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Bioengineering

Fabricación y entrega de medicamentos Aplicaciones de seda nanopartículas

doi: 10.3791/54669 Published: October 8, 2016

Summary

Las nanopartículas están emergiendo sistemas de administración de fármacos como prometedores para una amplia gama de indicaciones. A continuación, describimos un método simple pero potente para la fabricación de nanopartículas de seda usando seda Bombyx mori ingeniería inversa. Estas nanopartículas de seda pueden ser cargados fácilmente con una carga útil terapéutica y posteriormente exploradas para aplicaciones de administración de fármacos.

Abstract

La seda es un biopolímero prometedor para aplicaciones biomédicas y farmacéuticas debido a su excelente propiedades mecánicas, la biocompatibilidad y biodegradabilidad, así como su capacidad para proteger y posteriormente liberar su carga útil en respuesta a un disparador. Mientras que la seda se puede formular en varios formatos de materiales, las nanopartículas de seda están emergiendo sistemas de administración de fármacos como prometedores. Por lo tanto, este artículo se refiere a los procedimientos de capullos de seda de ingeniería inversa, para dar una solución de seda regenerada que se puede utilizar para generar nanopartículas de seda estables. Estas nanopartículas se caracterizan posteriormente, el fármaco cargado y explorado como un sistema de administración de fármacos contra el cáncer potencial. En pocas palabras, los capullos de seda son técnicas de ingeniería inversa por primera vez por el desgomado los capullos, seguido por disolución de seda y limpiar, para producir una solución acuosa de seda. A continuación, la solución de seda regenerada se somete a nanoprecipitation para producir nanopartículas de seda - un método simple pero potenteque genera nanopartículas uniformes. Las nanopartículas de seda se caracterizan de acuerdo a su tamaño, el potencial zeta, la morfología y la estabilidad en medios acuosos, así como su capacidad para atrapar una carga útil quimioterapéutico y matar las células de cáncer de mama humanos. En general, la metodología descrita produce nanopartículas de seda uniformes que se pueden explorar fácilmente para una gran variedad de aplicaciones, incluyendo su uso como un nanomedicina potencial.

Introduction

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Los sistemas de administración de fármacos de tamaño nanométrico se utilizan a menudo para controlar la liberación del fármaco y para entregar un conjunto diverso de cargas útiles terapéuticos - por ejemplo, proteínas, péptidos y fármacos de bajo peso molecular - para apuntar las células y tejidos. Estas cargas útiles terapéuticos se incorporan a menudo en varios vehículos de fármacos macromoleculares, tales como liposomas, polímeros solubles en agua (incluyendo dendrímeros), y micro y nanopartículas 1. Las nanopartículas (típicamente en un intervalo de tamaño de 1 nm a 1.000 nm) están siendo ampliamente exploradas como posibles portadores de fármacos, en particular para la administración de fármacos contra el cáncer 2. La introducción exitosa de Abraxane (120 nanopartículas a base de albúmina de tamaño nm cargados con paclitaxel) en la práctica clínica habitual 3 ha catalizado el campo, por lo que muchas más nanopartículas para la administración de fármacos están entrando ahora en ensayos clínicos 4. Los tumores sólidos en general, muestran un mal drenaje linfático y tienen vasos sanguíneos que gotean que significa que nanoparticles de hasta 200 nm se pasivamente dirigidos a estos tumores después de la administración intravenosa. Este fenómeno de orientación pasiva se llama la permeabilidad mejorada y retención de efecto (EPR) y se informó por primera vez en 1986 5. El efecto EPR puede conducir a un aumento de 50 a 100 veces en las concentraciones de fármaco dentro del microambiente del tumor para una dosis de fármaco dada cuando la carga útil fármaco se administra utilizando un enfoque de soporte del fármaco macromolecular en lugar de el fármaco libre sin el portador. Nanopartículas cargadas con fármaco-diseñadas para la administración de fármacos contra el cáncer tienen que alcanzar el microambiente tumoral y, a menudo deben introducir un compartimiento intracelular específica, por lo general mediante la captación endocítica, para el fármaco para lograr su efecto terapéutico deseado 3. Las nanopartículas diseñadas para la administración de fármacos intracelular explotan endocitosis como puerta de entrada en la célula, así como una ruta para superar los mecanismos de resistencia a fármacos. La liberación del fármaco a partir de nanopartículas es a menudo diseñados específicamente para oCCur en los lisosomas (es decir, la administración de fármacos lysosomotropic) 6, donde la capacidad de respuesta del pH de la portadora de nanopartículas (lisosomal pH aproximadamente 4,5) puede servir como detonante de liberación de fármacos o enzimas lisosomales que liberan la carga útil del portador 7.

