Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

İleri Hayvan Karaciğer Kolorektal Metastaz Model: Görüntüleme Teknikleri ve Metastatik Klonların Özellikleri

doi: 10.3791/54657 Published: November 30, 2016
* These authors contributed equally

Abstract

Karaciğer metastazlarının ve ilerlemesi yavaş oranlarının sınırlı sayıda hasta başarılı bir şekilde lokal tedavi ile tedavi edilebilir 1,2 yaklaşır. Bununla birlikte, küçük bir karaciğer metastazlarının heterojenliği hakkında bilinen ve tek tek metastatik koloni gelişimini değerlendirmek edebilen hayvan modelleri ihtiyaç vardır. Burada, kantitatif karaciğerde bireysel tümör klonların gelişimini görselleştirmek ve büyüme kinetiği ve kolonizasyon verimliliğini tahmin yeteneği sağlar hepatik metastaz gelişmiş bir model sunuyoruz. Bu stabil olarak lusiferaz ve tdTomato ve farklı büyüme özelliklerine sahip ile etiketlenmiş HCT116 insan kolorektal kanser hücrelerinin monoklonal türevlerinin bir panel oluşturulur. Bir splenektomi ardından dalak enjeksiyonu ile, bu klonların çoğunluğu karaciğer metastazı üretebilen, fakat kolonizasyon farklı frekanslarda ve farklı büyüme oranları ile vardır. In vivo görüntüleme Sisteml kullanılmasıM (IVIS), görselleştirmek ve in vivo ve ex vivo Işıklı flüoresan görüntüleme ile metastazı gelişimi ölçmek mümkündür. Buna ek olarak, Diffüz Lüminesans Görüntüleme Tomografi (DLIT) in vivo karaciğer metastazı 3D dağılımını sağlar. Hasat karaciğerin ex vivo floresan görüntüleme bireysel hepatik metastatik kolonilerin nicel ölçümler sağlar, karaciğer kolonizasyon sıklığı değerlendirilmesi ve büyüme kinetiği için izin metastaz. Model klinik gözlenen karaciğer metastazları benzer olduğundan, karaciğer metastazı ile ilişkili genleri tespit etmek için ve karaciğer metastatik hastalık için potansiyel ablatif veya adjuvan tedaviler test etmek için bir yöntemi olarak hizmet verebilir.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Primer kolorektal kanserler (CRC) karaciğer metastazı olan hastalar kötü prognoz ile karakterizedir. % 12 5 - karaciğer metastazlarının (evre IV) olan hastalar sadece 8 5 yıllık sağkalım oranı ise% 88 3,4 - birincil metastatik olmayan CRC için 5 yıllık sağkalım oranı (aşamaları I - III) 75 olarak tahmin edilmektedir 6. Ancak, metastatik hastalar metastazlar ve farklı nüks kez farklı numaralar ile başvuran, heterojen bir grubunu temsil etmektedir. Klinik gözlemler, ve (yerel büyüme oranı ile orantılı) tek bir metastaz boyutu (kolonileşme yetisi ya kolonizasyon frekansına orantılı olabilir) metastaz sayısı bağımsız prognostik faktörler 1,7 olduğuna işaret etmektedir. büyümek için kendi yetenek ve yaymak ve karaciğer mikroçevresinin hayatta kendi yeteneği: Bir başka deyişle, karaciğer kolonize metastatik klonların başarısı iki önemli özelliği bağlıdır.

Dizaynyakalama ve büyük ölçüde karaciğer metastazı biyoloji anlayışımızı geliştirmek ve potansiyel terapötik yaklaşımların tasarımı için etkili bir araç sağlayabilir metastatik klonların özelliklerini nicel yeteneği ile başarılı klinik modelleri. Deneysel karaciğer metastazı modelleri daha önce 8,9 rapor edilmiştir, ancak bunların hiçbiri niceliksel yakalamak ve in vivo ve ex vivo hem de bireysel metastatik klonların özelliklerini tanımlamak için yeteneği sağladı.

Burada, farklı karaciğer kolonizasyon verimlilik ve büyüme özellikleri ile tümör klonların nesil içeren karaciğer metastazı yeni, gelişmiş bir model sunuyoruz. Metastatik kapasite iç farklılıklar vardır monoklonal hücre çizgilerinin üretimi ile lusiferaz ve tdTomato floresan protein kanser hücrelerinin çift etiketleme bir arada kullanılabilir. Bu deneysel modelde, veriler gelişimi göstermektedirKaraciğer metastazları kolonizasyon sıklığı açısından ve klinik gözlemlerle tutarlı iki katına zaman (Td), tarif edilebilir. Bu modelin sayısal doğa ilaç keşfi ve tanı amaçlı kolayca uyarlanamıyor yapar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bütün hayvan prosedürleri Chicago Üniversitesi (Protokol # 72213-09) Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmış ve steril koşullar altında gerçekleştirilmiştir.

1. hazırlıklar

  1. % 10 Fetal Sığır Serumu (FBS), 100 U / ml penisilin ve 100 mg / ml streptomisin ile takviye edilmiş Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM): 500, HCT116 tümör hücrelerinin kültürü için orta mL olun.
  2. 20 dakika boyunca 251 ° F 'de, 4, cerrahi havlu, gazlı bez, iki küçük Adson alıcılar, iğne sürücüsü, makas iki çift küçük bir kelepçe ve 3 microclips - cihazlar dahil olmak üzere 3 dalak enjeksiyon modeline için kullanılabilir, otoklavın .
  3. , Fareler için ameliyat sonrası anestezi hazırlayın dalak enjeksiyonu takiben deri altına uygulanacak. fare başına 0.9 normal serum fizyolojik 500 uL buprenorfin 4 ug - 2 seyreltilir.
  4. periton enjeksiyonlar dur için ateşböceği luciferase 150 mikrogram / 150 uL hacimde hazırlayınbiyoparlaklık deneyleri ing. -20 ° C'de saklayın ve ışıktan korumak.

