Introduction
Brillouin प्रकाश बिखरने (बी एल) के प्रभाव में 1922 1 यह एक सामग्री में सक्रिय thermally ध्वनिक phonons से दृश्य प्रकाश के प्रकीर्णन स्थिर होते Léon Brillouin द्वारा की खोज की थी। ठोस अवस्था भौतिकी में, ध्वनिक phonons एक जाली में सभी परमाणुओं के कंपन सुसंगत हैं। एक जाली में परमाणुओं के दो बारी प्रकार की एक आयामी श्रृंखला ध्वनिक phonons, बीएलएस से पता चला है, और ऑप्टिकल phonons, आईआर अवशोषण और रमन बिखरने (चित्रा 1) द्वारा जांच के बीच के अंतर को दर्शाता हुआ एक सरल मॉडल है। whilst ऑप्टिकल phonons के बाहर के चरण परमाणुओं के आंदोलनों हैं ध्वनिक phonons, प्रसार की दिशा के साथ एक विस्थापन के साथ श्रृंखला में परमाणुओं के चरण में आंदोलन कर रहे हैं (अनुदैर्ध्य ध्वनिक phonons) या प्रसार दिशा (अनुप्रस्थ ध्वनिक phonons) को सीधा (अनुदैर्ध्य या अनुप्रस्थ मोड) एक oscillating बिजली द्विध्रुवीय पल का निर्माण किया।
बीएलएस Spectroscopy 1920 के दशक के बाद से विश्लेषणात्मक विज्ञान के क्षेत्र में इस्तेमाल किया गया है; हालांकि, 1980 के दशक के बाद से ही है उच्च विपरीत माप मिलकर multipass फेब्री पेरोट स्पेक्ट्रोमीटर के उपयोग के माध्यम से संभव हो गया। तब से, एक बढ़ती हुई 2-4 और चुंबकीय सामग्री (फोटोन-Magnon बातचीत के माध्यम से) संघनित पदार्थ (जहां फोटोन-phonon बातचीत शोषण किया जाता है) में विश्लेषणात्मक अनुप्रयोगों के लिए बीएलएस के क्षेत्र में प्रगति की संख्या 5 के बारे में लाया गया है। जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों 6-8 पर मौलिक काम करता है विभिन्न तरीकों के विकास के लिए मार्ग प्रशस्त किया है यहाँ लागू एक और पहले से वर्णित 9 एक एक प्लेटलेट की तरह विन्यास में एक चिंतनशील सब्सट्रेट का उपयोग की लोच tensor के पूर्ण विवरण प्राप्त करने के लिए भी शामिल है, एक नमुना।
वर्तमान काम में, हम संयोजी ऊतक में बाह्य मैट्रिक्स के मौलिक घटक, रेशेदार प्रोटीन इलास्टिन के लिए बीएलएस स्पेक्ट्रोस्कोपी लागू करते हैं और प्रकार मैं कोलेजन। टीype मैं कोलेजन एक कठोर, ट्रिपल पेचदार अणु जो laterally और longitudinally व्यापक जोड़ने पार के साथ assembles ऐसे tendons के रूप में ऊतकों में अनिवार्य रूप से कठोर फाइबर के रूप में है। कोलेजन के नेटवर्क अक्सर elastin के नेटवर्क के साथ सह-अस्तित्व में, एक प्रोटीन है, जो असामान्य रूप से, एन्ट्रापी और अपने पर्यावरण के साथ हाइड्रोफोबिक बातचीत का एक संयोजन के माध्यम से लंबी दूरी की लोच उत्पन्न करता है और इस तरह के फेफड़ों और त्वचा के रूप में ऊतकों के कार्य करने के लिए आवश्यक है। दोनों फाइबर वर्तमान अनुसंधान के क्षेत्र में एक हेक्सागोनल क्रिस्टल मॉडल का उपयोग कर मॉडलिंग कर रहे हैं। 9 भाग 1 में, हम प्रोटोकॉल जानवरों के ऊतकों से तंतुओं को निकालने के लिए और स्पेक्ट्रोस्कोपी माप के लिए नमूना तैयार करने का वर्णन है। भाग 2 में, Brillouin तंत्र की स्थापना और फाइबर से स्पेक्ट्रा प्राप्त करने के लिए प्रक्रिया प्रस्तुत किया है। भाग 3 उसमें निहित प्रासंगिक यांत्रिक जानकारी निकालने के लिए Brillouin स्पेक्ट्रा के लिए लागू डेटा विश्लेषण का विवरण देता है। फिर, प्रतिनिधि परिणाम प्रस्तुत किया है और कर रहे हैं discusseघ।
Protocol
सावधानी: कृपया जैविक सुरक्षा प्रोटोकॉल और उपयोग करने से पहले सभी प्रासंगिक सामग्री सुरक्षा डाटा शीट (MSDS) से परामर्श करें। लेजर इन प्रयोगों में कार्यरत एक कक्षा 3 बी लेजर है; प्रणाली का एक सुरक्षित उपयोग के लिए स्थानीय नियमों के अनुपालन की आवश्यकता है। जब व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (सुरक्षा चश्मे) के उपयोग सहित एक लेजर स्पेक्ट्रोस्कोपी माप प्रदर्शन कर सभी उचित सुरक्षा प्रथाओं का उपयोग करें।
पूंछ tendons 7-8 सप्ताह पुरानी Wistar यूरोपीय संघ के विनियमन 1099/2009 के अनुसार और पशुओं के कल्याण (वध या हत्या) विनियम 1995 के गोजातीय डब स्नायुबंधन एक स्थानीय वधशाला से प्राप्त किया गया में अन्य प्रयोजनों के लिए euthanized चूहों से प्राप्त किया गया।
1. नमूना फाइबर की तैयारी
नोट: बाह्य मैट्रिक्स के प्रोटीन फाइबर विभिन्न ऊतकों से निकाला जा सकता है, विभिन्न प्रक्रियाओं का उपयोग। प्रोटोकॉल व्यापक रूप से लागू प्रक्रियाओं के आधार पर परिष्कृत किया गया।
