Summary
Un protocole de mesure de conductivité électrique des biofilms microbiens vivant dans des conditions physiologiques pertinentes est présenté.
Abstract
Nous démontrons ici la méthode de déclenchement électrochimique utilisé pour caractériser la conductivité électrique des biofilms microbiens électrode cultivés dans des conditions physiologiques pertinentes. 1 ces mesures sont effectuées sur la vie des biofilms en milieu aqueux à l’aide de la source et drain électrodes modelés sur une surface de verre dans une configuration spécialisée dénommée un tableau d’électrodes interdigitées (IDA). Un biofilm est cultivé qui s’étend à travers l’écart reliant la source et drain. Potentiels sont appliquées aux électrodes (E,S et E,D) générant un courant drain-source (ISD) à travers le biofilm entre les électrodes. La dépendance de la conductivité électrique sur le potentiel de la porte (la moyenne des potentiels source et de drain, EG = [E,D + ES] / 2) est déterminé par systématiquement changer la barrière de potentielle et le drain-source résultant de la mesure actuel. La dépendance de la conductivité sur barrière potentielle renseigne mécanistes sur le processus de transport d’électrons extracellulaire qui sous-tendent la conductivité électrique du biofilm spécifique sous enquête. La méthode de mesure électrochimique gating décrite ici repose directement sur celle utilisée par M. S. Wrighton2,3 et collègues et R. W. Murray4,5,6 et collègues les 1980 s d’enquêter sur les polymères conducteurs minces.
Introduction
Transport d’électrons extracellulaire (EET) est un processus qui permet à certains microorganismes pour le transport des électrons entre les processus métaboliques intracellulaires et accepteurs d’électrons insolubles ou bailleurs de fonds qui se trouvent à l’extérieur de la cellule, allant des minéraux naturels à électrodes. Dans certains cas, EET permet aux micro-organismes former électro-conducteur multicellulaire biofilms épais sur la surface de l’électrode, dans lequel cellules pas en contact direct avec l’électrode peuvent toujours utiliser comme un accepteur d’électrons métabolique ou donneur. Il y a un intérêt considérable dans ces biofilms comme catalyseurs d’électrode pour diverses applications, comme électrosynthèse microbienne, contaminant de détection/suppression et la production d’énergie à distance et le stockage,7,8,9 ,10,11,12,13,14 en raison de la diversité des processus métaboliques, interprété par les micro-organismes et la durabilité des biofilms microbiens par rapport à base d’enzymes bioélectrodes. 15 , 16 en outre, voies EET peuvent potentiellement être utilisées aux changements électriquement contrôle ou signal de naturellement ou issus du génie génétique microbiennes processus métaboliques impliqués, par exemple, dans la production d’un produit désiré ou la détection d’un analyte cible ou la stimulation. La conductivité électrique des biofilms électrocatalytique, ce qui les distingue d’autres matériels biologiques, est un aspect central de leurs propriétés électrocatalytique, pourtant peu est entendu sur le processus sous-jacent de EET au sein de l’électrode, et ce qui est connu est fortement contesté. 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24
Décrite ici est une méthode de 2 électrodes pour mesurer la conductivité dans les biofilms living, électrode cultivés à l’aide de rangées d’électrodes interdigitées (ADIS). Idas et Lyncée se composent d’électrodes rectangulaires parallèles, modelés sur la surface du verre plat tel que tous les autres groupes sont relié à des côtés opposés du tableau résultant à 2 électrodes (source et drain). Un examen attentif d’une ADI (voir par exemple, la Figure 6.12b de ref #1) révèle que les écarts qui séparent les bandes adjacentes sont également connectés de manière ne forment qu’un espace unique qui tisse en arrière sur la baie qui sépare les deux électrodes. Il en résulte un espace long et étroit séparant les électrodes source et de drain, à rendement très élevé source-drain courants lorsqu’un matériau conducteur est formé, cast, polymérisé ou cultivé (dans le cas du type de biofilms considérés ici) sur le tableau. En outre, la petite taille des électrodes se traduit par petit fond actuel en raison de la capacité de charge et de changer dans l’état d’oxydation de la matière conductrice avec changement de porte potentielle, étant donné que la quantité de matériel nécessaire pour faire de conductivité Dimensions à l’aide de IDAs est si petites. La technique de base IDA électrochimique de blocage décrites ici, mis au point afin de caractériser les polymères conducteurs minces,2,3,4,25 a récemment été appliqué à des systèmes vivants. 18 une autre technique utilisée pour mesurer la conductivité des biofilms vivant utilisé un grand format, diviser les électrodes source et de drain et mètres de la source pour définir la barrière potentielle. 26 , 27 Toutefois, ces méthodes ont été détaillés précédemment. 18