Muchas clases diferentes de materiales se pueden utilizar para generar las nanopartículas (por ejemplo, metales y muchos materiales orgánicos e inorgánicos). Sin embargo, los biopolímeros están surgiendo como materiales atractivos debido a su biocompatibilidad conocida, biodegradabilidad y baja toxicidad 8. Muchos biopolímeros están siendo explorados, incluyendo la albúmina, alginato, quitosano y seda. De éstos, la seda se ha convertido en un contendiente prometedor para el desarrollo en los sistemas de administración de fármacos 9. Las sedas de diversos tipos son producidos por un número de artrópodos, como arañas (por ejemplo, Nephila clavipes) y gusanos de seda (por ejemplo, Bombyx mori). la seda del gusano de seda se utiliza mucho más extenvamente que la seda de araña, porque el gusano de seda está totalmente domesticado y por lo tanto su seda representa un material de partida reproducible. la seda del gusano de seda es una Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) ha aprobado un plan para el uso humano, en particular como material de sutura; que tiene un historial de seguridad robusta en los seres humanos y se sabe que degradan in vivo 10. El perfil de degradación de la seda puede ser afinado en un rango de horas (de seda cristalina bajo) a 12 meses o más (seda muy cristalino). Productos de degradación de seda son no tóxicos y se metabolizan en el cuerpo 10. La estructura de seda imparte la capacidad de unirse compuestos de peso molecular pequeñas y fármacos de proteínas macromoleculares 11, por lo que es un buen material para liberación controlada de fármacos. Fármacos de proteínas (por ejemplo, anticuerpos) son susceptibles a la desnaturalización, agregación, escisión proteolítica y el aclaramiento por el sistema inmune. Sin embargo, la seda se estabiliza proteínas terapéuticas debido a la capacidad de amortiguación de su re nanocristalinaregiones y su capacidad de adaptar el contenido de agua en la nanoescala 11. Estas características únicas proporcionan protección física y reducen la movilidad de carga útil 11 y por lo general no se ven con otros (bio) polímeros. Muchos sistemas de suministro de fármacos contra el cáncer, por ejemplo hidrogeles basados en seda 12, películas 13-15 y nanopartículas 16,17, ahora se han desarrollado para aprovechar estas características (revisado en las referencias 18,19)

Aquí, las nanopartículas de seda se caracterizaron mediante la determinación de su tamaño y carga sobre un marco de tiempo prolongado. La doxorrubicina, un fármaco contra el cáncer clínicamente relevante, se utilizó como un fármaco modelo para estudios de carga de drogas y de citotoxicidad en células de cáncer de mama humano triple negativos tratados con nanopartículas de seda cargados con el fármaco.

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Protocol

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1. Preparación de una solución de ingeniería inversa de seda de Bombyx mori capullos

NOTA: Esta metodología se basa en protocolos descritos en otras partes 12,27.

  1. Cortar 5 g de capullos secos con unas tijeras en 5 mm x 5 mm pedazos. Retire cualquier capas sucias.
  2. Pesar 4,24 g de carbonato de sodio y añadir esta cuidadosamente para 2 l de agua destilada hirviendo.
    NOTA: Esto produce una solución de carbonato 0,02 M de sodio.
  3. Añadir los trozos de corte de capullo a la solución de carbonato de sodio hirviendo y se deja hervir durante 60 minutos para DEGUM las fibras de seda. Se agita la seda de vez en cuando para asegurarse de procesamiento de la muestra homogénea.
  4. Eliminar la seda desgomado y se lava con 1 L de agua destilada durante 20 min; repetir la etapa de lavado al menos 3 veces.
  5. Retire la seda lavada y apretarlo bien para eliminar el exceso de líquido y luego desatar / tire de la seda con la mano. Coloque la seda desatada en una campana de extracción de aire durante la noche seco. Esto normalmente produce 3,6 g de s desgomadofibras calaña.
  6. El día siguiente, pésese fibras de seda desgomado secadas al aire 5 g y el paquete de la seda firmemente en la parte inferior de un vaso de precipitados de 50 ml.
  7. Prepare una solución fresca 9,3 M de bromuro de litio. Disolver las fibras de seda en bromuro de litio usando una seda 1 ga relación de 4 ml de bromuro de litio. Cubrir la muestra LiBr seda con papel de aluminio para evitar la evaporación y permitir que la seda se disuelva completamente a 60 ° C. Este paso puede tardar hasta 4 horas y es ayudada por la agitación de vez en cuando.
  8. Humedecer un casete de diálisis (peso molecular de corte de 3.500 Da) en agua durante 5 minutos. Inyectar 15 ml de la solución de bromuro de litio de seda en el casete de diálisis 15 ml y el uso de una aguja y una jeringa para eliminar las burbujas de aire.
  9. Se dializa frente a 1 L de agua destilada y cambiar el agua a los 1, 3 y 6 horas (es decir, 3 cambios en el primer día) y de nuevo a la mañana siguiente y por la noche (es decir, 2 cambios en el segundo día), y de nuevo el a la mañana siguiente (es decir, 1 cambio en la tercera día).
  10. Recoge los soluti sedadesde el casete de diálisis y se centrifuga la solución durante 20 min a 5 ° C a 9500 x g. Recuperar el sobrenadante y repetir este proceso de centrifugación dos veces más.
  11. Determinar el peso de un recipiente pesado vacío (W1) y añadir 1 ml de la solución de seda. Anotar el peso de nuevo (W2) y luego secar la muestra dejando el recipiente de pesar a 60 ºC durante la noche. A continuación, determinar el peso total seco (W3) (seda seca y barco de pesada). La concentración de la solución de seda (w / v) es:% = (W3-W1 / W2-W1) x 100.