- 100 मिलीग्राम / शरीर के वजन सोडियम pentobarbitone किलो का अंतर peritoneal इंजेक्शन द्वारा एक चूहे बलिदान। फिर शरीर के साथ संपर्क के बिंदु पर सीधे पूंछ तोड़, एक एकल बढ़त धार के साथ नीचे दबाने। फिल्म चिपटना में पूंछ लपेटें और इसे -20 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए जब तक आवश्यक दुकान।
- फ्रीजर से पूंछ लीजिए, समीपस्थ अंत से एक 20 मिमी लंबे खंड में कटौती अभी भी जमे हुए हैं और फिर फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) समाधान (7.4 पीएच) आरटी पर से भरा एक पेट्री डिश में पिघलना करने के लिए इसे छोड़ whilst।
- एक बार पूंछ thawed है, त्वचा को विभाजित करने की एक छुरी का उपयोग कर खंड की लंबाई के साथ एक चीरा बनाते हैं। फिर पूंछ बांस के बारे में चार लिपटा कण्डरा बंडलों को प्रकट करने के लिए वापस छील।
- ठीक संदंश का प्रयोग और सावधान नहीं किसी भी पूर्व तनाव लागू करने के लिए किया जा रहा है, धीरे म्यान से बाहर प्रत्येक फाइबर आकर्षित और एक शीशी w / v सोडियम azide 0.01% के साथ आसुत जल से युक्त में यह जगह (नेन 3) के लिए जनसंपर्कघटना बैक्टीरिया विकास, और दुकान प्रशीतित। एक एकल पूंछ के आसपास तीस कण्डरा तंतुओं अर्जित करता है।
- शुद्ध रेशेदार प्रकार मैं कोलेजन प्राप्त करने के लिए, प्रोटेयोग्लाईकैन्स और अन्य सभी noncollagenous सामग्री हटाने के लिए कण्डरा तंतुओं को एक तीन भाग enzymatic पाचन प्रक्रिया 10 लागू होते हैं।
- सबसे पहले, फाइबर 0.125 यू / एमएल chondroitinase एबीसी में 0.05 एम Tris बफर और 0.06 एम सोडियम एसीटेट (सीएच 3 COONa) में पीएच 8.0 से कम 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में 200 rpm पर विसर्जित कर दिया।
- फिर, पीएच 6.0 से 0.05 एम Tris बफर और 0.15 मीटर सोडियम क्लोराइड (NaCl) में 1 यू / एमएल Streptomyces hyaluronidase में फाइबर विसर्जित और 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए मिलाते इनक्यूबेटर में लौटने।
- अंत में, trypsin के 1 मिलीग्राम / एमएल में फाइबर 0.05 एम सोडियम फास्फेट (NaHPO 4) और 0.15 मीटर NaCl में पीएच 7.2 से 16 घंटे के लिए मिलाते इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर विसर्जित कर दिया।
- स्टोर आसुत जल से युक्त शीशियों में प्रशीतित शुद्ध फाइबर, वाईवें 0.01% NaN 3, बैक्टीरियल वृद्धि को रोकने के लिए जब तक माप के लिए जरूरी है।
- वधशाला से गोजातीय डब बंध प्राप्त करने, चिपटना फिल्म में लपेट और इसे -20 डिग्री सेल्सियस उपयोग करें जब तक पर जमे हुए दुकान।
- शुद्ध इलास्टिन का उत्पादन करने के लिए, फ्रीजर से बंध एकत्रित करते हैं, यह एक उबलते पानी में स्नान लांसिंग प्रक्रिया के अनुसार, आरटी पर पिघलना करने के लिए एक छुरी का उपयोग कर इसे defat और पचाने बंध 11 प्रकार के रूप में अनुमति देते हैं।
- आसुत जल में सोडियम हाइड्रोक्साइड (NaOH) के एक 0.1 एम समाधान तैयार है और एक शंक्वाकार फ्लास्क में defatted बंध करने के लिए इसे जोड़ने के लिए, ऊतक को कवर।
- 45 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में कुप्पी उबाल लें।
- पाचन कुप्पी से बंध निकालें और आसुत जल में बार बार अघुलनशील ऊतक ब्लॉक धोने तक पीएच 7.0 (पीएच मीटर का उपयोग निगरानी) प्राप्त की है।
- फाइनल से ऊतक निकालेंसमाधान धोने और आसुत जल में डूब एक मोहरबंद कंटेनर में (0.01% NaN 3 के साथ मिश्रित बैक्टीरिया विकास को रोकने के लिए) है और यह प्रशीतित की दुकान।
- रेफ्रिजरेटर से ऊतक लीजिए और, बड़ा ब्लॉक से (20 से 50 मिमी लंबा, के बारे में 2 मिमी मोटी) दूर बहुत अधिक बल और पूर्व तनाव, चिमटी का उपयोग धीरे छोटे इलास्टिन खंडों खींचने के लिए लागू करने के लिए नहीं सावधान किया जा रहा है और उन्हें जगह पीबीएस समाधान (7.4 पीएच) के साथ एक पेट्री डिश में।
- ठीक संदंश का प्रयोग, धीरे मोटी 1 मिमी के आसपास छोटे फाइबर बंडलों को तंग और उन्हें एक छुरी का उपयोग कर एक कुछ मिमी की लंबाई करने के लिए काट दिया।
- (बैक्टीरियल वृद्धि को रोकने के लिए 0.01% NaN 3 के साथ) और उन्हें प्रशीतित तक माप के लिए आवश्यक स्टोर आसुत जल से युक्त शीशियों के लिए फाइबर स्थानांतरण।
- एक हीरे कटर का प्रयोग, चिंतनशील सिलिकॉन स्लाइड का एक टुकड़ा काट।
- एक हाइड्रेटेड compartme बनाने के लिएNT, Parafilm की एक पट्टी में कटौती केंद्र (इतना बड़ा एक फाइबर फिट करने के लिए) में एक खोखला कटौती के साथ सिलिकॉन स्लाइड पर फिट और सिलिकॉन सब्सट्रेट पर यह जगह है।