Lusiferaz / tdTomato etiketli monoklonal hücre çizgileri 10,11 2. Üretim

  1. Çözülme ve HCT116 insan kolorektal kanser hücre ve% 10 FBS, 100 U / ml penisilin ve 100 mg / ml streptomisin ile DMEM içerisinde 293FT insan embriyonik böbrek hücreleri korumak. % 5 CO2 ve 37 ° C 'de kültür içinde muhafaza edin.
  2. yüksek titre lentivirüs üretin.
    1. 12 x 10 6 293FT% 10 FBS,% 1 penisilin / streptomisin ile bitmiş DMEM, 18 ml (cDMEM) 15 cm hücre kültür tabaklarında kanalı 3 ve 10 arasında hücreler ve% 1 temel olmayan amino asitler, - D 1, levha 10 üzerinde . 37 ° C'de inkübe edilir ve% 5 CO2.
    2. D2, aşağıdaki transfeksiyon çözeltisi kullanılarak hücrelerin transfekte:
      1. Her yemeğin, aşağıdakileri kullanın: lusiferaz (Luc2) ve tdTomato eklenen pFUG lentiviral vektör 37.5 ug DNA karışımınısteril H 2 O. 1062 uL toplam tekrar süspanse 11 (Chicago Üniversitesi'nde Dr. Geoffrey Greene bir hediye), pCMVΔ8.74 25 ug ve pMD2.G ve 12.5 mikrogram yapıları 2 M CaCl 2 188 mcL ekleyin.
      2. Ekle 1,250 2x Hepes-tamponlu tuzlu su (HBS, 50 mM HEPES, 1.5 mM Na 2 HPO 4, 180 mM NaCl, pH 7.12), DNA / CaCl2 çözeltiye, bir kerede, bir damla uL, Kabarcık üflerken bir pipet ile çözüm.
      3. 20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir, ve sonra da 25 uM'lik bir son konsantrasyon yapmak için RT cDMEM ve klorokin 15.5 ml.
    3. 293FT hücrelerinin her tabak ortamı aspire ve transfeksiyon solüsyonu ile değiştirin. Kaplama hücreleri kolayca yerinden gibi, yavaş transfeksiyon solüsyonu 16 mL ekleyin.
    4. D3 üzerine 8 sonra - yine Taki 16 saat transfeksiyon solüsyonu çıkarın ve Dulbecco fosfat tamponlu tuz (DPBS) ile bir kez yıkama hücrelering hücreleri çıkarmak için değil bakım. 10 mM Hepes taze cDMEM 18 mL ile değiştirin.
      Not: yavaşça bulaşık hareket transfeksiyon solüsyonu aspire ve hücreleri uzaklaştırmak için, böylece plakaların yan duvarı boyunca ortamı eklenir.
    5. D, 4, transfeksiyon zamanı 48 saatte, hücreleri çıkarmak için şekilde bir pipet ile yavaşça aspire yemekler ortamı toplar. Santrifüj 5 dakika boyunca 300 xg'de toplanan medya büyük hücreli enkaz çöktürmek için.
    6. kullanılarak viral süpernatan filtre 0.45 um düşük-protein bağlayıcı 50,000 xg ve 4 ° C 'de 2 saat süre ile, SW-28 rotor kullanılarak filtre şişesi ve santrifüj. santrifüj bittikten hemen sonra süpernatant süzün ve silecekler ile tüpün içini kurutun.
    7. % 1 FBS, düşük serum Ortamı (RSM) 50 uL viral pelletini. Alikotlar ileride kullanmak (viral stok) -80 ° C 'de muhafaza edilebilir.
  3. lentivirüs transduceve HCT116 hücrelerine es tdTomato pozitif klonlardan oluşan bir panel oluşturabilir.
    1. Viral enfeksiyondan önce 1 x 10 5 1 yuvalı plakalar 24 d yoğunluğunda HCT116 hücreler plaka.
    2. % 1 penisilin / streptomisin ve 8 ug / ml polibren ile: (100 seyreltme 1) (CRSM) RSM 4 mL (2.2.7) yeniden süspansiyon haline getirilmiş virüs 40 uL seyreltilir.
    3. enfeksiyonun günde, DPBS ile bir kez yıkama hücreleri ve daha sonra her bir aşama 2.3.2 seyreltilmiş virüs 250 uL ekleyin. Her bir oyuğa cDMEM 1 ml, sonra 37 ° C'de 4 saat ve% 5 CO2 inkübe ve; 72 saat - 48 CO2, 37 ° C'de inkübe ve% 5.
    4. % 0.05 tripsin 1 mL 0.53 mM EDTA hücrelerin tekrar ve tripsin nötralize etmek için cDMEM 1 ml. 4 dakika boyunca 300 x g'de bir mikrosantrifüj tüpü ve pelet hücreleri aktarın. Hanks Dengelenmiş Tuz Çözeltisi (HBSS) artı% 2 FBS 1 mL pelet 3x yıkanır.
    5. Adım 2.3.4 den pelet1 x 10 6 hücre / mL, tek bir hücre süspansiyonu içine FACS tamponu (% 2 FBC ve PBS içinde 2 mM EDTA) ile.
    6. Sıralama PE pozitif hücreler için yolluklama bir hücre ayırıcıyla tdTomato pozitif HCT116 hücreleri (uyarım / emisyon: 556/585 nm). Ebeveyn tdTomato pozitif HCT116 hücreleri (Şekil 1 A) oluşturmak için% 5 CO2 37 ° C'de 10 cm'lik bir tabak içinde toplanan hücreler büyümek.
    7. % 0.05 tripsin 8 mL, 3 0.53 mM EDTA 2.3.6 gelen ebeveyn tdTomato pozitif HCT116 hücreleri tekrar - 5 dakika ve daha sonra tripsin nötralize etmek için 8 mL cDMEM ilave edin.
      1. 4 dakika boyunca 300 x g'de 50 ml tüp ve pelet hücreleri aktarın. Süpernatantı ve cDMEM (Şekil 1B) 200 uL başına 1 hücreye ebeveyn tdTomato pozitif HCT116 hücreleri sulandırmak.
    8. % 5 CO2 ve 37 ° C'de (Şekil 1C) bir 96-çukurlu plaka içinde çukur başına bir tek hücre (seyreltme 200 uL) plaka.
    9. % 5 CO2 37 ° C'de şişeler içinde tek tek monoklonları büyütün. (Şekil 1D).

Hücre sayısı bir işlev olarak Floresan Sinyal Şiddeti 3. Kalibrasyon

  1. 10 3, 0 yoğunluğunda, hemen HCT116-l2t olarak adlandırılır, transfekte olmamış HCT116 hücreleri, levha 2 x 10 4, 3 x 10 5 x 10 4 5, 7 x 10 4, x, 10 4 9 ve 10 5 hücre / göz her yoğunluk üç kez, 96 oyuklu plakalar.
  2. Inkübasyondan 5 saat sonra, IVIS 10 kullanılarak tdTomato floresan şiddetleri ölçmek.
    1. Yazılımı başlatmak için masaüstündeki görüntü yazılımı simgesini tıklayın. görüntüleme sistemi başlatmak için "Başlat" butonuna tıklayın. (Birkaç dakika sürer) başlatma tamamlandıktan sonra, "Floresan", "4 saniyelik" pozlama süresi, "Orta" binning, "2" F / durdur seçeneğini "535" uyarma filtresi,ve "580" emisyon filtresi.
    2. görüntüleme istasyonu üzerinde 96 plaka yerleştirin ve görüntüleme başlatmak için "Acquire" üzerine tıklayın. Görüntü alındıktan sonra, araç paleti içinde "ROI Araçlar" linkine tıklayın ve yarık simgesinden 12 x 8 seçin.
    3. 96 plaka görüntü üzerinde sinyal alanı kapsayacak ve ölçümler sekmesini tıklayın 12 x 8 yırtmaçlı oluşturun. Cm kare başına steradyan'dır s başına fotonların birimleri ile ROI ölçümleri bir tablo ile bir pencere gözlemlemek (fotonlar / s / sr / cm2).
  3. hücre sayısı ve sinyal yoğunluğu temsil eden işlev (Y ekseni) eşit bağımsız değişken (X ekseni) bir scatterplot oluşturun. Floresan yoğunluğunun birimine karşılık gelen hücrelerin miktarını hesaplamak için (Şekil 2) 10, bir veri analiz yazılımı kullanılarak regresyon eğrisi hesaplanır.