Le protocole ci-dessous encapsule notre expérience avec la mesure de conductivité de la vie des biofilms MCL Geobacter sulfurreducens et biocathode. G. sulfurreducens est une électrode modèle réduisant l’organisme en mesure d’utiliser les matériaux insolubles, y compris les électrodes, comme accepteur d’électrons métabolique unique. En outre, il forme des biofilms épais qui sont capables de transporter des électrons au fil de multiples longueurs de cellule, ce qui en fait un organisme modèle idéal pour étudier le transfert d’électron sur de longues distances extracellulaire anodique. Nous incluons également les détails pour l’étude des biocathode MCL, une communauté mixte aérobie, autotrophes biofilm isolée de la cathode d’une pile à combustible microbienne benthique. Biocathode MCL (nommé pour les trois constituants primaires – Marinobacter, Chromatiaceaea et Labrenzia) est capable d’oxyder une électrode comme son donneur d’électron unique et de transport des électrons sur plusieurs longueurs de cellule, rendant il un système cathodique intéressant à étudier. En outre, biocathode MCL possède la plus haute conductivité déclarée pour un système vivant à ce jour à l’aide de ces méthodes. L’inclusion de ces biofilms électroactifs diversifiée dans ce protocole vise à souligner que cette technique est applicable pour mesurer le transport d’électrons à travers tout biofilm vivant capable d’électriquement interagissent avec des électrodes.
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Protocol
1. préparation de la microélectrode interdigitées tableau (IDA)
- Obtenir commercialement disponible IDA électrodes modelés sur un substrat non conductrice ou synthétiser les méthodes lithographiques standard. 28
NOTE : Dimensions IDA et/ou des matériaux peuvent varier selon les conditions souhaitées pour différentes expériences. Idas et Lyncée utilisées ici ont été obtenus sur le marché et se composait de deux microélectrodes or interdigitées modelés sur un substrat en verre relié aux grandes électrodes aux extrémités opposées du tableau. Les électrodes sont exposés tandis que les lignes de bus reliant les électrodes pour les grandes électrodes de contact sont recouvertes d’un matériau isolant mince. Idas et Lyncée utilisé ici se composent de deux séries de 10 µm à l’échelle et 2 mm long or microélectrode bandes (source et drain) espacement apart 5 µm, modelée sur une surface de verre plat. Idas et Lyncée utilisé ici eu 65 paires d’électrodes (130 bandes interdigitées totales). Bandes alternantes sont reliés à des électrodes aux extrémités opposées du tableau. - Fil et isolez IDA
- Connectez un fil à chaque pad de grandes électrodes à l’aide de conducteur époxy alu.
- Préparer le conducteur époxy conformément aux instructions du fabricant pour l’époxy spécifique en cours d’utilisation avec un embout de tige ou d’une pipette (les instructions peuvent varier selon le fabricant).
- Placez un fil sur chaque pad or, fixer en place avec du ruban de laboratoire. Couvrir le fil et le patin d’époxy alu à l’aide d’un embout de tige ou d’une pipette.
- Déplacer délicatement à un four à 80 ° C pendant 1 h à la cure ou cure basée sur les recommandations du fabricant pour l’époxy alu conducteur spécifique utilisé.
- Après que l’époxy durcit, utiliser un multimètre pour assurer la connectivité électrique entre l’extrémité du fil et les plaquettes. La résistance entre le fil et le plateau doit être < 5 Ω. En outre, utilisez le multimètre pour vérifier qu’aucun conducteur époxy ne se connecte plusieurs électrodes auto-adhésives, aussi cela peut bref le tableau. Si époxy conductrice se connecte les fils multiples, utilisez un scribe pour isoler les fils.
- Isolez la connexion précontraite en enduisant la connexion avec un thermique, électrique et matériau isolant imperméable à l’eau. Résines de polyuréthane ignifuges sont souvent adaptés.
- Retirer l’embout d’un tube à centrifuger conique de 15 mL (à environ la marque 2,5 mL) comme un moule pour le matériau isolant. Faire deux petits trous dans le fond pour les fils à percent à l’aide d’une aiguille de 21g.
- Insérez l’ACCOVAM dans le moule et les fils à travers les trous dans le fond du moule.
