Summary
Nanopartikler er fremstår som lovende stoffet leveringssystemer for et bredt spekter av indikasjoner. Her beskriver vi en enkel, men kraftfull metode for å produsere silke nanopartikler ved hjelp av omvendt utvikling silkeorm silke. Disse silke nanopartikler kan lett lastet med en terapeutisk nyttelast og senere utforsket for levering av legemidler programmer.
Abstract
Silke er et lovende biopolymer for biomedisinske og farmasøytiske anvendelser på grunn av sine fremragende mekaniske egenskaper, biokompatibilitet og biologisk nedbrytbarhet, samt dens evne til å beskytte og deretter frigi dens nyttelast som respons på en utløser. Mens silke kan formuleres i forskjellige material formater, er silke nanopartikler fremstår som lovende medikamentavleveringssystemer. Derfor denne artikkelen dekker prosedyrene for reverse engineering silke kokonger for å gi en regenerert silke løsning som kan brukes til å generere stabile silke nanopartikler. Disse nanopartiklene senere blir preget, narkotika lastet og utforsket som en potensiell kreft narkotika leveringssystem. Kort fortalt er silke kokonger reverskonstruert først ved degumming kokonger, etterfulgt av silke oppløsning og rydde opp, for å gi en vandig silke løsning. Deretter blir den regenererte silke løsningen utsatt for nanoprecipitation å gi silke nanopartikler - en enkel, men effektiv metodesom genererer uniform nanopartikler. Silke nanopartikler er karakterisert i henhold til deres størrelse, zeta potensial, morfologi og stabilitet i vandige medier, så vel som deres evne til å fange et kjemoterapeutisk nyttelast og drepe humane brystcancerceller. Samlet sett gir den beskrevne metoden ensartede silke nanopartikler som lett kan utforskes for en myriade av programmer, inkludert deres bruk som en potensiell nanomedisin.
Introduction
Nanostørrelse medikamentleveringssystemer er ofte brukes for å kontrollere medikamentfrigjøring og for å levere et variert sett av terapeutiske nyttelaster - for eksempel, proteiner, peptider og små molekylvekt legemidler - til målceller og vev. Disse terapeutiske nyttelaster blir ofte innlemmet i forskjellige makromolekylære legemiddelbærere, for eksempel liposomer, vannoppløselige polymerer (inkludert dendrimerer), og mikro- og nanopartikler 1. Nanopartikler (typisk i et størrelsesområde fra 1 nm til 1000 nm) blir mye undersøkt som potensielle legemiddelbærere, spesielt for antikreftlegemiddelavlevering 2. Den vellykkede introduksjonen av Abraxane (120 nm store albumin-baserte nanopartikler lastet med paclitaxel) i rutinemessig klinisk praksis tre har katalysert feltet, slik at mange flere nanopartikler for levering av legemidler går nå inn i kliniske studier 4. Solide svulster viser generelt dårlig lymfedrenasje og har lekk blodkar som betyr at nanoparticles på opp til 200 nm vil bli passivt rettet mot disse svulstene etter intravenøs administrasjon. Dette passive målretting fenomenet kalles forbedret permeabilitet og retensjon (EPR) virkning, og ble først rapportert i 1986 5. EPR-effekten kan føre til en 50- til 100-gangers økning i medikamentkonsentrasjon innen tumoren mikromiljøet for en gitt legemiddeldose når medikamentet nyttelasten blir levert ved hjelp av et makromolekylært medikament bærer tilnærming heller enn fritt medikament uten bæreren. Narkotika lastet nanopartikler laget for kreft narkotika levering må nå svulsten mikromiljøet og ofte må skrive inn et bestemt intracellulære rommet, vanligvis ved endocytic opptak, for at stoffet skal oppnå ønsket terapeutisk effekt 3. Nanopartikler er utformet for intracellulær levering av legemidler utnytte endocytose som en gateway inn i cellen, så vel som en rute for å overvinne medikamentresistensmekanismer. Drug utgivelse fra nanopartikler er ofte spesielt designet for å occur i lysosomer (dvs. lysosomotropic levering av legemidler) 6 hvor pH respons av nanopartikkel carrier (lysosomal pH ca. 4,5) kan tjene som trigger for medikamentfrigjørings eller lysosomale enzymer som frigjør nyttelasten fra transportøren 7.
