Summary
Nanopartikler dukker op som lovende drug delivery systemer til en bred vifte af indikationer. Her beskriver vi en simpel endnu kraftfulde metode til at fremstille silke nanopartikler anvendelse af omvendt manipuleret Bombyx mori silke. Disse silke nanopartikler kan let fyldes med en terapeutisk nyttelast og efterfølgende undersøgt for lægemiddeltilførselsanvendelser.
Abstract
Silke er en lovende biopolymer til biomedicinske og farmaceutiske anvendelser på grund af dets enestående mekaniske egenskaber, biokompatibilitet og bionedbrydelighed, samt dets evne til at beskytte og efterfølgende frigive sit nyttelast som svar på en udløser. Mens silke kan formuleres i forskellige materialer formater, er silke nanopartikler fremstår som lovende lægemiddeltilførselssystemer. Derfor er denne artikel dækker procedurerne for reverse engineering silke kokoner at give en regenereret silke løsning, der kan bruges til at generere en stabil silke nanopartikler. Disse nanopartikler efterfølgende karakteriseret, lægemiddel fyldte og udforsket som en potentiel anticancer lægemiddelafgivelsessystem. Kort fortalt silkekokoner revers manipuleret først ved degumming kokoner fulgt af opløsning silke og rydde op, hvilket gav en vandig silke opløsning. Dernæst den regenererede silke opløsning underkastes nanoprecipitation til opnåelse silke nanopartikler - en simpel men kraftfuld metodeder genererer ensartede nanopartikler. Silke nanopartikler karakteriseres efter deres størrelse, zetapotentialet, morfologi og stabilitet i vandige medier, samt deres evne til at indeslutte et kemoterapeutisk nyttelast og dræbe humane brystcancerceller. Samlet set den beskrevne metode giver ensartede silke nanopartikler, der let kan udforskes til et utal af applikationer, herunder deres anvendelse som en potentiel nanomedicin.
Introduction
Nanostørrelse lægemiddeladministrationssystemer anvendes ofte til at styre lægemiddelfrigivelse og levere et bredt sæt af nyttevirkning - for eksempel proteiner, peptider og lille molekylvægt lægemidler - at målrette celler og væv. Disse terapeutiske nyttelast er ofte medtaget i forskellige makromolekylære lægemiddelbærere såsom liposomer, vandopløselige polymerer (herunder dendrimerer) og mikro- og nanopartikler 1. Nanopartikler (typisk i en størrelsesorden på 1 nm til 1000 nm) bliver meget undersøgt som potentielle lægemiddelbærere, især for anticancer drug delivery 2. Den vellykkede indførelse af Abraxane (120 nm størrelse albumin-nanopartikler fyldt med paclitaxel) i almindelig klinisk praksis 3 har katalyseret marken, så mange flere nanopartikler til lægemiddeladministration går nu ind kliniske forsøg 4. Solide tumorer viser generelt dårlig lymfedrænage og har utætte blodkar, som betyder, at nanoparticles på op til 200 nm, vil blive passivt rettet mod disse tumorer efter intravenøs administration. Denne passive targeting fænomen kaldes den forbedrede permeabilitet og retention (EPR) virkning og blev først rapporteret i 1986 5. EPR effekt kan føre til en 50- til 100-fold stigning i medikamentkoncentrationer i tumormikromiljøet for en given dosis lægemiddel, når lægemidlet nyttelast afgives ved anvendelse af en makromolekylær lægemiddel carrier tilgang frem for den frie lægemiddel uden bæreren. Drug nanopartikler designet til anticancer drug delivery skal nå tumormikromiljøet og ofte skal indtaste en bestemt intracellulært, sædvanligvis ved endocytisk optagelse, for lægemidlet for at opnå den ønskede terapeutiske virkning 3. Nanopartikler er konstrueret til intracellulær lægemiddelafgivelse udnytte endocytose som en gateway i cellen samt en rute til at overvinde drug resistensmekanismer. Lægemiddelfrigivelse fra nanopartikler ofte specielt designet til at occur i lysosomer (dvs. lysosomotropiske drug delivery) 6, hvor pH reaktionsevne nanopartikel luftfartsselskab (lysosomal pH ca. 4,5) kan tjene som udløser for narkotika release eller lysosomale enzymer, som frigør nyttelasten fra bæreren 7.
