Introduction
啮齿动物模型已被用于研究许多人类疾病表现，包括肾盂肾炎和尿路感染（UTI）。 UTI是一个全球性的健康问题，可以影响所有年龄段的儿童，男性和女性。 1，2，3尿路感染的初始表现形式包括膀胱炎，如果感染沿输尿管上升，肾脏感染（肾盂肾炎）可以遵循。与此同时，全球糖尿病患病率接近四亿人。 4,5重要的是，尿路感染发病率可能高达谁是病人肥胖或有2型糖尿病，导致复发性尿路感染感染（入替），败血症，从肾盂肾炎肾纤维化和膀胱功能障碍的风险增加4倍以上升高。 6，7，8鼠类模型在研究UTI方面很重要，因为目前的抗生素疗法仅在UTI患者的一个子集中产生持续的预防性应答。为了改善临床UTI护理，关键步骤是了解rUTI及其从急性感染到炎症到纤维化的病理生理过程的机制以及2型糖尿病的影响。
改进动物模型的目标是开发可以更准确地评估疾病进展和治疗干预措施的技术。已经采用几种不同的方法在大鼠和/或小鼠中诱导肾盂肾炎，以研究肾损伤的病理生理学，抗生素治疗的效果以及UTI的自然过程的其他方面。建立逆行性UTI的常见方法是经尿道导尿。 10，11，12，13 </ sup>该方法通过尿道将细菌引入麻醉动物的膀胱。虽然这种技术密切模拟人类肾盂肾炎，但由于多种因素，肾盂肾炎感染的实际发生率和大小可能是非常可变的，包括在接种期间或之后紧随其后的输尿管反流自发或排尿不足。 11其结果是，在诱导上行肾盂肾炎的感染可以限制这种模型来研究肾脏感染以及治疗策略的效用的实验变化。
该报告描述了一种手术肾盂肾炎大鼠模型，其中将大肠杆菌直接注射入大鼠肾脏。尽管这种大鼠模型是侵入性的，但是可以有效地控制输送到肾脏的大肠杆菌的数量，从而能够强壮的肾脏感染和炎症。 14在这个过程中，我们还描述如何通过体内磁共振成像（MRI）纵向监测这些诱导的肾脏感染。
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Protocol
所有动物研究都是根据Case Western Reserve大学批准的机构动物护理和使用委员会（IACUC）方案进行的。下述外科手术的持续时间约为45-60分钟。每个时间点MRI程序本身约为15分钟。
麻醉
- 在异氟烷麻醉室内麻醉大鼠，其设定为与氧气混合的2％异氟烷，以便在腹膜内施用可注射麻醉之前促进动物处理和约束。
- 暴露于异氟烷3-5分钟后，检查动物是否被麻醉，并且对脚趾没有反应。
- 进一步镇静大鼠腹膜内注射赛拉嗪和氯胺酮：75mg / kg氯胺酮/ 10mg / kg甲苯噻嗪。当进行腹膜内注射时，拉回针头以确保肠或其他重要器官的部分未被穿刺。
- 一世在切口部位皮下注射2 mg / kg布比卡因以提供局部疼痛缓解。
2.手术区域的准备
- 在外科手术器械和用品用于手术之前灭菌并放置在外科手术垫上进行无菌处理。大多数仪器和耗材可以进行高压灭菌和重新使用。
- 使用无菌手套进行所有外科手术。
- 使用电动剃须刀将皮毛从动物的右侧剃掉。将动物从肋骨的底部剃除到后腿的顶部，为切口提供一个大的无毛的区域。
- 将动物放在无菌手术垫上，以将消毒区域与周围区域隔离。
- 用消毒剂如聚维酮碘或betadine擦洗皮肤。开始在手术中心的擦洗，并以圆形的方式移动到外面。用新的聚维酮碘或betadine擦拭至少重复三次。 用70％酒精拭子擦洗手术部位，直到皮肤清晰，因为如果吸收碘可能会有毒性。
手术程序
- 在无菌条件下维持此程序。
- 将麻醉动物置于左侧卧位的暖暖床上，右侧腹部朝上。
注意：必须注意将动物的核心体温保持在35-37°C以防止体温过低。这个升温床也应根据需要进行灭菌以维持无菌条件。 - 感觉为肋骨笼，并使用无菌尺寸10手术刀刀片从肋骨底部开始，做一个小2-3厘米的右背腹膜后切口。
- 沿切口两侧纵向放置无菌纱布。
- 解剖皮下组织，脂肪和肌肉，以便可视化和进入腹腔。使用弯刀Mayo剪刀可以进一步穿透配给伤口并切割厚厚的组织。
- 一旦肝脏清晰可见，便可使用钝镊子将肝脏向上收缩。
- 另一方面使用另一对钝钳，暴露右肾，使其位于腹腔外。
- 使用左手的手指和拇指将肾脏固定就位。用右手慢慢稳定地将0.1ml UTI89 大肠杆菌溶液（浓度在1×10 8 -1×10 9 ）从无菌注射器注入肾盂（其呈现为白色气泡） 15 。
注意：按照参考文献15所述准备细菌滴度。 - 在针上放置一条可吸收的止血钳，以防止接种物流入腹膜。慢慢将针从肾盂拉出。
注意：注意不要刺穿或感染周围的组织导致非目标感染症状和/或并发症。 - 使用较大的注射器，用生理盐水彻底冲洗肾脏，然后放回腹腔。
缝合线
注意：将被埋在组织中的缝线应为4-0不可吸收的编织缝线。可吸收或单丝缝线可用于身体表面。
- 将缝合线均匀并尽可能靠近组织边缘，以防止血流阻塞;通常距离边缘不超过0.3厘米。
- 抓住皮肤并使用一对细齿镊略微转动，并将针头保持器旋转到旋前的位置，以准备刺穿皮肤。
- 通过放置手腕旋转针头并将其穿过皮肤，将针头穿过皮肤的全部厚度。
- 对最接近执行过程的个人的皮肤边缘重复此过程。