नोट: शुष्क फाइबर माप के लिए, एक यू के आकार में कटौती parafilm इतना है कि चार पक्षों में से एक हवा के लिए खुला रहता है जब कदम 1.3.4 में तय हो गया। - रेफ्रिजरेटर से फाइबर निकालें, भंडारण समाधान में से एक भी फाइबर इकट्ठा करने और 5 मिनट के लिए आरटी पर शुद्ध पानी से भर नमूना धोने के लिए एक छोटा सा पेट्री डिश में यह जगह ठीक संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करें। फिर, फाइबर इकट्ठा करने और सिलिकॉन सब्सट्रेट पर parafilm खोखला के केंद्र को हस्तांतरण।
सावधानी: इस कार्रवाई के दौरान यह खींच द्वारा फाइबर को नुकसान पहुँचाए से बचें, और सब्सट्रेट पर नमूना reorienting के रूप में इस यांत्रिक गुणों में बदलाव के कारण हो सकता है से बचें। - फाइबर पर एक पतली गिलास coverslip रखें और कांच की सतह पर धीरे से एक गर्म टांका लोहे गुजर नीचे parafilm पिघल द्वारा चैम्बर सीलकांच।
सावधान: टांका टिप भी बंद लाने या जरूरत से ज्यादा सब्सट्रेट हीटिंग नहीं द्वारा फाइबर को नुकसान पहुँचाए से बचें। - एक सपाट सतह पर सील कक्ष में एक छोटा सा वजन के तहत जगह और जब नमूना को होने वाले नुकसान से बचने के लिए नमूना और सिलिकॉन सब्सट्रेट के बीच एक अच्छा संपर्क प्राप्त करने के लिए लगभग 12 घंटे के लिए छोड़ दें।
- वजन निकालें और सब्सट्रेट पर जगह में चैम्बर सुरक्षित, शिकंजा का उपयोग कर।
2. Brillouin प्रयोग की स्थापना और फाइबर स्पेक्ट्रा हासिल करना
- नमूना डिब्बे की तैयारी
- और मात्रा स्थिति बिखरने, एक खड़ी है, जबकि एक निरंतर बिखरने कोण (देखें चित्र एसआई 1 2 Φ = 90 °) को बनाए रखने के नमूने के विमान में रोटेशन सक्षम करने के लिए एक गोनियोमीटर के साथ सुसज्जित धारक पर नमूना हिस्सा 1.3 में के रूप में तैयार माउंट।
- Le के माध्यम से नमूना पर लेजर प्रकाश का सही फोकस समायोजन प्रदर्शनएनएस। 9
सावधान: लेजर उत्पादन शक्ति बहुत अधिक हो सकता है और नमूने में एक जला उत्पादन हो सकता है। यकीन है कि यह पर्याप्त उच्च एक अच्छा संवेदनशीलता देने के लिए नमूना को होने वाले नुकसान से बचने के लिए बहुत अधिक सेट, लेकिन नहीं की गई है। यहाँ हम नमूने पर सीए 76 मेगावाट की बिजली का इस्तेमाल किया। यह नमूना जल के बिना एक अच्छा संवेदनशीलता प्राप्त करने के लिए पर्याप्त था, यह भी विचार है कि यह पतली और एक सब्सट्रेट है कि गर्मी लेजर रोशनी द्वारा उत्पन्न dissipating में मदद करता है के साथ संपर्क में है। - एक 45 डिग्री के कोण (Φ) घटना लेजर बीम एक वर्नियर पैमाने का उपयोग करने पर नमूना स्थिति। एक माप चल रहा है और (देखें नीचे) स्पेक्ट्रम में चोटियों की तीव्रता अधिकतम द्वारा इष्टतम स्थिति को प्राप्त।
- स्पेक्ट्रोमीटर की स्थापना
- अधिग्रहण और डेटा के हेरफेर के लिए सॉफ्टवेयर खोलें और नमूना 12 के एक Brillouin स्पेक्ट्रम के अधिग्रहण की स्थापना की। प्रक्रिया यहाँ वर्णित म्यू पर लागू होता हैltipass मिलकर व्यकिकरणमीटर (चित्रा एसआई -1 ए)।
- दो फेब्री पेरोट (एफपी) interferometers स्वतंत्र रूप से नियंत्रण इकाई द्वारा पीजो के लिए लागू voltages बदलने संरेखित करें। इस पूर्व संरेखण प्रक्रिया के लिए, प्रकाश प्रत्येक एफपी से परिलक्षित निरीक्षण करते हैं। तीव्रता दो एफपीएस से परिलक्षित शून्य करने के लिए जाता है, सही संरेखण पर पहुंच गया है।
- स्पेक्ट्रम जांचना: सुलभ आवृत्ति रेंज, या मुफ्त वर्णक्रमीय रेंज (एफएसआर), पहली एफपी गुहा के दो दर्पण, एल, एफएसआर = सी / 2 एल, जहां सी प्रकाश की गति है के माध्यम से और के बीच की दूरी पर निर्भर है एल एक डायल गेज से मापा जाता है।
- दो एफपी interferometers के स्कैन सिंक्रनाइज़ और मिलकर multipass विन्यास करने के लिए ऑप्टिकल प्रणाली स्विच। प्रेषित लेजर प्रकाश की तीव्रता का एक प्रतिक्रिया नियंत्रण स्वत: माप के दौरान दो एफपीएस के संरेखण को बनाए रखने होगा।
- मापन ओएफ Brillouin स्पेक्ट्रा
सावधान: Brillouin स्पेक्ट्रम तापमान और नमूना और इन मानकों की तो सावधान नियंत्रण के हाइड्रेशन पर अत्यधिक निर्भर है प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य स्पेक्ट्रा प्राप्त करने की कुंजी है।- नमूने के एक Brillouin स्पेक्ट्रम के अधिग्रहण शुरू करने और इसे चलाने के लिए जब तक एक अच्छा संकेत करने वाली शोर अनुपात हासिल की है। इस बिखरने क्रॉस सेक्शन, एकाग्रता और नमूना की मोटाई के आधार पर कई मिनट लग सकते हैं।