2. Preparación de nanopartículas de seda de seda de soluciones de ingeniería inversa

  1. Añadir un 5% (w / v) gota a gota solución de seda a la acetona, manteniendo a> 75% (v / v) de solución de acetona. Por ejemplo, añadir 9 ml de un 5% (w / v) gota a gota solución de seda (10 l / gota a un ritmo de 50 gotas / min) a 34 ml de acetona.
  2. Se centrifuga el precipitado a 48.000 xg durante 2 horas a 4 ° C.
  3. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en agua destilada por desalojar primero el sedimento con una espátula y después añadiendo 20 ml de agua destilada. Utilice puntas de pipeta para eliminar el sedimento de la espátula. Después de agitación durante 20 segundos, seguido de dos ciclos de sonicación usando una sonda ultrasónica a 30% de amplitud durante 30 segundos, hasta la parte superior del tubo de centrífuga de capacidad con agua destilada.
  4. Repetir la centrifugación y resuspensión paso al menos dos veces.
  5. Resuspender el precipitado en 6 ml de agua destilada, según se detalla en el apartado 2.3 y se almacena a 4 ° C hasta su uso. Para los estudios de cultivo de células, las poblaciones de nanopartículas de seda pueden ser irradiadas con radiación gamma 17.

3. Determinación de la concentración de nanopartículas de seda

  1. nanopartículas de seda centrifugar a 48.000 xg durante 2 horas a 4 ° C.
  2. Recoge todas las nanopartículas en 3 ml de agua destilada, seguido de dos ciclos de sonicación a 30% de amplitud durante 30 seg.
  3. Dividir la población de 3 ml de nanopartículas de seda en 2 ml y 1 ml lotes y transferir a pre-pesaba tubos de 2 ml. Anotar el peso total de la muestra de 2 ml. Almacenar el lote 1 ml a 4 ° C hasta su uso; esta muestra 1 ml se utiliza para generar una curva de calibración.
  4. Snap congelación y luego liofilizar la gran cantidad de nanopartículas de seda de 2 ml en un liofilizador durante la noche. Después de la liofilización, se vuelve a pesar el tubo de 2 ml y calcular la cantidad de nanopartículas de seda (mg) que fue originalmente presente en la muestra de 2 ml.
  5. Diluir 1 ml de la nanopartícula de seda stock con agua destilada para generar una curva de calibración de 5 puntos (0,04-7 mg / ml). Asegurarse de que las muestras no exceden del máximo de absorbancia.
  6. Determinar la absorbancia de cada dilución estándar a 600 nm. Esto se realiza mejor utilizando una configuración de placa de 96 pocillos. Parcela absorbancia frente a la concentración (mg / ml) para la curva estándar. A continuación, utilice esta curva estándar de rutina para determinar la concentración de las nanopartículas de seda en suspensiones.