Karaciğer Metastazlarının 4. Hayvan Modeli

  1. HCT116-l2t hücreleri 70 ulaştıklarında-% 80 confluency, dalak enjeksiyon yaklaşık 1 saat önce onları hazırlamak. 3 0.53 mM EDTA,% 0.05 tripsin kullanılarak hücreleri ayırmak - 5 dakika, ve daha sonra cDMEM eşit miktarda ile nötralize. topaklanma önlemek için iyice pipetle emin olun.
  2. Otomatik hücre sayacı ile hücreleri saymak.
  3. 2 x 10 6 hücre / 100 uL - 1.2 'lik bir konsantrasyon 1 x DPBS tekrar süspansiyon hücreleri. pipet ve topaklanma önlemek için iyice hücreleri tekrar süspansiyon emin olun.
  4. bazen tüp onları resuspending, enjeksiyon kadar buz üzerinde hücreleri tutun.
  5. fareler anestezi öncesinde, adım 1.3 açıklanan buprenorfin karışımı 500 uL enjekte deri altından tarafından ameliyat öncesi anestezi ve sıvı bolus sağlar. Ağrı (hareketliliğin azalması, kambur boy, damat başarısızlık, ele seslendirme) belirtileri çözülene kadar günde iki kez ek buprenorfin karışımının aynı dozunu.
  6. 6 ila 8 haftalık anestezisibir anestezi bölmesi oksijen içinde% 2 izofluran ile -eski dişi atimik çıplak fareler. Fareler kuyruk sıkıştırarak anestezi altında tamamen emin olun. anestezi altında iken kuruluğunu önlemek için gözleri veteriner merhem kullanın. dalak enjeksiyon için tek bir burun konisi her anestezi fare aktarın. insizyon önce, her bir fare olan steril bir cerrahi örtü ile kaplanmalıdır.
  7. çıplak farelerin sol kanattan deri yoluyla dışarıdan görülen bir mor alanı olarak dalak tanımlayın. Mikrodiseksiyon makas kullanarak, sadece dalak üstündeki cilde 8 mm sol yan kesi yapmak.
    1. Sonraki, karın duvarında yukarı kaldırın ve küçük bir kesi yapmak. iç organlar kesi uzaklaşmaya böylece karın boşluğuna hava izin verin. Yaklaşık 5 mm karın ön duvarı kesi büyütün.
    2. hafifçe bir pamuklu çubuk ile kesi çevresinde basınç uygulayarak dalak Açığa. Gerekirse, pankreas şişman nazikçe adam olabilirdalak zarar etmeyecek şekilde maruz kalma ile yardımcı olmak için ipulated.
  8. Yavaşça maruz dalak ucuna bir 27 G iğne ile 1 ml şırınga kullanarak hücrelerin 100 uL enjekte edilir. İlave karaciğer tümörleri önlemek için, 60 s - en az 30 daha uzun bir sürede, yavaş yavaş enjekte edilir.
  9. önceden enjekte edilen hücre süspansiyonu sızmasını önlemek için enjeksiyon sonunda iğne çıkarmadan dalak bir mikro yerleştirin.
  10. 5 dakika boyunca yerine mikro-klip bırakın.
  11. 5 dk enjeksiyondan, hemostaz için bir el koter cihazı kullanılarak bir splenektomi gerçekleştirin. Ön taraftan başlayarak dalak hilusu teşrih. Büyük Gemilerin diseksiyon, aşırı kanama önlemek için koter kullanılarak, komşu yağ dokusu ile damarların proksimal tarafı ön coagulate.
    NOT: hemostaz için Yöntemler: koter ile doğrudan kanama noktasını koagüle 3 kanama noktasına baskı uygulamak - 5 dakika, ya da bir 5-0 ipek kravat ile kanama noktası dikiş-Arter. iki kat, her bir fare cenah kesi kapatın. İlk olarak, tek bir yatay dikiş 5-0 emilebilir örgülü sütür (örneğin, vikril) ile karın duvarı kapatın. Sonra, tek bir yatay dikiş ile yine 4-0 emilemeyen monofilament sütür (örneğin, prolen) kullanarak cilt kapatın.
  12. Her prosedür arasındaki steril koşulları sağlamak için% 70 izopropanol püskürterek bütün aletleri temizleyin.
    NOT: Anestezi uyanık iken hayvanlar ısındı emin olun. Onlar ayakta olmak ve normal aktiviteye dönünceye kadar ameliyat sonrası tüm fareleri izleyin. 5 dk - Tipik olarak, iyileşme süresi yaklaşık 3 olduğunu. Onlar sternum yatma muhafaza edilmesi için yeterli bilinci yerine kadar sahipsiz hayvanları bırakmayın. Tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların şirkete ameliyat geçirmiş bir hayvan iade etmeyin.

Vivo Bioluminescent Görüntüleme 5.