नोट: वहाँ संकेत करने वाली शोर अनुपात के लिए अंगूठे का एक नियम नहीं है, लेकिन वर्णक्रमीय गुणवत्ता experimentalist विशिष्ट नमूना विश्लेषण किया पर आधारित द्वारा जाँच की है। वहाँ वर्णक्रमीय गुणवत्ता और माप की अवधि के बीच एक व्यापार बंद इसलिए प्रयोगात्मक मापदंडों विशिष्ट आवेदन के अनुसार चयनित करने की आवश्यकता है। - , उनमें से प्रत्येक के लिए कदम 2.3.1 के बाद - - एक सूखी नमूना की माप के लिए, लगातार स्पेक्ट्रा लेते हैं चोटियों की स्थिति में जब तक कोई बदलाव नहीं रहाएस मनाया। इस हासिल की है नमूना कमरे वातावरण के साथ संतुलन में है और आगे कोई सुखाने स्पेक्ट्रम को प्रभावित करेगा जब।
- प्रकाश ध्रुवीकरण का चयन करें (वी.वी. या VH, वि ऊर्ध्वाधर और एच बिखरने विमान को प्रकाश ध्रुवीकरण रिश्तेदार की क्षैतिज दिशा के लिए के लिए खड़ा है) और फाइबर अक्ष के लिए प्रत्येक कोण पर स्पेक्ट्रा के अधिग्रहण (θ, चित्रा एसआई -1) में नमूना घूर्णन द्वारा हाथ से विमान।
- बाद के प्रसंस्करण के लिए दायर करने के लिए Brillouin स्पेक्ट्रा बचाओ।
- नमूने के एक Brillouin स्पेक्ट्रम के अधिग्रहण शुरू करने और इसे चलाने के लिए जब तक एक अच्छा संकेत करने वाली शोर अनुपात हासिल की है। इस बिखरने क्रॉस सेक्शन, एकाग्रता और नमूना की मोटाई के आधार पर कई मिनट लग सकते हैं।
3. Brillouin स्पेक्ट्रा का विश्लेषण
नोट: Brillouin चोटियों में से फ़िट विश्लेषण विभिन्न कार्यों का उपयोग किया जा सकता है। के रूप में इस viscoelastic मीडिया में damped ध्वनिक मोड से होने वाले चोटियों के लिए एक वैध मॉडल है एक damped हार्मोनिक थरथरानवाला (DHO) समारोह 4,13 चुना गया था।
- Brillouin चोटियों में से फ़िट विश्लेषण
- वें में ब्याज के शिखर के लिए वर्णक्रमीय रेंज का चयन करेंई Brillouin स्पेक्ट्रम।
- यदि वर्णक्रम पृष्ठभूमि शून्य के मुकाबले कहीं ज्यादा है फिट में एक आधारभूत सक्षम करें।
ध्यान दें: आधारभूत स्पेक्ट्रा के बीच भिन्न हो सकते हैं। सुनिश्चित करें कि सुधार एक व्यवस्थित और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य ढंग से लागू किया जाता है। - एक विस्तृत कम से कम वर्गों के हित के Brillouin पीक करने के लिए एक समारोह DHO 4,13 का उपयोग कर iteratively तक अभिसरण हासिल की है और सबसे अच्छी फिटिंग की अवस्था प्राप्त की है ढाले लागू करें। तब, फाइल करने के लिए फिट परिणामों को बचाने के।
- प्रत्येक Brillouin नक़ल की दो चोटियों के फिट मापदंडों से औसत मूल्यों प्राप्त करते हैं।
- शिखर आवृत्ति से ध्वनिक लहर वेग की गणना (नीचे अभिव्यक्ति का उपयोग)।
- प्लॉट रेखांकन, जैसे, फाइबर अक्ष के ध्वनिक लहर वेग बनाम कोण, के माध्यम से फिट परिणाम θ और प्रासंगिक मॉडल लागू होते हैं (जैसे, ध्वनिक anisotropic सिस्टम 9 के लिए) इस तरह की लोच tensor गुणांक के रूप में यांत्रिक मात्रा निकालने के लिए।
Representative Results
Brillouin स्पेक्ट्रोस्कोपी इस प्रयोग (चित्रा एसआई-1 ए) में इस्तेमाल तंत्र पहले से वर्णित किया गया है। 9 यह एक एकल मोड नमूना पर 76 मेगावाट बिजली उत्पादन के साथ 532 एनएम ठोस राज्य लेजर कार्यरत हैं। एक 20 सेमी अवर्णी लेंस नमूना पर लेजर प्रकाश केंद्रित है और एक backscattering ज्यामिति में नमूना से बिखरे हुए प्रकाश एकत्र करता है। एक मिलकर multipass फेब्री पेरोट व्यकिकरणमीटर बिखरे हुए प्रकाश है, जो तब एक कम शोर photodiode डिटेक्टर से पता चला है छानने के लिए प्रयोग किया जाता है। यह दृष्टिकोण अत्यंत उच्च विपरीत (सीए 120 डीबी) और etalons की आत्म-संरेखित पीजो स्कैनिंग के माध्यम से स्थिरता देता है। एक polarizer और विश्लेषक घटना और बिखरे हुए प्रकाश का ध्रुवीकरण का चयन करने के लिए पेश कर रहे हैं। स्पेक्ट्रा आमतौर पर polarizer घटना प्रकाश ध्रुवीकरण की खड़ी (वी) दिशा और वैकल्पिक रूप से चयन करने के लिए खड़ी (वी) विश्लेषक का चयन तय रखा के साथ प्राप्त कर रहे हेआर क्षैतिज (एच) बिखरे हुए प्रकाश ध्रुवीकरण की दिशा। इस विन्यास में, अनुदैर्ध्य और अनुप्रस्थ ध्वनिक मोड क्रमशः पता चला रहे हैं।
एक ठेठ Brillouin स्पेक्ट्रम लोचदार बिखरने और समान रूप से स्थानांतरित कर दिया चोटियों, या Brillouin दोहरी है, जो नमूना के यांत्रिकी के हस्ताक्षर हैं में से एक या अधिक सेट के कारण एक गहन केंद्रीय चोटी है। इन मापों में, बिखरे हुए प्रकाश दोनों थोक, नमूना सब्सट्रेट इंटरफेस में घटना के प्रकाश का प्रतिबिंब के बाद नमूना के लिए अर्ध orthogonal और, यात्रा थोक सतह (पी एस मोड) के समानांतर यात्रा phonons से phonons से ही शुरू कर सकते हैं। 9