4. Preparación de seda cargada con doxorrubicina nanopartículas

  1. Disolver 1,2 mg de HCl de doxorrubicina en 8 ml de agua destilada.
  2. Completar hasta 10 ml con agua destilada para obtener una solución de trabajo de 116 mg / ml (0,2 mmol / ml).
  • Preparación de seda cargada con doxorrubicina nanopartículas
    1. Mezclar 2 ml de solución de doxorrubicina 0,2 mol / ml con 200 l de 10, 30 o 50 mg / ml de las nanopartículas de seda en un tubo de 2 ml.
    2. Incubar la suspensión de seda-doxorrubicina a temperatura ambiente (25 ° C) durante la noche en un mezclador giratorio.
    3. A continuación, se centrifuga la suspensión de seda-doxorrubicina a 194.000 xg durante 30 min. Se lavan las nanopartículas de seda cargadas de doxorrubicina con agua destilada y repetir este procedimiento dos veces más.
    4. En común el sobrenadante y tenga en cuenta el volumen total (esta muestra se utiliza para determinar la eficacia de encapsulación).
    5. Volver a suspender las nanopartículas de seda cargadas de doxorrubicina en agua destilada, protegerlo de la luz y se almacena a 4 ° C ONUhasta su uso.
  • Determinación de la eficiencia de encapsulación y la carga de fármaco
    1. Pipetear 200 l del sobrenadante de la etapa 4.2.4 en una placa de microtitulación de color negro.
    2. Use un lector de microplacas de fluorescencia para medir la fluorescencia asociada a la doxorrubicina en un entorno fotomultiplicador fijo.
    3. Establecer la longitud de onda de excitación de longitud de onda a 485 nm y emisión a 590 nm y registrar los valores de fluorescencia.
    4. Generar una curva de calibración de la doxorrubicina. Mediciones garantizar se adquieren con la misma configuración del instrumento (es decir, con un ajuste fijo fotomultiplicador). Usando la curva de calibración, se calcula la concentración de doxorrubicina en el sobrenadante combinado. Repetir la medición en tres experimentos independientes.
    5. Utilizar la ecuación (1) para determinar la eficiencia de encapsulación:
      Ecuación 1
  • 5. Caracterización de seda Nanopartículas

    1. Evaluación del tamaño y el potencial zeta de recién preparado y almacenado seda nanopartículas.
      1. Las tiendas de seda nanopartículas en agua destilada a 4 ° C y 25 ° C.
      2. Medir el tamaño y el potencial zeta de las nanopartículas de seda en los días 0, 14 y 28 utilizando dispersión dinámica de luz (DLS). Establecer índices de refracción de 1,33 para el agua destilada y 1,60 para la proteína 17. Calcular los tamaños de partículas con el software de interfaz de usuario.
    2. Evaluación morfológica de seda nanopartículas mediante microscopía electrónica de barrido (SEM).
      1. Coloque un disco adhesivo de carbono sobre un trozo SEM y luego colocar una oblea de silicio.
      2. Diluir nanopartículas de seda a una concentración de 1 mg / ml. Pipetear 10 l de la muestra sobre una oblea de silicio, se congela la muestra a -80 ° C y liofiliza durante la noche utilizando un sistema de secado por congelación según las instrucciones del fabricante.
      3. Escudo de la muestra con una capa de oro de hasta 20 nm de espesorutilizando un aplicador de pulverización catódica bajo vacío.
        NOTA: La configuración del equipo varían según el modelo. El modelo utilizado aquí es totalmente automatizado y funciona mediante la única espesor.
      4. muestras de imagen con un microscopio electrónico de barrido a 5 kV y una ampliación de 40.000 veces.

    6. Citotoxicidad in vitro de Control y cargadas con doxorubicina seda nanopartículas

    1. La viabilidad celular tras la exposición a nanopartículas de seda.
      1. Cultura MDA-MB-231 células en RPMI 1640 con 10% v / v FBS. Células de la placa de cultivo de tejidos tratados de poliestireno y se incuban en un 5% humidificado atmósfera de CO 2 a 37 ° C. Rutinariamente subcultivo a 80% de confluencia cada 2-3 días.
      2. Placa de células MDA-MB-231 a una densidad de 2 x 10 4 células / cm 2 en placas de 96 pocillos. Dejar que las células se recuperaran durante la noche.
      3. Añadir (i) 0,001 a 1 mg de doxorrubicina libremente difusible, (ii) 0,001-0,5 nanopartículas de seda mg y 0,1 mg de nanopartículas de sedacargado con 0,001 a 1 mg de doxorrubicina en placas de 96 pocillos (volumen final de 100 l por pocillo).
      4. Determinar la viabilidad celular y la media máxima concentración inhibitoria (IC 50) mediante la adición de (3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio (MTT 5 mg / ml en PBS) a 72 hr. Incubar durante 5 horas, escurrir con cuidado los pocillos con una pipeta y disolver el formazano con 100 l de dimetilsulfóxido. Medir la absorbancia a 560 nm., repetir la medición en tres experimentos independientes.
        NOTA: Los valores de absorbancia de los controles no tratados sirven como valor de referencia para la viabilidad celular 100%.
    2. SEM de las células expuestas a nanopartículas de seda.
      1. Seed MDA-MB-231 células en cubreobjetos de vidrio estéril a una densidad de 2 x 10 4 células / cm 2. Dejar que las células se recuperaran durante la noche. Exponer las células a las condiciones de tratamiento deseadas para 72 hr.
      2. Fijar las células con 2% v / v de glutaraldehído en PBS durante 30 min, se lava con diagua calmado dos veces, se deshidratan con una serie de etanol, y el punto crítico secar las muestras, como se detalla en otro lugar 28.
      3. Pulverización catódica revestir las muestras con un oro capa hacia arriba a 20 nm de espesor utilizando un dispositivo de recubrimiento por pulverización catódica bajo vacío.
        NOTA: La configuración del equipo varían según el modelo. El modelo utilizado aquí es totalmente automatizado y funciona mediante la única espesor.
      4. Imagen por SEM de las muestras utilizando una aceleración de electrones de 5 kV y ampliación de 700 veces.