Mange forskjellige klasser av materialer kan brukes til å generere nanopartikler (for eksempel metaller og mange organiske og uorganiske materialer). Imidlertid er biopolymerer fremstår som attraktive materialer på grunn av deres kjente biokompatibilitet, nedbrytbarhet og lav toksisitet 8. Mange biopolymerer blir undersøkt, inkludert albumin, alginat, kitosan og silke. Av disse har silke dukket opp som en lovende kandidat for utvikling i stoffet leveringssystemer 9. Silke av forskjellige typer er produsert av et antall av leddyr, inkludert edderkopper (f.eks Nephila clavipes) og Silkeormer (f.eks silkeorm). Silkworm silke brukes langt mer extensivt enn edderkopp silke fordi silkeormen er fullt domestisert og dens silke representerer således en reproduserbar utgangsmateriale. Silkworm silke er en Food and Drug Administration (FDA) godkjente materialer for bruk på mennesker, spesielt som en sutur materiale; den har en robust sikkerhetshistorie hos mennesker, og er kjent for å nedbrytes in vivo 10. Nedbrytningen profilen til silke kan være finjustert for å variere fra timer (lav krystallinsk silke) til 12 måneder eller mer (høy krystallinsk silke). Silke degraderingsprodukter er ikke-toksiske og metaboliseres i kroppen 10. Silke struktur formidler evnen til å binde små molekylære forbindelser og makromolekylære protein narkotika 11, noe som gjør det til et godt materiale for kontrollert legemiddeldosering. Protein medikamenter (f.eks antistoffer) er utsatt for denaturering, aggregasjon, proteolytisk spaltning og klaring av immunsystemet. Imidlertid stabiliserer silke terapeutiske proteiner på grunn av bufferkapasiteten til sin nanocrystalline gjenregioner og dens evne til å tilpasse vanninnhold på nanoskala 11. Disse unike egenskapene gir fysisk beskyttelse og redusere nyttelasten mobilitet 11 og er vanligvis ikke sett med andre (bio) polymerer. Mange anticancer stoffet leveringssystemer, for eksempel silke-baserte hydrogeler 12, filmer 13-15 og nanopartikler 16,17, har nå blitt utviklet for å utnytte disse funksjonene (anmeldt i referanser 18,19)
Her ble silkenanopartikler kjennetegnet ved å bestemme deres størrelse og ladning over en lengre tidsperiode. Doxorubicin, en klinisk relevant kreft narkotika, ble brukt som modell medikament for narkotika lasting og cytotoksiske studier i trippel negative menneskelige brystkreft celler behandlet med narkotikabelastede silke nanopartikler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av en Reverse-konstruert Silk Solution fra silkeorm Cocoons
MERK: Denne metodikken er basert på protokoller som er beskrevet andre steder 12,27.
- Skjær 5 g tørket kokonger med saks inn i 5 mm x 5 mm stk. Fjern eventuelle skittent lag.
- Vei ut 4,24 g natriumkarbonat og legge dette nøye til 2 l kokende destillert vann.
NB: Det oppnås en 0,02 M natriumkarbonat-løsning. - Tilsett snitt kokong stykkene til den kokende natriumkarbonat-løsning og kok i 60 min for å avkoking av silke fibre. Rør silke innimellom for å sikre homogen utvalgets behandling.
- Fjern det degummed silke og vaskes med 1 liter destillert vann i 20 min; gjenta vasketrinnet minst 3 ganger.
- Fjern vasket silke og klem det godt for å fjerne overflødig væske og deretter løse / trekke silke hånd. Plasser ubundne silke i et avtrekk lufttørke over natten. Dette gir typisk 3,6 g Degummed silk fibre.
- Neste dag, veie opp 5 g lufttørkede degummed silke fiber og pakke silke tett i bunnen av en 50 ml beger.
- Forbered en frisk 9,3 M litium bromide løsning. Oppløse silke fiber i LiBr med en 1 g silke til 4 ml LiBr ratio. Dekk silke LiBr prøven med aluminiumsfolie for å forhindre fordamping og la silke oppløst fullstendig ved 60 ° C. Dette trinnet tar opptil 4 timer og blir hjulpet av og til røring.
- Våte en dialyse kassett (molekylvekt cut-off på 3500 Da) i vann i 5 minutter. Injiser 15 ml silke LiBr løsning i 15 ml dialyse kassetten og bruke en nål og sprøyte for å fjerne eventuelle luftbobler.
- Dialyser mot en liter destillert vann og endre vann på 1, 3 og 6 timer (dvs. 3 endringer på den første dagen) og igjen på neste morgen og kveld (dvs. 2 endringer på den andre dagen), og igjen på påfølgende morgen (dvs. en endring på den tredje dagen).
- Samle silke solutipå fra dialyse kassetten og sentrifuger løsningen i 20 minutter ved 5 ° C ved 9500 x g. Gjenopprette supernatanten og gjenta denne sentrifugering prosessen to ganger til.
- Bestemme vekten av en tom veie båt (W1) og tilsett 1 ml av silke løsning. Ta opp vekten igjen (W2), og deretter tørke prøven ved å la en vekt på båten ved 60 ° C over natten. Deretter bestemmer den totale tørrvekt (W3) (tørket silke og veiing båt). Konsentrasjonen av silke oppløsning (vekt / volum) er:% = (W3-W1 / W2-W1) x 100.
2. Utarbeidelse av Silke Nanopartikler fra Reverse konstruerte Silk Solution
- Legg til en 5% (vekt / volum) silke løsning dråpevis til aceton, under opprettholdelse av en> 75% (v / v) acetonløsning. For eksempel legge 9 ml av en 5% (w / v) silke løsning dråpevis (10 mL / slipp med en hastighet på 50 dråper / min) til 34 ml aceton.
- Fellingen sentrifugeres ved 48.000 xg i 2 timer ved 4 ° C.
- Aspirer supernatanten og resuspender pellet i destillert vann ved først løsner pelleten med en spatel og deretter tilsetning av 20 ml destillert vann. Bruk pipette tips for å fjerne pellet fra slikkepott. Etter vortex-blanding i 20 sekunder etterfulgt av to sykluser sonikering ved anvendelse av en ultralydsonde på 30% amplitude i 30 sekunder, etterfyller sentrifugerøret kapasitet med destillert vann.
- Gjenta sentrifugering og resuspendering trinnet minst to ganger.