चित्रा 2 एक 30 गीगा मुक्त वर्णक्रमीय रेंज के साथ, शुष्क और हाइड्रेटेड trypsin पचा कोलेजन 0.2 गीगा संकल्प पर वी.वी. ध्रुवीकरण के साथ प्राप्त फाइबर की बीएलएस स्पेक्ट्रा से पता चलता है और लगभग 10 मिनट के संग्रह समयस्पेक्ट्रम प्रति। प्रत्येक स्पेक्ट्रम, रोटेशन की एक विशेष कोण से मेल खाती है θ (चित्रा एसआई -1 सी)। Θ = 0 डिग्री पर सूखी कोलेजन फाइबर में, अनुदैर्ध्य मोड whilst पी एस मोड (9.85 ± 0.03) गीगा (2A चित्रा) पर है (18.92 ± 0.02) गीगा एक थोक शिखर को जन्म दे। कम आवृत्तियों के निजी सचिव के रूप में शिखर पारियों θ से 0 डिग्री (फाइबर का अक्षीय उन्मुखीकरण की जांच कर रही phonon) 90 ° (phonon रेडियल उन्मुखीकरण की जांच कर) को जाता है, एक ही श्रेणी में θ को बदलने पर जबकि थोक चोटी केवल थोड़ा लाल पारियों (phonon रोटेशन भर में एक अर्ध रेडियल दिशा की जांच कर रही)। गीला कोलेजन फाइबर में, अनुदैर्ध्य phonons के कारण दो चोटियों, प्रयोग के दौरान अनिवार्य रूप से अपरिवर्तित रहे हैं सीए 10.5 गीगा पर थोक चोटी और 4.9 गीगा (चित्रा 2 बी) में पी एस चोटी के साथ। इस शिखर आवृत्ति में 80 से 100% की कमी (18.92 के आंकड़ों के रिश्तेदार को इंगित करता हैऔर 9.85 गीगा, क्रमशः), और इसलिए सामग्री की कठोरता, हाइड्रेशन के कारण की। ध्यान दें कि हाइड्रेटेड कोलेजन के थोक और पी एस मोड शुद्ध पानी के साधनों के लिए आवृत्ति में बंद झूठ, सुझाव है कि अपने लोचदार स्थिरांक, पानी और फाइबर योगदान का एक संयोजन कर रहे हैं पानी द्वारा निभाई गई एक प्रमुख भूमिका के साथ।
चित्रा 3 सूखी trypsin पचा कोलेजन फाइबर की एक स्पेक्ट्रम θ = VH ध्रुवीकरण के साथ 30 डिग्री पर मापा पता चलता है; वी.वी. ध्रुवीकरण का रिसाव सक्षम बनाता पी एस और थोक चोटियों अभी भी मनाया जा सकता है। ट्रांसवर्स मोड पर (4.1 ± 0.2) गीगा (θ = 0 °) जो थोड़ा 0 डिग्री से 90 डिग्री से θ परिवर्तन के रूप में नीली पारियों एक चोटी के लिए खाते। दोनों अनुप्रस्थ और पी एस चोटियों के लिए फ़िट परिणाम भी दिखाई जाती हैं। पीक मानकों को निकाले गए थे और ध्वनिक लहर वेग वी एल वी = λ / √2, जहां के रूप में प्राप्त किए गए
चित्रा 4 कोण θ के एक समारोह के रूप में ध्वनिक लहर वेग अनुदैर्ध्य और अनुप्रस्थ मोड से प्राप्त (पी एस और टी चोटियों) की एक साजिश है । समीकरण A1 और A2 नीचे - - hexagonally सममित लोचदार ठोस 7 की एक मॉडल के लिए फिट विश्लेषण सूखी trypsin पचा प्रकार की लोच tensor के पांच घटक मैं फाइबर (तालिका 1) कोलेजन प्रदान करता है।
9 द्वारा दिया जाता है
(A1)
(A2)
जहां ρ सामग्री के घनत्व, और सी 11, सी 33, सी 44 और सी 13 है पांच लोचदार स्थिरांक कि एक हेक्सागोनल समरूपता के साथ सिस्टम को चिह्नित के चार हैं। पांचवें निरंतर, सी 12, सी 12 ~ सी 11 लगभग संबंध से प्राप्त किया जा सकता है -। 2 सी 44 7
गुणांकों पहले unpurified कोलेजन fibe से प्राप्त उन लोगों के लिए समान हैंरुपये। 9 एक उल्लेखनीय अंतर गुणांक सी 13 कि लोचदार moduli ई ǁ और ई के समान मूल्यों में परिलक्षित होता है के लिए होता है 
शुद्ध कोलेजन के लिए (लगभग 7.2 और 7.7 GPA)।
चित्रा 5 बनाम θ गीला कोलेजन के अनुदैर्ध्य ध्वनिक लहर वेग की एक साजिश है । इस मामले में, आवृत्ति में कोई समय-समय पर परिवर्तन मनाया जाता है, त्रुटि के भीतर एक निरंतर वेग दे रही है। चित्रा 6 सूखी और हाइड्रेटेड इलास्टिन θ = 0 डिग्री पर मापा फाइबर की स्पेक्ट्रा से पता चलता है। ट्रांसवर्स मोड इन नमूनों के लिए पता नहीं थे। सूखी इलास्टिन में, थोक चोटी 8.2 गीगा 9 (13 और 20% सूखी कोलेजन की इसी चोटियों से कम) में पी एस मोड whilst 16.8 गीगा पर होता है। गीले इलास्टिन फाइबर एक थोक पी पेशeak पर (12.30 ± 0.01) गीगा (37% सूखी इलास्टिन के थोक चोटी की तुलना में आवृत्ति में कम)। गीला elastin के पी एस मोड उन आवृत्तियों पर लोचदार चोटी की तीव्र पूंछ की वजह से स्पेक्ट्रम में स्पष्ट नहीं है। दूसरी ओर, सीए 7.5 GHz पर चोटी थोक पानी के लिए जिम्मेदार ठहराया है।
चित्रा 7 θ पर सूखी इलास्टिन फाइबर में ध्वनिक लहर वेग की निर्भरता से पता चलता है। इन आंकड़ों से, लोच tensor घटकों (और यांत्रिक moduli) (1 टेबल)। 9 प्राप्त किया गया गीला कोलेजन के रूप में, वहाँ हाइड्रेटेड इलास्टिन फाइबर के यांत्रिक मापांक में isotropy का सबूत है। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि कैसे Brillouin स्पेक्ट्रोस्कोपी कठोरता, संरचना और एक सामग्री के संरचनात्मक पहलुओं पर प्रासंगिक जानकारी दे सकते हैं।