- Préparer le matériau isolant spécifique. Suivez les instructions fournies avec la résine spécifique obtenue.
- Pipetter l’isolant dans le moule afin que l’époxy alu est complètement couvert (~2.5 mL) et laisser pour sécher selon les spécifications du fabricant.
- Connectez un fil à chaque pad de grandes électrodes à l’aide de conducteur époxy alu.
2. installation du réacteur électrochimique, les tests et l’inoculation
- Mettre en place la cellule électrochimique.
- Insérez IDA contre-électrode et électrode de référence dans la cellule électrochimique.
Remarque : Le réacteur électrochimique utilisé peut varier considérablement, tant que toutes les électrodes parfaitement à l’intérieur. Une considération est que l’électrode de référence devrait être aussi proche que possible de l’électrode de travail accordée les limites pratiques du réacteur. Ici, nous utilisons un réacteur à chambre unique avec la référence électrode ~ 2-3 cm de l’électrodes. En outre, la contre-électrode doit être supérieure à l’électrode de travail pour s’assurer qu’il n’est pas limitant dans le système. - Si vous travaillez avec une culture pure, stériliser le réacteur avec la contre-électrode à l’intérieur. Stériliser l’électrode de référence par trempage dans l’eau de Javel pour 10 min et 10 min. d’eau déionisée stérile stérilisent l’IDA par immersion dans l’eau de Javel pour 5 s suivie d’eau déionisée stérile 10 s avant l’insertion dans le réacteur.
- Remplir la cellule électrochimique avec milieu stérile adapté pour la croissance de biofilm. Pour g. sulfurreducens17,18, utiliser le milieu d’eau douce à l’exclusion de fumarate. Pour biocathode MCL,9 utiliser l’eau de mer artificielle. 9
- Connecter les électrodes à un bipotentiostat. Branchez une électrode IDA à la tête de travail 1, l’autre électrode de IDA à la tête de travail 2, l’électrode de référence à la borne de référence et la contre-électrode au câble compteur.
- Insérez IDA contre-électrode et électrode de référence dans la cellule électrochimique.
-
L’essai électrochimique d’IDAs.
Remarque : L’objectif principal de ce test est de s’assurer que les deux électrodes sont isolées électriquement. Toutes les techniques électrochimiques sont disponibles dans le logiciel utilisé pour contrôler la bipotentiostat.- Effectuer des essais de conductivité de contrôle (avant une reprise de biofilm) pour assurer son bon fonctionnement IDA, à l’aide d’un bipotentiostat.
- Mesure du potentiel de circuit ouvert de chaque électrode pendant 1 min.
Remarque : Sur certains instruments, circuit ouvert potentiels doit être atteint en utilisant le programme de collecte galvanostatique et affectant le courant 0 mA. - Mesure du potentiel de circuit ouvert d’électrode 2 lors de l’exécution de voltamétrie cyclique sur électrode 1 entre + 0,2 V à + 0,6 V (par rapport à elle) à 20 mV/s.
Remarque : Autres limites et les vitesses de balayage pour CV peuvent être utilisés si vous le souhaitez. Toutefois, éviter les potentiels qui seront traduira par la génération d’hydrogène ou l’oxygène. - Vérifier que le circuit ouvert potentiel mesuré à électrode 2 reflète pas le potentiel de l’électrode 1 pendant le CV en utilisant le logiciel potentiostat.
Remarque : Le potentiel de circuit ouvert de l’électrode 2 peut changer, mais il doit être indépendant du potentiel de l’électrode 1. - Répétez les étapes 2.2.1.1 par 2.2.1.3 sauf contrôle le potentiel d’électrode 2 et mesure le potentiel du circuit ouvert de l’électrode 1.
- Mesure du potentiel de circuit ouvert de chaque électrode pendant 1 min.
- Définissez le potentiel des électrodes sur le potentiel de croissance désirée du biofilm électroactifs pertinents en utilisant le logiciel bipotentiostat. Par exemple, utilisez + 0,5 V (par rapport à elle) pour Geobacter sulfurreducens ou + 0,31 V (par rapport à elle) pour biocathode MCL.
- Effectuer des essais de conductivité de contrôle (avant une reprise de biofilm) pour assurer son bon fonctionnement IDA, à l’aide d’un bipotentiostat.
- Cultiver des biofilms électroactifs pertinentes
- Inoculer le réacteur électrochimique d’un stock de culture/enrichissement des micro-organismes électrochimiquement actives désirées à l’aide des techniques microbiologiques aseptiques habituelles. Pour les tests standards, ensemencer dans un 01:20 ratio (inoculum au volume du réacteur) de l' OD600 = 0,5 culture.