  1. üzerinde görüntüleme gerçekleştirmekhaftalık olarak ölçmek ve zamanla biyoparlaklık değişiklikleri ölçmek için.
  2. Bir anestezi odasına fareler yerleştirin ve oksijen içinde% 2 izofluran ile onları uyutmak. Fareler kuyrukları kısma anestezi altında tamamen emin olun. anestezi altında iken kuruluğunu önlemek için gözleri veteriner merhem kullanın.
  3. Daha sonra, periton boşluğu içine adım 1.4 firefly luciferase önceden hazırlanmış 150 uL her fare enjekte edilir.
  4. Bireysel burun konileri izofluran uygulanması ile IVIS fareler yerleştirin. Bitişik farelere sinyali en aza indirmek için aralarında ayırıcılar ile yatar pozisyonda fareler yerleştirin. beş farenin en fazla bir zamanda görüntülenebilir.
  5. Tedbir ve bioluminescent şiddetleri luciferase enjeksiyondan sonra 3 dakika analiz.
    1. Adım 3.2.1 de açıklandığı gibi IVIS başlatılıyor sonra, "Luminescent", "1 saniye" maruz kalma süresi ve "Orta" binning seçin.
    2. IMAGin başlatmak için "Acquire" düğmesini tıklayınörn. luciferase enjeksiyondan sonra tutarlı bir süre (3 dk) her görüntüleme gerçekleştirmek için emin olun.
    3. Görüntü alındıktan sonra, bir görüntü penceresi ve araç paleti görünecektir. "YG Araçlar" tıklayın ve "1", "2", "3", "4", ya da "5" daire simgesi, görüntülü farelerin sayısına karşılık gelen.
    4. , İlgi (ROI) Bölgeleri tanımlamak fare karın boşluğuna ışıldayan sinyalinin sinyal alanını daire ve sonra radyant verimlilik keyfi bir birim olarak ROI "ölçümleri" tıklayın ((fotonlar / s / cm 2 / steradyan) / (uW / cm2)). arka ek bir yatırım getirisi daire var emin olun.
  6. Dört hafta sonrası enjeksiyon ve önceki hayvan kurban etmek, tek tek tümör kolonileri biyolüminesans şiddetlerinin gerçek zamanlı 3D rekonstrüksiyon kullanarak tümör yükünü ve dağılımını değerlendirmek için IVIS kullanarak Diffüz Lüminesans Görüntüleme Tomografi (DLIT) gerçekleştirin. fareler anestezi ve aşama 5.2.4 de tarif edildiği gibi, luciferase enjekte edilir. DLIT her seferinde bir fare üzerinde gerçekleştirilmiştir.
  7. Adım 3.2.1 de açıklandığı gibi IVIS başlatılıyor sonra, "Görüntüleme sihirbazı", "biyolüminesensin" seçin ve "İleri" ye tıklayın. "DLIT" seçin ve "İleri" butonuna tıklayınız. "Firefly" probları seçin ve "İleri" butonuna tıklayınız. "Fare" görüntü konusunu, "Otomatik" poz parametresi, görüş "C-13 cm" alan ve "0,5 cm" konu yüksekliği seçin ve "İleri" butonuna tıklayınız. görüntüleme başlatmak için "Edinme" düğmesini tıklayın.
  8. Görüntü alındıktan sonra, "DLIT 3D İmar" sekmesini seçin ve "Analiz" sekmesine gidin ve 3 boyutlu rekonstrüksiyon görüntü oluşturmak için "yeniden yapılandırma" tıklayın.
  9. "Araçlar" ve "3D Animasyon" tıklayın. 3D animasyon penceresinde "Y ekseni üzerinde Spin SOLA" seçeneğini seçin. Bir .mov dosya biçimi içine "Kaydet" ve "Kaydet" i tıklayın.

6. Ex Vivo Floresan Görüntüleme

  1. dalak enjeksiyonları izleyen 6 hafta - anestezi, veya 4 kurumsal yönergelere göre ise servikal dislokasyon ile fareler kurban.
  2. karaciğer Hasat. sağdan sola bir yatay bir kesi yapmak. Bir pikap ile kılıç şeklinde sürecini kapma falciform, hepatik ven ve inferior vena kava teşrih.
    1. triadın diseksiyon sırasında kaudat lob kesmemeye özen sağ hepatorenal ligament, triadın ve sol hepatorenal ligament teşrih. Bu otofloresans gösterecektir olarak karaciğer hasat sonra, safra kesesi çıkarın. Mevcut herhangi bir ek ekstra karaciğer tümörlerinin not edin.
  3. Mevcut makroskopik numaraları ve karaciğer tümörlerinin boyutları not alın ve DPBS hasat ciğeri yerleştirin.
    NOT: Tümörler çıplak gözle makroskopik olarak görünürBeyaz tümörler (a Örnek örneğin, bakınız Şekil 4).
  4. Önceki görüntüleme kağıda yerleşimi, her karaciğer alıp yavaşça bir kağıt havlu üzerine blot aşırı sıvı kaldırmak.
  5. IVIS kullanarak her bir tümör kolonisinden floresan şiddetleri ölçün.
    1. "Floresan", "4 saniye" pozlama süresi, "Orta" binning, "2" F / stop "535" uyarma filtresi ve "580" emisyon filtresi seçin. görüntüleme başlatmak için "Edinme" düğmesini tıklayın.
    2. Görüntüyü aldıktan sonra, görüntü penceresi ve araç paleti bulun. "YG Araçlar" tıklayın ve daire simgesinden "1" seçeneğini seçin. ((Radyan verimlilik keyfi bir birim olarak ROI "ölçümleri" tıklatın daire, görüntü üzerinde bireysel tümör kolonileri sinyal alanını İB'leri tanımlamak ve fotonlar / s / cm 2) / steradyan / (uW / cm 2) ). arka ek bir yatırım getirisi daire var emin olun.
    3. Bir küre olmaya varsayarak toplam tümör hacmini hesaplayın. Tümör hacmi = 4 x π xr 3/3 (r = yarıçap). splenically enjekte edilen hücrelerin sayısı bölü karaciğer tümör sayısı gibi tümör koloni oluşturan hücrelerin (Fc) fraksiyonu hesaplayın.
    4. Adım 3.3 doğrusal yaklaşım gelen koloni başına toplam hücre sayısını (= X) hesaplayın. Td (gün) 28 / Y. = Y = 2 X ve Td günlük olarak hücre bölünmeleri (= Y) sayısını hesaplayın

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu denemenin amacı,., In vivo metastatik tümör yükü seri ölçümü için ve kolonize sıklığı ve karaciğer metastazları gelişen büyüme kinetiğinin tahmini için potansiyeli olan bir tutarlı ve kolayca tekrarlanabilir hayvan modeli kurmak oldu 2-6 Rakamlar efsanelerle, Creative Commons CC-BY lisansı 10 altında önceki yayın sağlanmaktadır.

Çift etiketli tümör hücre monoklonları Üretimi

İlk olarak, ışık veren ve floresan etiketli monoklonal hücre soylarının bir paneli, farklı metastatik yetenekleri ile elde edilmiştir. Ebeveyn HCT116 kolon kanser hücrelerinin başarılı Işıklı transfeksiyonu (Luc2) ve flüoresan (tdTomato) proteinler izlenerek, 16 çift etiketli monoklonları ebeveyn HCT1 seyrelterek elde edildi1 hücre / 96 yuvalı plakalar içinde 200 uL 16-l2t hücreleri (Şekil 1) 10. In vitro floresans ve HCT116-l2t lüminesans daha sonra in vivo ve ex in tümör hücrelerinin sayısını tahmin etmek için hücrelerin artan miktarı kullanılarak nicelleştirilmiştir (Şekil 2) 10 karaciğer tümörü görüntüleme vivo.

