعدادات لقوة الليزر (ربح، الثقب، وما إلى ذلك) يمكن أن تختلف تبعا لنوع من الالبريد المجهر والتحقيق الفلورسنت استخدامها. ولذلك، فإننا نوصي التشاور دليل المجهر للحالة المثلى لتصوير حي لديك 17،18.- استخدام متحد البؤر مجهر المسح الضوئي ليزر (والبرامج المرتبطة بها) لتصوير حي. استخدام الهدف النفط 63X 1.4NA مع الثقب من 1-1،1 حدات إيري.
- لبدء التصوير، واستخدام الحقل مشرق للعثور على منطقة تمثيلية على الشريحة الغرفة. بعد ذلك، حدد الحقل عن طريق النقر على خيار الوظيفة على البرنامج. للكشف عن GFP في المسار 1 استخدام مجموعة تصفية 488 نانومتر ليزر مع الخائن شعاع في 582 نانومتر، للكشف عن الموجات بين 488 و 582 نانومتر.
- في المسار 2 اختيار مرشح وضع الأمثل لmCherry (RFP) باستخدام الحزمة الخائن في 578 نانومتر، والكشف عن موجات بين 578 و 600 نانومتر. استخدام 488 نانومتر و 578 نانومتر ليزر مع قوة الليزر 50٪ وانتاج كسب 600-700. الحصول على الصور كل 30 ثانية ليصبح المجموع 90 دقيقة.
- البذور حوالي 5 × 10 4 خلايا في شريحة غرفة بتركيز بحيث تكون 60-70٪ متكدسة في وقت التجربة. احتضان خلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية حاضنة ترطيب مع 5٪ CO 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وتقدم طريقة القائم على المجهر لمراقبة مختلف مراحل البلعمة. وأظهرت أحداث مختلفة خلال البلعمة من مختلف الجسيمات الفلورسنت من الخلايا DC2.4. استخدام الأساليب المذكورة هنا، ونحن التحقيق في دور الإسفنجية في المراحل المبكرة من البلعمة. لهذا الغرض، DC2.4 الخلايا الجذعية ناقصة وراثيا في Sptlc2، الإنزيم الذي يحفز الخطوة الأولى والحد من معدل في مسار السكروز الشحميات السفينغولية، استخدمت. بالمقارنة مع خلايا نوع البرية، Sptlc2 - / - خلايا DC2.4 خفضت بشكل كبير مستوى الإسفنجية بما في ذلك سيراميد، سفينغوميالين وglucosylceramide 8. Sptlc2 - / - خلايا DC2.4 معيبة ملزمة، وكذلك في امتصاص جيم البيض، زيموزان ومفتش الخرز اللاتكس 8. في الشكل 1، يظهر من مترافق-زيموزان fluorescently الجسيمات ملزمة في خلايا DC2.4 (انظر التقطيعةن 3.1 لمزيد من التفاصيل). أظهرت خلايا DC2.4 أقل بكثير ملزم من زيموزان من الخلايا السيطرة DC2.4 (ع = 0.0008؛ الشكل 1A) - Sptlc2 - /. وكان عدد من جسيمات زيموزان ملزمة لكل خلية أعلى بكثير لخلايا السيطرة من لSptlc2 - / - خلايا DC2.4 (ع <0.0001، الشكل 1C). ونحن التحقيق بجانب قدرة Sptlc2 - / - خلايا DC2.4 في phagocytose جيم البيض. أظهرت خلايا البلعمة DC2.4 أقل بكثير من C. المبيضة البيضاء (ع <0.0005) بالمقارنة مع الخلايا السيطرة (الشكل 2A، 2B) - Sptlc2 - /. وكما كان متوقعا، وأظهرت الخلايا Sptlc2 التي تعاني من نقص عدد أكبر بكثير من الخلايا غير البلعمية (ع <0.05، الشكل 1C) وانخفضت عدد من جيم البيض في الخلية (الشكل 1C، D). هذه النتائج تؤكد دور مسارا السكروز الشحميات السفينغولية سليمة في ملزمة، وكذلك في تيانه امتصاص الجسيمات. ويبين الشكل 3 الوقت الفاصل بين الصور مما يدل على المراحل المبكرة من البلعمة (انظر القسم 3.3 لإجراء تفصيلي). فيلم 1 يبين تصوير حي من الخلايا DC2.4 التعبير عن مستقر F-الأكتين، جهاز الاستشعار البيولوجي الذي يكشف عن توزيع الأكتين الخيطية في الخلايا (انظر القسم 3.1 لمزيد من التفاصيل) الحية.