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    Representative Results

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    Los datos se analizaron estadísticamente como se detalla anteriormente 17. Se utilizó la prueba t de Student para pares de muestras y análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) seguido de comparaciones múltiples de Bonferroni test post hoc de múltiples muestras. El asterisco indica significación estadística de la siguiente manera: * P <0,05 y ** P <0,001. Todos los datos se presentan como valores medios ± desviación estándar (SD) y los números entre paréntesis indican el número de experimentos independientes.

    Solución de seda regenerada se preparó y se añadió posteriormente gota a gota a acetona para generar nanopartículas de seda a través de nanoprecipitation (Figura 1). Este método produjo uniforme (índice de polidispersidad: 0,1), esférica, las nanopartículas de seda (106,5 nm ± 1,1) con una carga superficial negativa (-49,57 mV ± 0,6) (figuras 2 y 3). nanopartícula seda stla capacidad en agua se evaluó durante un máximo de 28 días mediante el control de tamaño de partículas, el potencial zeta y la morfología (Figuras 2 y 3). Durante el período de almacenamiento de 28 días, ya sea en 4 ° C o 25 ° C, no se observó ningún cambio significativo en el tamaño de partícula, la carga (Figura 2) o en la morfología (Figura 3).

    La doxorrubicina se usó como un fármaco quimioterapéutico modelo clínicamente relevante para la carga de fármaco y en estudios de citotoxicidad in vitro. Se usaron tres concentraciones de nanopartículas de seda diferentes (10, 30 y 50 mg / ml) para evaluar la capacidad de carga de fármaco de las nanopartículas de seda. La eficiencia de doxorrubicina encapsulado para 10, 30 y 50 mg / nanopartículas de seda ml (es decir, 2, 6 o 10 mg de la seda y 232 g de doxorrubicina) era 73 ± 2,2, 87 ± 1,8 y 97 ± 0,2%, respectivamente (Figura 4A ). El tamaño de partícula y el potencial zeta de la doxorrubicina-lonanopartículas de seda ADED (10 mg) se midieron y se compararon con controles de nanopartículas de seda 10 mg. El tamaño de partícula no cambió después de la carga de fármaco (figura 4B), mientras que el potencial zeta de las nanopartículas de seda cargadas de doxorrubicina se redujo significativamente de 49,57 ± 0,6 mV a 43,52 ± 0,37 mV (Figura 4C).

    La capacidad de las nanopartículas cargadas con fármacos de seda para entregar doxorrubicina y posteriormente eliminar las células cancerosas se evaluó in vitro. cáncer de mama humano células MDA-MB-231 fueron expuestas a nanopartículas de seda, doxorrubicina libremente difusible o nanopartículas de seda cargadas de doxorrubicina. La viabilidad celular se evaluó después de un período de exposición de 72 hr. Los valores de IC50 de la doxorrubicina libremente difusible y nanopartículas de seda cargadas de doxorrubicina fueron 0,48 g / ml y 0,24 g / ml, respectivamente, mientras que las nanopartículas de seda tenían un IC 50> 5 mg / ml (Figura 5A).A dosis de drogas equivalentes de 0,1 g, doxorrubicina libremente difusible y nanopartículas de seda cargadas de doxorrubicina causaron disminuciones significativas en la viabilidad celular de 83 ± 11 y 65 ± 11%, respectivamente (Figura 5B). Sin embargo, la doxorrubicina libremente difusible mostró una citotoxicidad mayor sustancial de nanopartículas de seda cargadas de doxorrubicina. Estas mediciones cuantitativas fueron corroborados por imágenes SEM cualitativa (Figura 5c). A continuación, los cultivos de control mostraron una alta densidad celular y una mesenquimales predominando MDA-MB-231 fenotipo; Similares observaciones fueron hechas para los cultivos expuestos a nanopartículas de seda. Sin embargo, los cultivos expuestos a la doxorrubicina mostraron un fenotipo celular marcadamente diferentes. A la dosis de doxorrubicina equivalente, MDA-MB-231 células tratadas con doxorrubicina libremente difusible y nanopartículas de seda cargadas de doxorrubicina mostraron una reducción sustancial en el número de células. Además, muchas células tenían una muy amplia y se extienden morfología. culturas exposed a nanopartículas de seda cargadas de doxorrubicina mostraron evidencia de nanopartículas (y sus agregados) asociados con la membrana plasmática (Figura 5C).