- 紧缩缝线足以抵抗组织边缘。任何更紧的会阻塞血液供应，伤口愈合缓慢，并可能导致开裂。
- 使用方形结缝合缝合线，就好像它是一个简单的中断线迹，只不过只有短绞线被切割，留下约3-4毫米的尾巴。
- 在第一针被束缚之后，准备放置距离第一针约3毫米的第二针，然后继续缝合线。
- 一旦达到切口的末端，不要将最后一个针头完全拉过来。相反，使用在此处将针保持器保持的环作为短股线，以便将缝合线封闭件的远端扣紧。
- 使用仪器领带，使用方形结缝合缝线。这导致3股从远端的完成的结粘连。
5.动物恢复
- 手术后腹膜内注射2.1 mg / kg育亨宾逆转麻醉。一个3-5小时后，预计手术完全恢复。
- 手术后将动物放在加热垫（避免体温过低）和吸收性软床上。
- 提供口服或肠胃外液体的补液，直到它能够恢复正常进食（24小时内）。手术后立即口服约0.6ml生理盐水溶液以限制脱水效果。
- 按照IACUC批准的动物保健和使用协议中所述提供止痛。皮下注射5 mg / kg卡洛芬用于疼痛管理。
- 定期监测切口是否肿胀，渗出，疼痛或开裂。
6. 通过磁共振成像验证
- 对高场小动物MRI扫描仪进行体内 MRI实验。
- 用3％异氟烷在氧气中诱导麻醉，并将动物与右肾在等中心放置在MRI扫描仪中吃射频线圈。在整个成像过程中通过鼻锥连续地给动物1-2％的异氟烷麻醉。
注意：对于图1所示的体内 MRI图像，使用大鼠体积线圈（内径= 72mm）。 - 使用动物监测和控制系统来维持每只动物的呼吸速率（40-60次呼吸/分钟）和核心体温（35±1℃）。
- 使用多层，多回波自旋回波MRI采集获得感染和对照肾脏的高分辨率，轴向T2加权图像。典型的MRI采集参数是重复时间= 5000msec，回波时间= 40msec，切片厚度= 2.0mm，平面内空间分辨率=200μm，3个信号平均值，并且采集时间为8分钟。
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Representative Results
医学成像技术提供了非侵入性评估UTI和治疗功效的机会。因此，MRI用于验证注射1-2×10 7 UTI89 大肠杆菌后的急性感染诱导，并可视化手术前后肾脏的变化。 图1a-b显示肾脏感染逐渐增加的区域（黄色箭头）。在感染后第1天和第4天为每只动物获得的MRI图像有助于表征急性肾盂肾炎感染的生长。
图1：来自（ a ）感染后第（ 1 ）天和（ b ）第4天的大肠杆菌诱导的肾盂肾炎模型的轴向T1加权MRI图像（黄色箭头）。
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Discussion
啮齿动物（即小鼠和大鼠）升高的急性肾盂肾炎可以通过经尿道导尿术产生。 16，17，18经尿道这种感染的方法是有利的，因为它是非侵入性的和模拟上行感染的人类病理生理学。 17，18，19，20然而，这种方法也可以遭受不规则感染率和由于生理限制，例如排尿和解剖变异变量大肠杆菌给药于肾脏。 11 Fierer 等。 （1971）报道，40例（15％）大鼠肾脏中有6例在大肠杆菌输入膀胱后出现肾盂肾炎证据。 15一周RELI此外， 大肠杆菌的重复输注需要几次严重产生肾盂肾炎。 15，19
在本报告中，我们描述了一种替代的啮齿动物肾盂肾炎模型，其将大肠杆菌直接引入肾盂。肾盂肾炎技术的手术模型的主要益处包括施用1×10 8 - 1×10 9的一致剂量的大肠杆菌浓度以及在相同的解剖部位（右肾盂）处注射细菌动物。 15该直喷避免了对回流提供了更可靠的感染以及注射剂量的一个更准确的确定的要求。总的来说，这种手术肾盂肾炎模型为需要一致，可重复感染，尿道反流影响最小的研究提供了替代选择。
优化这种手术技术的成功包括：1）实现深度麻醉以限制呼吸运动并允许足够的工作时间; 2）切除手术切口区域，防止非预备区域的污染; 3）灭菌以防止引入污染; 4）将已知剂量的大肠杆菌小心注入大鼠肾盂; 5）彻底盐水冲洗肾后注射; 6）通过缝线逼近伤口边缘;和7）监测术中和术后并发症如低温和全身副作用。尽管使用加热垫来提高动物的舒适度，但是通过使用直肠温度传感器来维持核心体温可以进一步优化该方案。实现成功的生存手术的关键步骤是适当的麻醉和监测动物的呼吸。否则导致延长手术时间，以稳定动物的麻醉水平，并限制由于过度的不良伤害运动。工作区域的绝对不育和/或腹膜与大肠杆菌细菌的意外感染也是与手术模型相关的常见并发症。因此，充分准备高压灭菌手术工具，对整个工作空间进行消毒，以及限制额外的大肠杆菌感染的程序性努力都有助于最大限度地减少动物死亡率以及错误的感染结果。