الشكل 1: فحص من زيموزان ملزم في الخلايا DC2.4. (أ) مراقبة وSptlc2 - / - حضنت الخلايا DC2.4 مع زيموزان مترافق fluorescently، وقدرتها على ربط الجسيمات فحصها بواسطة المجهر متحد البؤر. تشير الأسهم مواقع ملزمة. شريط مقياس = 100 ميكرون. (B، C) الكمي لعدد من الجزيئات المربوطة زيموزان (ب) وعدد من الجسيمات زيموزان ملزمة لكل جيظهر الذراع (C). وتم قياس كمية الجسيمات ملزمة وقدم كنسبة مئوية نسبة إلى عنصر التحكم. جميع الرسوم البيانية عرض SD من ثلاث تجارب مستقلة، واحصي لا يقل عن 200 خلايا لكل تجربة. وقد استخدم أونبايريد اختبار (ت) لتحليل أهمية الفروق الملحوظة. ** ف <0.001. شريط مقياس = 100 ميكرون. طبع بإذن من Tafesse وآخرون. 2015 8. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: البلعمة من C. البيض في خلايا DC2.4. أصيب (أ) الخلايا مع C andida -BFP كما هو موضح في الخطوة 3.2. في 90 دقيقة بعد الإصابة، تم إصلاح الخلايا وملطخة شبيه بالقضيب مترافق fluorescentlyفي وتصويرها باستخدام المجهر مبائر. (B - D) يظهر الكمي لعدد من المبيضات -BFP، والخلايا البلعمية غير المنضوية، وعدد من المبيضات -BFP لكل خلية. جميع الرسوم البيانية عرض SD من ثلاث تجارب مستقلة، واحصي لا يقل عن 200 خلايا لكل تجربة. وقد استخدم أونبايريد اختبار (ت) لتحليل أهمية الفروق الملحوظة. ** ف <0.001. شريط مقياس = 100 ميكرون. طبع بإذن من Tafesse وآخرون. 2015 8. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (3): الوقت الفاصل بين التصوير من C. المبيضة البيضاء امتصاص لتصور المراحل المبكرة من البلعمة. البرية خلايا نوع DC2.4 التعبير عن مستقر F-الأكتين -mCherry (F-الأكتين) حضنت مع المبيضات -BFP (كما هو موضح باللون الأحمر) وتصويرها باستخدام المجهر مبائر. وتظهر الصور التي تم التقاطها في 30 ثانية فترات. تظهر العلامات النجمية مختلف مراحل إعادة الأكتين خلال البلعمة. شريط مقياس = 100 ميكرون. طبع بإذن من Tafesse وآخرون. 2015 8. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
فيلم 1: تصوير مباشر. والخلايا المصابة نوع DC2.4 البرية معربا عن مستقر F-الأكتين-mCherry (كما هو موضح باللون الأخضر) مع المبيضات -BFP (كما هو موضح باللون الأحمر). تم إجراء التصوير الحي باستخدام المجهر متحد البؤر كما هو موضح في الخطوة 3.3. طبع بإذن من Tafesse وآخرون. 2015 8.ق / ftp_upload / 54646 / 54646mov1.avi "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
البالعات المهنية، مثل الضامة والخلايا الجذعية، تبتلع، والقضاء على غزو الجراثيم مما يجعل البلعمة عنصرا هاما من نظام دفاع المضيف. وخلال هذه العملية البالعات تخضع إعادة تنظيم الغشاء واسعة النطاق وإعادة ترتيب الهيكل الخلوي في سطحها خلية 8، 19، 20. من أجل فهم أفضل هذه العملية الحيوية، وتصور مختلف مراحل البلعمة أمر ضروري. نحن هنا وصف طريقة القائم المجهر الذي تم استخدامه لمراقبة مختلف مراحل البلعمة.