    Figura 1
    Figura 1: Los pasos clave para generar una solución de seda ingeniería inversa y nanopartículas de seda En primer lugar, los capullos de seda son técnicas de ingeniería inversa mediante el corte y luego desgomado ellos durante 60 minutos (es decir, hirviendo) para producir fibras de seda desgomado.. Las fibras se disuelven en 9,3 M LiBr y luego se dializaron frente a agua durante 72 hr. Un acuoso al 5% w / v solución de seda se utiliza para generar las nanopartículas de seda. La adición gota a gota de seda en acetona conduce a nanoprecipitation seda. Nanopartículas de seda se lavan y se recogen para su posterior uso. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de estafigura.

    Figura 2
    Figura 2:. Tamaño y caracterización de nanopartículas de carga de seda tamaño de partícula y potencial zeta de las nanopartículas de seda a 4 ° C y 25 ° C durante 28 días. ± SD; barras de error se ocultan dentro del símbolo de ploteo cuando no es visible, n = 3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    figura 3
    Figura 3:. Evaluación de la calidad de las nanopartículas de seda almacenadas a 4 ° C y 25 ° C más de 28 días nanopartículas de seda fueron imágenes mediante microscopía electrónica de barrido (barra de escala = 1 m). Please clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    Figura 4
    Figura 4: Caracterización de nanopartículas de seda cargadas de doxorrubicina (Dox-SNPs) (A) Encapsulación eficiencia de 232 mg de doxorrubicina en respuesta a diferentes cantidades de nanopartículas de seda (SNP);. 2, 6 y 10 mg de nanopartículas de seda. La eficiencia de encapsulación para 10 mg y nanopartículas de seda 5 mg aumentó significativamente en comparación con las nanopartículas de seda 2 mg. (B) Tamaño de partícula y (C) potencial zeta de las nanopartículas de seda cargadas de doxorrubicina en comparación con el control de las nanopartículas de seda (10 mg de nanopartículas de seda). Estadísticamente se determinaron diferencias significativas para los pares de muestras con la prueba t de Student. Múltiples muestras se evaluaron mediante ANOVA de una vía, seguido de la prueba de comparación múltiple post hoc de Bonferroni; *PAG &#60; 0,05, ** P <0,001, ± SD; barras de error se ocultan dentro del símbolo de trama cuando no es visible, n = 3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    Figura 5
    Figura 5: En la citotoxicidad in vitro de nanopartículas de seda y nanopartículas de seda cargadas de doxorrubicina en células de cáncer de mama humano (A) La viabilidad celular de las células MDA-MB-231 después de un ciclo de tratamiento de 72 h con nanopartículas de seda (SNP) (0,01-5 mg. / ml); volúmenes por pocillo fueron 100 l. (B) La viabilidad celular de las células MDA-MB-231 después de un ciclo de tratamiento de 72 h con nanopartículas de seda 0,1 mg, 0,1 mg de doxorrubicina libremente difusible (Dox) o 0,1 mg de nanopartículas de seda cargado con 0,1 g de doxorubicina (Dox-SPN). La viabilidad celular se redujo estadísticamente después de la exposición a 0,1 g de doxorrubicina libremente difusible y 0,1 mg de nanopartículas de seda cargados con 0,1 g de doxorrubicina en comparación con el control. Imágenes (C) de SEM de células MDA-MB-231 expuestas a (i) medio (control), (ii) nanopartículas 0,1 mg de seda, (iii) 0,1 g de doxorrubicina libremente difusible, y (IV) nanopartículas de seda cargadas de doxorrubicina en dosis equivalentes (barra de escala = 50 micras). El análisis estadístico se realizó mediante ANOVA de un factor seguido por el test de post hoc de comparación múltiple de Bonferroni, ns = no significativo, * p <0,05, ** P <0,001, ± SD; barras de error se ocultan dentro del símbolo de trama cuando no es visible, n = 3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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    Discussion

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    Están disponibles diversos métodos para producir nanopartículas de seda, incluyendo el alcohol de polivinilo combinando 20, secando por pulverización 21, 22 desalado, micropuntos capilar de impresión 23, CO2 supercrítico precipitación 24 y nanoprecipitation 16,25 (revisado en la referencia 26). Sin embargo, nanoprecipitation, debido a su simplicidad general, es la técnica más popular para la generación de nanopartículas de seda. Por lo tanto, el propósito de este estudio fue aplicar a la seda nanoprecipitation ingeniería inversa para la fabricación de nanopartículas a base de seda que se pueden utilizar para una variedad de aplicaciones, incluyendo la administración de fármacos contra el cáncer lysosomotropic.