尽管将大肠杆菌直接注射到肾脏中的益处，但是与经尿道递送方法相比，这种肾盂肾炎的手术模型也具有多重限制。使用直接手术注射方法的最大缺点是该技术的固有侵入性。然而，通过实施适当的无菌技术和使用充分的疼痛管理，通过加热垫进行温度控制以及手术后的柔软的吸收性床上用品，死亡率相当低确保快速恢复。此外，用于灭菌的高压灭菌手术工具是一种非常可靠和经济有效的灭菌方法。整体手术时间承诺通常小于1小时。此外，麻醉管理以及校准为体重的疼痛药物的局部和全身递送确保了准确的剂量递送和受试者的安全性。手术模型中的另一个潜在限制是由于较小的解剖尺寸，手术技术在小鼠中更加困难。与可以在大鼠和小鼠中实施的经尿道方法相反，使用大鼠模型进行手术模型的要求增加了研究的总体成本，并且可能对可能更容易获得的各种遗传改变的研究产生限制并且在鼠标模型中具有成本效益。如上所述，手术方法的另一个显着限制是它不代表人类肾盂肾炎紧密的经尿道方法。
在这里，我们使用MRI技术跟踪肾脏感染。 如图1所示，MRI扫描提供了随时间非侵入式监测肾脏感染的能力。跟踪大肠杆菌感染的另一种方法是通过细菌的荧光标记。 11,18然而，荧光成像是在此大鼠模型中（而不是小鼠模型）不太有效由于导致大大降低检测灵敏度的组织的光吸收。因此，MRI提供了更敏感的手段来跟踪大肠杆菌感染的最早阶段，并提供三维感染程度的区域信息。
UTI /急性肾盂肾炎病理生理学和肾纤维化进展的机制了解甚少。感染剂，下说谎的免疫宿主反应和炎症反应发挥不可或缺的作用，但每个的意义是未知的。使用这种直接注射程序将细菌靶向递送到肾脏的改善有可能增加啮齿动物模型中急性肾盂肾炎的再现性，并且可能更准确地评估治疗UTI的早期治疗干预措施。该方法最初是作为优化细菌递送到肾脏的方法而开发的，但也适用于递送其它试剂和病原体。这种方法可以类似地提供对膀胱炎，肾盂肾炎，UTI和糖尿病肾病的研究的益处。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absorbing Pad | Fisher | 14-127-47 | |
| Sterile Cotton Gauze Pad | Fisher | 22-415-469 | |
| Latex Surgical Gloves | Henry Schein Animal Health | 21540 | |
| Curved Mayo Scissors | Fisher | S17341 | |
| Straight Blunt Foreceps | Fisher | 08-895 | |
| Scalpel Handle | Fisher | 08-913-5 | |
| Sterile Scalpel Blades | Fisher | 53220 | |
| 1 ml Luer-Lok Syringe | BD Biosciences | 309628 | For bacterial injections |
| 20 ml Luer-Lok Syringe | BD Biosciences | 301031 | For saline wash |
| Hemostat | Seneca Medical | 240267 | |
| 23 G 3/4 in. Needle | BD Biosciences | 305143 | |
| 30 G 1 in. Needle | BD Biosciences | 305128 | |
| U-100 Insulin Syringe | Exel International | 25846 | For medication injections |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 050033 | |
| Xylazine | Henry Schein Animal Health | 33197 | Inject IP |
| Ketamine | Patterson Vetrinary | 07-881-9413 | Inject IP |
| Yohimbine (Atipamezole) | Patterson Vetrinary | 07-867-7097 | Inject IP after surgery |
| Bupivacaine (Marcaine) | Patterson Vetrinary | 07-890-4584 | Inject SQ at site of incision |
| 4-0 Chromic Gut Suture | Ethicon Inc. | U203H | |
| 4-0 Braided Vicryl Suture | Ethicon Inc. | J304H | |
| 1 ml SubQ Syringe | BD Biosciences | 309597 | |
| E. coli UTI89 or CFT073 | ATCC | 700928 | |
| Surgicel Absorbable Hemostat | Ethicon Inc. | ETH1951CS | |
| Biospec 9.4T MRI | Bruker | 94/20 USR |
References
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