Mange forskellige klasser af materialer kan anvendes til at generere nanopartikler (f.eks, metaller og mange organiske og uorganiske materialer). Imidlertid er biopolymerer fremstår som attraktive materialer på grund af deres kendte biokompatibilitet, bionedbrydelighed og lav toksicitet 8. Mange biopolymerer bliver undersøgt, herunder albumin, alginat, chitosan og silke. Heraf har silke dukket op som en lovende udfordrer til udvikling i drug delivery-systemer 9. Silke af forskellige typer produceres af en række leddyr, herunder edderkopper (f.eks Nephila clavipes) og silkeorme (f.eks Bombyx mori). Avlen silke bruges langt mere EXTENkende end edderkop silke fordi avlen er helt tamme og silke repræsenterer således en reproducerbar udgangsmateriale. Avlen silke er en Food and Drug Administration (FDA) godkendt materiale til humant brug, især som suturmateriale; det har en robust sikkerhed rekord i mennesker, og er kendt for at nedbryde in vivo 10. Nedbrydningen profil silke kan finjusteres til at variere fra time (lav krystallinsk silke) til 12 måneder eller mere (høj krystallinsk silke). Silke nedbrydningsprodukter er ugiftige og metaboliseres i legemet 10. Den silke struktur bibringer evnen til at binde små molekylvægt forbindelser og makromolekylære protein narkotika 11, hvilket gør det et godt materiale til kontrolleret frigivelse af lægemiddel. Proteinlægemidler (f.eks antistoffer) er modtagelige for denaturering, aggregering, proteolytisk spaltning og clearance af immunsystemet. Imidlertid silke stabiliserer terapeutiske proteiner grundet bufferkapacitet dens nanokrystallinske reregioner og dens evne til at skræddersy vandindhold på nanoskala 11. Disse unikke funktioner giver fysisk beskyttelse og reducerer nyttelasten mobilitet 11 og er typisk ikke set med andre (bio) polymerer. Mange anticancer lægemiddelafgivelsessystemer, f.eks silke-baserede hydrogeler 12, film 13-15 og nanopartikler 16,17, er nu blevet udviklet til at udnytte disse funktioner (revideret i referencer 18,19)
Her blev silke nanopartikler karakteriseret ved at bestemme deres størrelse og ladning over et forlænget tidsrum. Doxorubicin, en klinisk relevant anticancer narkotika, blev brugt som model lægemiddel til lægemiddel lastning og cytotoksicitet studier i tredobbelt negative humane brystkræftceller behandlet med narkotika-loaded silke nanopartikler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Udarbejdelse af en Reverse-manipuleret Silk Solution fra Bombyx mori Kokoner
BEMÆRK: Denne metode er baseret på protokoller beskrevet andetsteds 12,27.
- Skær 5 g tørrede kokoner med en saks i 5 mm x 5 mm stykker. Fjern eventuelle snavsede lag.
- Afvej 4,24 g natriumcarbonat og tilføje denne omhyggeligt til 2 l kogende destilleret vand.
BEMÆRK: Dette giver en 0,02 M natriumcarbonatopløsning. - Tilsæt cut kokon brikkerne til det kogende natriumcarbonatopløsning og koges i 60 min til degum silkefibrene. Omrør silke lejlighedsvis at sikre homogen prøve behandling.
- Fjern degummerede silke og vask med 1 I destilleret vand i 20 minutter; gentage vasketrinet mindst 3 gange.
- Fjern den vaskede silke og presse det godt for at fjerne overskydende væske og derefter løsne / træk silke i hånden. Placer ubunden silke i et stinkskab at lufttørre natten over. Dette giver typisk 3,6 g degummerede sILK fibre.
- Den næste dag, afvejes 5 g lufttørret degummerede silkefibre og pakke silke stramt ind i bunden af et 50 ml bægerglas.
- Forbered en frisk 9,3 M LiBr løsning. Opløs silkefibrene i LiBr anvendelse af en 1 g silke til 4 ml LiBr ratio. Dæk silke LiBr prøven med aluminiumfolie for at forhindre fordampning og tillade silke opløses fuldstændigt ved 60 ° C. Dette trin tager op til 4 timer og er hjulpet af lejlighedsvis omrøring.
- Våd en dialyse kassette (molekylvægt cut-off på 3.500 Da) i vand i 5 minutter. Injicer 15 ml silke LiBr opløsningen i 15 ml dialyse kassette og bruge en nål og sprøjte for at fjerne eventuelle luftbobler.
- Dialyse mod 1 liter destilleret vand og skifte vand på 1, 3 og 6 timer (dvs. 3 ændringer på den første dag) og igen på den næste morgen og aften (dvs. 2 ændringer på den anden dag), og igen på den følgende morgen (dvs. 1 ændres på den tredje dag).
- Saml silke solutipå fra dialyse kassette og centrifugeres opløsningen i 20 minutter ved 5 ° C ved 9.500 x g. Gendan supernatanten og gentage denne centrifugering proces to gange mere.
- Bestemme vægten af en tom vejebåd (W1) og tilsæt 1 ml af silke opløsning. Noterer vægten igen (W2) og derefter tørre prøven ved at forlade vejebåd ved 60 ºC natten over. Dernæst bestemme den samlede tørvægt (W3) (tørret silke og vejer båd). Koncentrationen af silke opløsning (vægt / volumen) er:% = (W3-W1 / W2-W1) x 100.
2. Udarbejdelse af Silk Nanopartikler fra Reverse-manipuleret Silk Solution
- Tilføj en 5% (vægt / volumen) silke opløsning dråbevis til acetone og samtidig opretholde en> 75% (v / v) acetone-opløsning. Tilføj f.eks 9 ml af en 5% (vægt / volumen) silke opløsning dråbevis (10 pl / drop med en hastighed på 50 dråber / min) til 34 ml acetone.
- Centrifugeres bundfaldet ved 48.000 xg i 2 timer ved 4 ° C.
- Aspirere supernatanten og resuspender pellet i destilleret vand ved først at løsne pelleten med en spatel og derefter tilsætte 20 ml destilleret vand. Brug pipettespidser til at fjerne pelleten fra spatlen. Efter vortex i 20 sekunder efterfulgt af to lydbehandling cykler ved hjælp af en ultralydsonde med 30% amplitude i 30 sek, top op centrifugerøret til kapaciteten med destilleret vand.
- Der centrifugeres og resuspension trin mindst to gange.