    Durante la última década, nanoprecipitation ha convertido en uno de los procedimientos más comunes para la fabricación de nanopartículas a base de proteínas 29. Nuestro grupo de investigación y otros 16,17 25,26,30,31 han aplicado con éxito esta tecnologíagía a la seda; A continuación, presentamos un sencillo pero robusto protocolo paso a paso para la generación de nanopartículas de seda. nanoprecipitation acetona produce partículas esféricas de seda que son homogéneos en tamaño y caen típicamente en el rango de tamaño nanométrico. La acetona se ha convertido en la fase continua preferido sobre disolventes tales como metanol, etanol, isopropanol y butanol 16,25. La acetona produce nanopartículas que tienen un nivel reducido de hidratación en comparación con el metaestable 100-200 nm de tamaño estructuras micelares esféricas presentes en soluciones de seda nativas y regeneradas 32. Sin embargo, existe la posibilidad de explorar mezclas de disolventes y variaciones en el tiempo de desgomado con el fin de generar partículas de seda (nano) con potencialmente propiedades diferentes a las descritas aquí. El protocolo descrito aquí utiliza acetona como la fase continua, que permite la fabricación de partículas uniformes esféricas de tamaño nano de seda (106,5 ± 1,1 nm) que llevan una carga superficial negativa (-49,5777; 0,6 mV) y que tienen un relleno ajustado de las cadenas, de seda cristalino hidrófobos 16,17. En general, el procedimiento descrito requiere poca práctica en el tiempo y produce nanopartículas de seda a partir de una solución acuosa de seda de ingeniería inversa (Figura 1). Algunas de las características clave de este procedimiento incluyen el uso de 60 minutos seda desgomado, el tamaño de gota adecuado (aproximadamente 10 l / gota) y una velocidad de goteo máximo de 50 gotas / min. El cumplimiento de estas características clave da como resultado un rendimiento típico de 14%. Estas nanopartículas son robustos y proporcionan evidencia de que son estables y no cambian sus características físicas durante un período de almacenamiento de 28 días. Sin embargo, una advertencia potencial del método descrito es la ausencia de generar partículas de más de un intervalo de tamaño amplio (es decir, la generación de partículas desde el nanómetro a micrómetro escala manteniendo al mismo tiempo un índice de polidispersidad estrecha).

    El control de tamaño de partícula, la carga y la forma es importante para la administración de fármacos, particularmente cuando la orientación de los tumores sólidos 33. Las partículas en el rango de tamaño de 100 nm están emergiendo como los candidatos ideales para la orientación del tumor. Por lo tanto, las nanopartículas de seda 100 nm de tamaño son candidatos potenciales como los sistemas de administración de fármacos contra el cáncer para tratamientos de tumores sólidos. Nanopartículas de seda tienen una carga superficial negativa, lo que los hace fácilmente cargados de fármacos cargados positivamente a través de la explotación de la interacción electrostática 16. Sin embargo, además de la carga, también se conocen las características de drogas adicionales (por ejemplo, logD) para afectar a la carga de fármaco y la liberación 34. En el presente estudio, la doxorrubicina, un fármaco contra el cáncer débilmente básica, fue seleccionado como candidato fármaco modelo. El estudio carga de fármaco (Figura 4) demostró que el aumento de la concentración de nanopartículas de seda provocado un aumento de la eficiencia de encapsulación de doxorrubicina; 10 mg de nanopartículas de seda pueden encapsular 232 g de doxorrubicina. La carga de fármacos de la seda nanoparticles, a su vez, dio lugar a nanopartículas de seda con una carga superficial reducido significativamente, lo que era evidencia experimental directa de confirmar que la interacción de carga de doxorrubicina-seda es importante para esta combinación vehículo de fármaco particular.

    Hemos proporcionado anteriormente pruebas de que las nanopartículas de seda pueden servir como un sistema de administración de fármacos 16,17 lysosomotropic. Aquí, se muestra una prueba de uso de nanopartículas de seda cargadas de doxorrubicina para el tratamiento de la línea celular MDA-MB-231 de cáncer de mama humano. Estas células se derivan de un cáncer de mama triple negativo altamente invasiva (ER - / PR - / HER2 -) que es difícil de tratar en la clínica 35. Por lo tanto, el diseño de un sistema de suministro de fármaco adaptado a esta población de pacientes se espera para producir enormes beneficios. En ausencia de la carga de fármaco, las nanopartículas de seda no afectaron la viabilidad celular (IC 50 valores> 5 mg / ml) (Figura 5a, c). Sin embargo, en equidosis valentes, significativamente mayor citotoxicidad se observó con doxorrubicina libremente difusible que con las nanopartículas de seda cargadas de doxorrubicina (Figura 5b). Las diferencias entre la farmacocinética celulares in vitro de fármaco unido libremente difusible y partículas explicar esta observación. El fármaco libremente difusible puede atravesar rápidamente la membrana plasmática a través de la difusión, mientras que la captación de las nanopartículas cargadas con fármaco se basa en la endocitosis. No obstante, la captación endocítica de las nanopartículas puede mejorar la retención del fármaco y superar los mecanismos de resistencia a los medicamentos 3. Sin embargo, el verdadero beneficio de la administración de fármacos contra el cáncer de nanopartículas mediada es que explota el efecto EPR para facilitar la orientación tumor pasiva y para mejorar la farmacocinética. Por lo tanto, el uso de un enfoque de administración de fármacos basada en nanopartículas sólo puede evaluarse completamente in vivo. Los estudios in vitro tienen limitaciones (es decir, la ausencia del efecto EPR) que impide la plena characterization de estos tipos de sistemas de administración de fármacos 7.