Diferansiyel Karaciğer Kolonizasyon ile Klonların tarafından Metastaz Geliştirme

Daha sonra, karaciğer metastazlarının oluşturmak için, 16 daha önce oluşturulan tek tek HCT116-l2t klon intrasplenically farelere enjekte edildi; Bir splenektomi sonra gerçekleştirildi. Karaciğer metastazı gelişimi fareler telef edildikten sonra, ex vivo flüoresan görüntüleme ardından haftalık in vivo biyolojik olarak ışık veren görüntüleme ile izlenmiştir. Oluşturulan 16 monoklonları dışında, biz nedeniyle d P1, P2, O1 ve O2, olarak belirlenmiş klonlar seçilmiştirifferent karaciğerde kolonizasyonu ve büyüme yetenekleri görülmektedir. Klonlar O1 ve O2 "oligometastatic" klonu temsil ve potansiyel sınırlı metastatik hastalık bir fenotip yansıtan, küçük bir tümör yükü olmuştur. Klonlar P1 ve P2 olarak da polymetastatic hastalığa denir yaygın yayılmasını temsil, daha büyük bir tümör yükü olmuştur. Biyolüminesans P1 ve P2 farelerde (6.7 x 10 6 ± 4.7 x 10 6 ve 3.6 x 10 6 ± 2.5 x 10 6 foton / s / cm2 / steradyan) O1 ve O2 fareler ile karşılaştırıldığında (2.0 x yüksekti 10 5 ± 1.3 × 10 5 ve 1,7 × 10 5 ± 9.1 × 10 4 fotonlar / s / cm 2 / steradyan) dalak enjeksiyonu (Şekil 3A, B) 10 sonra 3 hafta. Dalak enjeksiyondan sonra 4 hafta karaciğerinin ex vivo floresan ölçümü P1 ve P2 karaciğerleri yüksek Fluores sahip olduğunu göstermiştirO1 ve O2 karaciğerleri (Şekil 3C) ile karşılaştırıldığında yüzde yoğunlukları. Ex vivo olarak floresans görüntüleri tümör dağılımları makroskopik bulguları (Şekil 3C, D), 10 ile tutarlı olmuştur.

Bireysel Klonların Kolonizasyon ve Büyüme Kinetiği

sayısı ve makroskopik olarak görsel tümörlerin boyutları sayıldı ve her bir karaciğer ölçüldü. Buna ek olarak, ex vivo olarak floresan görüntüleme her monoklondan (Şekil 4) 10, her bir tümör kolonisi üzerinde yapıldı. 10; P1 tümörlerin sayısı O2 (Şekil 5a, b p <0.001) P2, O1 ve O2 ile karşılaştırıldığında tümör boyutu P1, A1 göre P2 daha büyük ise, daha yüksek ve. O1 ve O2 ile karşılaştırıldığında Ancak, P1 ve P2 karaciğer toplam tümör hacmi daha büyük (Şekil 5C) 5 - - sırasıyla P1 ve O1 içinde 6-5, 6.0 x 10-6 ± 2.3 x 10 diğer klonlar (FC = 8.2 x 10 göre Dolayısıyla P1 karaciğer kolonize için geliştirilmiş bir yeteneğe sahipti p <0.001; Şekil 5D) 10. P2 klonları O1 ve O2 gibi karaciğer kolonize benzer bir yeteneği vardı ama oluşturulan tümörlerin boyutu diğer klonlar daha büyüktü. Tümör koloni, td, ve hücre bölünmesini başına hücre sayısı, daha önce gen kalibrasyon kullanılarak bu verilerden hesaplanabilir(- G Şekil 2 ve 5E) 10 floresan yoğunluğu ve hücrelerin sayısı arasındaki korelasyon erated. Bu O1 ve O2 (p <0.05) 'e benzer bir Td sahip olsa makroskopik görsel inceleme ile görüldüğü gibi, karaciğerde çok küçük tümörleri oluşturulmuş P1, daha büyük bir Fc vardı. Makroskopik büyük tümörlerde, sınırlı sayıda elde P2, benzer bir Fc, ancak O1 ve O2 (p <0.05) ile karşılaştırıldığında daha kısa bir Td vardı. Birlikte ele alındığında bu sonuçlar, Fc ve TD metastaz potansiyeli katkıda bulunan iki anahtar parametreler olduğunu göstermektedir.

Karaciğerde metastaz tümörlerin 3D dağılımı DLIT (Şekil 6) 10 ile gösterilmiştir. Bu görüntüleme tekniği kullanarak, bireysel hepatik metastatik kolonilerin biyolüminesans tespiti ve ölçülmesi ile metastaz mekânsal-zamansal dinamik davranışını izlemek mümkündür.

Veriler standart veri analiz yazılımı kullanılarak analiz edildi oluşturulur ve hata barları ortalama ± standart sapma olarak gösterildi. Pearson korelasyon katsayıları parametreler arasındaki ilişkiyi değerlendirmek için kullanıldı. P değerleri istatistiksel olarak anlamlı kabul bir p <0.05 ile, 2-kuyruklu Student t-testleri kullanılarak değerlendirildi.

Şekil 1
Şekil 1:. Etiketli HCT116 hücrelerinin monoklonları bir Masası Üretimi (A) lusiferaz ve tdTomato ile etiketlenmiş ebeveyn HCT116 hücreleri büyütün. (B) 1 hücre / 200 uL ebeveyn HCT116 hücreleri seyreltilir. (C), levhalar, 96 oyuklu bir plaka içerisinde seyreltme 200 uL. (D) monoclo büyütün96 oyuklu bir plaka içerisinde her bir mesafede Nes. (E) karaciğer metastazları oluşturmak için farelere intrasplenically monoklonları enjekte edilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2: floresan şiddetleri ile hücrelerin sayısı tahmini (A), 96 oyuklu bir plaka içerisinde, üçlenmiş hücrelerin farklı sayıda ışık saçan görüntüsü.. (B) hücre sayısı ve parlaklık (R = 0.99, p <0.0001) arasındaki ilişki. Ölçek çubuğu Işıklı yoğunluğunu (fotonlar / s / cm 2 / steradyan) temsil eder. (C), 96 oyuklu bir plaka içerisinde, üçlenmiş hücrelerin farklı sayıda floresan görüntüsü. biz şiddetleriBir 535 nm uyarma ve 580 nm emisyon ile radyant verimlilik olarak tekrar elde. (D), hücrelerin sayısı ve floresan (R = 0.99, p <0.0001) arasındaki ilişki. Ölçek çubuğu ışıma verimliliği rasgele biriminde floresan yoğunluğu ((foton / s / cm2 / steradyan) / (uW / cm2)) temsil eder. Izni 10 ile yayımlanmaktadır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3: Seçilen Clones Karaciğer Biyoparlaklık ve E x Vivo Floresan (A) Temsilcisi bioluminescent görüntüler.. Ölçek çubuğu Işıklı int temsilensity (foton / s / cm2 / steradyan). P1 ve P2 3 hafta ve 1 - - O1 ve O2 4 hafta (B) Biyolüminesans 1 haftalık ölçülür. Veriler ortalama ± standart sapma olarak temsil edildi. (C) Temsilcisi ex vivo olarak karaciğerinin floresan görüntüler. Yoğunlukları 535 nm uyarma ve 580 nm emisyon ile radyant verimlilik olarak elde edildi. Ölçek çubuğu ışıma verimliliği rasgele biriminde floresan yoğunluğu ((foton / s / cm2 / steradyan) / (uW / cm2)) temsil eder. (D) makroskopik karaciğer görüntüleri (oklar küçük beyaz tümörleri gösterir). P1 ve P2: polymetastatic klonlar, O1 ve O2: oligometastatic klonlar. Izni 10 ile yayımlanmaktadır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.