- Pellet resuspenderes i 6 ml destilleret vand, som beskrevet i 2.3 og opbevares ved 4 ° C indtil anvendelse. For cellekultur studier, kan silke nanopartikler lagre være gamma bestrålet 17.
3. Bestemmelse af Silk Nanopartikel Koncentration
- Centrifugér silke nanopartikler ved 48.000 xg i 2 timer ved 4 ° C.
- Saml alle nanopartikler i 3 ml destilleret vand, efterfulgt af to lydbehandling cyklusser ved 30% amplitude i 30 sek.
- Fordel 3 ml lager af silke nanopartikler i 2 ml og 1 ml partier og overførsel til PRe-vejet 2 ml rør. Registrere den samlede vægt af 2 ml prøve. Opbevar 1 ml parti ved 4 ° C indtil anvendelse; denne 1 ml prøve vil blive anvendt til at generere en kalibreringskurve.
- Snap fryse og derefter lyofilisere 2 ml silke nanopartikel meget i en frysetørrer natten over. Efter frysetørring, derefter vejes 2 ml rør og beregne mængden af silke nanopartikler (mg), der oprindeligt var til stede i 2 ml prøve.
- Fortynd 1 ml silke nanopartikel lager med destilleret vand for at generere en 5-punkts kalibreringskurve (0,04-7 mg / ml). Sørg for, at prøver ikke overstiger den maksimale absorbans.
- Absorbans bestemmes hver standard fortynding ved 600 nm. Dette gøres bedst med en 96-brønds plade setup. Plot absorbans versus koncentration (mg / ml) i standardkurven. Så brug denne standardkurve rutinemæssigt at bestemme koncentrationen af silke nanopartikler i suspensioner.
4. Fremstilling af doxorubicin-belastet Silk Nanopartikler
- Opløs 1,2 mg doxorubicin HCI i 8 ml destilleret vand.
- Der fyldes op til 10 ml med destilleret vand til opnåelse af en arbejdslager på 116 ug / ml (0,2 pmol / ml).
- Bland 2 ml 0,2 pmol / ml doxorubicin-opløsning med 200 pi 10, 30 eller 50 mg / ml silke nanopartikler i et 2 ml rør.
- Inkubér silke-doxorubicin suspensionen ved stuetemperatur (25 ° C) natten over på en roterende blander.
- Dernæst centrifugeres silke-doxorubicin suspension ved 194.000 xg i 30 min. de doxorubicin-loaded silke nanopartikler Vask med destilleret vand og gentage denne procedure to gange mere.
- Pool supernatanten og notere det totale volumen (denne prøve anvendes til at bestemme indkapslingseffektiviteten).
- Resuspender de doxorubicin-loaded silke nanopartikler i destilleret vand, beskytte mod lys og opbevares ved 4 ºC unthe brug.
- Pipetter 200 pi af supernatanten fra trin 4.2.4 i en sort mikrotiterplade.
- Brug en fluorescensmikropladelæser at måle doxorubicin-associeret fluorescens ved en fast fotomultiplikator indstilling.
- Indstil excitationsbølgelængden til 485 nm og emission bølgelængde til 590 nm og registrere fluorescens værdier.
- Generer en doxorubicin kalibreringskurve. Sørg målinger er erhvervet med indstillinger identiske instrument (dvs. med en fast indstilling fotomultiplikator). Ved hjælp af kalibreringskurven, beregne doxorubicin koncentrationen i den kombinerede supernatant. Gentag denne måling i tre uafhængige forsøg.
- Brug ligning (1) for at bestemme indkapslingseffektivitet:
5. Karakterisering af Silk Nanopartikler
- Vurdering af størrelse og Zeta Potentielle af frisklavet og Lagret Silk Nanopartikler.
- Opbevar silke nanopartikler i destilleret vand ved 4 ° C og 25 ° C.
- Mål størrelse og zeta potentiale silke nanopartikler på dag 0, 14 og 28 ved hjælp af dynamisk lysspredning (DLS). Sæt brydningsindeks med 1,33 for destilleret vand og 1,60 for protein 17. Beregn partikelstørrelser med brugergrænsefladen software.
- Morfologisk Vurdering af Silk Nanopartikler af Scanning Electron Microscopy (SEM).
- Placer en carbon klæbeskive på en SEM-stub og efterfølgende vedhæfte en siliciumskive.
- Fortynd silke nanopartikler til en koncentration på 1 mg / ml. Afpipetteres 10 pi af prøven på en siliciumskive, frys prøven ved -80 ° C og lyofiliseres natten over under anvendelse af en frysetørring-system i henhold til producentens anvisninger.
- Coat prøven med en guldlag op til 20 nm tyktmed en lav vakuum pådampningsbelægningsmaskine.
BEMÆRK: Instrument indstillinger varierer mellem modeller. Modellen bruges her er fuldautomatisk og fungerer ved kun tykkelse. - prøver billede med en scanning elektron mikroskop på 5 kV og en 40.000-fold forstørrelse.
6. In vitro cytotoksicitet of Control og doxorubicin-loaded Silk Nanopartikler
- Cell Levedygtighed efter udsættelse for Silk Nanopartikler.
- Kultur MDA-MB-231 celler i RPMI 1640 med 10% volumen / volumen FBS. Plate celler på vævskulturbehandlet polystyren og inkuberes i en befugtet 5% CO2-atmosfære ved 37 ° C. Rutinemæssigt videredyrke ved 80% sammenløb hver 2-3 dage.