फाईआंकड़ा 1. ध्वनिक और परमाणुओं की एक आयामी श्रृंखला में ऑप्टिकल phonons। एक आयामी द्विपरमाणुक श्रृंखला में ध्वनिक और ऑप्टिकल कंपन की योजनाबद्ध आरेख। परमाणुओं जन एम 1 और एम 2 है और बारी-बारी से कर रहे हैं। तीर परमाणुओं के विस्थापन का संकेत मिलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2. trypsin शुद्ध प्रकार की Brillouin स्पेक्ट्रा मैं चूहे की पूंछ कण्डरा से फाइबर कोलेजन। (ए) सूखी फाइबर और (बी) के स्पेक्ट्रा, फाइबर अक्ष θ करने के लिए अलग-अलग कोण पर वी.वी. माप से फाइबर हाइड्रेटेड डिग्री में। शुद्ध आसुत जल की एक स्पेक्ट्रम भी दिखाया गया है। स्पेक्ट्रा थोक चोटी की तीव्रता (ऊंचाई) के लिए सामान्यीकृत थे। लेबल बी और पी एस क्रमश थोक और समानांतर से सतह मोड से संबंधित चोटियों को निरूपित। त्रुटि सलाखों के मानक त्रुटि (गिनती की संख्या का वर्गमूल) से संकेत मिलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा सूखी trypsin शुद्ध प्रकार की 3. Brillouin स्पेक्ट्रम मैं θ पर एक VH माप से चूहे की पूंछ कण्डरा से फाइबर कोलेजन। स्पेक्ट्रम = 30 °। लेबल टी, पी एस और बी, अनुप्रस्थ करने के लिए, समानांतर से सतह और थोक मोड क्रमशः संबंधित चोटियों निरूपित। दोनों टी और पी एस मोड के लिए एक damped हार्मोनिक थरथरानवाला (DHO) मॉडल का उपयोग फिट विश्लेषण के परिणाम भी दिखाई जाती हैं। त्रुटि सलाखों के मानक त्रुटि (गिनती की संख्या का वर्गमूल) से संकेत मिलता है।/54648fig3large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4. सूखी trypsin शुद्ध कोलेजन फाइबर अक्ष के कोण बनाम में ध्वनिक लहर वेग का प्लॉट। सूखी कोलेजन फाइबर के अनुदैर्ध्य और अनुप्रस्थ ध्वनिक लहर वेग Brillouin चोटियों के फिट विश्लेषण से निकाली गई। डेटा hexagonally सममित लोचदार ठोस का एक मॉडल के लिए फिट हैं। लाल रेखा: समीकरण A1 (2 आर = 0.99); ब्लू लाइन: समीकरण ए 2 (2 आर = 0.36)। त्रुटि सलाखों एक Levenberg-Marquardt nonlinear कम से कम Brillouin स्पेक्ट्रा के फिट चौकों के बाद सहप्रसरण मैट्रिक्स के विकर्ण तत्वों का वर्गमूल से प्राप्त मानक त्रुटियों का संकेत मिलता है। एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें यह आंकड़ा की पर।
चित्रा 5. गीला trypsin शुद्ध कोलेजन फाइबर अक्ष के कोण बनाम में अनुदैर्ध्य ध्वनिक लहर वेग का प्लॉट। हाइड्रेटेड कोलेजन फाइबर Brillouin चोटियों के फिट विश्लेषण से प्राप्त की अनुदैर्ध्य ध्वनिक लहर वेग। दिखाए लाइन आंख के लिए एक गाइड है और इस श्रेणी में ध्वनिक लहर वेग के औसत मूल्य देता है। त्रुटि सलाखों एक Levenberg-Marquardt nonlinear कम से कम Brillouin स्पेक्ट्रा के फिट चौकों के बाद सहप्रसरण मैट्रिक्स के विकर्ण तत्वों का वर्गमूल से प्राप्त मानक त्रुटियों का संकेत मिलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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चित्रा गोजातीय डब बंधन से इलास्टिन फाइबर के 6. Brillouin स्पेक्ट्रा। Θ पर शुष्क और हाइड्रेटेड फाइबर की स्पेक्ट्रा = 0 °। स्पेक्ट्रा थोक चोटी की तीव्रता (ऊंचाई) के लिए सामान्यीकृत थे। लेबल बी और पी एस क्रमश थोक और समानांतर से सतह मोड से संबंधित चोटियों को निरूपित। बी एफ और बी डब्ल्यू, क्रमशः फाइबर और पानी के थोक चोटियों को देखें। त्रुटि सलाखों के मानक त्रुटि (गिनती की संख्या का वर्गमूल) से संकेत मिलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा सूखी इलास्टिन फाइबर अक्ष के कोण बनाम में अनुदैर्ध्य ध्वनिक लहर वेग 7. प्लॉट। सूखी इलास्टिन मिथ्या के अनुदैर्ध्य ध्वनिक लहर वेगएर Brillouin चोटियों के फिट विश्लेषण से निकाली गई। डेटा hexagonally सममित लोचदार ठोस का एक मॉडल के लिए फिट हैं। लाल रेखा: समीकरण A1 9 (2 आर = 0.74)। त्रुटि सलाखों एक Levenberg-Marquardt nonlinear कम से कम Brillouin स्पेक्ट्रा के फिट चौकों के बाद सहप्रसरण मैट्रिक्स के विकर्ण तत्वों का वर्गमूल से प्राप्त मानक त्रुटियों का संकेत मिलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा एसआई -1। Brillouin सेट अप और बीएलएस बिखरने ज्यामिति के योजनाबद्ध। (ए) घटना प्रकाश एक ठोस राज्य लेजर द्वारा उत्सर्जित एक अवर्णी लेंस के माध्यम से नमूना के लिए भेजा है। प्रकाश थोक ध्वनिक phonons द्वारा और refl से उत्पन्न उन से बिखरे हुएसब्सट्रेट सतह है, जो नमूने के साथ संपर्क में है पर प्रकाश की