Şekil 4:. Bireysel Karaciğer Kolonileri Floresan Şiddetteki miktarının belirlenmesi solda Görüntüler temsilcisi makroskopik bulguları ve sağda görüntüler her klon floresan şiddetleri vardır. floresan şiddetleri bir 535 nm uyarma ve 580 nm emisyon ile radyant verimlilik olarak elde edildi. P1 ve P2: polymetastatic klonlar, O1 ve O2: oligometastatic klonlar. Izni 10 ile yayımlanmaktadır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5,
Şekil 5:. Koloniler Yetenek ve Büyüme Kinetiği Kantitatif Tahmini ( (B), tümörlerin makroskopik boyutu, karaciğer total tümör hacmi hesaplanmıştır (C), (D) Fc (tümör koloni oluşturan hücrelerin koloni kısmı), (E) Toplam hücre sayısı koloni başına, (F) (Td) süresi iki katına ve her klon hücre bölünmeleri (G) sayısı. P1 ve P2: polymetastatic klonlar, O1 ve O2: oligometastatic klonlar. Veri hata çubukları gösterildiği edildiği tüm şekil panelleri için ortalama ± standart sapma olarak temsil edildi. Izni 10 ile yayımlanmaktadır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 6,
Şekil 6: QuantificatiDiffüz Lüminesans Görüntüleme Tomografi (DLIT). (A) 3D havai görünümünü kullanarak bireysel Tümör Kolonileri Bioluminescence on. Ölçek çubuğu radyant verimlilik keyfi biriminde floresan yoğunluğunu temsil eder. (B) Koronal bölüm. (C) Sagittal bölüm. (D) transaksiyal bölümü. (E) karaciğerin makroskopik görüntüsü. Karaciğer (F) ex vivo flüoresan görüntüsü. Izni 10 ile yayımlanmaktadır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Geçerli raporunda sunulan hayvan modeli iki ana yaklaşım dayanmaktadır. İlk olarak, koloni ve karaciğerde çoğalan farklı eğilimleri metastatik klonlar gözlemleme yeteneği sağlamak için, yüksek ölçüde heterojen monoklonal hücre soylarının bir paneli yerine kurulmuş bir bölünmemiş kanser hücre hattı 12,13 daha kurulmuştur. Metastaz gelişmesine monoklonal yaklaşımı son genomik verileri 14 tarafından haklı ve başarılı metastatik süreç 10,15,16 modellemek için önceden kullanıldı. İkinci olarak, lusiferaz ve tdTomato belirteçleri ile ana hücre hattının çift etiketleme metastatik büyümeye in vivo ve ex vivo hem de gelişmiş analizi sağlamak için dahil edilmiştir. Işıklı ve floresan etiketleme detaylı anatomik inceleme ve karaciğer colonizatio sıklığı ya da etkinliği olarak kabul metastatik tümörlerin miktarı hem de potansiyel ölçümü (sağlarn) ve tek bir koloni boyutu. Ikinci kolayca aşama 2'de tarif edilen basit bir kalibrasyon prosedürü kullanılarak hücre gerçek bir sayıya dönüştürülür ve 2 ila 10 ve 4 Şekil 10 olabilir. Bu verileri kullanarak, karaciğerdeki her metastatik düğüm için Td tahmin etmek için enjekte Her bir başlangıç monoklondan (Şekil 5), 10 karaciğer metastazlarının büyüme kinetikleri değerlendirmek mümkündür.

Üç farklı kolorektal metastatik fenotiplere P1, P2 ve O1 / O2 olarak belirlenen bu deney sisteminde, gözlendi. Her metastatik klon için kolonizasyon ve yerel büyüme oranları sıklığı verileri karşılaştırırken bu metastatik fenotipleri farklıydı. İlk metastatik fenotip, P1, karaciğer içinde çok sayıda küçük metastatik tümörler tekabül eden, karaciğer, ancak, nispeten düşük bir yerel büyüme hızını kolonize gelişmiş bir yeteneğini gösterdi. İkinci metastatik fenotip, P2, vardıkolonizasyon daha düşük bir frekans ancak büyük ikincil tümörlerin nispeten az sayıda ile sonuçlanan önemli ölçüde daha yüksek lokal artış hızı. Son olarak, üçüncü metastatik fenotip, O1 ve O2, kolonizasyon ve yavaş yerel büyüme oranları düşük frekanslı hem de gösterdi. Bu üçüncü metastatik fenotipi klinik oligometastatic karaciğer hastalığı (Şekiller 3 ila 10, 5 10) bir temsili olarak kabul edilebilir. Buna ek olarak, gen ekspresyon analizi Bu klonlar ekspresyonu 10 belirlenen önemli farkları değerlendirmek. O1 ve O2 klonları ile P1 karşılaştırırken, örneğin, iltihabik tepkiler ve interferon sinyal yer alan genlerin bir alt kümesi de dahil olmak üzere 756 farklı şekilde eksprese edilen genler vardı. Bu çalışma, hem de diğerleri, tümör büyümesi ve hayatta kalma 21, 22 kilit rol oynarken bu genleri rol oynadığı ortaya çıkmıştır. O1 ve O2 ile P2 karşılaştırırken Buna ek olarak, farklı şekilde Expresse 461 vardıERK1 / 2 sinyali yoluyla aracılık hücresel büyüme ve çoğalmaya kritik rol oynayan genlerin kapsayan bir alt-grup D genleri.