    En resumen, la metodología descrita permite la fabricación fácil de nanopartículas de seda esféricas de tamaño uniforme y carga superficial. Estas nanopartículas de seda se pueden utilizar para una amplia gama de aplicaciones (por ejemplo, los cosméticos, las plantillas para modelar nano, teranósticos, lubricantes, partículas de control para los estudios nanotoxicidad), incluyendo su uso como plataformas de administración de fármacos contra el cáncer.

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Acetone VWR International, Radnor, PA, USA 20066.33
    Automated Critical Point Dryer Leica Microsystems, Wetzlar, Germany EM CPD300
    Balancing Mettler Toledo, Greifensee, Switzerland NewClassic MS
    Black polystyrene microplate, 96 well Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA 3991
    Capillary cell (DTS 1070) Malvern Instrument, Worcestershire, UK DTS107
    Carbon adhesive disc Agar Scientific, Essex, UK G3347N
    Centrifuge  Hermle Labortechnik, Wehingen, Germany Z323K
    Centrifuge  Beckman Coulter, Brea, CA, USA Avanti J-E, Rotor: J20
    Centrifuge  Beckman Coulter, Brea, CA, USA Optima L-70K, Rotor: 50.2 Ti, Adaptor 303392
    Coater, low vacuum Leica Microsystems, Wetzlar, Germany EM ACE200
    Cuvettes, polystyrene, disposable Fisher Scientific, Waltham, MA, USA FB55147
    Doxorubixin  LC Laboratories, Boston, MA, USA D4000
    Electronic pipetting, Easypet  Eppendorf, Hamburg, Germany N/A
    FE-SEM Hitachi High-Technologies, Krefeld, Germany SU6600
    Fetal Bovine Serum Thermo Scientific, Waltham, MA, USA 16000-044
    Freeze dryer Martin Christ, Osterode, Germany Epsilon 2-4
    Heat inactivated Bombyx mori silk cocoons Tajima Shoji, Kanagawa, Japan N/A
    Hotplate with Stirrer Bibby Scientific, Stanffordshire, UK US 152
    Incubator Memmert, Schwabach, Germany INB 200
    Insulin, human recombinant, zinc solution Thermo Scientific, Waltham, MA, USA 12585-014
    Lithium bromide Acros Organics, Geel, Belgium AC199870025
    MDA-MB-231 ATCC, Manassas, VA, U.S.A N/A
    Micropipette and tips Eppendorf, Hamburg, Germany N/A
    Microplate Reader Molecular devices, Sunnyvale, CA, USA SpectraMax M5
    Oak Ridge High-Speed Centrifuge Tubes, 50 ml Thermo Scientific, Waltham, MA, USA N/A
    Open-Top Thickwall Polycarbonate tube, 4 ml Beckman Coulter, Brea, CA, USA 355645
    Penicilin/streptomycin  Thermo Scientific, Waltham, MA, USA 15140-122
    RPMI medium Thermo Scientific, Waltham, MA, USA 11875-093
    Serological pipettes, 5 ml Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA
    Silicon wafers Agar Scientific, Essex, UK G3391
    Slide-A-Lyzer Dialysis cassettes, 3.5K MWCO, 15 ml Thermo Scientific, Waltham, MA, USA 87724
    Sodium carbonate anhydrous Fisher Scientific, Waltham, MA, USA S/2840/62
    Specimen stubs for SEM Agar Scientific, Essex, UK G301
    Ultrasonic homogenizer Bandelin, Berlin, Germany Sonoplus HD 2070
    UV transparent microplate, 96 well Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA 3635
    Vortex IKA, Staufen, Germany Genius 3
    Zetasizer Malvern Instrument, Worcestershire, UK Nano ZS
    Zetasizer Software version 7.11 DLS software
    Micro Modulyo  Thermo Fisher 230 Freeze drying system 

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    References

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    Fabricación y entrega de medicamentos Aplicaciones de seda nanopartículas
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    Wongpinyochit, T., Johnston, B. F., Seib, F. P. Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles. J. Vis. Exp. (116), e54669, doi:10.3791/54669 (2016).More

    Wongpinyochit, T., Johnston, B. F., Seib, F. P. Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles. J. Vis. Exp. (116), e54669, doi:10.3791/54669 (2016).

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