- La valeur de l’agitation dans le réacteur pour le niveau souhaité (~ 200 tr/min) et l’incubateur / bain d’eau à la température désirée selon les conditions de croissance du biofilm d’intérêt. Pour g. sulfurreducens, utiliser 30 ° C pour une croissance optimale.
- Incuber le système basé sur des exigences spécifiques de la microorganismes d’intérêt jusqu'à ce que le biofilm comble le fossé qui sépare les deux électrodes. Pour les fixes biofilm sulfurreducens g. , incuber pendant environ 7 à 10 jours. Pour biocathode MCL, incuber ~ 7 jours. Dans chaque cas, contrôler la température à 30 ° C.
3. électrochimiques gating expériences
- Sélectionnez les paramètres expérimentaux qui serviront à déterminer la dépendance courant-potentiel pour les mesures de blocage.
- Déterminer l’échelle des potentiels de porte qui s’appliqueront à l’IDA pour obtenir l’intensité menée (ISD) par rapport à la courbe du potentiel porte E (G) pour le système.
Remarque : La gamme des potentiels porte examiné devrait couvrir tous les potentiels avec l’activité d’oxydoréduction possible. Si aucune information sur le système d’intérêt est disponible, une gamme large potentielle devrait être utilisée (-0,55 à + 0,6 V contre elle). Une approche essais-erreurs permet d’affiner la gamme basée sur le système à l’étude. Barrière potentielle est défini comme :
où ED est le potentiel de l’électrode de drain et ES est le potentiel de l’électrode de la source. La gamme des potentiels de porte utilisé est limitée par les exigences et les limites du système spécifique d’intérêt. 18
NOTE : Source et drain potentiels qui seront traduira par l’évolution de l’oxygène et l’hydrogène doivent être évitées car ces processus peuvent endommager le biofilm. - Déterminer la tension drain-source (VSD) qui sera utilisée comme force d’entraînement pour le transport des électrons à travers le film de la source au drain. Voltage source-drain est défini comme :
NOTE : La tension drain-source devrait être suffisamment petite pour que la j’aiSD augmentent linéairement avec VSD. 17 - Choisissez une vitesse de balayage (v) au cours de laquelle EG est modifié linéairement avec le temps qui est indépendant d’ISD afin que le système peut être approché pour être à l’équilibre pour chaque porte potentiel.
Remarque : Une vitesse de balayage de moins de 0,002 V/s est souvent utilisée pour les systèmes biologiques. 29 , 30 - Mettre en place le logiciel bipotentiostat pour effectuer les mesures de blocage (c'est-à-dire balayer la barrière potentielle) sur la plage sélectionnée, à la tension drain-source sélectionnés et à la vitesse de numérisation souhaitée basée sur des considérations qui précèdent.
Remarque : pour les mesures antérieures de blocage à l’aide de g. sulfurreducens,17,19 EG = -0,55 V à 0,6 V (par rapport à elle), VSD = 0,01 V ou 0,1 V, v = 0,001 V/s. Pour Biocathode MCL, EG = 0.25 V à 0,7 V (par rapport à elle), VSD = 0,002 V, v = 0,0002 V/s.- En outre, effectuer une mesure de base VSD = 0,000 V (c.-à-d., un CV à chaque électrode prise simultanément) à la même v choisie à l’étape 3.1.3.
- Effectuer des mesures blocage en utilisant les conditions en 3.1.4 sous les deux chiffre d’affaires (avec donneur d’électrons soluble ou accepteur présent) et des conditions de non-chiffre d’affaires (sans donneur d’électrons soluble ou accepteur).
Remarque : Des conditions de Non-chiffre d’affaires sont avantageuses car les mesures ne sont pas masqués par l’oxydation ou la réduction de composés solubles pour le métabolisme cellulaire, bien que devraient provenir des résultats similaires quelle que soit la condition est utilisée après en soustrayant les courants de fond (détaillées dans 3.1.8).- Obtenir les conditions de chiffre d’affaires en utilisant le même moyen de réacteurs que celui utilisé pour la croissance bactérienne sur l’électrode. Ce milieu contient un donneur d’électrons solubles, tels que l’acétate de sulfurreducens g.,17 ou accepteur, tels que l’oxygène pour Biocathode MCL.