أهمية الرئيسية للتقنية التصوير الحي هو أنه يوفر قدرة فائقة على مراقبة واجهة المضيف الممرض على المستوى الجزيئي. من خلال السماح التصور من الخطوات الرئيسية للعدوى الميكروبية، ويوفر التصوير الحي البصيرة الحاسمة في الطبيعة الأساسية للاستجابة المناعيةضد مسببات الأمراض 8، 10، 21، 22. بالإضافة إلى البلعمة، الأساليب المذكورة هنا يمكن أن تمتد إلى دراسة أنواع أخرى من الإلتقام مستقبلات بوساطة، بما في ذلك macropinocytosis 10. التصوير الحي هو أيضا نهجا قيما لدراسة العلاقة المضيف الممرض من البكتيريا داخل الخلايا مثل السل المتفطرة والسالمونيلا التيفية، وكذلك الطفيليات بما في ذلك الليشمانيا والتوكسوبلازما 22، 23.
وهناك العديد من المزايا من تصوير الخلايا الحية على تقنيات أخرى مثل النهج البيوكيميائية التقليدية. يعيش التصوير الخلية يسمح لنا لرصد ديناميات المكانية والزمانية من العمليات الخلوية 8. وعلاوة على ذلك، والتصوير الحي يسمح لنا للحصول على إعلامأوجه في قرار خلية واحدة 21. البلعمة هي عملية الخلوية الحيوية التي تنطوي على تجميع المستقبلات، الأكتين وإعادة غشاء الدهون في غضون بضع دقائق (10). تصوير حي تمكننا من التقاط هذه المعلومات بطريقة وقت حساس، وهو أمر صعب إلا لتحقيقه.
الحد الرئيسي لهذا الأسلوب هو أنه يتطلب التحسين دقيق للظروف تجريبية والاجهزة المجهر. هناك العديد من العوامل الرئيسية الحاسمة للحصول بنجاح الصور. صفات البروتين الفلوري (أو جهاز الاستشعار البيولوجي) تستخدم لتصور البالعات (مثل F-الأكتين)، وكذلك طبيعة الصبغة المستخدمة لتسمية الجسيمات هي الجوانب الحاسمة من التصوير. للتصوير الحية، بنفس القدر من الأهمية هو موازنة الغرفة البيئية لإعداد المجهر. اعتمادا على أداة، يمكن للموازنة تأخذ من 15 دقيقة إلى عدة ساعات. سيويهدف الامتحانات التنافسية الوطنية CO 2 العرض للحفاظ على درجة الحموضة المناسبة داخل وسائل الإعلام والثقافة، فمن الضروري للسماح كافية وقت قبل وضع التجربة. في الحالات التي يكون فيها العرض CO 2 غير كافية و / أو غير متوازن، zwitterionic العضوية وكيل التخزين المؤقت الكيميائية مثل HEPES يمكن استكمال لوسائل الاعلام النمو. التعرض لفترة طويلة من الجسيمات الفلورية والخلايا الحية إلى متحد البؤر ليزر يمكن أن يؤدي إلى الضيائية والتبييض. تحسين قوة الليزر (والتعرض لفترة أقل كان ذلك أفضل) والتأكد من مصاريع مغلقة بين عمليات الاستحواذ صورة يمكن أن تقلل من هذه المشاكل. وعموما، فإن الأساليب المذكورة هنا هي مثالية لدراسة العلاقة الديناميكية بين مسببات الأمراض والبالعات خلال البلعمة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
نشكر ويندي السلمون ونيكي واتسون للمنشأة كيك في معهد وايتهيد من معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا للتصوير.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-Mercaptoethanol | AppliChem | A1108 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Cell Signaling Technology | 9998 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | ThermoFisher | D3571 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | ThermoFisher | BP-231-1 | |
| DMEM (Dulbecco’s Minimal Eagle’s medium) | Gibco | 11965 | |
| PBS, 1x (Phosphate- Buffered Saline) | Corning cellgro | 21-031-CV | |
| Fetal Bovine serum | Sigma Aldrich | 12003C | |
| FITC-coupled IgG-coated latex beads | Cayman | 500290 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | ThermoFisher | 25030081 | |
| Paraformaldehyde Solution (4% in PBS) | Affymetrix | 19943 1 LT | |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml) | ThermoFisher | 15-140-122 | |
| Phalloidin-Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A12379 | |
| RAW 264.7 cells | ATCC | TIB-71 | |
| RPMI (Roswell Park Memorial Institute) | Gibco | 61870 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | S7900 | |
| Trypan blue solution (0.4% (w/v) in PBS) | Corning cellgro | MT25900CI | |
| Trypsin-EDTA (1x) (0.05%) | ThermoFisher | 25300054 | |
| Tween 20 Surfact-Amps Detergent Solution | ThermoFisher | 85114 | |
| Zymosan-Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | Z23374 | |
| Chambered 1.0 Borosilicate Coverglass system (8 chambers) | ThermoFisher | 155361 | |
| Glasstic slide 10 with grids | Hycor | 87144 |
References
- Janeway, C. A. Jr, Medzhitov, R.