- Plate MDA-MB-231-celler ved en densitet på 2 x 10 4 celler / cm2 i plader med 96 brønde. Lade cellerne inddrive natten over.
- Tilføj (i) 0,001-1 ug frit diffunderbart doxorubicin, (ii) 0,001-0,5 mg silke nanopartikler og 0,1 mg silke nanopartiklerlastet med 0,001-1 ug doxorubicin i 96-brønds plader (slutvolumen 100 pi per brønd).
- Bestem cellelevedygtighed og halvmaksimal inhiberende koncentration (IC50) ved tilsætning (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT 5 mg / ml i PBS) ved 72 timer. Inkuber i 5 timer, omhyggeligt dræne brøndene med en pipette og opløse formazan med 100 pi dimethylsulfoxid. absorbansen ved 560 nm. Gentag denne måling i tre uafhængige forsøg.
BEMÆRK: De absorbansværdier af ubehandlede kontroller tjene som referenceværdi for 100% cellelevedygtighed.
- SEM af celler udsat for Silk Nanopartikler.
- Seed MDA-MB-231 celler på sterile dækglas med en tæthed på 2 x 10 4 celler / cm2. Lade cellerne inddrive natten over. Udsætte cellerne for de ønskede behandlingsbetingelser i 72 timer.
- Fikseres cellerne med 2% v / v glutaraldehyd i PBS i 30 min, vask med distilnede vand to gange, dehydrere med en ethanol-serien, og kritisk punkt tørre prøverne, som beskrevet andetsteds 28.
- Sputter pels prøverne med en guld lag op til 20 nm tyk hjælp af en lav vakuum pådampningsbelægningsmaskine.
BEMÆRK: Instrument indstillinger varierer mellem modeller. Modellen bruges her er fuldautomatisk og fungerer ved kun tykkelse. - Billede prøverne ved SEM under anvendelse af en elektron acceleration på 5 kV og 700-gange forstørrelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Data blev statistisk analyseret som beskrevet tidligere 17. Den t-test blev anvendt til prøvepar og envejs variansanalyse (ANOVA) efterfulgt af Bonferronis multipel sammenligning post hoc test for multiple prøver. En stjerne angiver statistisk signifikans således: * P <0,05 og ** P <0,001. Alle data præsenteres som middelværdier ± standardafvigelse (SD) og tallene i parentes angiver antallet af uafhængige forsøg.
Regenereret silke opløsning blev fremstillet og efterfølgende tilsat dråbevist til acetone for at generere silke nanopartikler via nanoprecipitation (figur 1). Denne metode gav en ensartet (polydispergeringsindeks: 0,1), sfæriske, silke nanopartikler (106,5 nm ± 1,1) med en negativ overfladeladning (-49,57 mV ± 0,6) (figur 2 og 3). Silk nanopartikel stevne i vand blev vurderet i op til 28 dage ved at overvåge partikler størrelse, zetapotentialet og morfologi (figur 2 og 3). Over oplagringsperioden 28 dage, ved enten 4 ° C eller 25 ° C blev ingen signifikant ændring i partikelstørrelsen, ladning (figur 2) eller morfologi observeret (figur 3).
Doxorubicin blev anvendt som en klinisk relevant kemoterapeutisk model lægemiddel til lægemiddelfyldning og in vitro Cytotoksicitetsstudier. Tre forskellige silke nanopartikel koncentrationer (10, 30 og 50 mg / ml) blev anvendt til at vurdere lægemidlet belastningsevne silke nanopartikler. Doxorubicin indkapslingseffektivitet i 10, 30 og 50 mg / ml silke nanopartikler (dvs. 2, 6 eller 10 mg af silke og 232 ug doxorubicin) var 73 ± 2,2, 87 ± 1,8 og 97 ± 0,2%, henholdsvis (figur 4A ). Partikelstørrelsen og zeta-potentialet af doxorubicin-loaded silke nanopartikler (10 mg) blev målt og sammenlignet med 10 mg silke nanopartikel kontroller. Partikelstørrelsen ændredes ikke efter lægemiddelfyldning (figur 4B), mens zetapotentialet af doxorubicin-belastet silke nanopartikler blev signifikant reduceret fra 49.57 ± 0,6 mV til 43,52 ± 0,37 mV (figur 4C).
Evnen af lægemiddel fyldte silke nanopartikler til at levere doxorubicin og efterfølgende dræbe kræftceller blev vurderet in vitro. Human brystcancer MDA-MB-231 celler blev udsat for silke nanopartikler, frit diffunderbare doxorubicin eller doxorubicin-loaded silke nanopartikler. Cellelevedygtighed blev vurderet efter en eksponeringsperiode 72 timer. De IC50-værdier på frit diffunderbare doxorubicin og doxorubicin-loaded silke nanopartikler var 0,48 ug / ml og 0,24 ug / ml, mens de silke nanopartikler havde en IC50> 5 mg / ml (figur 5A).Ved ækvivalente drug doser på 0,1 ug, frit diffunderbare doxorubicin og doxorubicin-loaded silke nanopartikler forårsagede signifikante fald i cellelevedygtighed på 83 ± 11 og 65 ± 11% (figur 5B). Imidlertid viste frit diffunderbar doxorubicin en væsentlig større cytotoksicitet end doxorubicin-loaded silke nanopartikler. Disse kvantitative målinger blev bekræftet ved kvalitativ SEM imaging (figur 5c). Her viste kontrolkulturer høj celletæthed og en fremherskende mesenkymale MDA-MB-231 fænotype; lignende observationer blev gjort for kulturer, der udsættes for silke nanopartikler. Imidlertid kulturer eksponeret for doxorubicin viste en markant anderledes cellefænotype. På tilsvarende doxorubicin dosis, MDA-MB-231-celler behandlet med frit diffunderbare doxorubicin og doxorubicin-loaded silke nanopartikler udviste en væsentlig reduktion i celleantal. Desuden er mange celler havde en meget bred og spredt ud morfologi. kulturer exposed til doxorubicin-loaded silke nanopartikler viste tegn på nanopartikler (og deres aggregater) i forbindelse med plasmamembranen (figur 5C).