- Atteindre des conditions de non-chiffre d’affaires en faisant le même milieu de réacteur utilisé pour la croissance bactérienne sur l’électrode, sauf omettre le donneur d’électrons soluble ou accepteur. Après s’être assuré que le potentiostat est hors tension, retirez le milieu aseptique et ajouter dans un milieu frais sans donneur d’électrons pour systèmes anodiques ou accepteur pour systèmes cathodiques. Alternativement, un système à débit continu peut être mis en place pour remplacer lentement le milieu avec le support souhaité pour les conditions nonturnover.
Remarque : Si l’oxygène est accepteur d’électrons solubles (comme pour biocathode MCL), sparge le système avec un mélange de ~ 15 % CO2 et 85 % N2 (ou un mélange de gaz qui permettra de maintenir le bon pH dans le milieu).
- Après avoir complété les mesures de blocage, utilisez le logiciel de potentiostat pour définir le potentiel de chaque électrode retour à la croissance potentielle pour permettre au système de re-stabiliser (en utilisant les mêmes valeurs que dans 2.2.2).
- Si toutes les conditions décrites ci-dessus sont remplies (ISD est indépendant de v et augmentent linéairement avec VSD), je convertir des valeurs deSD en conductivité à l’aide des équations suivantes comme décrit précédemment31
- où G est la conductance et S est un facteur d’échelle qui est dépendante du système et les facteurs variables, notamment la taille de l’électrode, la taille de l’écart et hauteur de biofilm. Pour certains systèmes, S peut être déterminée au moyen des équations prédéterminées. 31 par ailleurs, S peut être calculée numériquement en utilisant un logiciel de modélisation, tel que décrit précédemment. 17
- Soustraire les courants de fond afin d’identifier la forme et l’amplitude du courant mené. Soit soustraire le courant généré à VSD = 0,00 V du courant généré à VSD = 0,01 V ou soustraire le courant drain de la source de courant généré avec un VSD = 0,01 V. soit méthode supprime fond courants, laissant seulement le courant de conduction.
- Déterminer l’échelle des potentiels de porte qui s’appliqueront à l’IDA pour obtenir l’intensité menée (ISD) par rapport à la courbe du potentiel porte E (G) pour le système.
- Mesures de blocage électrochimiques dépendantes température
- Déterminer la plage de températures d’intérêt. Cette gamme est hautement dépendante du système à l’étude, températures toutefois physiologiquement pertinentes doivent être utilisés.
NOTE : Des études antérieures ont utilisé une gamme de température de 10 ° C à 30 ° C afin d’étudier le transport des électrons dans des conditions physiologiquement pertinentes pour les microorganismes mésophiles. 17 - Obtenir une recirculation bain-marie ou incubateur pour réguler la température du réacteur et un réacteur de contrôle pour s’assurer que la valeur de consigne et la température réelle du milieu est la même.
- Placez un thermomètre ou thermocouple dans un réacteur de contrôle où serait l’ACCOVAM.
- J’ai effectuer des mesures deSD (voir 3.1.4) sur la plage de températures sélectionnés dans le cadre de chiffre d’affaires et nonturnover (décrit à l’étape 3.1.5) les conditions à l’aide de la bipotentiostat suite à une des deux procédures décrites ci-dessous.
- J’ai générerSD vs EG courbes, comme décrit plus haut (voir 3.1), pour chaque température sur la plage de températures d’intérêt. Pour les matériaux qui présentent conductivité d’oxydo-réduction, tels que g. sulfurreducens et Biocathode MCL, le courant de crête de chaque température sert à déterminer la j’aiSD vs dépendance T.
Remarque : Cette méthode est utilisée pour générer une pleine j’aiSD vs EG la courbe pour chaque température, mais nécessite plus de temps que la deuxième option. - Alternativement, mettre et maintenir l’IDA à la barrière de potentielle que les rendements maximum menée actuel à l’aide de la bipotentiostat (obtenu à partir de laSD je courbeG vs E étape 3.1.4) et enregistrer le courant maximal de menées à l’aide de la bipotentiostat tout en la température est à vélo entre la plage de températures sélectionnées en utilisant les contrôles à bord du bain-marie ou incubateur.
Remarque : avec la géométrie de l’électrode/réacteur utilisée ici, la j’aiSD et T sont autorisés à se stabiliser pour au moins 20 min et une moyenne stable j’aiSD est utilisé pour chaque température. Plus ou moins le temps de stabilisation peut être exigée basé sur le système spécifique. Cette méthode est plus rapide que la première et entraîne moins de stress pour le biofilm. Toutefois, les courbes pleines de blocage ne sont pas générées. - Cycle de la température d’un point de consigne à l’autre et retour à nouveau en utilisant les contrôles à bord de l’incubateur ou le bain-marie pour déterminer la réversibilité de la réaction pour s’assurer que la température de cyclisme n’endommage pas le biofilm.