- Underhill, D. M., Goodridge, H. S.
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S.
- Aderem, A., Underhill, D. M.
- Flannagan, R. S., Harrison, R. E., Yip, C. M., Jaqaman, K., Grinstein, S. Dynamic macrophage "probing" is required for the efficient capture of phagocytic targets. J. Cell Biol. 191, 1205-1218 (2010).
- Swanson, J. A. Shaping cups into phagosomes and macropinosomes. Nat. Rev. Mol Cell Biol. 9, 639-649 (2008).
- Botelho, R. J., et al. Localized biphasic changes in phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate at sites of phagocytosis. J. Cell Biol. 151, 1353-1368 (2000).
- Tafesse, F. G., et al. Disruption of Sphingolipid Biosynthesis Blocks Phagocytosis of Candida albicans. PLoS Pathog. 11, e1005188 (2015).
- Kwik, J., et al. Membrane cholesterol, lateral mobility, and the phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate-dependent organization of cell actin. PNAS. 100, 13964-13969 (2003).
- Levin, R., Grinstein, S., Schlam, D.
- Freeman, S. A., Grinstein, S. Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton. Immunol. Rev. 262, 193-215 (2014).
- Jutras, I., Desjardins, M. Phagocytosis: at the crossroads of innate and adaptive immunity. Annu. Rev. Cell. 21, 511-527 (2005).
- Strijbis, K., et al. Bruton's Tyrosine Kinase (BTK) and Vav1 contribute to Dectin1-dependent phagocytosis of Candida albicans in macrophages. PLoS Pathog. 9, e1003446 (2013).
- Li, X., et al. The beta-glucan receptor Dectin-1 activates the integrin Mac-1 in neutrophils via Vav protein signaling to promote Candida albicans clearance. Cell Host Microbe. 10, 603-615 (2011).
- Esteban, A., et al. Fungal recognition is mediated by the association of dectin-1 and galectin-3 in macrophages. PNAS. 108, 14270-14275 (2011).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Meth. 9, 671-675 (2012).
- Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Meth. Cell Biol. 123, 77-94 (2014).
- Khodjakov, A., Rieder, C. L. Imaging the division process in living tissue culture cells. Methods. 38, 2-16 (2006).
- Freeman, S. A., et al. Integrins Form an Expanding Diffusional Barrier that Coordinates Phagocytosis. Cell. 164, 128-140 (2016).
- Jaumouille, V., et al. Actin cytoskeleton reorganization by Syk regulates Fcgamma receptor responsiveness by increasing its lateral mobility and clustering. Dev. Cell. 29, 534-546 (2014).
- Bain, J., Gow, N. A., Erwig, L. P. Novel insights into host-fungal pathogen interactions derived from live-cell imaging. Sem. Immunopath. 37, 131-139 (2015).
- Forestier, C. L. Imaging host-Leishmania interactions: significance in visceral leishmaniasis. Para. Immunol. 35, 256-266 (2013).
- John, B., Weninger, W., Hunter, C. A. Advances in imaging the innate and adaptive immune response to Toxoplasma gondii. Future Microbiol. 5, 1321-1328 (2010).