Figur 1: De vigtigste trin til at generere en omvendt manipuleret silke opløsning og silke nanopartikler Først silkekokoner revers manipuleret ved at skære og derefter degumming dem i 60 min (dvs. kogning) til opnåelse degummerede silkefibre.. Fibrene opløses i 9,3 M LiBr og derefter dialyseret mod vand i 72 timer. En vandig 5% w / v silke opløsning anvendes til at generere silke nanopartikler. Dråbevis tilsætning af silke i acetone fører til silke nanoprecipitation. Silk nanopartikler vaskes og samle til senere brug. Klik her for at se en større version af dennefigur.
Figur 2:. Størrelse og ladning karakterisering af silke nanopartikler partikelstørrelse og zeta-potentialet af silke nanopartikler ved 4 ° C og 25 ° C i løbet af 28 dage. ± SD; fejl barer er skjult i plottet symbol, når det ikke er synligt, n = 3. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3:. Kvalitetsvurdering af silke nanopartikler opbevaret ved 4 ° C og 25 ° C over 28 dage Silk nanopartikler blev afbildet ved anvendelse af scanningselektronmikroskopi (Scale bar = 1 um). Please klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Karakterisering af doxorubicin-loaded silke nanopartikler (Dox-SNP'er) (A) indkapslingseffektivitet 232 ug doxorubicin som reaktion på forskellige mængder af silke nanopartikler (SNPs);. 2, 6 og 10 mg af silke nanopartikler. Indkapslingseffektiviteten for 10 mg og 5 mg silke nanopartikler signifikant forøget sammenlignet med 2 mg silke nanopartikler. (B) Partikelstørrelse og (C) zetapotentiale af doxorubicin-loaded silke nanopartikler sammenlignet med kontrolgruppen silke nanopartikler (10 mg silke nanopartikler). Statistisk signifikante forskelle for prøvepar blev bestemt med t-test. Multiple prøver blev vurderet ved envejs ANOVA efterfulgt af Bonferroni multiple sammenligning post hoc test; * P & #60; 0,05, ** P <0,001, ± SD; fejl barer er skjult i plottet-symbolet, når det ikke er synligt, n = 3. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: In vitro cytotoksicitet af silke nanopartikler og doxorubicin-loaded silke nanopartikler i humane brystcancerceller (A) Cellelevedygtighed af MDA-MB-231-celler efter en 72 hr behandlingscyklus med silke nanopartikler (SNP'er) (0,01-5 mg. / ml); volumener pr brønd var 100 pi. (B) Cellelevedygtighed af MDA-MB-231-celler efter en 72 hr behandlingscyklus med 0,1 mg silke nanopartikler, 0,1 ug frit diffunderbart doxorubicin (Dox) eller 0,1 mg silke nanopartikler ladet med 0,1 ug doxorubicin (Dox-SNationale parlamenter). Cellelevedygtighed blev statistisk faldet efter udsættelse for 0,1 ug frit diffunderbare doxorubicin og 0,1 mg silke nanopartikler ladet med 0,1 ug doxorubicin sammenlignet med kontrollen. (C) SEM billeder af MDA-MB-231 celler udsat for (i) medium (kontrol), (II) 0,1 mg silke nanopartikler, (iii) 0,1 ug af frit diffunderbare doxorubicin, og (iv) doxorubicin-loaded silke nanopartikler på ækvivalente doser (Scale bar = 50 um). Statistisk analyse blev udført ved envejs ANOVA efterfulgt af Bonferroni multiple hoc test sammenligning stolpe, ns = ikke signifikant, * P <0,05, ** P <0,001, ± SD; fejl barer er skjult i plottet-symbolet, når det ikke er synligt, n = 3. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Forskellige fremgangsmåder er tilgængelige til at producere silke nanopartikler, herunder polyvinylalkohol blande 20, spraytørring 21, udsaltning 22, kapillær microdot udskrivning 23, superkritisk CO2 udfældning 24 og nanoprecipitation 16,25 (gennemgået i henvisning 26). Imidlertid nanoprecipitation, på grund af sin samlede enkelhed, er den mest populære metode til generering silke nanopartikler. Derfor er formålet med denne undersøgelse var at anvende nanoprecipitation at reverse engineering silke til at fremstille silke-baserede nanopartikler, der kan bruges til en række applikationer, herunder lysosomotropiske anticancer drug delivery.