- J’ai générerSD vs EG courbes, comme décrit plus haut (voir 3.1), pour chaque température sur la plage de températures d’intérêt. Pour les matériaux qui présentent conductivité d’oxydo-réduction, tels que g. sulfurreducens et Biocathode MCL, le courant de crête de chaque température sert à déterminer la j’aiSD vs dépendance T.
- Réinitialiser la température à la température de croissance normale, en utilisant les contrôles à bord de l’incubateur ou le bain-marie et laisser le système se stabilise.
Remarque : Pour un chef d’orchestre de l’oxydo-réduction, laSD par rapport aux données de 1/T je peux adapter avec l’expression taux d’Arrhénius, qui permet le calcul de l’énergie d’activation comme suit :
où Eun est l’énergie d’activation pour le transfert d’électrons entre cofacteurs redox adjacentes et k est la constante de Boltzmann.
- Déterminer la plage de températures d’intérêt. Cette gamme est hautement dépendante du système à l’étude, températures toutefois physiologiquement pertinentes doivent être utilisés.
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Representative Results
ADI ont été câblée, isolée et testées pour s’assurer que les deux électrodes sont électriquement isolés les uns des autres (Figure 1). Réacteurs ont été assemblés, inoculés avec le g. sulfurreducenset incubés jusqu'à ce qu’un biofilm comblé le fossé entre les électrodes. Le biofilm sulfurreducens g. on voit visuellement pour couvrir le tableau. Autres films biologiques peut demander au chercheur de faire une mesures électrochimiques gating pour voir si les deux électrodes ont été raccordés électriquement. La microscopie devrait également être utilisée pour vérifier la connexion entre les électrodes du tableau. Électrochimiques gating expériences ont été menées pour déterminer la dépendance à l’égard d’ISD EG (Figure 2). La conductivité du film la vie est alors calculée avec le courant de conduction mesuré dans les expériences de blocage. La précision et l’exactitude de ces mesures était élevé en raison de la haut rapport signal sur bruit possible avec la configuration de l’IDA. La dépendance en température d’ISD sur T a aussi été déterminée avec une énergie d’activation pour le transport des électrons à travers le biofilm (Figure 2). Les résultats obtenus ici sont similaires à celles observées auparavant17,18 et appuient l’hypothèse que les biofilms MCL g. sulfurreducens et biocathode ont un comportement semblable aux conducteurs d’oxydoréduction où les électrons sont transféré par le biofilm par sauts entre les cofacteurs d’oxydo-réduction près à proximité.
Figure 1 : IDA mis en place et contrôler les tests électrochimiques. (A) une ADI qui a été câblée et isolée. En médaillon : Agrandi imagé du tableau montrant les électrodes interdigitées et celui des grandes électrodes auto-adhésives. Électrodes de compteur et de référence distincts sont placées dans la cellule électrochimique ainsi que de l’IDA pour réaliser des expériences. (B) contrôles électrochimiques présentant une autonomie électrique de chaque électrode. Le potentiel de circuit ouvert de l’électrode 2 ne répond pas changeant le potentiel de l’électrode 1 au cours de la CV, indiquant que les électrodes ne sont pas court-circuitée et peuvent être utilisés pour le biofilm gating Mensurations. (C) même que B, sauf le potentiel d’électrode 2 se déplace pendant le CV d’électrode 1, indiquant que les électrodes sont court-circuitées et ne doivent pas être utilisés pour les mesures de blocage. Cette IDA n’était pas utilisée dans d’autres expériences. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : électrochimique gating expériences. (A) électrochimiques déclenchement des mesures d’un vivant, électrode cultivé biofilm de g. sulfurreducens . Le pic en forme j’aiSD-EG courbe est indicative incohérente, plusieurs étape de transport des électrons dans le biofilm. La courbe actuelle menée a été obtenue en soustrayant la source de la canalisation actuelle (et divisant par 2) obtenu au potentiel de chaque porte pour éliminer les courants de fond. Pour obtenir des exemples de données actuelles raw prises avec VSD = 0 et VSD = 0,01 V, on se reportera à l’Information à l’appui des travaux antérieurs. 18 (B) thermo-dépendantes Gate measurementsover une gamme physiologiquement pertinente montrant une augmentation de la conductivité lorsque la température est augmentée, une propriété observée pour les conducteurs d’oxydo-réduction. 4 (C) Transformation de l’ISD – données T et apte à l’équation d’Arrhénius. L’ajustement linéaire de l’équation d’Arrhénius est indicatif d’un processus de transfert d’électron multi-étapes. L’énergie d’activation pour le transport des électrons dans un biofilm de g. sulfurreducens est calculé à partir de la pente de la courbe d’être ~0.01 eV, ce qui concorde avec le transport des électrons entre les centres redox du côté c-type cytochromes. 32 , 33 , 34 S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Lors de la configuration de l’IDA, il est essentiel de vérifier que la source et le drain ne sont pas court-circuitées ensemble avant mesures électrochimiques de blocage, car cela modifiera la j’aiSD vs EG courbe et pourrait conduire à des interprétations et des résultats erronés. Il est également essentiel pour sélectionner VSD et v tel que le courant est linéairement dépendantes sur VSD et indépendantes de v. Si ce n’est pas le cas, alors les équations décrites ci-dessus ne peuvent pas être utilisées pour calculer la conductivité.