ection, लेंस द्वारा एकत्र, मिलकर एक-multipass फेब्री पेरोट व्यकिकरणमीटर द्वारा फ़िल्टर और एक photomultiplier से पता चला है। FP1 और FP2 मिलकर सेट-अप का गठन दो interferometers संकेत मिलता है। एक polarizer घटना प्रकाश का ध्रुवीकरण का चयन करता है, और एक विश्लेषक बिखरे हुए प्रकाश का ध्रुवीकरण का चयन करने के लिए प्रयोग किया जाता है। (बी) के एक चिंतनशील सिलिकॉन सब्सट्रेट की सतह के साथ संपर्क में एक नमूना के साथ बीएलएस ज्यामिति। एक गिलास स्लाइड () नहीं दिखाया डिब्बे को सील करने के लिए नमूना ऊपर रखा गया है, और कोमल दबाव सब्सट्रेट के कोनों पर पैड के माध्यम से लागू किया जाता है। घटना प्रकाश (कश्मीर i) गुजरता लेंस के माध्यम से, एयर नमूना इंटरफेस (कश्मीर 'मैं) में अपवर्तित और नमूना सब्सट्रेट इंटरफेस में केंद्रित है। बिखरे हुए प्रकाश ही लेंस द्वारा एकत्र दोनों थोक phonons के साथ बातचीत से परिणाम (क्यू (s 'कश्मीर)ख) और नमूना (क्यू एस के उन यात्रा पी एस)। (सी) प्रकाश के निर्देशों और सतह के लिए सामान्य के बीच कोण के रूप में Φ Φ और 'संकेत कर रहे हैं नमूना की और अपनाया समन्वय प्रणाली के योजनाबद्ध आरेख। जेड फाइबर की दिशा के लिए असाधारण अक्ष समानांतर परिभाषित करता है। कोण θ और α की phonons क्यू दिशा और क्यू बी जेड अक्ष क्रमश के बीच उन लोगों के हैं मैं कश्मीर, कश्मीर 'मैं, कश्मीर एस, कश्मीर:। घटना के wavenumbers और बिखरे हुए प्रकाश, क्यू बी, क्यू एस, थोक और पी एस मोड, क्रमशः की लहर वैक्टर। (रेफरी 9. से पुनर्प्रकाशित) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| नमूना | लोचदार गुणांक (GPA) | |
| trypsin पचा कोलेजन | सी 33 | 18.7 ± 0.1 |
| सी 11 | 14.4 ± 0.2 | |
| सी 44 | 3.4 ± 0.1 | |
| सी 12 | 7.2 ± 0.2 | |
| सी 13 | 11.2 ± 0.3 | |
| इलास्टिन | सी 33 | 11.5 ± 0.2 |
| सी 11 | 10.4 ± 0.1 | |
| सी 44 | 1.9 ± 0.2 | |
| सी 12 | 6.6 ± 0.2 | |
| सी 13 | 6.8 ± 0.3 | |
Discussion
Brillouin बिखरने स्पेक्ट्रोस्कोपी एक अनूठे उपकरण है जिसके द्वारा एक प्रोटीन, फाइबर की लोच tensor के अलग-अलग घटकों अभूतपूर्व विस्तार में विशेषता जा सकता है। इसके अलावा, माप एक सूक्ष्म स्तर पर बनाया जा सकता है और इस तरह जैविक संरचनाओं के सूक्ष्म पैमाने यांत्रिकी में उपन्यास अंतर्दृष्टि के साथ हमें प्रदान करेगा, हमें अनुमति देता है, पहली बार के लिए, यांत्रिक, और शायद कार्यात्मक, जटिलताओं के महत्व को समझने के लिए मैट्रिक्स वास्तुकला और जैव रसायन में हाल के वर्षों में खुलासा किया गया है जो।
तकनीक एक गीगा आवृत्ति रेंज में यांत्रिक गुणों के उपाय। इस डोमेन संरचनात्मक biopolymers के लिए पहले पता लगाया गया कभी नहीं किया है और यह दोनों उठाती है और लोच के आणविक तंत्र के बारे में मौलिक सवालों के जवाब देने के लिए साधन प्रदान करता है।
हम कदम जानवरों के ऊतकों से कोलेजन और elastin तंतुओं को निकालने के लिए और Brillouin scatteri को मापने के लिए वर्णितएनजी स्पेक्ट्रा एक चिंतनशील सब्सट्रेट का उपयोग फाइबर बायोमैकेनिक्स का पूरा विवरण प्राप्त करने के लिए। प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम उन है कि यह सुनिश्चित करें कि शुद्ध फाइबर प्राप्त कर रहे हैं और उचित प्रयोगात्मक शर्तों रेशेदार प्रोटीन की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य माप के लिए जगह में हैं। हालांकि, यह ध्यान रखें कि निष्कर्षण प्रक्रियाओं फाइबर के यांत्रिक गुणों को संशोधित कर सकते में वहन किया जाना चाहिए।
तकनीक का संशोधन microfocused Brillouin बिखरने और मानचित्रण के लिए ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी के साथ युग्मन दृष्टिकोण 13 शामिल है और पूरक तकनीक के साथ संभव संयोजन (जैसे, रमन बिखरने)। तकनीक की वर्तमान अनुप्रयोगों मुख्य रूप से excised जैविक सामग्री पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं, लेकिन महत्वपूर्ण घटनाओं, जैसे, कई Vipa etalons 14 के आधार पर उन लोगों के लिए संभव पहले से ही आवेदन की एक श्रृंखला दानव के साथ बिस्तर को benchtop से इस तकनीक का अनुवाद कर रहे हैंविवो अनुप्रयोगों में संभावित सहित 15,16 strated। Vipa दृष्टिकोण है कि हम क्या वर्णन करने के लिए एक विकल्प है; यह तेजी से अधिग्रहण का समय दिया है, लेकिन जरूरी नहीं कि इस तरह यहां का विश्लेषण किया उन लोगों के रूप अपारदर्शी नमूने के मामले में उचित है। इसके अलावा, एक चिंतनशील सब्सट्रेट के उपयोग की वजह से उनके विपरीत अर्ध लोचदार प्रकाश अस्वीकार करने के लिए पर्याप्त नहीं होगा सेट अप है कि Vipa etalons उपयोग में व्यावहारिक नहीं है। एक वर्णक्रमीय डाटासेट और सामग्री की स्वाभाविक रूप से कमजोर बिखरने क्रॉस सेक्शन के अधिग्रहण की गति से संबंधित सीमाओं गतिशील जैविक प्रणालियों को और गहरी ऊतकों के भीतर से डेटा का अधिग्रहण करने के लिए आवेदन सीमित कर सकता है, लेकिन तकनीकी शोधन मौजूदा प्रदर्शन पर सुधार हो सकता है।