Bu deneysel modelde üretilen metastatik fenotip çeşitlilik metastatik heterojen gözlenen klinik temsilleri ile tutarlıdır. Örneğin, karaciğer metastazlarının boyutu (büyüme potansiyeli ile ilgili bir parametre) ve sayıları (kolonizasyon yeteneği ile ilgili bir parametre) uzak metastaz 1 için bağımsız risk faktörleri olduğu gösterilmiştir. Geliştirilmiş büyüme potansiyeli veya kolonizasyon yeteneği ile, P1 ve P2 gözlenen özellikler, bu veriler ile tutarlıdır. Buna ek olarak, Stereotaktik Vücut Radyo-terapi (SBRT) veya cerrahi rezeksiyon akciğer metastazları ile tedavi edilen hastaların son gözlemler tümörlerin sayısı ve genel belirleyen en önemli faktörlerden ve hastalıksız sonuçlar 17,18 olarak ilerleme hızına hem etmektedir. Böylece, kolonizasyon ve büyüme yetenekleri görünüyoruzak bölgelerde 19,20 metastatik klonlarının gelişimini belirleyen en kritik faktörler arasında olacağım. metastatik klon bu özelliklere göre deneysel modelleri, metastaz gelişiminin mekanizmalarının anlaşılması için yararlı araçlar sağlar, hem de karaciğer metastatik hastalığın tedavisi için, yeni tedavi yöntemlerinin test etmek için bir vasıta sağlayabilir.

Spontan metastaz üretebilen ortotopik bir model doğru olsa da, kolay üretilebilir ve tutarlı bir kendiliğinden model bir yetersizlik devam etmektedir. Intracecal implantasyonunu ya da enjeksiyon kullanılarak modeller tarif edilmiş olmasına rağmen, bu alım ve metastaz oluşumu 23-26 değişken oranları gösterdi. Diğer yöntemler karaciğer metastazı oluşturmak için intrasplenik veya intraportal enjeksiyon yoluyla ektopik implantasyon yaklaşımı kullanmışlardır. Enjeksiyon genel teknik aynı iken, burada sunulan model, under duyarlı bir yaklaşım sağlarSirkülasyon Tümör Hücrelerinin (CTC) aşamasından başlayarak, metastaz gelişme mekanizmalarını zanmıştır. Hassasiyet ve yaklaşım tekrarlanabilirliği metastaz dinamikleri parça Bioluminescent ve flüoresan görüntüleme hem izin vermek için hücre çizgilerinin çift etiketleme ile belirlenir. Işıklı ve flüoresan verilerden metastatik yükü ölçmek için yeteneği nedeniyle, sistematik ölçümü ve zaman içinde metastaz büyüme kinetikleri takip etmek mümkündür. Böyle ultrason tabanlı görüntüleme gibi alternatif yaklaşımlar, kullanılmasına rağmen potansiyel olarak artan arası kullanıcı 27 değişkenliği ile bu yöntemler, çok daha kullanıcı bağlıdır. Buna ek olarak, monoklonal hücre soylarının bir paneli üreterek, daha iyi bir model için, klinik görülen metastatik hastalık değişkenliği tekrarlanabilir ve tat metastatik fenotiplere verebilmektedir.

Bu deneysel tekniği mastering ederken,Özellikle in vivo fare modeli (adım 4) için intrasplenik enjeksiyon, değişiklik gerektirebilir birkaç kritik adımlar vardır. dalak yetersiz enjeksiyonu kötü sonuçlar neden olabileceğinden notun, dalak enjeksiyon gerçekleştiren modelin en önemli kısmı vardır. mikroklip uygunsuz yerleştirilmesinin neden olduğu enjeksiyon veya sızıntı boyunca hücrelerin sızıntı, karaciğer metastazları ve / veya ekstra-karaciğer tümörleri veya periton carcinomatoses önemli bir miktarda daha az sayıda neden olabilir. Buna ek olarak, komşu dokulara hücreleri ve büyüme ekstravazasyona neden olabilir intrasplenik basıncında bir artış, önlemek için, en azından uzun protokolde tarif edildiği gibi üzere, yavaş yavaş, tümör hücreleri enjekte etmek için önemlidir dalak diseksiyon güdük etrafında ekstra karaciğer tümörleri.

Son olarak, adım 4.3, 1.2 dalak enjeksiyon (için verilen hücre aralığı var - 2 × 10 6 </ Sup> hücreler). Bu aralığın amacı bu tekniğin bireysel operatörler için hesap etmektir. Bu enjekte hücrelerin optimal sayıda kalibre etmek zaman alabilir. çok az sayıda hücre enjekte edilir ise, karaciğer metastazları sürekli olarak geliştirilmesi olmayabilir ve çok sayıda hücreleri enjekte edilir, portal ven oklüzyonu hayvan erken ölümüne yol oluşabilir. Optimal sayısını bulmak için bu modeli başlarken başlangıçta tümör hücrelerinin farklı konsantrasyonları denemek için ihtiyatlı olabilir.