Au moins deux courants de fond doivent être examinés et retirés les mesures actuelles. Le premier est contexte actuel en raison de la charge/décharge faradique des cofacteurs redox comme le potentiel de grille est balayé. Ce contexte actuel est fortement influencé par la quantité d’oxydo-réduction cofacteurs accessibles électriquement reliés à la surface de l’électrode. Un deuxième fond actuel est capacité de la double couche. Un troisième fond actuel est en raison du chiffre d’affaires des accepteurs/donneurs d’électrons métabolique par les cellules. Ce contexte actuel n’est applicable dans les conditions de chiffre d’affaires. Les courants de fond dans cette étude ont été éliminés en soustrayant la source actuelle du courant de drain à VSD = 0,01 V. Cette méthode suppose que les courants de fond sont égaux à deux électrodes et source-drain courants sont égaux en grandeur aux deux électrodes, mais de signe opposé. Dans ce cas en soustrayant les courants de la source et de drain donne un double actuel mené en ampleur et devrait être divisé par deux. Il est à noter que cette hypothèse n’est vraie dans la limite d’un petit VSD, qui est dépendante du système (pour g. sulfurreducens, VSD< 0,05 V). Des valeurs plus grandes de VSD souvent se traduit par des conditions disparates sur chacune des électrodes et empêche cette méthode de soustraction de fond ne soient utilisés. Alternativement, des courants de fond peut être retirés en soustrayant la source et drain courants obtenus à VSD = 0,0 V de ceux obtenus à VSD = 0,01 V. Cette méthode n’assume que les courants de base de chaque électrode sont les mêmes.
La technique décrite ici est flexible. La plupart des paramètres décrits dans le protocole sont dépendante du système à l’étude et peut être modifiée. Pour exemple, le matériel et les dimensions de l’IDA peuvent varier, la température ambiante et la gamme de potentiels de la porte, entre autres paramètres, peuvent être modifiés pour répondre aux besoins de l’étude spécifique. De plus, standards des techniques microbiologiques et électrochimiques sont adaptés et utilisés, rendant ce protocole adapté pour les chercheurs d’une variété de domaines d’études.