बीएलएस बाह्य मैट्रिक्स पर मौलिक biophysical अनुसंधान के क्षेत्र में एक प्रमुख साधन हो वादा किया है और इस तरह मैट्रिक्स विकास के दौरान यांत्रिक गुणों के विकास में नए अंतर्दृष्टि और रोग में उनके नुकसान का उत्पादन करने के लिएअध: पतन। हालांकि, यह याद है कि माप noninvasive हैं और इसलिए इन विवो में शुरू किया जा सकता है महत्वपूर्ण है। दरअसल, यह पहले से ही कॉर्निया 16 में हासिल किया गया है और इस तरह के काम संयोजी ऊतक विकार की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए नए नैदानिक उपकरण के विकास के लिए एक मंच प्रदान कर सकता है।
अल्ट्रासाउंड elastography और परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी (AFM) micromechanical माप के वैकल्पिक तरीके हैं, लेकिन बीएलएस तकनीक पूर्व और AFM के विपरीत, की तुलना में (एक subcellular पैमाने पर) बेहतर स्थानिक संकल्प प्रदान करता है, नमूना पर कोई यांत्रिक बलों लगाता है और करने के लिए ही सीमित नहीं है केवल सतह विशेषताओं का विश्लेषण। कोलेजन और elastin के Brillouin moduli, जीपीए रेंज में हैं whilst स्थूल तनाव से यंग moduli (अधिक जानकारी के लिए कहीं और सूचित किया जाएगा) एमपीए के आदेश के हैं। यह परिणाम उत्तेजना आवृत्ति पर एक मजबूत निर्भरता के साथ एक अंतर लोचदार मापांक इंगित करता है, के कारणफाइबर के viscoelastic व्यवहार। बीएलएस जैव चिकित्सा विज्ञान के क्षेत्र में समस्याओं और सामग्री की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए लागू किया जा सकता है। यह शरीर विज्ञान और जैविक ऊतकों की विकृति पर सवाल का जवाब देने में मदद कर सकते हैं, साथ ही आणविक स्तर पर सामग्री और बातचीत की बुनियादी समझ के लिए एक भौतिक उपकरण प्रदान करते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chondroitinase ABC | Sigma-Aldrich | C2905 | |
| Tris Buffer | Fluka | 93358 | |
| Sodium Acetate | Fisher Scientific | S608-500 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Sodium Azide | Fisher Scientific | S2002 | |
| Streptomyces Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H1136-1AMP | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S7653 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T4665 | |
| Sodium Phosphate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S320-500 | |
| Pure Water | Millipore | ZRQS0P3WW | Produced in-house |
| Distilled Water | Bibby Scientific Limited | D4000 | Produced in-house from water still |
| Euthatal | Merial | J01601A | |
| Tandem Interferometer TFP-1 | JRS Scientific Instruments | ||
| Freezer | Lec | TU55144 | |
| Refrigerator | Zanussi | ZBA15021SA | |
| Hot Plate | Fisher Scientific | SP88857206 | |
| Clamps | VWR | 241-7311 & 241-7201 | |
| Clamp Stand | VWR | 241-0093 | |
| Thermometer | Fisher Scientific | 13-201-401 | |
| Cling Film | Sainsbury's | 7650540 | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | |
| Silicone | IDB Technologies | N/A | No catalogue number. Order upon request. |
| Cover Glass | VWR | 631-1571 | |
| Conical Flask | VWR | 214-1175 | |
| Beaker | VWR | 213-0469 | |
| Measuring Cylinder | VWR | 612-3838 | |
| Vial | VWR | 548-0051 & 548-0863 | |
| Petri Dish | VWR | 391-0441 | |
| Scalpel | Swann Morton Ltd | 0914 & 0308 | |
| Diamond Scribe | RS Instruments | 394-217 | |
| Soldering Iron | RS Instruments | 231-5332 | |
| Fine Forceps | VWR | 232-0188 | |
| Double Micro-Spatula | VWR | Various Sizes | |
| pH Meter | Hanna Instruments | HI-2210-02 | |
| Orbital Shaker | IKA | 0002819000 |
References
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