- Resuspender pelleten i 6 ml destillert vann, som beskrevet i 2.3 og oppbevares ved 4 ° C inntil bruk. For cellekulturstudier, kan silke nanopartikkel aksjer være gamma bestrålt 17.
3. Fastsettelse av Silk partikler Konsentrasjon
- Sentrifuger silke nanopartikler på 48 000 xg for 2 timer ved 4 ° C.
- Samle alle nanopartikler i 3 ml destillert vann, etterfulgt av to sykluser ultralydbehandling ved 30% amplitude i 30 sek.
- Del 3 ml lager av silke nanopartikler i 2 ml og 1 ml masse og overføre til pre-veide 2 ml rør. Ta opp den totale vekt av 2 ml prøve. Oppbevar 1 ml mye ved 4 ° C inntil bruk; dette 1 ml prøve vil bli brukt til å generere en kalibreringskurve.
- Snap fryse og deretter lyofilisere 2 ml silke nanopartikkel mye i en frysetørker over natten. Etter frysetørking, Vei 2 ml rør og beregne mengden av silke nanopartikler (mg) som opprinnelig var til stede i 2 ml prøve.
- Fortynn 1 ml silke nanopartikkel lager med destillert vann for å generere en 5-punkts kalibreringskurve (0,04 til 7 mg / ml). Sørg for at prøvene ikke overskrider absorbans maksimum.
- Bestem absorbansen av hver standard fortynning ved 600 nm. Dette gjøres best ved hjelp av en 96-brønns plate oppsett. Plot absorbans mot konsentrasjon (mg / ml) for standardkurven. Deretter bruke denne standardkurven rutinemessig for å bestemme konsentrasjonen av silke nanopartikler i suspensjoner.
4. Utarbeidelse av Doxorubicin belastede Silk Nanopartikler
- Løs opp 1,2 mg doksorubicinhydroklorid i 8 ml destillert vann.
- Fyll opp til 10 ml med destillert vann for å gi en arbeids lager av 116 ug / ml (0,2 pmol / ml).
- Bland 2 ml 0,2 umol / ml doksorubicin oppløsning med 200 ul 10, 30 eller 50 mg / ml av silke nanopartikler i en 2 ml rør.
- Inkuber silke-doxorubicin suspensjonen ved romtemperatur (25 ° C) over natten på en rotasjonsblander.
- Deretter sentrifuger silke-doxorubicin suspensjon på 194 000 xg i 30 min. Vask doksorubicin lastet silke nanopartikler med destillert vann og gjenta denne prosedyren to ganger mer.
- Pool supernatanten og oppmerksom på det totale volumet (denne prøven blir brukt til å bestemme den innkapslingseffektivitet).
- Resuspender doksorubicin belastet silke nanopartikler i destillert vann, beskytte mot lys og oppbevares ved 4 ºC until bruk.
- Pipetter 200 ul av supernatanten fra trinn 4.2.4 til en svart mikrotiterplate.
- Bruke en fluorescens mikroplateleser til å måle doxorubicin-assosiert fluorescens ved en fast innstilling fotomultiplikator.
- Sett eksitasjon bølgelengde 485 nm og emisjonsbølgelengden til 590 nm og registrere fluorescens verdier.
- Generere en doxorubicin kalibreringskurve. Sørg for målingene er anskaffet med identiske instrumentinnstillinger (dvs. med en fast photomultiplier innstilling). Ved hjelp av kalibreringskurve beregnes doxorubicin konsentrasjon i den kombinerte supernatant. Gjenta denne målingen i tre uavhengige forsøk.
- Bruke ligning (1) for å bestemme innkapslingseffektivitet:
5. Karakterisering av Silk Nanopartikler
- Vurdering av størrelse og Zeta potensial tilberedes og lagret Silk Nanopartikler.
- Oppbevar silke nanopartikler i destillert vann ved 4 ° C og 25 ° C.
- Måle størrelsen og zeta-potensialet av silke nanopartikler på dagene 0, 14 og 28 ved hjelp av dynamisk lysspredning (DLS). Sett brytningsindeksene til 1,33 for destillert vann og 1,60 for protein 17. Beregn partikkelstørrelser med brukergrensesnittet programvare.
- Morfologisk Vurdering av Silke Nanopartikler av Scanning elektronmikroskopi (SEM).
- Plasser en karbon lim platen på en SEM spire og deretter legge ved en silisiumskive.
- Fortynn silke nanopartikler til en konsentrasjon på 1 mg / ml. Pipetter 10 pl av prøven på en silisiumskive, fryser prøven ved -80 ° C og lyofilisere over natten ved bruk av et frysetørkesystem i henhold til produsentens instruksjoner.
- Coat prøven med et gull lag opp til 20 nm tykkved hjelp av et lavt vakuum frese coater.
MERK: Instrument innstillingene varierer mellom modellene. Modellen som brukes her er helautomatisk og opererer med tykkelse bare. - Bilde prøver med et scanning elektronmikroskop ved 5 kV og en 40 000 gangers forstørrelse.
6. In Vitro Cytotoksisitet of Control og Doxorubicin lastet Silk Nanopartikler
- Celleviabilitet etter eksponering for Silk Nanopartikler.
- Kultur MDA-MB-231-celler i RPMI 1640 med 10% volum / volum FBS. Plate celler på vevskultur behandlede polystyren og inkuberes i en fuktig 5% CO2 atmosfære ved 37 ° C. Rutinemessig subkultur på 80% samløpet hver 2-3 dager.