Ici, nous avons décrit un protocole pour l’étude de transport des électrons dans vie, électrode cultivé, des biofilms électroactifs utilisant IDAs. ADI ont été utilisées auparavant pour caractériser le transport des électrons en couches minces polymères conducteurs et peut être fabriquée à l’aide de divers matériaux d’électrode standard et techniques photolithographiques. 2 le principal avantage de l’ADI est le signal haut bruit ratio en raison de i) l’écart longtemps serpentine qui sépare la source de l’alternance et évacue les bandes de l’électrode et ii) la surface de l’électrode total relativement faible par rapport à la taille de l’écart. La géométrie des électrodes est importante de tenir compte dans le déclenchement des mesures parce que les dimensions de l’électrode et gap ont un effet important sur le rapport signal sur bruit et par conséquent sur la précision des mesures de conductivité effectuées. 18
Électrochimique gating expériences de living, cultivés en électrode sulfurreducens g. biofilms exposition une pointe claire en forme de dépendance à l’égard d’ISD sur EG, suggérant que les électrons sont transportés à travers le biofilm via incohérent, plusieurs étapes en île, comme dans les polymères conducteurs oxydo-réduction. 4 , 35 la conductivité de la crête du biofilm g. sulfurreducens s’est avérée pour être ~ 4 µS/cm, en accord avec les résultats antérieurs obtenus dans des conditions similaires. 17 en outre, la barrière de potentielle pour conductivité maximale est similaire au milieu potentiel a célébré pour sulfurreducens g. biofilms lors chiffre d’affaires CV17 cela a également été observée auparavant et est postulée comme signifiant que les mêmes transporteurs d’électrons utilisés par les cellules pour le transport des électrons résultant du métabolisme de l’acétate sont également utilisés pour transporter les frais de l’électrode de la source à l’électrode de vidange par le biofilm. Autres dépendances d’ISD sur EG, comme ont été observées dans différents matériaux et suggèrent un mécanisme différent de transfert d’électron. Par exemple, la j’aiSD vs EG courbe de la poly(methylthiophene) de polymère montre une courbe en forme de s et suggère la conduction métallique type électron. 36 , 37
La dépendance en température du courant de conduction est un paramètre essentiel pour déterminer le mécanisme de transport des électrons par l’intermédiaire de matériaux conducteurs. Jusqu'à tout récemment, seuls les échantillons ex situ avaient servis à enquêter sur la dépendance en température du courant mené par un biofilm. 22 résultats récents présentés ici et d’ailleurs17 obtient un autre j’aiSD – dépendance T à l’aide de mesures de blocage et donc prévoir un mécanisme de saut multi-étapes, incohérent de transport des électrons par l’intermédiaire de G. sulfurreducens des biofilms, qui est différentes de celle d’un mécanisme proposé antérieurement. 22
La limitation majeure de cette technique et d’autres géométries semblables lors de l’évaluation de transport d’électrons à travers un biofilm microbien est que la charge se déplace latéralement entre les électrodes de source et le drain placés dans le même plan, sur une surface plane. L’écoulement naturel d’électrons à travers le biofilm, cependant, est perpendiculaire à la surface de l’électrode. En utilisant cette technique et le modèle, nous rapprochant le biofilm comme un film homogène et d’interroger des flux d’électrons à travers une partie seulement du biofilm. Validation expérimentale de l’hétérogénéité spatiale du biofilm est encore nécessaire de valider davantage cette technique. Toutefois, comme indiqué ci-dessus, cette méthode permet des mesures in situ avec le plus haut rapport signal sur bruit disponible à ce jour. Cette technique peut être utilisée pour étudier les frais de transport de tout matériel qui peut interagir avec une électrode.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
M.D.Y, S.M.G.-S. et L.M.T. reconnaissent l’Office of Naval Research (prix #N0001415WX01038 et N0001415WX00195), le Naval Research Laboratory et le Naval Research Laboratory Nanosciences Institute ; M.Y.E.-N. est pris en charge par les États-Unis Département d’énergie Grant DE-FG02-13ER16415.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IDAs | CH Instruments | 012125 | Manufactured by ALS-Japan; sold by CH Instruments |
| Wire | Digikey | W7-ND | |
| Conductive silver epoxy | Electron microscopy sciences | 12670-EE | |
| Insulating material | 3M | 2131-B | Scotchast flame retardant compound |
| 15 mL conical centrifuge tube | VWR | 89004-368 | |
| 21g needle | VWR | BD-305165 | |
| 5 mL pipette tips | VWR | 82018-842 | |
| 5 mL pipettor | VWR | 89079-976 | |
| Freshwater medium components | Sigma Aldrich | All standard laboratory chemicals | |
| Ammonium chloride | |||
| Sodium phosphate monobasic | |||
| Sodium bicarbonate | |||
| Artificial seawater medium components | Sigma Aldrich | All standard laboratory chemicals | |
| Sodium chloride | |||
| Magnesium chloride hexahydrate | |||
| Magnesium sulfate heptahydrate | |||
| Potassium chloride | |||
| Sodium bicarbonate | |||
| Calcium chloride dihydrate | |||
| Ammonium chloride | |||
| Potassium phosphate dibasic | |||
| Ag/AgCl reference electrode | Basi | MF-2079 | |
| Graphite rod counter electrode | Electron microscopy sciences | 70230 | |
| Recirculating water bath | Thermo Scientific | 152-5256 | |
| Bipotentiostat | Pine Instruments | WD-20 | http://www.voltammetry.net/pine/aftermath/user |
| Stir bars | VWR | 58947-114 | |
| G. sulfurreducens culture | ATCC | 51573 | |
| Jacketed reactor | Pine Instruments | RRPG085 |
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