Gennem det seneste årti, er nanoprecipitation blevet en af de mest almindelige procedurer for fremstilling af protein-baserede nanopartikler 29. Vores forskergruppe 16,17 og andre 25,26,30,31 har med succes anvendt denne techlogi til silke; her præsenterer vi en enkel, men robust trinvis protokol for generering af silke nanopartikler. Acetone nanoprecipitation giver sfæriske silke partikler, der er homogene i størrelse og falder typisk i nanometer størrelse. Acetone har vist sig som den foretrukne kontinuerlige fase over opløsningsmidler, såsom methanol, ethanol, isopropanol og butanol 16,25. Acetone giver nanopartikler, der har et reduceret niveau af hydrering i sammenligning med den metastabile 100-200 nm dimensioneret sfæriske micellære strukturer er til stede i native og regenererede silke løsninger 32. Men der er mulighed for at udforske opløsningsmiddelblandinger og variationer i degumming tid for at generere silke (nano) partikler med potentielt forskellige egenskaber dem der er beskrevet her. Protokollen beskrevet her udnytter acetone som den kontinuerlige fase, der muliggør fremstilling af ensartede, sfæriske nanostørrelse silke partikler (106,5 ± 1,1 nm), der bærer en negativ overflade ladning (-49,5777; 0,6 mV), og som har en tæt pakning af de hydrofobe, krystallinske silke kæder 16,17. Samlet set den beskrevne procedure kræver små hands-on tid og giver silke nanopartikler fra en omvendt manipuleret vandig silke opløsning (figur 1). Nogle af de vigtigste funktioner i denne procedure omfatter anvendelse af 60 minutter degummeret silke, den passende dråbestørrelse (ca. 10 pi / drop) og en maksimal nedkastning på 50 dråber / min. Overholdelse af disse centrale funktioner resulterer i et typisk udbytte på 14%. Disse nanopartikler er robuste og vi dokumentere, at de er stabile og ikke ændre deres fysiske egenskaber over en opbevaringsperiode 28 dage. Men en potentiel advarsel af den beskrevne fremgangsmåde er fraværet at generere partikler over et bredt størrelsesområde (dvs. generering partikler fra nanometer til Mikrometerskalaen samtidig opretholde en smal polydispersitetsindeks).
Styring partikelstørrelse, oplade og form er iVIGTIG til levering af narkotika, især når rettet mod solide tumorer 33. Partikler i 100 nm størrelsesintervallet dukker op som ideelle kandidater til tumor målretning. Derfor 100 nm størrelse silke nanopartikler er potentielle kandidater som anticancer lægemiddelafgivelsessystemer for solide tumorer behandlinger. Silk nanopartikler har en negativ overflade ladning, hvilket gør dem let fyldt med positivt ladede lægemidler gennem udnyttelse af den elektrostatiske vekselvirkning 16. Men ud over ladning, yderligere medikament karakteristika (f.eks logD) er også kendt for at påvirke lægemiddelfyldning og frigive 34. I den foreliggende undersøgelse, doxorubicin, en svagt basisk anticancerlægemiddel, blev valgt som en model lægemiddelkandidat. Lægemiddelfyldningen undersøgelse (figur 4) viste at forøgelse af silke nanopartikel koncentration ført til øget doxorubicin indkapslingseffektivitet; 10 mg af silke nanopartikler kan indkapsle 232 ug doxorubicin. Lægemiddelfyldning af silke nanoparticles igen resulterede i silke nanopartikler med en betydeligt reduceret overfladeladning, som var direkte eksperimentelt bevis, der bekræfter, at doxorubicin-silke charge interaktion er vigtigt for denne særlige medikament-carrier kombination.
Vi har tidligere dokumenteret, at silke nanopartikler kan tjene som en lysosomotropiske lægemiddelafgivelsessystem 16,17. Her viser vi en test med doxorubicin-loaded silke nanopartikler til behandling af den humane brystcancer MDA-MB-231-cellelinie. Disse celler er afledt af en stærkt invasiv tredobbelt negativ brystcancer (ER - / PR - / HER2 -), der er vanskelige at behandle i klinikken 35. Derfor designe et lægemiddelafgivelsessystem skræddersyet til denne patientgruppe forventes, hvilket giver enorme fordele. I fravær af lægemiddelfyldning, havde silke nanopartikler ikke påvirke cellernes levedygtighed (IC50-værdier> 5 mg / ml) (figur 5a, c). Dog på equivalente doser, blev signifikant større cytotoksicitet observeret med frit diffusible doxorubicin end med doxorubicin-loaded silke nanopartikler (figur 5b). Forskellene mellem de in vitro cellulære farmakokinetik frit diffusible og partikel bundet stof forklare denne observation. Den frit diffusible stof kan hurtigt krydse plasmamembranen via diffusion, hvorimod optagelse af narkotika nanopartikler afhængig endocytose. Ikke desto mindre kan endocytisk optagelse af nanopartikler forbedre medikamenttilbageholdelse og overvinde drug resistensmekanismer 3. , Den sande gavn for nanopartikel-medieret levering anticancer narkotika er, at det udnytter EPR effekt at lette passiv tumor målretning og forbedre farmakokinetik. Derfor er brugen af en nanopartikel-baserede lægemiddelafgivelsessystem tilgang kan kun vurderes fuldt ud in vivo. In vitro studier har begrænsninger (dvs. fravær af EPR effekt), der udelukker den fulde characterization af disse typer af lægemiddelafgivelsessystemer 7.
Sammenfattende den beskrevne metode muliggør nem fremstilling af sfæriske silke nanopartikler af ensartet størrelse og overfladeladning. Disse silke nanopartikler kan bruges til en bred vifte af applikationer (f.eks kosmetik, skabeloner til nano mønster, Theranostics, smøremidler, kontrol partikler til nanotoxicity undersøgelser), herunder deres anvendelse som anticancer drug delivery platforme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | VWR International, Radnor, PA, USA | 20066.33 | |
| Automated Critical Point Dryer | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | EM CPD300 | |
| Balancing | Mettler Toledo, Greifensee, Switzerland | NewClassic MS | |
| Black polystyrene microplate, 96 well | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 3991 | |
| Capillary cell (DTS 1070) | Malvern Instrument, Worcestershire, UK | DTS107 | |
| Carbon adhesive disc | Agar Scientific, Essex, UK | G3347N | |
| Centrifuge | Hermle Labortechnik, Wehingen, Germany | Z323K | |
| Centrifuge | Beckman Coulter, Brea, CA, USA | Avanti J-E, Rotor: J20 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter, Brea, CA, USA | Optima L-70K, Rotor: 50.2 Ti, Adaptor 303392 | |
| Coater, low vacuum | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | EM ACE200 | |
| Cuvettes, polystyrene, disposable | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | FB55147 | |
| Doxorubixin | LC Laboratories, Boston, MA, USA | D4000 | |
| Electronic pipetting, Easypet | Eppendorf, Hamburg, Germany | N/A | |
| FE-SEM | Hitachi High-Technologies, Krefeld, Germany | SU6600 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 16000-044 | |
| Freeze dryer | Martin Christ, Osterode, Germany | Epsilon 2-4 | |
| Heat inactivated Bombyx mori silk cocoons | Tajima Shoji, Kanagawa, Japan | N/A | |
| Hotplate with Stirrer | Bibby Scientific, Stanffordshire, UK | US 152 | |
| Incubator | Memmert, Schwabach, Germany | INB 200 | |
| Insulin, human recombinant, zinc solution | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 12585-014 | |
| Lithium bromide | Acros Organics, Geel, Belgium | AC199870025 | |
| MDA-MB-231 | ATCC, Manassas, VA, U.S.A | N/A | |
| Micropipette and tips | Eppendorf, Hamburg, Germany | N/A | |
| Microplate Reader | Molecular devices, Sunnyvale, CA, USA | SpectraMax M5 | |
| Oak Ridge High-Speed Centrifuge Tubes, 50 ml | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | N/A | |
| Open-Top Thickwall Polycarbonate tube, 4 ml | Beckman Coulter, Brea, CA, USA | 355645 | |
| Penicilin/streptomycin | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 15140-122 | |
| RPMI medium | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 11875-093 | |
| Serological pipettes, 5 ml | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | ||
| Silicon wafers | Agar Scientific, Essex, UK | G3391 | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis cassettes, 3.5K MWCO, 15 ml | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 87724 | |
| Sodium carbonate anhydrous | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | S/2840/62 | |
| Specimen stubs for SEM | Agar Scientific, Essex, UK | G301 | |
| Ultrasonic homogenizer | Bandelin, Berlin, Germany | Sonoplus HD 2070 | |
| UV transparent microplate, 96 well | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 3635 | |
| Vortex | IKA, Staufen, Germany | Genius 3 | |
| Zetasizer | Malvern Instrument, Worcestershire, UK | Nano ZS | |
| Zetasizer Software version 7.11 | DLS software | ||
| Micro Modulyo | Thermo Fisher | 230 | Freeze drying system |
References
- Haley, B., Frenkel, E. Nanoparticles for drug delivery in cancer treatment. Urol. Oncol. 26 (1), 57-64 (2008).
- Sun, T., Zhang, Y. S., Pang, B., Hyun, D. C., Yang, M., Xia, Y. Engineered nanoparticles for drug delivery in cancer therapy. Angew. Chem. Int. Ed. 53 (46), 12320-12364 (2014).
- Davis, M. E., Chen, Z. G., Shin, D. M. Nanoparticle therapeutics: an emerging treatment modality for cancer. Nat. Rev. Drug Discov. 7 (9), 771-782 (2008).
- Sheridan, C. Proof of concept for next-generation nanoparticle drugs in humans. Nature Biotechnol. 30 (6), 471-473 (2012).
- Matsumura, Y., Hitoshi, M. A New Concept for Macromolecular Therapeutics in Cancer Chemotherapy: Mechanism of Tumoritropic Accumulation of Proteins and the Antitumor Agent Smancs. Cancer Res. 46, 6387 (1986).
- De Duve, C., De Barsy, T., Poole, B., Trouet, A., Tulkens, P., Van Hoof, F. Lysosomotropic agents. Biochem. Pharmacol. 23 (18), 2495-2531 (1974).
- Duncan, R., Richardson, S. C. W. Endocytosis and intracellular trafficking as gateways for nanomedicine delivery: opportunities and challenges. Mol. Pharm. 9 (9), 2380-2402 (2012).
- Vishakha, K., Kishor, B., Sudha, R. Natural Polymers - A Comprehensive Review. Int. J. Pharm. Biomed. Res. 3 (4), 1597-1613 (2012).
- Pritchard, E. M., Kaplan, D. L. Silk fibroin biomaterials for controlled release drug delivery. Expert. Opin. Drug Del. 8 (6), 797-811 (2011).
- Thurber, A. E., Omenetto, F. G., Kaplan, D. L. In vivo bioresponses to silk proteins. Biomaterials. 71, 145-157 (2015).
- Pritchard, E. M., Dennis, P. B., Omenetto, F., Naik, R. R., Kaplan, D. L. Physical and chemical aspects of stabilization of compounds in silk. Biopolymers. 97 (6), 479-498 (2012).
- Seib, F. P., Pritchard, E. M., Kaplan, D. L. Self-Assembling Doxorubicin Silk Hydrogels for the Focal Treatment of Primary Breast. Adv. Funct. Mater. 23 (1), 58-65 (2013).
- Seib, F. P., Kaplan, D. L. Doxorubicin-loaded silk films: drug-silk interactions and in vivo performance in human orthotopic breast cancer. Biomaterials. 33 (33), 8442-8450 (2012).
- Seib, F. P., Coburn, J., et al. Focal therapy of neuroblastoma using silk films to deliver kinase and chemotherapeutic agents in vivo. Acta. Biomater. 20, 32-38 (2015).
- Coburn, J. M., Na, E., Kaplan, D. L. Modulation of vincristine and doxorubicin binding and release from silk films. J. Control. Release. 220, 229-238 (2015).
- Seib, F. P., Jones, G. T., Rnjak-Kovacina, J., Lin, Y., Kaplan, D. L. pH-dependent anticancer drug release from silk nanoparticles. Adv. Healthc. Mater. 2 (12), 1606-1611 (2013).
- Wongpinyochit, T., Uhlmann, P., Urquhart, A. J., Seib, F. P. PEGylated Silk Nanoparticles for Anticancer Drug Delivery. Biomacromolecules. 16 (11), 3712-3722 (2015).
- Seib, F. P., Kaplan, D. L. Silk for Drug Delivery Applications: Opportunities and Challenges. Isr. J. Chem. 53 (9-10), 1-12 (2013).
- Yucel, T., Lovett, M. L., Kaplan, D. L. Silk-based biomaterials for sustained drug delivery. J. Control. Release. 190, 381-397 (2014).
- Wang, X., Yucel, T., Lu, Q., Hu, X., Kaplan, D. L. Silk nanospheres and microspheres from silk/pva blend films for drug delivery. Biomaterials. 31 (6), 1025-1035 (2010).
- Qu, J., Wang, L., Hu, Y., You, R., Li, M. Preparation of Silk Fibroin Microspheres and Its Cytocompatibility. J. Biomater. Nanobiotechnol. 4, 84-90 (2013).
- Lammel, A., Hu, X., Park, S., Kaplan, D., Scheibel, T. Controlling silk fibroin particle features for drug delivery. Biomaterials. 31 (16), 4583-4591 (2010).
- Gupta, V., Aseh, A., Rìos, C. N., Aggarwal, B. B., Mathur, A. B. Fabrication and characterization of silk fibroin-derived curcumin nanoparticles for cancer therapy. Int. J. Nanomedicine. 4, 115-122 (2009).
- Zhao, Z., et al. Generation of silk fibroin nanoparticles via solution-enhanced dispersion by supercritical CO2. Ind. Eng. Chem. Res. 52 (10), 3752-3761 (2013).
- Tudora, M., Zaharia, C., Stancu, I. Natural silk Fibroin micro-and nanoparticles with potential uses in drug delivery systems. U.P.B. Sci. Bull., Series B. 75 (1), 43-52 (2013).
- Zhao, Z., Li, Y., Xie, M. B. Silk Fibroin-Based Nanoparticles for Drug Delivery. Int. J. Mol. Sci. 16 (3), 4880-4903 (2015).
- Rockwood, D., Preda, R., Yücel, T. Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin. Nat. Protoc. 6 (10), 1-43 (2011).
- Seib, F. P., Müller, K., Franke, M., Grimmer, M., Bornhäuser, M., Werner, C. Engineered extracellular matrices modulate the expression profile and feeder properties of bone marrow-derived human multipotent mesenchymal stromal cells. Tissue. Eng. Part A. 15 (10), 3161-3171 (2009).
- Lai, P., Daear, W., Löbenberg, R., Prenner, E. J. Overview of the preparation of organic polymeric nanoparticles for drug delivery based on gelatine, chitosan, poly(d,l-lactide-co-glycolic acid) and polyalkylcyanoacrylate. Colloids Surf., B, Biointerfaces. 118, 154-163 (2014).
- Subia, B., Kundu, S. C. Drug loading and release on tumor cells using silk fibroin-albumin nanoparticles as carriers. Nanotechnology. 24 (3), 035103 (2013).
- Zhang, Y. Q., Shen, W. D., Xiang, R. L., Zhuge, L. J., Gao, W. J., Wang, W. B. Formation of silk fibroin nanoparticles in water-miscible organic solvent and their characterization. J. Nanopart. Res. 9 (5), 885-900 (2006).
- Jin, H. J., Kaplan, D. L. Mechanism of silk processing in insects and spiders. Nature. 424 (6952), 1057-1061 (2003).
- Yhr Bae,, Park, K. Targeted drug delivery to tumors: myths, reality and possibility. J. Control. Release. 153 (3), 198-205 (2011).
- Lammel, A., Schwab, M., Hofer, M., Winter, G., Scheibel, T. Recombinant spider silk particles as drug delivery vehicles. Biomaterials. 32 (8), 2233-2240 (2011).
- Holliday, D. L., Speirs, V. Choosing the right cell line for breast cancer research. Breast. Cancer. Res. 13, 215 (2011).