- Plate MDA-MB-231-celler ved en tetthet på 2 x 10 4 celler / cm2 i 96-brønners plater. La cellene for å utvinne over natten.
- Legg til (i) 0,001-1 pg fritt diffusjonsevne doksorubicin, (ii) 0,001-0,5 mg silke nanopartikler og nanopartikler 0,1 mg silkelastet med 0,001-1 pg doksorubicin i 96-brønners plater (sluttvolum 100 ul per brønn).
- Bestemme celle-levedyktighet, og halvparten av maksimal hemmende konsentrasjon (IC 50) ved tilsetning av (3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT 5 mg / ml i PBS) i 72 timer. Inkuber i 5 timer, forsiktig tømme brønnene med en pipette og oppløse formazanet med 100 ul dimetylsulfoksyd. Mål absorbansen ved 560 nm. Gjenta denne måling i tre uavhengige forsøk.
MERK: absorbansverdiene for ubehandlede kontroller tjener som en referanseverdi for 100% celleviabilitet.
- SEM av celler eksponert for Silk Nanopartikler.
- Seed MDA-MB-231 celler på sterile dekkglass ved en tetthet på 2 x 10 4 celler / cm2. La cellene for å utvinne over natten. Eksponere cellene til de ønskede behandlingsbetingelsene i 72 timer.
- Fiksere cellene med 2% volum / volum glutaraldehyd i PBS i 30 minutter, vask med distilnet vann to ganger, tørke med en etanol-serien, og kritisk punkt tørke prøvene, som beskrevet andre steder 28.
- Frese frakk prøvene med et gull lag opp til 20 nm tykk ved hjelp av et lavt vakuum frese coater.
MERK: Instrument innstillingene varierer mellom modellene. Modellen som brukes her er helautomatisk og opererer med tykkelse bare. - Bilde prøvene av SEM ved hjelp av et elektron akselerasjon av 5 kV og 700 ganger forstørrelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Data ble statistisk analysert som beskrevet tidligere 17. Den t-test ble anvendt for prøve parene og en-veis analyse av varians (ANOVA) etterfulgt av Bonferroni multiple sammenlignings post hoc test for flere prøver. En asterisk angir statistisk signifikans som følger: * P <0,05 og ** P <0,001. Alle data er presentert som middelverdier ± standardavvik (SD) og tallene i parentes angir antall uavhengige eksperimenter.
Regenererte silke oppløsning ble fremstilt og deretter tilsatt dråpevis til aceton for å generere silke nanopartikler via nanoprecipitation (figur 1). Denne fremgangsmåten ga ensartet (polydispersitetsindeks: 0,1), sfæriske, silke nanopartikler (106,5 nm ± 1,1) med en negativ overflateladning (-49,57 mV ± 0,6) (figurene 2 og 3). Silk nanopartikkel stevne i vann ble vurdert i opp til 28 dager etter partikkelstørrelse, zeta-potensialet og morfologi (figurene 2 og 3) å overvåke. I løpet av den 28-dagers lagringsperiode, ved enten 4 ° C eller 25 ° C, ble ingen signifikant endring i partikkelstørrelse, ladning (figur 2), eller morfologi observert (figur 3).
Doxorubicin ble anvendt som en klinisk relevant modell kjemoterapeutisk medikament for medikament-last og in vitro cytotoksisitets-studier. Tre forskjellige silke nanopartikkel-konsentrasjoner (10, 30 og 50 mg / ml) ble brukt for å vurdere medikamentlastekapasitet av silke nanopartikler. Den doksorubicin innkapslingseffektiviteten for 10, 30 og 50 mg / ml silke nanopartikler (dvs. 2, 6 eller 10 mg av silke og 232 ug av doksorubicin) var 73 ± 2,2, 87 ± 1,8 og 97 ± 0,2%, respektivt (figur 4A ). Partikkelstørrelsen og zeta-potensialet av doksorubicin-loaded silke nanopartikler (10 mg) ble målt og sammenlignet med 10 mg silke nanopartikkel kontroller. Partikkelstørrelsen ble ikke endret etter medikament-last (figur 4B), mens zeta-potensialet av doxorubicin belastede silke nanopartikler ble signifikant redusert fra 49,57 ± 0,6 mV til 43,52 ± 0,37 mV (figur 4C).
Evnen til narkotika lastet silke nanopartikler for å levere doxorubicin og deretter drepe kreftceller ble undersøkt in vitro. Menneskelig brystkreft MDA-MB-231 celler ble utsatt for silke nanopartikler, fritt diffusible doxorubicin eller doxorubicin lastet silke nanopartikler. Celleviabilitet ble vurdert etter en 72 timers eksponeringsperiode. De IC50-verdier for fritt diffusjonsevne doksorubicin og doksorubicin-lastet silke nanopartikler var 0,48 pg / ml og 0,24 pg / ml, henholdsvis mens silkenanopartikler hadde en IC50> 5 mg / ml (figur 5A).På tilsvarende narkotika doser på 0,1 mikrogram, fritt diffusible doxorubicin og doxorubicin lastet silke nanopartikler forårsaket betydelig nedgang i cellelevedyktigheten til 83 ± 11 og 65 ± 11%, henholdsvis (figur 5B). Men fritt diffusible doxorubicin viste en betydelig større cytotoksisitet enn doxorubicin lastet silke nanopartikler. Disse kvantitative målinger ble bekreftet av kvalitativ SEM imaging (Figur 5c). Her kontrollkulturer viste høy celletetthet og en dominerende mesenchymale MDA-MB-231 fenotype; lignende observasjoner ble gjort for kulturer som er utsatt for silke nanopartikler. Men kulturer utsatt for doxorubicin viste en markant annen celle fenotype. På tilsvarende doxorubicin dose, MDA-MB-231-celler behandlet med fritt diffusjonsevne doksorubicin og doksorubicin-lastet silke nanopartikler viste en vesentlig reduksjon i celletall. Videre er mange celler hadde en meget bred og spredt ut morfologi. kulturer exposed til doksorubicin belastede silke nanopartikler viste bevis på nanopartikler (og deres aggregater) forbundet med plasmamembranen (figur 5C).
Figur 1: De viktigste tiltak for å generere en omvendt utvikling silke løsning og silke nanopartikler Først blir silke kokonger omvendt utvikling ved å klippe og deretter degumming dem i 60 min (dvs. kokende) for å gi Degummed silke fiber.. Fibrene ble oppløst i 9,3 M LiBr og deretter dialysert mot vann i 72 timer. Vandig 5% vekt / volum silke løsning brukes til å generere silke nanopartikler. Dråpevis tilsetning av silke i aceton fører til silke nanoprecipitation. Silke nanopartikler er vasket og samle for senere bruk. Klikk her for å se en større versjon av dennefigur.
Fig. 2: Størrelse og ladning karakterisering av silke nanopartikler av partikkelstørrelse og zeta-potensialet av silke nanopartikler ved 4 ° C og 25 ° C i løpet av 28 dager. ± SD; feilfelt er skjult innenfor tomten symbol når den ikke er synlig, n = 3. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fig. 3: kvalitetsvurdering av silke nanopartikler som er lagret ved 4 ° C og 25 ° C over 28 dager Silke nanopartikler ble fotografert ved hjelp av scanning elektronmikroskopi (Skala bar = 1 um). Please klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Karakterisering av doxorubicin belastede silke nanopartikler (Dox-SNP'er) (A) Innkapslingseffektivitet av 232 pg doksorubicin i respons til forskjellige mengder av silke nanopartikler (SNPs);. 2, 6 og 10 mg av silke nanopartikler. Innkapslingseffektiviteten til 10 mg og 5 mg silke nanopartikler signifikant øket når sammenlignet med 2 mg silke nanopartikler. (B) Partikkelstørrelse og (C) zeta-potensialet av doxorubicin belastede silke nanopartikler sammenlignet med kontroll silke nanopartikler (10 mg av silke nanopartikler). Statistisk signifikante forskjeller for eksempel parene ble bestemt med t-test. Flere prøver ble vurdert ved en-veis ANOVA, etterfulgt av Bonferroni multiple sammenlignings post hoc test; * P & #60 0,05, ** p <0,001, ± SD; feilfelt er skjult innenfor tomten-symbol når den ikke er synlig, n = 3. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: In vitro cytotoksisitet av silke nanopartikler og doxorubicin lastet silke nanopartikler i humane brystkreftceller (A) Celleviabilitet av MDA-MB-231 celler etter en 72 timers behandlingssyklus med silke nanopartikler (SNPs) (0,01-5 mg. / ml); volum per brønn var 100 pl. (B) Celleviabilitet av MDA-MB-231 celler etter en 72 timers behandlingssyklus med 0,1 mg silke nanopartikler, 0,1 mikrogram av fritt diffusible doxorubicin (Dox) eller 0,1 mg av silke nanopartikler lastet med 0,1 pg av doxorubicin (Dox-SNPs). Cellelevedyktigheten ble statistisk redusert som følge av eksponering til 0,1 ug av fritt diffusjonsevne doksorubicin og 0,1 mg av silke nanopartikler lastet med 0,1 ug av doksorubicin når sammenlignet med kontrollen. (C) SEM bilder av MDA-MB-231-celler utsatt for (i) medium (kontroll), (ii) 0,1 mg silke nanopartikler, (iii) 0,1 ug av fritt diffusjonsevne doksorubicin, og (iv) doksorubicin belastede silke nanopartikler ekvivalente doser (Scale bar = 50 mikrometer). Statistisk analyse ble utført ved en-veis ANOVA, etterfulgt av Bonferroni multiple sammenlignings post hoc test, ns = ikke signifikant, * P <0,05, ** p <0,001, ± SD; feilfelt er skjult innenfor tomten-symbol når den ikke er synlig, n = 3. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Forskjellige metoder er tilgjengelige for å produsere silke nanopartikler, inkludert polyvinylalkohol blending 20, spraytørke 21, salting ut 22, kapillær microdot utskrift 23, superkritisk CO 2 nedbør 24 og nanoprecipitation 16,25 (anmeldt i referanse 26). Imidlertid nanoprecipitation, på grunn av dens generelle enkelhet, er den mest populære teknikk for generering av silke nanopartikler. Derfor hensikten med denne studien var å søke nanoprecipitation til tilbakekonstrueres silke til å produsere silke-baserte nanopartikler som kan brukes for en rekke programmer, inkludert lysosomotropic kreft narkotika levering.
I løpet av det siste tiåret, har nanoprecipitation blitt en av de mest vanlige prosedyrer for produksjon av protein-baserte nanopartikler 29. Vår forskningsgruppe 16,17 og andre 25,26,30,31 har med hell brukt denne teknikkenlogi til silke; Her presenterer vi en enkel, men robust trinnvis protokoll for generering av silke nanopartikler. Aceton nanoprecipitation gir sfæriske silke partikler som er homogen i størrelse og faller vanligvis i nanometer størrelse. Aceton har dukket opp som den foretrukne kontinuerlige fase i løpet av løsningsmidler slik som metanol, etanol, isopropanol og butanol 16,25. Aceton gir nanopartikler som har et redusert nivå av fuktighet i forhold til det metastabile 100-200 nm dimensjonert sfæriske micelle-strukturer er tilstede i native og regenererte silke løsninger 32. Men det er rom for å utforske løsemiddelblandinger og variasjoner i degumming tid for å generere silke (nano) partikler med potensielt forskjellige egenskaper til de som er beskrevet her. Protokollen er beskrevet her benytter aceton som den kontinuerlige fase, som tillater fremstilling av ensartede sfæriske nanostørrelse silke partikler (106,5 ± 1,1 nm) som bærer en negativ overflateladning (-49,5777; 0,6 mV) og som har en tett pakking av de hydrofobe, krystallinske silke kjedene 16,17. Totalt sett krever den beskrevne prosedyren lite hands-on tid og gir silkenanopartikler fra en omvendt-konstruert vandig silke løsning (figur 1). Noen av de viktigste funksjonene i denne prosedyren omfatter bruk av 60 minutter degummed silke, riktig dråpestørrelse (ca. 10 mL / slipp) og maksimalt slippe hastighet på 50 dråper / min. Etterlevelse disse viktige funksjoner resulterer i en typisk utbytte på 14%. Disse nanopartikler er robuste og vi gir bevis for at de er stabile og ikke endrer sine fysiske egenskaper i løpet av en 28 dagers lagringsperiode. Imidlertid er en potensiell trussel av den beskrevne fremgangsmåte er det ikke foreligger for å generere partikler over et bredt størrelsesområde (dvs. generering av partikler fra nanometer til mikrometer målestokk og samtidig opprettholde en smal polydispersitetsindeks).
Kontrollere partikkelstørrelse, lade og form er jegmportant for levering av legemidler, spesielt når målretting solide tumorer 33. Partikler i 100 nm størrelsesområdet er fremstår som ideelle kandidater for svulst målretting. Derfor 100 nm store silke nanopartikler er potensielle utfordrere som kreft narkotika leveringssystemer for solide svulster behandlinger. Silke nanopartikler har en negativ overflateladning, noe som gjør dem lett lastet med positivt ladede stoffer gjennom utnyttelse av elektrostatisk interaksjon 16. Men foruten kostnad, flere narkotika egenskaper (f.eks logD) er også kjent for å påvirke narkotika lasting og slipp 34. I den foreliggende undersøkelse, doxorubicin, en svakt basisk anticancer medikament, ble valgt som en modell medikamentkandidat. Den medikamentbelastning undersøkelsen (figur 4) viste at en økning av silke nanopartikkelkonsentrasjonen ført til økt doksorubicin innkapslingseffektivitet; 10 mg av silke nanopartikler kan kapsle 232 mikrogram av doxorubicin. Drug lasting av silke nanoparticles i sin tur resultert i silkenanopartikler med en betydelig redusert overflateladning, som var direkte eksperimentelle bevis som bekrefter at doxorubicin-silke charge interaksjonen er viktig for denne bestemte medikamentkombinasjonen.
Vi har tidligere gitt bevis for at silke nanopartikler kan tjene som en lysosomotropic medikamentleveringssystem 16,17. Her viser vi en test ved hjelp av doxorubicin-lastet silke nanopartikler for å behandle humane brystcancer MDA-MB-231-cellelinjen. Disse cellene er avledet fra en meget inngripende trippel negativ brystkreft (ER - / PR - / HER2 -) som er vanskelig å behandle i klinikken 35. Derfor designe et stoff levering system skreddersydd for denne pasientgruppen forventes å gi store fordeler. I fravær av medikamentbelastning, ble silke nanopartikler ikke påvirke cellenes levedyktighet (IC50-verdier på> 5 mg / ml) (figur 5a, c). Men på equivalente doser, betydelig større cytotoksisitet ble observert med fritt diffusible doksorubicin enn med doksorubicin belastede silke nanopartikler (figur 5b). Forskjellene mellom de in vitro cellulære farmakokinetikken til fritt diffusjonsevne og partikkel-bundet medikament forklare denne observasjon. Den fritt diffusible stoffet kan raskt krysse plasmamembranen via diffusjon, mens opptaket av stoffet belastede nanopartikler er avhengig endocytose. Likevel kan endocytic opptak av nanopartikler forbedre narkotika oppbevaring og overvinne narkotika resistensmekanismer 3. Imidlertid er den virkelige fordelen av nanopartikkel-formidlet anticancermedikamentavgivelses at den utnytter EPR-effekten for å lette passiv tumor målretting og for å bedre farmakokinetikk. Derfor er bruken av et nanopartikkelbasert levering av legemidler metode kan bare fullt evaluert in vivo. In vitro studier har begrensninger (dvs. fravær av EPJ-effekten) som utelukker full characterization av disse typer narkotika leveringssystemer 7.
I sammendraget, gjør den beskrevne metoden enkel fremstilling av sfæriske silke nanopartikler av jevn størrelse og overflateladning. Disse silke nanopartikler kan brukes til et bredt spekter av applikasjoner (for eksempel kosmetikk, maler for nano mønster, theranostics, smøremidler, kontrollpartikler for nanotoxicity studier), inkludert deres bruk som kreft narkotika levering plattformer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | VWR International, Radnor, PA, USA | 20066.33 | |
| Automated Critical Point Dryer | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | EM CPD300 | |
| Balancing | Mettler Toledo, Greifensee, Switzerland | NewClassic MS | |
| Black polystyrene microplate, 96 well | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 3991 | |
| Capillary cell (DTS 1070) | Malvern Instrument, Worcestershire, UK | DTS107 | |
| Carbon adhesive disc | Agar Scientific, Essex, UK | G3347N | |
| Centrifuge | Hermle Labortechnik, Wehingen, Germany | Z323K | |
| Centrifuge | Beckman Coulter, Brea, CA, USA | Avanti J-E, Rotor: J20 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter, Brea, CA, USA | Optima L-70K, Rotor: 50.2 Ti, Adaptor 303392 | |
| Coater, low vacuum | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | EM ACE200 | |
| Cuvettes, polystyrene, disposable | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | FB55147 | |
| Doxorubixin | LC Laboratories, Boston, MA, USA | D4000 | |
| Electronic pipetting, Easypet | Eppendorf, Hamburg, Germany | N/A | |
| FE-SEM | Hitachi High-Technologies, Krefeld, Germany | SU6600 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 16000-044 | |
| Freeze dryer | Martin Christ, Osterode, Germany | Epsilon 2-4 | |
| Heat inactivated Bombyx mori silk cocoons | Tajima Shoji, Kanagawa, Japan | N/A | |
| Hotplate with Stirrer | Bibby Scientific, Stanffordshire, UK | US 152 | |
| Incubator | Memmert, Schwabach, Germany | INB 200 | |
| Insulin, human recombinant, zinc solution | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 12585-014 | |
| Lithium bromide | Acros Organics, Geel, Belgium | AC199870025 | |
| MDA-MB-231 | ATCC, Manassas, VA, U.S.A | N/A | |
| Micropipette and tips | Eppendorf, Hamburg, Germany | N/A | |
| Microplate Reader | Molecular devices, Sunnyvale, CA, USA | SpectraMax M5 | |
| Oak Ridge High-Speed Centrifuge Tubes, 50 ml | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | N/A | |
| Open-Top Thickwall Polycarbonate tube, 4 ml | Beckman Coulter, Brea, CA, USA | 355645 | |
| Penicilin/streptomycin | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 15140-122 | |
| RPMI medium | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 11875-093 | |
| Serological pipettes, 5 ml | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | ||
| Silicon wafers | Agar Scientific, Essex, UK | G3391 | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis cassettes, 3.5K MWCO, 15 ml | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 87724 | |
| Sodium carbonate anhydrous | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | S/2840/62 | |
| Specimen stubs for SEM | Agar Scientific, Essex, UK | G301 | |
| Ultrasonic homogenizer | Bandelin, Berlin, Germany | Sonoplus HD 2070 | |
| UV transparent microplate, 96 well | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 3635 | |
| Vortex | IKA, Staufen, Germany | Genius 3 | |
| Zetasizer | Malvern Instrument, Worcestershire, UK | Nano ZS | |
| Zetasizer Software version 7.11 | DLS software | ||
| Micro Modulyo | Thermo Fisher | 230 | Freeze drying system |
References
- Haley, B., Frenkel, E. Nanoparticles for drug delivery in cancer treatment. Urol. Oncol. 26 (1), 57-64 (2008).
- Sun, T., Zhang, Y. S., Pang, B., Hyun, D. C., Yang, M., Xia, Y. Engineered nanoparticles for drug delivery in cancer therapy. Angew. Chem. Int. Ed. 53 (46), 12320-12364 (2014).
- Davis, M. E., Chen, Z. G., Shin, D. M. Nanoparticle therapeutics: an emerging treatment modality for cancer. Nat. Rev. Drug Discov. 7 (9), 771-782 (2008).
- Sheridan, C. Proof of concept for next-generation nanoparticle drugs in humans. Nature Biotechnol. 30 (6), 471-473 (2012).
- Matsumura, Y., Hitoshi, M. A New Concept for Macromolecular Therapeutics in Cancer Chemotherapy: Mechanism of Tumoritropic Accumulation of Proteins and the Antitumor Agent Smancs. Cancer Res. 46, 6387 (1986).
- De Duve, C., De Barsy, T., Poole, B., Trouet, A., Tulkens, P., Van Hoof, F. Lysosomotropic agents. Biochem. Pharmacol. 23 (18), 2495-2531 (1974).
- Duncan, R., Richardson, S. C. W. Endocytosis and intracellular trafficking as gateways for nanomedicine delivery: opportunities and challenges. Mol. Pharm. 9 (9), 2380-2402 (2012).
- Vishakha, K., Kishor, B., Sudha, R. Natural Polymers - A Comprehensive Review. Int. J. Pharm. Biomed. Res. 3 (4), 1597-1613 (2012).
- Pritchard, E. M., Kaplan, D. L. Silk fibroin biomaterials for controlled release drug delivery. Expert. Opin. Drug Del. 8 (6), 797-811 (2011).
- Thurber, A. E., Omenetto, F. G., Kaplan, D. L. In vivo bioresponses to silk proteins. Biomaterials. 71, 145-157 (2015).
- Pritchard, E. M., Dennis, P. B., Omenetto, F., Naik, R. R., Kaplan, D. L. Physical and chemical aspects of stabilization of compounds in silk. Biopolymers. 97 (6), 479-498 (2012).
- Seib, F. P., Pritchard, E. M., Kaplan, D. L. Self-Assembling Doxorubicin Silk Hydrogels for the Focal Treatment of Primary Breast. Adv. Funct. Mater. 23 (1), 58-65 (2013).
- Seib, F. P., Kaplan, D. L. Doxorubicin-loaded silk films: drug-silk interactions and in vivo performance in human orthotopic breast cancer. Biomaterials. 33 (33), 8442-8450 (2012).
- Seib, F. P., Coburn, J., et al. Focal therapy of neuroblastoma using silk films to deliver kinase and chemotherapeutic agents in vivo. Acta. Biomater. 20, 32-38 (2015).
- Coburn, J. M., Na, E., Kaplan, D. L. Modulation of vincristine and doxorubicin binding and release from silk films. J. Control. Release. 220, 229-238 (2015).
- Seib, F. P., Jones, G. T., Rnjak-Kovacina, J., Lin, Y., Kaplan, D. L. pH-dependent anticancer drug release from silk nanoparticles. Adv. Healthc. Mater. 2 (12), 1606-1611 (2013).
- Wongpinyochit, T., Uhlmann, P., Urquhart, A. J., Seib, F. P. PEGylated Silk Nanoparticles for Anticancer Drug Delivery. Biomacromolecules. 16 (11), 3712-3722 (2015).
- Seib, F. P., Kaplan, D. L. Silk for Drug Delivery Applications: Opportunities and Challenges. Isr. J. Chem. 53 (9-10), 1-12 (2013).
- Yucel, T., Lovett, M. L., Kaplan, D. L. Silk-based biomaterials for sustained drug delivery. J. Control. Release. 190, 381-397 (2014).
- Wang, X., Yucel, T., Lu, Q., Hu, X., Kaplan, D. L. Silk nanospheres and microspheres from silk/pva blend films for drug delivery. Biomaterials. 31 (6), 1025-1035 (2010).
- Qu, J., Wang, L., Hu, Y., You, R., Li, M. Preparation of Silk Fibroin Microspheres and Its Cytocompatibility. J. Biomater. Nanobiotechnol. 4, 84-90 (2013).
- Lammel, A., Hu, X., Park, S., Kaplan, D., Scheibel, T. Controlling silk fibroin particle features for drug delivery. Biomaterials. 31 (16), 4583-4591 (2010).
- Gupta, V., Aseh, A., Rìos, C. N., Aggarwal, B. B., Mathur, A. B. Fabrication and characterization of silk fibroin-derived curcumin nanoparticles for cancer therapy. Int. J. Nanomedicine. 4, 115-122 (2009).
- Zhao, Z., et al. Generation of silk fibroin nanoparticles via solution-enhanced dispersion by supercritical CO2. Ind. Eng. Chem. Res. 52 (10), 3752-3761 (2013).
- Tudora, M., Zaharia, C., Stancu, I. Natural silk Fibroin micro-and nanoparticles with potential uses in drug delivery systems. U.P.B. Sci. Bull., Series B. 75 (1), 43-52 (2013).
- Zhao, Z., Li, Y., Xie, M. B. Silk Fibroin-Based Nanoparticles for Drug Delivery. Int. J. Mol. Sci. 16 (3), 4880-4903 (2015).
- Rockwood, D., Preda, R., Yücel, T. Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin. Nat. Protoc. 6 (10), 1-43 (2011).
- Seib, F. P., Müller, K., Franke, M., Grimmer, M., Bornhäuser, M., Werner, C. Engineered extracellular matrices modulate the expression profile and feeder properties of bone marrow-derived human multipotent mesenchymal stromal cells. Tissue. Eng. Part A. 15 (10), 3161-3171 (2009).
- Lai, P., Daear, W., Löbenberg, R., Prenner, E. J. Overview of the preparation of organic polymeric nanoparticles for drug delivery based on gelatine, chitosan, poly(d,l-lactide-co-glycolic acid) and polyalkylcyanoacrylate. Colloids Surf., B, Biointerfaces. 118, 154-163 (2014).
- Subia, B., Kundu, S. C. Drug loading and release on tumor cells using silk fibroin-albumin nanoparticles as carriers. Nanotechnology. 24 (3), 035103 (2013).
- Zhang, Y. Q., Shen, W. D., Xiang, R. L., Zhuge, L. J., Gao, W. J., Wang, W. B. Formation of silk fibroin nanoparticles in water-miscible organic solvent and their characterization. J. Nanopart. Res. 9 (5), 885-900 (2006).
- Jin, H. J., Kaplan, D. L. Mechanism of silk processing in insects and spiders. Nature. 424 (6952), 1057-1061 (2003).
- Yhr Bae,, Park, K. Targeted drug delivery to tumors: myths, reality and possibility. J. Control. Release. 153 (3), 198-205 (2011).
- Lammel, A., Schwab, M., Hofer, M., Winter, G., Scheibel, T. Recombinant spider silk particles as drug delivery vehicles. Biomaterials. 32 (8), 2233-2240 (2011).
- Holliday, D. L., Speirs, V. Choosing the right cell line for breast cancer research. Breast. Cancer. Res. 13, 215 (2011).