Sunulan modelin bir çukur bağışıklık sistemi zayıf çıplak farelerin bir ksenograft yaklaşımına göre ve istismar olmasıdır. Önerilen bir alternatif metot murin kolorektal hücre hattı MC38 monoklonal türevleri benzer bir panelin nesil, lusiferaz ve tdTomato olan çift etiketli ya EGFP proteinleri. Bu klonlar, daha sonra ana immu gelişen karaciğer metastazlarının etkileşimlerini yakalamak için genetik olarak özdeş hayvan modellerinde kullanılabilirne sistemi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Biz Luc2-tdTomato plazmid ve HCT116 hücre hattı, yardım için Sayın Ani Solanki (Hayvan Kaynak Merkezi) fareler yönetimi için, ve Dr. Lara Leoni Dr. Geoffrey L. Greene (Chicago Üniversitesi) teşekkür etmek istiyorum DLIT ile. Floresan ve ışıldayan yoğunlukları sayımsal bir IVIS Spectrum Chicago Üniversitesi (Perkin Elmer, Hopkinton, MA) Entegre Küçük Hayvan Görüntüleme Araştırma Kaynak gerçekleştirilmiştir. Bu çalışma Kanser Araştırma Virginia ve DK Ludwig Fonu tarafından desteklenen, Akciğer Kanseri Araştırma Vakfı (LCRF), Prostat Kanseri Vakfı (PCF), ve Kanser Merkezi Destek Hibe (P30CA014599). fon çalışma dizaynı, veri toplama ve analizi, yayınlama kararı, ya da yazının hazırlanmasında hiçbir rolü vardı.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System Caliper Life Sciences 124262 In Vivo imaging system
LivingImage 4.0 Software Caliper Life Sciences 128165 Imaging software
VAD-MGX Research Anesthetic Machine Vetamac VAD-MGX Inhalation anesthesia machine
DMEM Gibco 11965-118 Cell culture reagents
DPBS Gibco 14190250 Cell culture reagents
Penicillin/Streptomycin, liquid (10,000 units penicillin;10,000 μg streptomycin) Invitrogen 15140163 Cell culture reagents
HBSS ThermoFisher 24020117 Cell culture reagents
Buprenex Injection (0.3 mg/mL) Reckitt Benckiser Healthcare Ltd. 12496-0757-5 Buprenorphine hydrochloride
Gemini Cautery System Braintree Scientific GEM 5917 Hand-held cautery for splenectomy
Micro Clip; Straight; 70 Grams Pressure; 1.5 mm Clip Width; 10 mm Jaw Length Roboz Surgical Instrument RS-5426 Hemoclip: Hemostasis instruments after spleen injection
D-luciferin, potassium salt Goldbio Technology LUCK-1G Luciferin potassium salt
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Gibco 31985062 Reduced Serum Medium
TC20 Automated Cell Counter BIO-RAD 1450102 Automatic cell counter
JMP10 software  SAS Institute Data analysis software
BD FACSAria II cell sorter BD Biocsiences Cell sorter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fong, Y., Fortner, J., Sun, R. L., Brennan, M. F., Blumgart, L. H. Clinical score for predicting recurrence after hepatic resection for metastatic colorectal cancer: analysis of 1001 consecutive cases. Ann. Surg. 230, (3), 309-318 (1999).
  2. Pawlik, T. M., et al. Effect of surgical margin status on survival and site of recurrence after hepatic resection for colorectal metastases. Ann. Surg. 241, (5), 715-722 (2005).
  3. Park, J. H., Watt, D. G., Roxburgh, C. S., Horgan, P. G., McMillan, D. C. Colorectal Cancer, Systemic Inflammation, and Outcome: Staging the Tumor and Staging the Host. Ann. Surg. 263, (2), 326-336 (2016).
  4. Veen, T., et al. Long-Term Follow-Up and Survivorship After Completing Systematic Surveillance in Stage I-III Colorectal Cancer: Who Is Still at Risk. J. Gastrointest. Cancer. 46, (3), 259-266 (2015).
  5. Siegel, R., et al. Cancer treatment and survivorship statistics. CA Cancer J. Clin. 62, (2), 220-241 (2012).
  6. O'Connell, J. B., Maggard, M. A., Ko, C. Y. Colon cancer survival rates with the new American Joint Committee on Cancer sixth edition staging. J. Natl. Cancer Inst. 96, (19), 1420-1425 (2004).
  7. House, M. G., et al. Survival after hepatic resection for metastatic colorectal cancer: trends in outcomes for 1,600 patients during two decades at a single institution. J. Am. Coll. Surg. 210, (5), 744-752 (2010).
  8. Smakman, N., Martens, A., Kranenburg, O., Borel Rinkes, I. H. Validation of bioluminescence imaging of colorectal liver metastases in the mouse. J. Surg. Res. 122, (2), 225-230 (2004).
  9. Rajendran, S., et al. Murine bioluminescent hepatic tumour model. J. Vis. Exp. (41), (2010).
  10. Oshima, G., et al. Imaging of tumor clones with differential liver colonization. Sci. Rep. 5, (10946), (2015).
  11. Liu, H., et al. Cancer stem cells from human breast tumors are involved in spontaneous metastases in orthotopic mouse models. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, (42), 18115-18120 (2010).
  12. Wang, X. M., et al. Integrative analyses identify osteopontin, LAMB3 and ITGB1 as critical pro-metastatic genes for lung cancer. PLoS One. 8, (2), e55714 (2013).
  13. Fidler, I. J., Kripke, M. L. Metastasis results from preexisting variant cells within a malignant tumor. Science. 197, (4306), 893-895 (1977).
  14. Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467, (7319), 1114-1117 (2010).
  15. Khodarev, N. N., et al. STAT1 pathway mediates amplification of metastatic potential and resistance to therapy. PLoS One. 4, (6), e5821 (2009).
  16. Langley, R. R., Fidler, I. J. Tumor cell-organ microenvironment interactions in the pathogenesis of cancer metastasis. Endocr. Rev. 28, (3), 297-321 (2007).
  17. Lussier, Y. A., et al. Oligo- and polymetastatic progression in lung metastasis(es) patients is associated with specific microRNAs. PLoS One. 7, (12), e50141 (2012).
  18. Lussier, Y. A., et al. MicroRNA expression characterizes oligometastasis(es). PLoS One. 6, (12), e28650 (2011).
  19. Calon, A., et al. Dependency of colorectal cancer on a TGF-beta-driven program in stromal cells for metastasis initiation. Cancer Cell. 22, (5), 571-584 (2012).
  20. Vanharanta, S., Massague, J. Origins of metastatic traits. Cancer Cell. 24, (4), 410-421 (2013).
  21. Khodarev, N. N., Roizman, B., Weichselbaum, R. R. Molecular pathways: Interferon/Stat1 Pathway: Role in the tumor resistance to genotoxic stress and aggressive growth. Clin. Cancer Res. 18, (11), 3015-3021 (2012).
  22. Li, C., et al. Interferon-stimulated gene 15 (ISG15) is a trigger for tumorigenesis and metastasis of hepatocellular carcinoma. Oncotarget. 5, (18), 8429-8441 (2014).
  23. Cespedes, M. V., et al. Orthotopic microinjection of human colon cancer cells in nude mice induces tumor foci in all clinically relevant metastatic sites. Am. J. Pathol. 170, (3), 1077-1085 (2007).
  24. Tseng, W., Leong, X., Engleman, E. Orthotopic mouse model of colorectal cancer. J. Vis. Exp. (10), (2007).
  25. Soares, K. C., et al. A preclinical murine model of hepatic metastases. J. Vis. Exp. (27), e51677 (2014).
  26. Evans, J. P., et al. From mice to men: Murine models of colorectal cancer for use in translational research. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 98, 94-105 (2016).
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Oshima, G., Stack, M. E., Wightman, S. C., Bryan, D., Poli, E., Xue, L., Skowron, K. B., Uppal, A., Pitroda, S. P., Huang, X., Posner, M. C., Hellman, S., Weichselbaum, R. R., Khodarev, N. N. Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones. J. Vis. Exp. (117), e54657, doi:10.3791/54657 (2016).More

Oshima, G., Stack, M. E., Wightman, S. C., Bryan, D., Poli, E., Xue, L., Skowron, K. B., Uppal, A., Pitroda, S. P., Huang, X., Posner, M. C., Hellman, S., Weichselbaum, R. R., Khodarev, N. N. Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones. J. Vis. Exp. (117), e54657, doi:10.3791/54657 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter